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Immunology and Infection

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

Published: May 31, 2020 doi: 10.3791/61112
Automatic Translation
1,2, 1,3,4
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

Summary

提示されたプロトコルは、封じ込めの設定で、ジカのような特定のウイルスに対する Aedes aegypti 蚊集団のベクター能力を決定することができる。

Abstract

提示された手順は、問題の蚊集団における感染率、播種感染、およびウイルスの潜在的な感染率を決定するために、実験室の条件下で Aedes aegypti 蚊をジカウイルスに感染させる一般的な方法論を記述する。これらの手順は、ベクター能力評価における様々な変更をグローバルに広く利用されています。彼らは、与えられた蚊(すなわち、種、集団、個体)が与えられた薬剤の伝達において果たす可能性のある役割を決定する上で重要である。

Introduction

ベクター能力は、種、集団、さらには個体のレベルでの能力として定義され、蚊、ダニ、またはフレボトミン砂飛のような与えられた節足動物の、節足動物1,2における複製または発生を伴う生物学的に薬剤を取得および伝達する。蚊および節足動物媒介ウイルス(すなわち、アルボウイルス)に関して、薬剤は雌の蚊によってビレミック宿主から浸透する。摂取後、ウイルスは、消化酵素によるタンパク質分解分解、微生物叢(ミドグ感染障壁、またはMIB)の存在、および分泌された腹膜マトリックスなどの様々な生理学的障害を克服し、中腸上皮細胞3の小集団の1つに生産的に感染しなければならない。中腸上皮の感染は、ウイルスの複製と最終的に蚊の開放的な循環系への中腸からの脱出、または中腸脱出障壁(MEB)を克服する播種感染の発症を表す血中リンパに続かなければならない。この時点で、ウイルスは二次組織(例えば、神経、筋肉、脂肪体)の感染を確立し、複製を続けることができますが、そのような二次複製は、ウイルスが唾液腺の体内細胞に感染する(唾液腺感染障壁を克服する)ために厳密に必要ではないかもしれません。唾液腺から補助的な空洞への出射口から唾液管への移動は、噛み付きの後続の宿主へのウイルスの接種を可能にし、伝達周期1、2、4、5、6、7を完了する。

このよく特徴づけられ、一般的に蚊ベクター内に広がるメカニズムが一般的に保存されていることを考えると、実験室のベクター能力評価はしばしば方法論的に類似しているが、プロトコルの違いは1,2である。一般的に、経口ウイルス暴露後、蚊は、ウイルス感染、播種感染、感染/潜在的なトランスリアル感染、および感染/潜在的な感染能力をそれぞれ8回受精させるため、中腸、脚、卵巣、唾液腺などの個々の組織をアッセイできるように解剖される。しかし、唾液腺にウイルスが存在することは、唾液腺脱出/出口バリア(SGEB)の証拠を与えられた1、2、4、5、7、9の伝達能力の決定的な証拠ではない。伝染能力を証明する標準的な方法は、感染の影響を受けやすい動物10、11、12への蚊の伝染のままである。しかし、多くのアルボウイルスでは、免疫不全マウスモデル13、14、15、16の使用が必要であることを考えると、この方法はしばしばコストが非常に高い。一般的に使用される代替手段は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)または感染性アッセイによって分析することができる蚊の唾液の採取であり、それぞれウイルスゲノムまたは感染性粒子の存在を実証する。このようなインビトロ唾液採取方法は、生体内給餌中に堆積したウイルスの量を12個過大評価または過小評価する可能性があり、そのようなデータは慎重に解釈しなければならないことを示している。しかし、インビトロ法は唾液中のウイルスの存在の観点から分析した場合に非常に価値が高く、感染の可能性を示す。

アルボウイルス性疾患の発生における蚊ベクターの役割を決定するための2つの主要なアプローチが存在する。最初の方法は、活動的な伝達18、19、20、21、22、23、24のコンテキストで蚊が収集されるフィールド監視を含みます。しかし、感染率が典型的には非常に低い(例えば、米国21の活動性ジカウイルス(ZIKV)循環地域における蚊の推定0.061%感染率)を考えると、潜在的な種の犯罪は、方法論25、26およびランダムな確率(例えば、1,600人の感染した個人をサンプリングする)によって大きく偏る可能性がある。.これを考慮して、特定の研究は、伝染に関与する蚊を正確にサンプリングするのに十分な生の数または種の多様性の両方で十分な蚊を獲得しない可能性があります。対照的に、ベクター能力分析は実験室で行われ、経口投与などのパラメータを厳密に制御することができます。蚊の感染と伝染能力の真の複雑さをフィールド環境で完全に表す能力はありませんが、これらの実験室評価はアーボビロ学の分野で強力なツールのままです。

