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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

Published: May 31, 2020 doi: 10.3791/61112
Automatic Translation
1,2, 1,3,4
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

Summary

Das vorgestellte Protokoll kann die Vektorkompetenz von Aedes aegypti-Mückenpopulationen für ein bestimmtes Virus, wie Zika, in einer Containment-Umgebung bestimmen.

Abstract

Die vorgestellten Verfahren beschreiben eine verallgemeinerte Methodik zur Infektion von Aedes aegypti-Mücken mit dem Zika-Virus unter Laborbedingungen, um die Infektionsrate, die disseminierte Infektion und die mögliche Übertragung des Virus in der betreffenden Mückenpopulation zu bestimmen. Diese Verfahren werden weltweit mit verschiedenen Modifikationen in der Vektorkompetenzbewertung eingesetzt. Sie sind wichtig für die Bestimmung der potenziellen Rolle, die eine bestimmte Mücke (dh Art, Population, Individuum) bei der Übertragung eines bestimmten Erregers spielen kann.

Introduction

Vektorkompetenz ist definiert als die Fähigkeit auf der Ebene der Art, der Population und sogar eines Individuums eines bestimmten Arthropoden wie einer Mücke, Zecke oder Phlebotin-Sandfliege, einen Wirkstoff biologisch mit Replikation oder Entwicklung im Arthropoden zu erwerben und zu übertragen1,2. In Bezug auf Moskitos und durch Arthropoden übertragene Viren (dh Arboviren) wird das Mittel von einem virämischen Wirt von einer weiblichen Mücke aufgenommen. Nach der Einnahme muss das Virus produktiv eine aus einer kleinen Population von Mitteldarmepithelzellen infizieren3und verschiedene physiologische Hindernisse wie den proteolytischen Abbau durch Verdauungsenzyme, das Vorhandensein der Mikrobiota (Mitteldarminfektionsbarriere oder MIB) und die sezernierte peritrophe Matrix überwinden. Auf die Infektion des Mitteldarmepithels muss eine Replikation des Virus und ein eventueller Austritt aus dem Mitteldarm in das offene Kreislaufsystem der Mücke oder Hämolymphe folgen, was den Beginn einer disseminierten Infektion darstellt, die die Mitteldarmfluchtbarriere (MEB) überwindet. Zu diesem Zeitpunkt kann das Virus Infektionen von sekundärem Gewebe (z. B. Nerven, Muskeln und Fettkörper) aufbauen und sich weiter replizieren, obwohl eine solche sekundäre Replikation möglicherweise nicht unbedingt notwendig ist, damit das Virus die Azinuszellen der Speicheldrüsen infizieren kann (Überwindung der Speicheldrüseninfektionsbarriere). Der Austritt aus den Acinarzellen der Speicheldrüse in ihre apikalen Hohlräume und die anschließende Bewegung in den Speichelgang ermöglicht die Impfung des Virus in nachfolgende Wirte beim Beißen und schließt den Übertragungszyklus1,2,4,5,6,7ab .

Angesichts dieses gut charakterisierten und allgemein erhaltenen Ausbreitungsmechanismus innerhalb eines Mückenvektors sind Laborvektor-Kompetenzbewertungen oft methodisch ähnlich, obwohl Unterschiede in den Protokollen bestehen1,2. Im Allgemeinen werden Moskitos nach oraler Virusexposition so seziert, dass einzelne Gewebe wie Mitteldarm, Beine, Eierstöcke oder Speicheldrüsen auf Virusinfektion, disseminierte Infektion, disseminierte Infektion / potenzielle transovariale Übertragung bzw. disseminierte Infektion / potenzielle Übertragungskompetenz untersucht werden können8. Das bloße Vorhandensein eines Virus in den Speicheldrüsen ist jedoch kein endgültiger Beweis für die Übertragungsfähigkeit, da hinweise auf eine Speicheldrüsen-Flucht-/Austrittsbarriere (SGEB) in einigen Vektor/Virus-Kombinationen1,2,4,5,7,9. Die Standardmethode zum Nachweis der Übertragungskompetenz bleibt die Mückenübertragung auf ein anfälliges Tier10,11,12. Da dies jedoch für viele Arboviren die Verwendung von immungeschwächten murinen Modellen13,14,15,16erfordert , ist diese Methode oft unerschwinglich. Eine häufig verwendete Alternative ist die Sammlung des Mückenspeichels, der durch reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) oder einen infektiösen Assay analysiert werden kann, um das Vorhandensein des viralen Genoms bzw. infektiöser Partikel nachzuweisen. Es ist erwähnenswert, dass solche In-vitro-Speichelentnahmemethoden12 oder 17 der während der In-vivo-Fütterung abgelagerten Virusmenge überschätzen oder unterschätzen können, was darauf hindeutet, dass solche Daten mit Vorsicht interpretiert werden müssen. Nichtsdestotrotz ist die In-vitro-Methode sehr wertvoll, wenn sie aus der Perspektive des bloßen Vorhandenseins von Viren im Speichel analysiert wird, was auf ein Übertragungspotenzial hinweist.

