Summary
Il protocollo presentato può determinare la competenza vettoriale delle popolazioni di zanzare Aedes aegypti per un dato virus, come Zika, in un ambiente di contenimento.
Abstract
Le procedure presentate descrivono una metodologia generalizzata per infettare le zanzare Aedes aegypti con il virus Zika in condizioni di laboratorio per determinare il tasso di infezione, l'infezione disseminata e la potenziale trasmissione del virus nella popolazione di zanzare in questione. Queste procedure sono ampiamente utilizzate con varie modifiche nelle valutazioni delle competenze vettoriali a livello globale. Sono importanti nel determinare il ruolo potenziale che una data zanzara (cioè specie, popolazione, individuo) può svolgere nella trasmissione di un determinato agente.
Introduction
La competenza vettoriale è definita come la capacità a livello di specie, popolazione e persino individuo, di un dato artropode come una zanzara, una zecca o una mosca di sabbia flebotomina, di acquisire e trasmettere un agente biologicamente con replicazione o sviluppo nell'artropode1,2. Per quanto riguarda le zanzare e i virus trasmessi dagli artropodi (cioè gli arbovirus), l'agente viene assorbito da un ospite viremico da una zanzara femmina. Dopo l'ingestione, il virus deve infettare in modo produttivo una di una piccola popolazione di cellule epiteliali dell'intestino medio3, superando vari ostacoli fisiologici come la degradazione proteolitica da parte degli enzimi digestivi, la presenza del microbiota (barriera di infezione dell'intestino medio, o MIB) e la matrice peritrofica secreta. L'infezione dell'epitelio midgut deve essere seguita dalla replicazione del virus e dall'eventuale fuga dal midgut nel sistema circolatorio aperto della zanzara, o emolinfa, che rappresenta l'insorgenza di un'infezione disseminata che supera la barriera di fuga del midgut (MEB). A questo punto il virus può stabilire infezioni dei tessuti secondari (ad esempio, nervi, muscoli e corpi adiposi) e continuare a replicarsi, sebbene tale replicazione secondaria possa non essere strettamente necessaria affinché il virus infetti le cellule acinari delle ghiandole salivari (superando la barriera di infezione della ghiandola salivare). L'uscita dalle cellule acinari della ghiandola salivare nelle loro cavità apicali e quindi il movimento nel dotto salivare consente l'inoculazione del virus in ospiti successivi al morso e completa il ciclo di trasmissione1,2,4,5,6,7.
Dato questo meccanismo di diffusione ben caratterizzato e generalmente conservato all'interno di un vettore di zanzara, le valutazioni delle competenze vettoriali di laboratorio sono spesso metodologicamente simili, sebbene esistano differenze nei protocolli1,2. Generalmente, dopo l'esposizione orale al virus, le zanzare vengono sezionate in modo che i singoli tessuti come l'intestino medio, le gambe, le ovaie o le ghiandole salivari possano essere analizzati per l'infezione virale, l'infezione disseminata, l'infezione disseminata / potenziale trasmissione transovarica e l'infezione disseminata / potenziale competenza di trasmissione, rispettivamente8. La semplice presenza di un virus nelle ghiandole salivari, tuttavia, non è una prova definitiva della capacità di trasmissione, data l'evidenza di una barriera di fuga/uscita della ghiandola salivare (SGEB) in alcune combinazioni vettore/virus1,2,4,5,7,9. Il metodo standard per dimostrare la competenza di trasmissione rimane la trasmissione delle zanzare a un animalesuscettibile10,11,12. Tuttavia, dato che per molti arbovirus ciò richiede l'uso di modelli murini immunocompromessi13,14,15,16,questo metodo è spesso proibitivo in termini di costi. Un'alternativa comunemente usata è la raccolta della saliva della zanzara, che può essere analizzata mediante reazione a catena trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR) o un test infettivo per dimostrare la presenza del genoma virale o di particelle infettive, rispettivamente. Vale la pena notare che tali metodi di raccolta della saliva in vitro possono sovrastimare12 o sottostimare17 la quantità di virus depositata durante l'alimentazione in vivo, indicando che tali dati devono essere interpretati con cautela. Tuttavia, il metodo in vitro è molto prezioso se analizzato dal punto di vista della semplice presenza di virus nella saliva, indicando il potenziale di trasmissione.