いくつかの蚊種、集団、および方法27、28、29、30、31、32の様々なベクトル能力分析に基づいて、ベクター能力評価の最近のレビュー1、典型的なベクトル能力ワークフローに関連するプロトコルのいくつかをここで説明する。これらの実験では、南北アメリカ(サルバドール市、ブラジル、ドミニカ共和国、および米国の低リオグランデバレー、TX、米国)からの3つのAe.aegypti集団が、4、5、または6ログ10の焦点形成単位(FFU/m線量)でZIKV(Mex 1-7、GenBank加盟:KX247632.1)の単一株にさらされました。その後、外挿術の様々な時間(2、4、7、10、および14日間)の後に、解剖および細胞培養ベースの感染アッセイによって感染、播種感染、および伝染能力の証拠について分析した。現在のワークフロー/プロトコルはZIKV用に最適化されていますが、多くの要素は節足動物の封じ込めおよびバイオセーフティレベル2および3(ACL/BSL2またはACL/ BSL3)の他の蚊媒介性アルボウイルスに直接翻訳可能です。

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Protocol

これらのプロトコルで行われたすべての手順は、ガルベストンのテキサス大学医学部の機関バイオセーフティ委員会および制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに完全に準拠して実行されました。

1. VERO細胞でZIKVを増幅

  1. 10%v/v熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)と1%(v/v)ペニシリンストレプトマイシン(100 U/mLおよび100 μg/mL)を補ったイーグルの最小限の必須培地(DMEM)の変更でベロ細胞(CCL-81またはVeroE6)を成長させる それぞれ)150 cm2組織培養フラスコにおいて5%CO2を有する加湿された37°Cインキュベーターで、合流率80~90%の間に。
  2. バイオセーフティキャビネット(BSC)では、培地を取り出し、10%漂白剤または二重第四級アンモニウムのワーキング希釈(材料表)で処分する。1 mLのウイルスストックで即座に単層を接種し、細胞当たり0.1-1の感染性ウイルス粒子を目指します。接種物が単層全体に接触するように、フラスコを直ちに攪拌する。
  3. 2%v/v熱不活化FBS、および1%(v/v)ペニシリンストレプトマイシンを補ったDMEMを使用して、培地を5 mLのボリュームに上げてください。その後、フラスコを加湿した37°Cインキュベーターに5%CO2で60分間移動させます。
  4. インキュベーターからフラスコを取り出し、BSCに持ち込みます。2%v/v熱不活性化FBS、および1%(v/v)ペニシリンストレプトマイシンを補ったDMEMを使用して、合計体積15 mLに培地を追加します。フラスコを5%CO2の加湿37°Cインキュベーターに移します。
  5. 細胞性効果(CPE)の証拠について、相コントラスト顕微鏡で毎日フラスコを調べます。細胞の約40〜50%のみが単層に残っている場合はウイルス収穫(ステップ1.7)に進み、一般的に利用されているZIKVの菌株に応じて感染後3〜5日。
  6. 上清を吸引し、50 mLの円錐バイアルに入れる。遠心分離(3,500 x g) で細胞デブリの上清を明らかにする。
    注:複数のフラスコが同じように感染した場合、複数のフラスコの上澄み物を50 mLの円錐形チューブに組み合わせることができます。
  7. 50 mLの円錐形チューブから新鮮なチューブに上清を取り出し、ペレットを破壊しないように注意してください。熱不活化FBSで上清を30%(v/v)の最終濃度に補います。アリコートこの混合物を個々のスクリューキャップチューブにし、使用するまで-80°Cで凍結します。