Es gibt zwei Hauptansätze, um die Rolle von Mückenvektoren bei arboviralen Krankheitsausbrüchen zu bestimmen. Die erste Methode beinhaltet die Feldüberwachung, bei der Moskitos im Rahmen der aktiven Übertragung18,19, 20,21,22,23,24gesammelt werden . Angesichts der Tatsache, dass die Infektionsraten jedoch in der Regel recht niedrig sind (z. B. die geschätzte Infektionsrate von Moskitos von 0,061% in Gebieten mit aktiver Zirkulation des Zika-Virus (ZIKV) in den Vereinigten Staaten21),kann die Belastung potenzieller Vektorarten durch die Fangmethodik25,26 und den Zufall (z. B. Probenahme einer infizierten Person von 1.600 nicht infizierten Personen) stark verzerrt sein21 . Unter Berücksichtigung dieser Tatsache kann eine bestimmte Studie nicht genügend Moskitos sowohl in der Rohzahl als auch in der Artenvielfalt erfassen, um Mücken, die an der Übertragung beteiligt sind, genau zu beproben. Im Gegensatz dazu werden Vektorkompetenzanalysen in einem Labor durchgeführt, was eine strenge Kontrolle von Parametern wie der oralen Dosis ermöglicht. Obwohl diese Laborbewertungen nicht vollständig in der Lage sind, die wahre Komplexität der Mückeninfektion und -übertragungsfähigkeit in einer Feldumgebung darzustellen, bleiben diese Laborbewertungen leistungsstarke Werkzeuge auf dem Gebiet der Arbovirologie.

Basierend auf verschiedenen Vektorkompetenzanalysen mit ZIKV in mehreren Mückenarten, Populationen und Methoden27,28,29,30,31,32, sowie einer aktuellen Überprüfung von Vektorkompetenzbewertungen 1 beschreiben wir hier einige der Protokolle, die miteinemtypischen Vektorkompetenz-Workflow verbunden sind. In diesen Experimenten wurden drei Ae. aegypti-Populationen aus Amerika (der Stadt Salvador, Brasilien; der Dominikanischen Republik; und dem unteren Rio Grande Valley, TX, USA) einem einzigen Stamm von ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) bei 4, 5 oder 6 log10 focus-forming units (FFU) / ml Dosen durch künstliche Blutmehle ausgesetzt. Anschließend wurden sie nach verschiedenen Zeiten extrinsischer Inkubation (2, 4, 7, 10 und 14 Tage) mittels Dissektion und einem zellkulturbasierten Infektionstest auf Hinweise auf Infektion, disseminierte Infektion und Übertragungskompetenz analysiert. Obwohl die derzeitigen Arbeitsabläufe/Protokolle für ZIKV optimiert sind, sind viele Elemente in den Arthropoden-Eindämmungs- und Biosicherheitsstufen 2 und 3 (ACL/BSL2 oder ACL/BSL3) direkt auf andere durch Mücken übertragene Arboviren übertragbar.

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Protocol

Alle in diesen Protokollen durchgeführten Verfahren wurden in voller Übereinstimmung mit den Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Biosafety Committee und dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas Medical Branch in Galveston genehmigt wurden.