Esistono due approcci principali per determinare il ruolo dei vettori di zanzare nelle epidemie di malattie arbovirali. Il primo metodo prevede la sorveglianza sul campo, in cui le zanzare vengono raccolte nel contesto della trasmissione attiva18,19,20,21,22,23,24. Tuttavia, dato che i tassi di infezione sono in genere piuttosto bassi (ad esempio, il tasso di infezione stimato dello 0,061% delle zanzare nelle aree di circolazione attiva del virus Zika (ZIKV) negli Stati Uniti21), l'incriminazione di potenziali specie di vettori può essere fortemente distorta dalla metodologia di cattura25,26 e dalla casualità (ad esempio, campionando un individuo infetto su 1.600 non infetti)21 . Tenendo conto di ciò, un determinato studio potrebbe non acquisire zanzare sufficienti sia in numero grezzo che in diversità di specie per campionare accuratamente le zanzare coinvolte nella trasmissione. Al contrario, le analisi della competenza vettoriale vengono eseguite in un ambiente di laboratorio, consentendo un controllo rigoroso di parametri come la dose orale. Sebbene non pienamente in grado di rappresentare la vera complessità dell'infezione da zanzara e la capacità di trasmissione in un ambiente di campo, queste valutazioni di laboratorio rimangono potenti strumenti nel campo dell'arbovirologia.
Sulla base di varie analisi di competenza vettoriale con ZIKV in diverse specie di zanzare, popolazioni e metodi27,28,29,30,31,32,nonché di una recente revisione delle valutazioni della competenza vettoriale1,descriviamo qui molti dei protocolli associati a un tipico flusso di lavoro di competenza vettoriale. In questi esperimenti, tre popolazioni di Ae. aegypti provenienti dalle Americhe (la città di Salvador, Brasile; repubblica Dominicana; e la bassa valle del Rio Grande, TX, USA) sono state esposte a un singolo ceppo di ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) a 4, 5 o 6 log10 unità di focalizzazione (FFU) / mL dosi sotto forma di farine di sangue artificiali. Successivamente, sono stati analizzati per prove di infezione, infezione disseminata e competenza di trasmissione dopo vari periodi di incubazione estrinseca (2, 4, 7, 10 e 14 giorni) mediante dissezione e un test infettivo basato su colture cellulari. Sebbene l'attuale flusso di lavoro / protocolli sia ottimizzato per ZIKV, molti elementi sono direttamente traducibili in altri arbovirus trasmessi dalle zanzare nel contenimento degli artropodi e nei livelli di biosicurezza 2 e 3 (ACL / BSL2 o ACL / BSL3).
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Protocol
Tutte le procedure eseguite in questi protocolli sono state eseguite nel pieno rispetto dei protocolli approvati dall'Institutional Biosafety Committee e dall'Institutional Animal Care and Use Committee della University of Texas Medical Branch di Galveston.
1. Amplifica ZIKV nelle celle Vero
- Coltiva cellule Vero (CCL-81 o VeroE6) nella modifica di Dulbecco del mezzo essenziale minimo (DMEM) di Eagle integrato con il 10% v / v siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e l'1% (v / v) penicillina-streptomicina (100 U / mL e 100 μg / mL, rispettivamente) in un incubatore umidificato a 37 ° C con co5% con co 2 a una confluenza compresa tra 80-90% in un pallone di coltura tissutale di 150 cm2.
- In un armadio di biosicurezza (BSC), rimuovere il mezzo e smaltire in candeggina al 10% o in una diluizione di lavoro di doppio ammonio quaternario (Tabella dei materiali). Inoculare immediatamente il monostrato con 1 mL di stock virale, mirando a 0,1-1 particella virale infettiva per cellula. Agitare immediatamente il pallone in modo tale che l'inoculo entri in contatto con il monostrato nella sua interezza.
- Ricaricare il mezzo a un volume di 5 ml utilizzando DMEM integrato con FBS inattivato dal calore al 2% v / v e 1% (v / v) penicillina-streptomicina. Quindi spostare il pallone nell'incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 per 60 minuti.
- Rimuovere il pallone dall'incubatrice e portarlo in un BSC. Aggiungere ulteriore mezzo a un volume totale di 15 ml utilizzando DMEM integrato con FBS inattivato dal calore al 2% v / v e 1% (v / v) penicillina-streptomicina. Spostare il matraccio in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.
- Esaminare il pallone ogni giorno al microscopio a contrasto di fase per l'evidenza di effetti citopatici (CPE). Procedere alla raccolta virale (fase 1.7) quando solo circa il 40-50% delle cellule rimane nel monostrato, generalmente 3-5 giorni dopo la concentrazione a seconda del ceppo di ZIKV utilizzato.
- Aspirare il surnatante e metterlo in un flaconcino conico da 50 ml. Chiarire il surnatante dei detriti cellulari mediante centrifugazione (3.500 x g per 20 min).