2. 人工血液の調製

  1. 蚊が感染性の血液を受ける日には、蚊が曝露する準備が整うまでに、栄養ユニット(材料表)が予熱されるように、節足動物の封じ込め施設の電源(材料表)をオンにします。
  2. 以下に説明する方法の1つを用いて人工血液食事を調製する。
    1. 方法1:市販の1:1 v/vで購入した、採取したばかりの(1週間以内)、またはヘパリン化されたヒト血液をウイルスストック(セクション1に記載されているように調製)と組み合わせる。
      注:この方法は、血液中に存在するウイルス/ウイルスファミリーに対する抗体がないことに依存します。
    2. 抗体の不存在が確認できない場合、または血液源が以前のフラビウイルス暴露を有することが知られている場合は、赤血球を洗浄して手動でパックする。
      1. BSCでは、50 mLの円錐管に全ヒト血液の30 mLを加え、リン酸緩衝生理食塩基(PBS)で最大50mLを上げる。
      2. 20分間3,500 x g の遠心分離機。
      3. 上清を吸引するか、10%漂白剤を含むトレイパンにやさしく注ぐか、または二級アンモニウムの希釈を働かせ、赤血球ペレットを捨てないように注意する。
      4. PBSを10mL加え、赤血球ペレットが再構成されるようBSCの底部に対して円錐管の底部を軽くタップします。懸濁液の容積をPBSで50mLまで持って来なさい。優しい反転で混ぜます。
      5. ステップ 2.2.2.1-2.2.2.4 を合計 4-6x 繰り返します。上清が透明であるか、わずかにピンク色で不透明でなくなったことを確認します。血清ピペットを使用してすべての上清を除去します。1-2 mLのPBSで赤血球ペレットを再懸濁します。
      6. 血液を組み立てる:パック赤血球の350 μL、10%スクロースの100 μL、熱不活性化FBSの200 μL、900 μM組換えATP、およびDMEMを使用して適切に希釈されたウイルスストックの2 mLを2%v/vヒートインFBS、および1%(vペンコシン)ストリンスチンを組み立てます。
  3. 感染していないマウスの皮膚と標準3 mLリザーバユニット(材料表)を重ね合わせ(他のオプションには、パラフィン膜、コラーゲン膜、またはソーセージケーシングが含まれます)。
  4. 白いペーパータオルの上に覆われた貯水池を置きます。一度に1mLのリザーバに感染性の血液ミールの〜2 mLを加えます。フィーダーの下のタオルを点検して、漏れの証拠がないか確認します。漏れが存在する場合は、フィーダーから血液を回収し、カバーを廃棄します。フィーダーをプラグで密封します。リークが存在しない場合は、もう一度確認してください。