1. ZIKV in Vero-Zellen verstärken

  1. Züchten Sie Vero-Zellen (CCL-81 oder VeroE6) in Dulbeccos Modifikation von Eagles minimal essentiellem Medium (DMEM), ergänzt mit 10% v/v hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS) und 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin (100 U/ml bzw. 100 μg/ml) in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 bis 80−90% Konfluenz in einem 150 cm2 Gewebekulturkolben.
  2. Entfernen Sie in einer Biosicherheitswerkbank (BSC) das Medium und entsorgen Sie es entweder in 10% Bleichmittel oder einer Arbeitsverdünnung von dualem quartärem Ammonium (Materialtabelle). Impfen Sie die Monoschicht sofort mit 1 ml Virusbestand, mit dem Ziel, 0,1−1 infektiöse Viruspartikel pro Zelle zu erhalten. Den Kolben sofort so rühren, dass das Inokulum die Monoschicht in seiner Gesamtheit berührt.
  3. Füllen Sie das Medium auf ein Volumen von 5 ml mit DMEM auf, das mit 2% v / v wärmeinaktiviertem FBS und 1% (v / v) Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Dann den Kolben für 60 min in den befeuchteten 37 °C Inkubator mit5% CO2 geben.
  4. Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und bringen Sie ihn in ein BSC. Fügen Sie zusätzliches Medium zu einem Gesamtvolumen von 15 ml hinzu, indem Sie DMEM verwenden, das mit 2% v / v wärmeinaktiviertem FBS und 1% (v / v) Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Den Kolben in einen befeuchteten 37 °C Inkubator mit 5 %CO2 stellen.
  5. Untersuchen Sie den Kolben täglich unter Phasenkontrastmikroskopie auf Hinweise auf zytopathische Wirkungen (CPE). Fahren Sie mit der Virusernte (Schritt 1.7) fort, wenn nur etwa 40-50% der Zellen in der Monoschicht verbleiben, in der Regel 3-5 Tage nach der Infektion, abhängig vom verwendeten ZIKV-Stamm.
  6. Den Überstand ansaugen und in eine konische Durchstechflasche mit 50 ml geben. Klären Sie den Überstand von Zelltrümmern durch Zentrifugation (3.500 x g für 20 min).
    HINWEIS: Wenn mehrere Kolben identisch infiziert waren, können Überstände aus mehreren Kolben zu konischen 50-ml-Röhrchen kombiniert werden.
  7. Entfernen Sie den Überstand aus dem konischen 50-ml-Rohr zu einem frischen und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Ergänzen Sie den Überstand mit wärmeinaktiviertem FBS bis zu einer Endkonzentration von 30% (v/v). Aliquotieren Sie diese Mischung in einzelne Schraubverschlussrohre und frieren Sie bei -80 °C bis zum Gebrauch ein.

2. Herstellung von künstlichen Blutmehlen

  1. An dem Tag, an dem Moskitos infektiösen Blutmehlen ausgesetzt werden sollen, schalten Sie die Stromquelle ( Table of Materials ) in einer Arthropoden-Eindämmungseinrichtung so ein, dass die Fütterungseinheiten (Table of Materials) vorgewärmt sind, wenn die Moskitos für die Exposition vorbereitet sind.
  2. Bereiten Sie künstliche Blutmehle mit einer der unten beschriebenen Methoden vor.
    1. Methode 1: Frisch geerntetes (innerhalb einer Woche) zitriertes oder heparinisiertes menschliches Blut, das im Handel gekauft wurde, 1:1 v/v mit Virusmaterial (hergestellt wie in Abschnitt 1 beschrieben) kombinieren.
      HINWEIS: Diese Methode ist davon abhängig, dass im Blut keine Antikörper gegen das Virus/die Virusfamilie vorhanden sind.
    2. Wenn das Fehlen von Antikörpern nicht bestätigt werden kann oder bekannt ist, dass die Blutquelle zuvor flavivirusexpositioniert ist, waschen und verpacken Sie die Erythrozyten manuell.
      1. In einem BSC 30 ml menschliches Vollblut in ein 50 mL konisches Rohr geben und bis zu 50 ml mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auffüllen.
      2. Zentrifuge bei 3.500 x g für 20 min.
      3. Aspirieren Sie den Überstand entweder durch vorsichtiges Gießen in eine Schalenpfanne, die entweder 10% Bleichmittel enthält, oder durch Arbeitsverdünnung von dualem quartärem Ammonium, wobei darauf zu achten ist, dass das Erythrozytenpellet nicht verworfen wird.
      4. Fügen Sie 10 ml PBS hinzu und klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des konischen Röhrchens gegen den Boden des BSC, so dass das Erythrozytenpellet rekonstituiert wurde. Bringen Sie das Volumen der Suspension mit PBS auf bis zu 50 ml. Durch sanfte Inversion mischen.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2.1−2.2.2.4 insgesamt 4−6x. Bestätigen Sie, dass der Überstand klar oder nur leicht rosa und nicht mehr undurchsichtig ist. Entfernen Sie den gesamten Überstand mit einer serologischen Pipette. Resuspendieren Sie das Erythrozytenpellet in 1−2 ml PBS.
      6. Setzen Sie das Blutmehl zusammen: 350 μL gepackte Erythrozyten, 100 μL 10% Saccharose, 200 μL hitzeinaktiviertes FBS, 900 μM rekombinantes ATP und 2 ml entsprechend verdünntes Virusmaterial unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 2% v/v hitzeinaktiviertem FBS und 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
  3. Überlagern Sie eine Standard-3-ml-Reservoireinheit(Materialtabelle)mit der Haut einer nicht infizierten Maus (andere Optionen umfassen Paraffinfilm, kollagene Membranen oder Wursthülle).
  4. Legen Sie den überdachten Behälter auf weiße Papiertücher. Fügen Sie ~ 2 ml infektiöses Blutmehl zu dem Reservoir 1 ml auf einmal hinzu. Untersuchen Sie das Handtuch unter dem Feeder auf Anzeichen von Leckagen. Wenn Leckagen vorhanden sind, holen Sie das Blutmehl aus den Feedern zurück und entsorgen Sie die Abdeckungen. Verschließen Sie die Feeder mit Stopfen. Bestätigen Sie erneut, dass keine Lecks vorhanden sind.