NOTA: se più palloni sono stati infettati in modo identico, i supernatanti di più palloni possono essere combinati in tubi conici da 50 ml. - Rimuovere il surnatante dal tubo conico da 50 ml in uno fresco, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Integrare il surnatante con FBS inattivato dal calore ad una concentrazione finale del 30% (v/v). Aliquotare questa miscela in singoli tubi con tappo a vite e congelare a -80 °C fino all'uso.
2. Preparazione di farine di sangue artificiali
- Il giorno in cui le zanzare devono essere esposte a farina di sangue infettiva, accendere la fonte di energia (Tabella dei materiali) in un impianto di contenimento degli artropodi in modo tale che le unità di alimentazione ( Tabella deimateriali) siano preriscaldate nel momento in cui le zanzare sono preparate per l'esposizione.
- Preparare farine di sangue artificiali utilizzando uno dei metodi descritti di seguito.
- Metodo 1: Combinare sangue umano appena raccolto (entro una settimana) citrato o eparinizzato acquistato commercialmente 1:1 v/v con brodo virale (preparato come descritto nel paragrafo 1).
NOTA: Questo metodo è subordinato all'assenza di anticorpi contro la famiglia virus/virus presenti nel sangue. - Se l'assenza di anticorpi non può essere confermata o se la fonte di sangue è nota per avere una precedente esposizione al flavivirus, lavare e imballare manualmente gli eritrociti.
- In un BSC, aggiungere 30 mL di sangue umano intero a un tubo conico da 50 mL e rabboccare fino a 50 mL con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Centrifuga a 3.500 x g per 20 min.
- Aspirare il surnatante versando delicatamente in una vaschetta contenente candeggina al 10% o diluizione di lavoro di doppio ammonio quaternario, facendo attenzione a non scartare il pellet di eritrociti.
- Aggiungere 10 ml di PBS e picchiettare delicatamente il fondo del tubo conico contro il fondo del BSC in modo tale che il pellet di eritrociti sia stato ricostituito. Portare il volume della sospensione fino a 50 ml con PBS. Mescolare per inversione delicata.
- Ripetere i passaggi 2.2.2.1−2.2.2.4 per un totale di 4−6x. Confermare che il surnatante è chiaro o solo leggermente rosa e non più opaco. Rimuovere tutto il surnatante usando una pipetta sierologica. Sospendere il pellet di eritrociti in 1−2 ml di PBS.
- Assemblare la farina di sangue: 350 μL di eritrociti confezionati, 100 μL di saccarosio al 10%, 200 μL di FBS inattivato dal calore, ATP ricombinante da 900 μM e 2 ml di stock virale opportunamente diluito utilizzando DMEM integrato con FBS inattivato dal calore al 2% v / v e 1% (v / v) penicillina-streptomicina.
- Metodo 1: Combinare sangue umano appena raccolto (entro una settimana) citrato o eparinizzato acquistato commercialmente 1:1 v/v con brodo virale (preparato come descritto nel paragrafo 1).
- Sovrapporre un'unità serbatoio standard da 3 ml(Tabella dei materiali)con la pelle di un topo non infetto (altre opzioni includono film di paraffina, membrane collagenose o involucro di salsiccia).
- Posizionare il serbatoio coperto su asciugamani di carta bianca. Aggiungere ~ 2 mL di farina di sangue infettiva al serbatoio 1 mL alla volta. Ispezionare l'asciugamano sotto l'alimentatore per eventuali prove di perdite. Se sono presenti perdite, recuperare la farina di sangue dagli alimentatori e scartare le coperture. Sigillare gli alimentatori con tappi. Ancora una volta conferma che non sono presenti perdite.
3. Backtitration di farine di sangue/test della placca
- Utilizzando il volume rimanente della farina di sangue preparata, eseguire una serie di diluizioni seriali 10x (cioè 6 diluizioni, che vanno da diluito 10x a 1.000.000x) utilizzando DMEM integrato con FBS inattivato dal calore al 2% v / v e 1% (v / v) penicillina-streptomicina.
- Aliquota 100 μL delle diluizioni nei pozzetti di 24 o 12 piastre di pozzo dal più diluito al più concentrato.
- Incubare per 1 ora in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.
- Alla fine del periodo di incubazione di 1 ora, riportare le piastre nel BSC e aggiungere 1 mL o 2 mL di sovrapposizione di metilcellulosa alle piastre a 24 pozzetti o 12 pozzetti, corrispondentemente.