3. 血液の食/プラークアッセイのバックティトレーション

  1. 調製された血液ミールの残りの体積を使用して、DMEMを2%v/v熱不活性化FBS、および1%(v/v)ペニシリン・ストレプトマイシンを補って、10xシリアル希釈シリーズ(すなわち、希釈された10倍から1,000,000xまでの範囲の6つの希釈)を行う。
  2. 最も希薄から最も濃縮までの24または12ウェルプレートのウェルに希釈のアリコート100 μL。
  3. 37°C、5%CO2インキュベーターで1時間インキュベートする。
  4. 1時間のインキュベーション期間の終わりに、プレートをBSCに戻し、メチルセルロースオーバーレイの1mLまたは2mLを24ウェルまたは12ウェルプレートに追加します。
  5. オーバーレイされたプレートを37°C、5%CO2インキュベーターに戻し、3〜7日間インキュベートします(ウイルス株依存)。
  6. インキュベーターに続いて、インキュベーターからプレートを取り出し、BSCに持ち込む。メチルセルロースオーバーレイを10%漂白剤または二級四級アンモニウム消毒剤を含むトレイパンに捨てます。
  7. PBSで各ウェルを2倍洗い、10%漂白剤または二重四級アンモニウムを含むトレイパンに洗浄を捨てます。
  8. メタノール:アセトン(1:1 v:v)の〜1 mLを加え、細胞が室温(RT)でBSCで少なくとも30分間プレートに固定できるようにします。有機廃棄物に関する制度方針に従ってメタノール:アセトンを廃棄する。
  9. 以下に説明する 2 つの方法のいずれかを使用して、ZIKV を視覚化します。
    1. メタノール:アセトンの除去に続いて、5分間の結晶バイオレット溶液(0.25%w/v 30%メタノール中の0.25%w/v)ですぐに染色する。水道水で2倍をすすいで乾燥させ、プラークまたは単層の破壊の証拠を目で直接視覚化します。
    2. あるいは、フォーカス形成アッセイを行う。
      1. 有機固定剤が残らないまでプレートを空気乾燥させます。
        注:これはBSCの外に〜2-3時間かかるはずですが、BSCまたは化学発煙フードで空気乾燥することによって加速することができます。
      2. 軌道プレートロッカーで、各ウェルを15分間無菌PBS(Mg2+ およびCa2+ フリー)で洗浄します。PBSを取り除き、各ウェルに1mLのブロッキング溶液(PBS + 3%FBS)を加え、RTで15分間ロックします。
      3. α-ZIKVまたはα-フラビウイルス一次抗体(例えば、フラビウイルス群ハイブリドーマD1-4G2-4-15[4G2])のウェルあたり100 μLをブロッキング溶液に1:2,000希釈して添加します。RTで最低4時間(好ましくは一晩、18時間を超えない)のロッキングでインキュベートする。
      4. 一次抗体を取り出し、軌道プレートロッカーでPBS(Mg2+ およびCa2+ フリー)をそれぞれ15分間洗浄します。
      5. 2次抗体(ラットαマウスHRP標識)のウェルあたり100 μLを加えて、ブロッキングバッファーで1:2,000希釈します。RTで1時間ロッキングでインキュベートします。
      6. 軌道プレートロッカーにPBS(Mg2+ とCa2+ 無料)を使用して、それぞれ15分間3倍洗浄します。
      7. アリコート100 μLの基質開発試薬(材料表)1ウェルあたり。RTで15分間のロックプレート。
      8. 基質を取り除き、プレート2xを水道水ですすいで、病巣/プラークの発生時の反応を停止します。水道水を注ぎ、プレートを空気乾燥させてから定量化します。
      9. ウイルス病巣を数えて、与えられたサンプルに存在するFFUの数を決定する。

4. 献血の管理

  1. Ae.アエジプティ蚊は、エブロセクション後2〜4日使用してください。スクリーニングされた蓋を持つ0.5 L段ボールカートンにメスの蚊を分類し、砂糖を奪う(一般的に感染性の血液粉の前に36-48時間)。水飽和綿球を介してアドリビタム水を提供します。
  2. 蚊が感染性の血液粉にさらされる朝に水飽和綿のボールを取り除きます。
  3. 透明なプラスチック製のグローブボックス内の給餌ユニットリードに人工の血液を含む貯水池を取り付けます。
  4. グローブボックス内に、50-100の飢えた Ae.aegypti 蚊を含むスクリーニングされた蓋付きの0.5 L段ボールカートンを、貯水池に取り付けられた給餌ユニットの下に置きます。
    注:適切に飢えた蚊は、通常20分以内に餌を与えます。(ZIKV)ウイルス価が~60分後にフィーダー内で減少する可能性があるため、摂食は、遅い集団でサンプルサイズを増加させるために必要に応じて延長することができますが、これは60分を超えて伸びるべきではありません。
  5. 給餌が完了したら、リザーバーを取り出し、作りたての10%漂白剤に浸します。
  6. -20°Cで30s、または冷蔵庫で5分間インキュベーションして蚊を冷たい麻酔をします。
  7. グローブボックス内で、氷の上のペトリ皿に蚊を注ぎます。アンエンゴーグ蚊から魅惑的なメスを数え、並べ替えます。70%エタノールで満たされた50 mLチューブ円錐管に浸漬して、未エングールド蚊を処分する。蚊がまだ麻酔されている間、0.5 L段ボールカートンに戻し、すぐに画面と蓋で覆います。カートンの余分な画面メッシュをトリミングし、テープでメッシュを固定します。
  8. 各カートンのスクリーンに滅菌濾過10%のスクロースで飽和した綿球を加えます。湿度を維持するために湿ったスポンジと大きなプラスチック二次容器にすべての蚊のカートンを置きます。
  9. 蚊のカートンを含む二次容器を、相対湿度10 ±%、16:8の光:暗いサイクルで、温度27±1°C(または関心領域の条件をシミュレートするのに適切な場合)のインキュベーターに入れます。実験が完了するまで、10%のスクロースへの アドリビタム アクセスで蚊を維持します。