3. Backtitration von Blutmehl/Plaque-Assay

  1. Unter Verwendung des verbleibenden Volumens des vorbereiteten Blutmehls wird eine 10-fache serielle Verdünnungsreihe (d. h. 6 Verdünnungen, die von 10x bis 1.000.000x verdünnt sind) unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 2% v/v wärmeinaktiviertem FBS und 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin, durchgeführt.
  2. Aliquot 100 μL der Verdünnungen in die Vertiefungen von 24 oder 12 Well Platten von den am meisten verdünnten bis zu den konzentriertesten.
  3. Inkubieren Sie für 1 h in einem 37 °C, 5% CO2 Inkubator.
  4. Am Ende der 1-stündigen Inkubationszeit werden die Platten wieder in das BSC gebracht und 1 ml oder 2 ml Methylcellulose-Overlay entsprechend in die 24 Well- oder 12 Well-Platten gegeben.
  5. Legen Sie die überlagerten Platten wieder in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator und inkubieren Sie für 3-7 Tage (virusstammabhängig).
  6. Nach der Inkubation die Platten aus dem Inkubator entfernen und in den BSC bringen. Entsorgen Sie das Methylcellulose-Overlay in eine Schalenpfanne, die 10% Bleichmittel oder duales quartäres Ammoniumdesinfektionsmittel enthält.
  7. Waschen Sie jede Vertiefung 2x mit PBS und entsorgen Sie die Wäsche in eine Schalenpfanne mit 10% Bleichmittel oder dualem quartärem Ammonium.
  8. Fügen Sie ~ 1 ml Methanol: Aceton (1: 1 v: v) hinzu und lassen Sie die Zellen mindestens 30 minuten lang im BSC bei Raumtemperatur (RT) auf der Platte fixieren. Entsorgung von Methanol:Aceton gemäß der institutionellen Politik für organische Abfälle.
  9. Visualisieren Sie ZIKV mit einer von zwei unten beschriebenen Methoden.
    1. Nach der Entfernung von Methanol:Aceton sofort mit einer kristallvioletten Lösung (0,25% w/v in 30% Methanol) für 5 min einfärben. 2x in Leitungswasser abspülen und trocknen lassen, dann direkt mit dem Auge sichtbar machen, um Hinweise auf Plaques oder Zerstörung der Monoschicht zu erhalten.
    2. Alternativ können Sie einen Fokusformungsassay durchführen.
      1. Lassen Sie die Platten an der Luft trocknen, bis kein organisches Fixiermittel mehr übrig ist.
        HINWEIS: Dies sollte ~ 2−3 h außerhalb des BSC dauern, kann aber durch Lufttrocknung in einem BSC oder chemischen Abzug beschleunigt werden.
      2. Jede Vertiefung 3x für jeweils 15 min in nichtsterilem PBS(Mg2+ und Ca2+ frei) auf einer Orbitalplattenwippe waschen. Entfernen Sie PBS und geben Sie 1 ml Blockierungslösung (PBS + 3% FBS) zu jeder Vertiefung und gestein für 15 min bei RT.
      3. 100 μL pro Vertiefung α-ZIKV- oder α-Flavivirus-Primärantikörper (z. B. Flavivirus-Gruppenhybrioma D1-4G2-4-15 [4G2]) in einer Verdünnung von 1:2.000 in Blocklösung zugeben. Inkubieren mit Schaukeln für mindestens 4 h (vorzugsweise über Nacht, nicht mehr als 18 h) bei RT.
      4. Den primären Antikörper entfernen und 3x für jeweils 15 min mit PBS(Mg2+ und Ca2+ frei) auf einer Orbitalplattenwippe waschen.
      5. Fügen Sie 100 μL pro Vertiefung des sekundären Antikörpers (Ziegen- α Maus-HRP-markiert) hinzu, der 1:2.000 in blocking buffer verdünnt ist. Inkubieren Sie mit Schaukeln für 1 h bei RT.
      6. 3x für je 15 min mit PBS (Mg2+ und Ca2+ frei) auf einer Orbitalplattenwippe waschen.
      7. Aliquot 100 μL Substratentwicklungsreagenz (Materialtabelle) pro Vertiefung. Gesteinsplatten bei RT für 15 min.
      8. Stoppen Sie die Reaktion bei der Entwicklung von Herden / Plaques, indem Sie das Substrat entfernen und die Platten 2x mit Leitungswasser spülen. Gießen Sie Leitungswasser ab und lassen Sie die Platten vor der Quantifizierung an der Luft trocknen.
      9. Zählen Sie virale Herde, um die Anzahl der in der gegebenen Probe vorhandenen FFU zu bestimmen.