- Riposizionare le piastre sovrapposte in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 e incubare per 3-7 giorni (virus dipendente dal ceppo).
- Dopo l'incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatore e portarle nel BSC. Scartare la sovrapposizione di metilcellulosa in una vaschetta contenente il 10% di candeggina o un doppio disinfettante al ammonio quaternario.
- Lavare ogni pozzetto 2 volte con PBS, scartando il lavaggio in una teglia contenente il 10% di candeggina o doppio ammonio quaternario.
- Aggiungere ~1 mL di metanolo:acetone (1:1 v:v) e lasciare che le celle si fissino sulla piastra per almeno 30 minuti nel BSC a temperatura ambiente (RT). Scartare il metanolo: acetone secondo la politica istituzionale sui rifiuti organici.
- Visualizza ZIKV utilizzando uno dei due metodi descritti di seguito.
- Dopo la rimozione del metanolo: acetone, colorare immediatamente con una soluzione di cristallo viola (0,25% p/v in metanolo al 30%) per 5 minuti. Risciacquare 2 volte nell'acqua del rubinetto e lasciare asciugare, quindi visualizzare direttamente ad occhio per prove di placche o distruzione del monostrato.
- In alternativa, eseguire il test di formazione del focus.
- Lasciare asciugare le piastre all'aria fino a quando non rimane alcun fissativo organico.
NOTA: questo dovrebbe richiedere ~ 2-3 ore al di fuori del BSC, ma può essere accelerato dall'essiccazione all'aria in un BSC o in una cappa di fumi chimici. - Lavare ogni pozzetto 3 volte per 15 minuti ciascuno in PBS non sterile (Mg2+ e Ca2+ libero) su un bilanciere a piastra orbitale. Rimuovere PBS e aggiungere 1 mL di soluzione di blocco (PBS + 3% FBS) a ciascun pozzo e roccia per 15 minuti a RT.
- Aggiungere 100 μL per pozzetto di anticorpo primario α-ZIKV o α-flavivirus (ad esempio, ibridoma del gruppo flavivirus D1-4G2-4-15 [4G2]) a una diluizione 1:2.000 in soluzione bloccante. Incubare con dondolo per un minimo di 4 ore (preferibilmente durante la notte, non superiore a 18 ore) a RT.
- Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 3 volte per 15 minuti ciascuno con PBS (Mg2+ e Ca2+ libero) su un bilanciere a piastra orbitale.
- Aggiungere 100 μL per pozzetto dell'anticorpo secondario (capra α topo HRP-marcato) diluito 1:2.000 nel tampone bloccante. Incubare con dondolo per 1 ora a RT.
- Lavare 3 volte per 15 minuti ciascuno con PBS (Mg2+ e Ca2+ libero) su un bilanciere a piastra orbitale.
- Aliquota 100 μL di reagente per lo sviluppo del substrato (Tabella dei materiali) per pozzetto. Piastre di roccia a RT per 15 min.
- Arrestare la reazione allo sviluppo di focolai / placche rimuovendo il substrato e risciacquando le piastre 2 volte con acqua del rubinetto. Versare l'acqua del rubinetto e lasciare asciugare all'aria le piastre prima di quantificare.
- Contare i focolai virali per determinare il numero di FFU presenti nel campione dato.
- Lasciare asciugare le piastre all'aria fino a quando non rimane alcun fissativo organico.
4. Somministrazione di farine di sangue
- Usa le zanzare Ae. aegypti 2-4 giorni dopo l'eclosione. Ordinare le zanzare femmine in cartoni di cartone da 0,5 L con coperchi schermati e privarle di zucchero (generalmente 36-48 ore prima della farina di sangue infettiva). Fornire acqua ad libitum tramite batuffoli di cotone saturi d'acqua.
- Rimuovere i batuffoli di cotone saturi d'acqua al mattino in cui le zanzare saranno esposte alla farina di sangue infettiva.
- Collegare serbatoi contenenti farine di sangue artificiali ai cavi dell'unità di alimentazione all'interno di un vano portaoggetti di plastica trasparente.
- All'interno del vano portaoggetti, posizionare una scatola di cartone da 0,5 L con un coperchio schermato, contenente 50-100 zanzare Ae. aegypti affamate, sotto l'unità di alimentazione attaccata al serbatoio.
NOTA: le zanzare opportunamente affamate si nutrono generalmente entro 20 minuti. L'alimentazione può essere prolungata secondo necessità per aumentare le dimensioni del campione nelle popolazioni più lente, anche se questo non dovrebbe estendersi oltre i 60 minuti, perché il titolo virale (ZIKV) può diminuire all'interno dell'alimentatore dopo ~ 60 minuti. - Al termine dell'alimentazione, rimuovere il serbatoio e immergere nella candeggina al 10% appena fatta.