4. Verabreichung von Blutmehl

  1. Verwenden Sie Ae. aegypti Moskitos 2-4 Tage nach der Eklosion. Sortieren Sie weibliche Moskitos in 0,5-Liter-Kartons mit abgeschirmten Deckeln und entziehen Sie ihnen Zucker (im Allgemeinen 36-48 h vor dem infektiösen Blutmehl). Geben Sie ad libitum Wasser über wassergesättigte Wattebällchen.
  2. Entfernen Sie die wassergesättigten Wattebällchen an dem Morgen, an dem die Moskitos dem infektiösen Blutmehl ausgesetzt sind.
  3. Befestigen Sie Behälter mit künstlichen Blutmehlen an den Leitungen der Fütterungseinheit in einem durchsichtigen Kunststoffhandschuhfach.
  4. Legen Sie im Handschuhfach einen 0,5-Liter-Karton mit einem abgeschirmten Deckel mit 50−100 ausgehungerten Ae. aegypti-Mücken unter die am Reservoir befestigte Futtereinheit.
    HINWEIS: Entsprechend ausgehungerte Moskitos fressen in der Regel innerhalb von 20 Minuten. Die Fütterung kann bei Bedarf verlängert werden, um die Stichprobengröße in langsameren Populationen zu erhöhen, obwohl dies nicht über 60 minuten hinausgehen sollte, da der (ZIKV) Virustiter nach ~ 60 minuten im Feeder abnehmen kann.
  5. Nach Abschluss der Fütterung entfernen Sie das Reservoir und tauchen Sie es in frisch hergestelltes 10% Bleichmittel ein.
  6. Kaltanästhesieren Sie Moskitos durch Inkubation für 30 s bei -20 ° C oder für 5 minuten im Kühlschrank.
  7. Gießen Sie die Moskitos im Handschuhfach in eine Petrischale auf Eis. Zählen und sortieren Sie die geschwollenen Weibchen von ungeschmiedeten Moskitos. Entsorgen Sie die ungefederten Moskitos durch Eintauchen in ein 50 ml langes konisches Röhrchen, das mit 70% Ethanol gefüllt ist. Während die Moskitos noch betäubt sind, gießen Sie sie zurück in den 0,5 L Karton und decken Sie sie schnell mit dem Bildschirm und dem Deckel ab. Schneiden Sie überschüssiges Siebnetz vom Karton ab und sichern Sie das Netz mit Klebeband.
  8. Fügen Sie einen Wattebausch hinzu, der mit steriler gefilterter 10% wässriger Saccharose gesättigt ist, zum Sieb jedes Kartons. Legen Sie alle Mückenkartons in einen großen Sekundärbehälter aus Kunststoff mit einem feuchten Schwamm, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
  9. Stellen Sie einen sekundären Behälter mit Kartons mit Moskitos in einen Inkubator mit einer Temperatur von 27 ± 1 ° C (oder je nach Bedarf zur Simulation von Bedingungen in der Region von Interesse) mit 80% ± 10% relativer Luftfeuchtigkeit und einem 16: 8 Hell: Dunkel-Zyklus). Halten Sie die Moskitos mit Ad-libitum-Zugang zu 10% Saccharose bis zum Abschluss der Experimente aufrecht.

5. Probenentnahme und -verarbeitung

  1. An bestimmten Tagen nach der Fütterung saugen Sie eine vorbestimmte Anzahl von Moskitos aus den entsprechenden Kartons mit einem mechanischen Aspirator in einem Handschuhfach ab. Schließen Sie das Auffangrohr mit einer Baumwollrunde ab, nachdem die erforderliche Anzahl von Moskitos erworben wurde.
  2. Kaltanästhesie von Moskitos durch Inkubation für 30 Sekunden bei -20 ° C oder für 5 Minuten bei 4 ° C.
  3. Gießen Sie die Moskitos im Handschuhfach in eine Petrischale auf Eis. Entfernen Sie mit zwei Pinzettenpaaren alle sechs Beine jeder Mücke und legen Sie sie in ein voretikettiertes 2 ml rundes Mikrozentrifugenrohr mit einem sterilisierten Edelstahlkugellager (7/32 ") und 500 μL Mückensammelmedium (MCM), bestehend aus DMEM, 2% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin und 2,5 μg / ml Amphotericin.
  4. Legen Sie die Mücke vorsichtig auf einen Tropfen Mineralöl, um sie zurückzuhalten, und achten Sie darauf, dass kein Kontakt zwischen dem Öl und dem Kopf und dem Rüssel der Mücke zulässt.
  5. Führen Sie den Mückenboss in eine 10 μL Pipettenspitze ein, die mit 10 μL wärmeinaktiviertem FBS gefüllt ist.
    HINWEIS: Alternativ kann die Pipette mit Saccharose, Blut oder Mineralöl gefüllt werden. Das Öl ermöglicht die direkte Visualisierung von Speichelblasen mittels Lichtmikroskopie.
  6. Lassen Sie die Mücke 30 Minuten lang speicheln. Werfen Sie die Mikropipettenspitze, die FBS + Speichel enthält, in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 μL MCM aus und legen Sie dann den Korpus in ein separates 2 ml rundes Mikrozentrifugenrohr mit einem sterilisierten Stahlkugellager und 500 μL MCM. Stellen Sie sicher, dass die für Körper, Beine und Speichel verwendeten Röhrchen so gekennzeichnet sind, dass klar ist, dass alle drei Proben von derselben Mücke stammen.
  7. Während die Mücken speicheln, führen Sie die Schritte 5,3-5,5 bei den verbleibenden Moskitos durch.
  8. Transportieren Sie die Röhrchen, die die Körper und Beine enthalten, zu einer Homogenisierungsvorrichtung für das Perlenmahlgewebe, die in einem BSC enthalten ist. Alle Körper- und Beinproben bei 26 Hz für 5 min verdrieren, um virale Partikel in den Überstand freizusetzen. Klären Sie alle Proben durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min, um Zelltrümmer zu pelletieren.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei -80 °C eingefroren oder sofort untersucht werden.

6. Nachweis von ZIKV durch Infektiologie-Assay

  1. Bereiten Sie in einem BSC 24 h vor Beginn des infektiösen Assays 24 Well-Gewebekulturplatten mit Vero-Zellen (105 Zellen pro Well) vor. Beschriften Sie jede Vertiefung mit der Identität einer einzelnen Mücke / Probe.
  2. Wenn die Proben bei -80 °C eingefroren wurden, lassen Sie sie auftauen.
  3. Entfernen Sie das Medium vor der Impfung mit Proben eine Platte nach der anderen von den Vero-Zellplatten.
  4. Bei Proben, die Körper oder Beine enthalten, vorsichtig 100 μL geklärten Überstand in jede Vertiefung aliquotieren, wobei darauf zu achten ist, dass die Mückenzellablagerungen aus dem Pellet nicht gestört werden.
    HINWEIS: Speichelproben können vor der Impfung auf Zellen 1:1 (v/v) mit MCM verdünnt werden, um die Proben für eine spätere Titration zu konservieren, falls erforderlich.
  5. Die Platten in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator geben und 1 h inkubieren.
  6. Bringen Sie die Platten zum BSC zurück und fügen Sie ~ 1 ml Methylcellulose-Overlay zu jeder Vertiefung hinzu. Legen Sie die überlagerten Platten wieder in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator und inkubieren Sie sie für 3−7 Tage (virus-/stammabhängig).
  7. Führen Sie die Fixierung und Visualisierung wie in den Schritten 3.6 bis 3.9 beschrieben durch.
  8. Quantifizieren Sie in Bezug auf das Scoring über einen Fokusformungsassay die positiven Vertiefungen durch Untersuchung unter einem Lichtmikroskop. Der Nachweis einer intrazytoplasmatischen Färbung von Zellen in einem Brunnen weist auf das Vorhandensein eines Virus hin. Stichproben werden ausschließlich als Fokus-positiv oder -negativ bewertet.

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Representative Results

Drei Populationen von Ae. aegypti aus Amerika (Salvador, Brasilien; die Dominikanische Republik; und das Rio Grande Valley, TX, USA) wurden einem Ausbruchsstamm von ZIKV aus Amerika (ZIKV Mex 1-7, Chiapas State, Mexiko, 2015) über eine Reihe von Blutmehltitern (4, 5 und 6 log10 FFU / ml) ausgesetzt, die in einem gewaschenen künstlichen Blutmehl auf der Basis von menschlichen Erythrozyten präsentiert wurden. An den Tagen 2, 4, 7, 10 und 14 nach der Infektion wurden Untergruppen von Moskitos verarbeitet, um Infektion, Verbreitung und mögliche Übertragungsraten zu bestimmen.