- Anestetizzare a freddo le zanzare mediante incubazione per 30 s a -20 °C o per 5 minuti in frigorifero.
- All'interno del vano portaoggetti, versare le zanzare in una capsula di Petri sul ghiaccio. Conta e ordina le femmine ingorgate dalle zanzare non impegnate. Smaltire le zanzare non innestate per immersione in un tubo conico da 50 ml riempito con etanolo al 70%. Mentre le zanzare sono ancora anestetizzate, versarle di nuovo nella scatola di cartone da 0,5 L e coprire rapidamente con lo schermo e il coperchio. Tagliare la rete dello schermo in eccesso dal cartone e fissare la rete con del nastro adesivo.
- Aggiungere un batuffolo di cotone saturo di saccarosio acquoso filtrato sterile al 10% sullo schermo di ciascuna scatola. Metti tutti i cartoni delle zanzare in un grande contenitore secondario di plastica con una spugna umida per mantenere l'umidità.
- Posizionare un contenitore secondario contenente cartoni di zanzare in un'incubatrice con una temperatura di 27 ± 1 °C (o a seconda dei casi per simulare le condizioni nella regione di interesse) con l'80% di ± il 10% di umidità relativa e un ciclo luce-buio 16:8). Mantenere le zanzare con accesso ad libitum al 10% di saccarosio fino al completamento degli esperimenti.
5. Acquisizione ed elaborazione del campione
- Nei giorni specificati dopo l'alimentazione, aspirare un numero predeterminato di zanzare dai cartoni appropriati utilizzando un aspiratore meccanico all'interno di un vano portaoggetti. Coprire il tubo di raccolta con un tondo di cotone dopo aver acquisito il numero richiesto di zanzare.
- Anestetizzare a freddo le zanzare mediante incubazione per 30 secondi a -20 °C o per 5 minuti a 4 °C.
- All'interno del vano portaoggetti, versare le zanzare in una capsula di Petri sul ghiaccio. Utilizzando due paia di pinze, rimuovere tutte e sei le zampe di ciascuna zanzara e posizionarle in un tubo microcentrifuga a fondo rotondo preetichettato da 2 mL contenente un cuscinetto a sfere in acciaio inossidabile sterilizzato (7/32 ") e 500 μL di mezzi di raccolta delle zanzare (MCM) composti da DMEM, 2% FBS, 1% penicillina-streptomicina e 2,5 μg / mL di amfotericina.
- Posizionare delicatamente la zanzara su una goccia di olio minerale per trattenerla, avendo cura di non permettere alcun contatto tra l'olio e la testa e la proboscide della zanzara.
- Inserire la proboscide della zanzara in una punta della pipetta da 10 μL riempita con 10 μL di FBS inattivato dal calore.
NOTA: In alternativa, la pipetta può essere riempita con saccarosio, sangue o olio minerale. L'olio consente la visualizzazione diretta delle bolle di saliva tramite microscopia ottica. - Lasciare salivare la zanzara per 30 minuti. Espellere la punta della micropipetta contenente FBS + saliva in un tubo di microcentrifuga contenente 100 μL di MCM, quindi posizionare la carcassa in un tubo microcentrifuga a fondo tondo da 2 mL separato contenente un cuscinetto a sfere in acciaio sterilizzato e 500 μL di MCM. Assicurarsi che i tubi utilizzati per i corpi, le gambe e la saliva siano etichettati in modo che sia chiaro che tutti e tre i campioni provengono dalla stessa zanzara.
- Mentre le zanzare stanno salivando, eseguire i passaggi 5.3-5.5 sulle zanzare rimanenti.
- Trasportare i tubi contenenti i corpi e le gambe a un dispositivo di omogeneizzazione del tessuto di fresatura di perline contenuto all'interno di un BSC. Triturare tutti i campioni del corpo e delle gambe a 26 Hz per 5 minuti per liberare particelle virali nel surnatante. Chiarire tutti i campioni mediante centrifugazione a 200 x g per 5 minuti a pellet detriti cellulari.
NOTA: A questo punto, i campioni possono essere congelati a -80 °C o analizzati immediatamente.
6. Rilevazione di ZIKV mediante test infettivo
- In un BSC, preparare 24 piastre di coltura tissutale con cellule Vero(10 5 cellule per pozzetto) 24 ore prima dell'inizio del test infettivo. Etichettare ogni pozzetto con l'identità di una singola zanzara/campione.