Bei einem Blutmehltiter von 4 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1−7 wurden Ae. aegypti aus Salvador, Brasilien, nach 4 bzw. 14 Tagen extrinsischer Inkubation mit Raten von 12,5 % bzw. 11,1 % infiziert, wobei keine Anzeichen einer disseminierten Infektion in den untersuchten Beinen beobachtet wurden und kein Virus im Speichel nachgewiesen wurde (Abbildung 1a). Die Erhöhung des Titers auf 5 log10 FFU/ml führte zu einer geringfügigen Erhöhung der Infektiosität mit Raten von 22,2%, 33,3% bzw. 22,2% an den Tagen 4, 10 und 14 nach der Infektion. Ähnlich wie in der Kohorte, die mit 4 log10 FFU/ml exponiert wurde, wurde zu keinem Zeitpunkt eine disseminierte Infektion oder Übertragungskompetenz beobachtet (Abbildung 1b). Beim höchsten untersuchten Titer (6 log10 FFU/ml) wurden nach 2 Tagen Inkubation keine Infektionen festgestellt, aber zu allen anderen Zeitpunkten wurden Infektionen beobachtet, die bei 88,9% nach 10 Tagen extrinsischer Inkubation ihren Höhepunkt erreichten. ZIKV wurde in den Beinen von Moskitos nachgewiesen, die 10 und 14 Tage nach der Infektion untersucht wurden (22,2% bzw. 66,7%), was darauf hindeutet, dass ziKV in den Hämocoel gelangt war, obwohl zu diesem Zeitpunkt ein infektiöser ZIKV im Speichel beobachtet wurde (Abbildung 1c).

Die Ae. aegypti-Population aus der Dominikanischen Republik erwies sich als die anfälligste für ZIKV-Infektionen und war nach Exposition gegenüber allen getesteten Blutmehltitern übertragungskompetent. Bei allen drei getesteten Dosen wurde zu allen Zeitpunkten ein gewisses Maß an Infektion beobachtet, wobei die niedrigste Rate 2 Tage nach der Infektion bei 4 log10 FFU/ml (25%) beobachtet wurde(Abbildung 1d). Mit Blutmehltitern von 5 log10 und 6 log10 FFU / ml Bedingungen erreichte die Infektionsrate einen Höchststand von 100%, wobei eine 100% ige Infektion bereits 4 Tage nach der Infektion in der Population von Moskitos beobachtet wurde, die 6 log10 FFU / ml ZIKV ausgesetzt waren (Abbildung 1e,f). Moskitos, die alle drei Dosen mit allen drei Dosen fütterten, zeigten eine Verbreitung von 7 Tagen nach der Infektion mit einem Höchststand von44,4% (4 log 10 FFU / ml, 14 Tage nach der Infektion), 88,9%(5 log 10 FFU / ml, 1 und 14 Tage nach der Infektion) und 100% (6 log10 FFU / ml, 10 Tage nach der Infektion). Die Transmissionskompetenz wurde nach allen drei Dosen (11,1%, 22,2% und 22,2% bei 4, 5 bzw. 6 log10 FFU/ml) beobachtet, jedoch erst nach einer 14-tägigen extrinsischen Inkubationszeit (EIP) (Abbildung 1d−f).

Die Ae. aegypti-Population aus dem Rio Grande Valley, TX, erwies sich als relativ resistent gegen eine Infektion mit ZIKV. Moskitos, die Blutmehltitern von 4 log10 FFU / ml ausgesetzt waren, wurden bereits 4 Tage nach der Infektion infiziert, mit Infektionsraten zwischen 22,2% und 44,4%. Unter diesen Expositionsbedingungen wurden 14 Tage nach der Infektion disseminierte Infektionen mit einer Rate von 11,1% beobachtet, und es wurde keine Übertragungskompetenz beobachtet (Abbildung 1g). Ein zehnfacher Anstieg des Blutmehltiters führte zu einem weitgehend ähnlichen Ergebnis, wobei Infektionen 4 Tage nach der Exposition beobachtet wurden (33,3% und 44,4%), während disseminierte Infektionen nach 14 Tagen extrinsischer Inkubation mit einer Rate von 22,2% gefunden wurden (Abbildung 1h). Schließlich wurde in der Kohorte, die einem 6 log10 FFU / ml Blutmehl ausgesetzt war, eine Infektion ab dem 2-tägigen Zeitpunkt nach der Infektion (22,2%) beobachtet und erreichte Spitzenwerte 4, 10 und 14 Tage nach der Infektion (66,7%). Disseminierte Infektionen in diesem Zustand wurden 7 Tage nach der Infektion (11,1%) beobachtet und erreichten 14 Tage nach der Infektion einen Höhepunkt von 44,4%. Nur eine einzige Mücke (11,1%) wurde 10 Tage nach der Infektion als übertragungsfähig beobachtet (Abbildung 1i).