- Se i campioni sono stati congelati a -80 °C, lasciare scongelare.
- Rimuovere il supporto dalle piastre cellulari Vero prima dell'inoculazione con campioni una piastra alla volta.
- Per i campioni contenenti corpi o zampe, aliquotare accuratamente 100 μL di surnatante chiarificato in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non disturbare i detriti delle cellule di zanzara dal pellet.
NOTA: i campioni di saliva possono essere diluiti 1:1 (v/v) con MCM prima dell'inoculazione sulle cellule per conservare i campioni per una successiva titolazione, se necessario. - Spostare le piastre in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 e incubare per 1 ora.
- Riportare le piastre al BSC e aggiungere ~ 1 mL di copertura di metilcellulosa a ciascun pozzetto. Riposizionare le piastre sovrapposte in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 e incubare per 3-7 giorni (virus/ceppo-dipendente).
- Eseguire la fissazione e la visualizzazione come descritto nei passaggi 3.6-3.9.
- Per quanto riguarda il punteggio tramite un test di formazione del fuoco, quantificare i pozzetti positivi esaminando al microscopio ottico. Il rilevamento della colorazione intracitoplasmatica delle cellule in un pozzo indica la presenza di virus. I campioni vengono valutati esclusivamente come focus-positivi o -negativi.
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Representative Results
Tre popolazioni di Ae. aegypti provenienti dalle Americhe (Salvador, Brasile; Repubblica Dominicana; e la Valle del Rio Grande, TX, USA) sono state esposte a un ceppo epidemico di ZIKV dalle Americhe (ZIKV Mex 1-7, Stato del Chiapas, Messico, 2015) su una gamma di titoli di farina di sangue (4, 5 e 6 log10 FFU / mL) presentati in una farina di sangue artificiale a base di eritrociti umani lavati. Nei giorni 2, 4, 7, 10 e 14 postnfection, sottoinsiemi di zanzare sono stati elaborati per determinare l'infezione, la diffusione e i potenziali tassi di trasmissione.
A un titolo di farina di sangue di 4 log10 FFU/mL di ZIKV Mex 1−7, Ae. aegypti di Salvador, Brasile, è stato infettato a tassi del 12,5% e dell'11,1% dopo 4 e 14 giorni di incubazione estrinseca, rispettivamente, senza evidenza di infezionedisseminata osservatanelle gambe analizzate e nessun virus rilevato nella saliva ( Figura 1a ). L'aumento del titolo a 5 log10 FFU / mL ha comportato un aumento marginale dell'infettività con tassi del 22,2%, 33,3% e 22,2% nei giorni 4, 10 e 14 post-notifica, rispettivamente. Analogamente a quanto osservato nella coorte esposta a 4 log10 FFU/mL, non è stata osservata alcuna infezione diffusa o competenza di trasmissione in nessun momento (Figura 1b). Al titolo più alto esaminato (6 log10 FFU/mL) non sono state identificate infezioni dopo 2 giorni di incubazione, ma le infezioni sono state osservate in tutti gli altri punti temporali, con un picco dell'88,9% entro 10 giorni di incubazione estrinseca. ZIKV è stato rilevato nelle zampe delle zanzare esaminate a 10 e 14 giorni dopo la sezione (22,2% e 66,7%, rispettivamente), indicando che ZIKV si era diffuso nell'emocoel, sebbene lo ZIKV infettivo fosse stato osservato nella saliva in questi punti temporali (Figura 1c).
La popolazione di Ae. aegypti della Repubblica Dominicana si è dimostrata la più suscettibile all'infezione da ZIKV ed era competente per la trasmissione dopo l'esposizione a tutti i titoli di farina di sangue testati. Un certo livello di infezione è stato osservato in tutti i punti temporali a tutte e tre le dosi testate, con il tasso più basso osservato 2 giorni dopo la concentrazione a 4 log10 FFU/mL (25%) (Figura 1d). Con titoli di farina di sangue di 5 log10 e 6 log10 I tassi di infezione da FFU / mL hanno raggiunto il picco del 100%, con un'infezione del 100% osservata già a 4 giorni dopo la concentrazione nella popolazione di zanzare esposte a 6 log10 FFU / mL ZIKV (Figura 1e,f). Le zanzare alimentate con tutte e tre le dosi hanno dimostrato la disseminazione entro 7 giorni dopo la concentrazione, con un picco del 44,4%(4 log 10 FFU/mL, 14 giorni di post-iniezione), dell'88,9%(5 log 10 FFU/mL, 1 e 14 giorni di postnfezione) e del 100% (6 log10 FFU/mL, 10 giorni di post-iniezione). La competenza di trasmissione è stata osservata dopo tutte e tre le dosi (11,1%, 22,2% e 22,2% rispettivamente a 4, 5 e 6 log10 FFU/mL), ma solo dopo un periodo di incubazione estrinseca di 14 giorni (EIP) (Figura 1d−f).