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Vektorkompetenzdaten verschiedener Ae. aegypti Populationen für ZIKV Mex 1−7. (a−c) Vektorkompetenz von Ae. aegypti aus Salvador, Brasilien (F2). (d−f) Vektorkompetenz von Ae. aegypti aus der Dominikanischen Republik (F6). (g−i) Vektorkompetenz von Ae. aegypti aus dem Rio Grande Valley, TX (F4). (a,d,g) Ae. aegypti ausgesetzt bei 4 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. (b,e,h) Ae. aegypti ausgesetzt bei 5 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. (c,f,i) Ae. aegypti ausgesetzt bei 6 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. Zu jedem Zeitpunkt (2, 4, 7, 10 und 14 Tage nach der Infektion) wurde eine Untergruppe von Moskitos gesammelt und beprobt. Infektions-, Verbreitungs- und Übertragungsraten werden als die Anzahl der positiven Kadaver- / Bein- / Speichelproben über die Anzahl der zu diesem Zeitpunkt untersuchten Moskitos dargestellt. Die Infektion wird in Blau dargestellt, die disseminierten Infektionen in Grün und die Übertragungsrate in Rot. Die Daten in dieser Abbildung wurden von Roundy und Azar et al.32 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die hier beschriebenen Methoden bieten einen verallgemeinerten Workflow zur Durchführung von Vektorkompetenzanalysen. Als allgemeiner Rahmen sind viele dieser Methoden in der Literatur erhalten. Es gibt jedoch erheblichen Spielraum für Änderungen (überprüft in Azar und Weaver1). Virus (z. B. virale Abstammung, Speicherung des Challenge-Virus, virale Passage-Geschichte), Entomologie (z. B. Laborbesiedlung von Mückenpopulationen, angeborene Immunität, das Mückenmikrobiom / -virom) und experimentelle Variablen (z. B. Blutmehlzusammensetzung, sequentielle Blutfütterung und Inkubationstemperatur) sind alle dafür bekannt, die Vektorkompetenz zu beeinflussen. Die methodische Variabilität in Kompetenzstudien hat sich im Kontext des ZIKV-Ausbruchs als problematisch erwiesen, da sie formale Metaanalysen ausgeschlossen hat1,33.

Innerhalb dieser allgemeinen Methodik kann die Bedeutung des angemessenen Hungers von Moskitos und Blutmehl-Make-up nicht genug betont werden. Es ist bekannt, dass Dehydration das Blutfütterungsverhalten von Moskitos in Laborparadigmen34antreibt, was den Wert von Zucker- und Wassermangel unterstreicht, bevor ein infektiöses Blutmehl angeboten wird. Während der Entzug von Zucker für 36-48 h und Wasser für 2-4 h vor der Exposition gegenüber dem Blutmehl von Ae. aegyptigut vertragen wird, ist es erwähnenswert, dass diese Moskitos unter Laborbedingungen notorisch leicht zu verarbeiten sind2. Solche aggressiven Hungerregime werden von anderen Mückenarten möglicherweise nicht annähernd so gut vertragen, was ein gewisses Maß an interner Optimierung erfordert. Ebenso kann der Blutmehlgehalt durch die Präferenz des Wirts informiert werden. Zum Beispiel ist die Verwendung von menschlichem Blut zur Herstellung eines Blutmehls für anthropophile Moskitos wie Ae. aegypti durchaus angemessen, aber menschliche Blutmehle, die für ornithophile Arten wie Culex quinquefasciatus hergestellt werden, können sich als weniger wirksamerweisen 35. Darüber hinaus ist in Bezug auf die Blutmehlmontage die Verwendung von relativ frischen Blutprodukten sehr ratsam, um die Hämolyse von Erythrozyten zu minimieren.

Eine der größten Einschränkungen der Vektorkompetenzbewertung als Ganzes und der hier beschriebenen Verfahren besteht darin, dass diese Studien weitgehend auf die Untersuchung von Viren mit Moskitos beschränkt sind, die unter Laborbedingungen aufrechterhalten werden können. Ae. aegypti, obwohl ein hochrelevanter Vektor für eine Vielzahl von Krankheitserregern von klinischer Bedeutung, ist auch eine der am einfachsten zu züchtenden und zu pflegenden Moskitos in Laborkolonien1,31,36,37. Es überrascht nicht, dass die Kompetenz von Ae. aegypti-Populationen daher oft die am besten charakterisierte unter den gewöhnlichen Vektormückenist 2. Dies ist besonders problematisch im Zusammenhang mit Arboviren, die sowohl enzootische als auch städtische Übertragungszyklenaufrechterhalten 38,39,40, da die Vektorkompetenz in der Regel nur im Kontext der besser beherrschbaren städtischen Mücken durchgeführt wird.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Wir danken den Mitarbeitern des World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton und Divya Mirchandani, für ihre unermüdliche Arbeit bei der Kuratierung und Bereitstellung vieler der Virusstämme, die für die Vektorkompetenzexperimente unserer und anderer Gruppen verwendet werden. Die vorgestellten Arbeiten wurden durch den McLaughlin Fellowship Fund (SRA) und die NIH-Zuschüsse AI120942 und AI121452 finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 159 Mücke Vektorkompetenz Aedes Aedes aegypti Arbovirus Zika
Vektorkompetenzanalysen an <em>Aedes aegypti</em> Mücken mit Zika-Virus
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Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).

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