La popolazione di Ae. aegypti della Valle del Rio Grande, TX, si è dimostrata relativamente refrattaria all'infezione da ZIKV. Le zanzare esposte a titoli di farina di sangue di 4 log10 FFU / mL, sono state infettate già 4 giorni dopo la notifica, con tassi di infezione tra il 22,2% e il 44,4%. Con queste condizioni di esposizione, sono state osservate infezioni disseminate a 14 giorni dopo la concentrazione ad un tasso dell'11,1% e non è stata osservata alcuna competenza di trasmissione (Figura 1g). Un aumento di dieci volte del titolo di farina di sangue ha prodotto un risultato in gran parte simile, con infezioni osservate a partire da 4 giorni dopo l'esposizione (33,3% e 44,4%), mentre infezioni disseminate sono state trovate dopo 14 giorni di incubazione estrinseca ad un tasso del 22,2% (Figura 1h). Infine, nella coorte esposta a una farina di sangue di 6 log10 FFU/mL, l'infezione è stata osservata a partire dal punto temporale di post-inflessione di 2 giorni (22,2%) e ha raggiunto picchi a 4, 10 e 14 giorni dopo la concentrazione (66,7%). Le infezioni disseminate in questa condizione hanno iniziato a essere osservate a 7 giorni dopo la concentrazione (11,1%) e hanno raggiunto il picco del 44,4% a 14 giorni dopo la riunione. Solo una singola zanzara (11,1%) è stata osservata in grado di trasmettere a 10 giorni dopo la concentrazione (Figura 1i).
Figura 1: Dati rappresentativi di competenza vettoriale di varie popolazioni di Ae. aegypti per ZIKV Mex 1−7. (a−c) Competenza vettoriale di Ae. aegypti di Salvador, Brasile (F2). (d−f) Competenza vettoriale di Ae. aegypti della Repubblica Dominicana (F6). (g−i) Competenza vettoriale di Ae. aegypti della Valle del Rio Grande, TX (F4). (a,d,g) Ae. aegypti esposto a 4 log10 FFU/mL di ZIKV Mex 1-7. (b,e,h) Ae. aegypti esposto a 5 log10 FFU/mL di ZIKV Mex 1-7. (c,f,i) Ae. aegypti esposto a 6 log10 FFU/mL di ZIKV Mex 1-7. In ogni momento (2, 4, 7, 10 e 14 giorni dopo la concentrazione) è stato raccolto e campionato un sottoinsieme di zanzare. I tassi di infezione, diffusione e trasmissione sono presentati come il numero di campioni positivi di carcasse / gambe / saliva rispetto al numero di zanzare analizzate in quel momento. Infezione rappresentata in blu, infezioni disseminate rappresentate in verde e velocità di trasmissione rappresentata in rosso. I dati in questa figura sono modificati da Roundy e Azar et al.32. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I metodi qui descritti forniscono un flusso di lavoro generalizzato per condurre analisi delle competenze vettoriali. Come quadro generale, molte di queste metodologie sono conservate in tutta la letteratura. Tuttavia, c'è un notevole spazio per le modifiche (recensito in Azar e Weaver1). Virus (ad esempio, lignaggio virale, conservazione del virus di sfida, storia di passaggio virale), entomologia (ad esempio, colonizzazione di laboratorio di popolazioni di zanzare, immunità innata, microbioma / viroma della zanzara) e variabili sperimentali (ad esempio, composizione della farina di sangue, alimentazione sequenziale del sangue e temperatura di incubazione) sono tutti noti per influenzare la competenza del vettore. La variabilità metodologica negli studi di competenza si è dimostrata problematica nel contesto dell'epidemia di ZIKV perché ha precluso meta-analisi formali1,33.
All'interno di questa metodologia generale, l'importanza della fame appropriata delle zanzare e del trucco della farina di sangue non può essere sopravvalutata. La disidratazione è nota per guidare il comportamento alimentare delle zanzare nei paradigmi di laboratorio34, sottolineando il valore della fame di zucchero e acqua prima di offrire una farina di sangue infettiva. Mentre la privazione di zucchero per 36-48 ore e acqua per 2-4 ore prima dell'esposizione alla farina di sangue è ben tollerata da Ae. aegypti, vale la pena notare che queste zanzare sono notoriamente facili da lavorare in condizioni di laboratorio2. Tali regimi aggressivi di fame potrebbero non essere altrettanto ben tollerati da altre specie di zanzare, richiedendo un certo grado di ottimizzazione interna. Allo stesso modo, il contenuto di farina di sangue può essere informato dalla preferenza dell'ospite. Ad esempio, l'uso del sangue umano per preparare una farina di sangue per zanzare antropofile come Ae. aegypti è del tutto appropriato, ma le farine di sangue umane fatte per specie ornitofile come Culex quinquefasciatus possono rivelarsi meno efficaci35. Inoltre, per quanto riguarda l'assemblaggio di farina di sangue, l'uso di emoderivati relativamente freschi è altamente consigliabile per ridurre al minimo l'emolisi degli eritrociti.
Uno dei maggiori limiti della valutazione della competenza vettoriale nel suo complesso e delle procedure qui descritte è che questi studi sono in gran parte limitati allo studio dei virus utilizzando zanzare che possono essere mantenute in condizioni di laboratorio. Ae. aegypti, mentre un vettore altamente rilevante per una moltitudine di agenti patogeni di importanza clinica, è anche una delle zanzare più facili da allevare e mantenere nelle colonie di laboratorio1,31,36,37. Non sorprende che la competenza delle popolazioni di Ae. aegypti sia spesso la più caratterizzata tra le zanzare vettori comuni2. Ciò è particolarmente problematico nel contesto degli arbovirus che mantengono sia i cicli di trasmissione enzootica che urbana38,39,40,poiché la competenza vettoriale è generalmente condotta solo nel contesto delle zanzare urbane più trattabili.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo lo staff del World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton e Divya Mirchandani, per il loro instancabile lavoro nel curare e fornire molti dei ceppi virali utilizzati per gli esperimenti di competenza vettoriale nostri e di altri gruppi. Il lavoro presentato è stato finanziato dal McLaughlin Fellowship Fund (SRA) e dalle sovvenzioni NIH AI120942 e AI121452.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3mL Standard Reservoir | R37P30 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| 7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls | 4RJH9 | Grainger | Grinding Media |
| Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case | A16-P4 | FisherScientific | Fixative |
| Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture | A6419-1G | MilliporeSigma | Reagent |
| Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 | MAB10216 | MilliporeSigma | Primary Antibody for focus forming assay |
| Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle | 5450-0011 | KPL/Seracare | Secondary Antibody for focus forming assay |
| Bleach | NC0427256 | FisherScientific | Decontamination |
| Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 | 10-126-34 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-740 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-91 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Crystal Violet | C0775-100G | MilliporeSigma | Stain |
| Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case | 05-402-7 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-70C | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-49A | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case | 13-675-20 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case | 13-675-15B | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case | 13-675-30 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case | 13-675-22 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | 08-772B | FisherScientific | Plastic consumable |
| Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL | S11150 | Atlanta Biologicals | Cell culture reagent |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | 12-550-A3 | FisherScientific | Immobilization of Mosquitos |
| FU1 Feeder | FU1-0 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; feeding units |
| Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles | 140-040-182 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle | 15-290-026 | Fisher Scientific | Cell culture reagent |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case | 15-140-163 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles | 25-200-114 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles | 11-965-118 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit | 7203706 | Lampire | Bloodmeal preparation |
| InsectaVac Aspirator | 2809B | Bioquip | Insectary Equipment |
| Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case | A412-4 | FisherScientific | Fixative |
| Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle | M0512-250G | MilliporeSigma | Cell culture reagent |
| Micro-chem Plus Disinfectant Detergent | C849T34 | Thomas Scientific | Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium |
| Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology | M5904-5X5ML | MilliporeSigma | Immobilization of Mosquitos |
| O-rings | OR37-25 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| Plastic Plugs | PP5-250 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| PS6 Power Unit (110-120V) | PS6120 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; power source |
| Rubis Forceps, Offset blades, superfine points | 4525 | Bioquip | Insectary Equipment |
| Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case | 50-809-242 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Sucrose, BioUltra, for molecular biology | 84097-250G | MilliporeSigma | Reagent |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case | 21-402-487 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-486 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-484 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-482 | FisherScientific | Plastic consumable |
| TissueLyser II | 85300 | QIAGEN | Homogenization |
| TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL | 5510-0030 | Seracare | Developing solution for focus forming assay |
| Vero | CCL-81 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
| Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] | CRL-1586 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
References
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