5. サンプルの取得と処理

  1. 指定された日のポスト給餌では、グローブボックス内の機械的吸引器を使用して適切なカートンから所定の数の蚊を吸引する。必要な数の蚊が獲得された後、綿を丸く収集管にキャップします。
  2. 蚊を-20°Cで30秒間、または4°Cで5分間潜伏して蚊を冷たい麻酔をします。
  3. グローブボックス内で、氷の上のペトリ皿に蚊を注ぎます。2組の鉗子を使用して、各蚊の脚6本すべてを取り除き、滅菌されたステンレス鋼のボールベアリング(7/32")と500μLの蚊収集メディア(MCM)を含む事前にラベル付けされた2 mL底マイクロ遠心分離チューブに入れます。
  4. 蚊をミネラルオイルの滴にそっと置いて抑制し、油と蚊の頭とプロボシスとの接触を許さないように注意してください。
  5. 10 μL の熱不活化 FBS を充填した 10 μL ピペットチップに蚊のプロボシスを挿入します。
    注:または、ピペットは、スクロース、血液、またはミネラルオイルで満たすことができます。オイルは軽い顕微鏡によって唾液泡の直接視覚化を可能にする。
  6. 蚊に30分間唾液を入れるようにします。FBS + 唾液を含むマイクロピペットチップを100 μLのMCMを含むマイクロ遠心分離管に排出し、滅菌されたスチールボールベアリングと500 μLのMCMを含む別の2 mLラウンドボトムマイクロ遠心チューブに死体を入れます。体、脚、唾液に使用されるチューブにラベルが付いていることを確認して、3つのサンプルすべてが同じ蚊から発生したものであることを確認します。
  7. 蚊が唾液を吐いている間に、残りの蚊にステップ5.3-5.5を実行します。
  8. ボディと脚を含むチューブをBSC内に含まれるビーズの粉砕組織均質化装置に輸送する。ウイルス粒子を上清に解放するために、26 Hzですべての体と脚のサンプルを5分間トリチュレートします。細胞の破片をペレットに5分間200 x g で遠心分離してすべてのサンプルを明らかにする。
    注:この時点で、サンプルは-80°Cで凍結するか、すぐにアッセイすることができます。

6. 感染アッセイによるZIKVの検出

  1. BSCでは、感染性アッセイの発症前に、ベロ細胞(ウェルあたり105 細胞あたり10個の細胞)を用いて24の組織培養プレートを調製する。各々のラベルには、単一の蚊/サンプルのアイデンティティが付いています。
  2. サンプルを-80°Cで凍結した場合は、解凍を行う。
  3. 一度に1プレートずつサンプルを接種する前に、ベロ細胞プレートから培地を取り出します。
  4. 体や脚を含むサンプルの場合、ペレットから蚊の細胞の破片を邪魔しないように注意して、各ウェルに清澄化上清の100 μLを慎重にアリコートします。
    注:唾液サンプルは、必要に応じて、後の滴定のためにサンプルを保存するために細胞に接種する前にMCMで1:1(v/v)希釈することができます。
  5. プレートを37°C、5%CO2インキュベーターに移動し、1時間インキュベートします。
  6. プレートをBSCに戻し、各ウェルにメチルセルロースオーバーレイの〜1 mLを追加します。オーバーレイしたプレートを37°C、5%CO2インキュベーターに戻し、3-7日間インキュベートします(ウイルス/歪み依存)。
  7. ステップ 3.6-3.9 の説明に従って、固定と視覚化を実行します。
  8. 焦点形成アッセイによる採点に関しては、光顕微鏡で検査することで正のウェルを定量化する。ウェル内の細胞の細胞内染色の検出は、ウイルスの存在を示す。サンプルは、フォーカスポジティブまたは-負としてスコア付けされます。

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Representative Results

Aeの3つの集団。 アメリカ大陸(サルバドール、ブラジル、ドミニカ共和国、およびリオグランデバレー、TX、米国)からの aegypti は、血液をベースにした血液中のチター(4、5、および6ログ10 FFU/mL)の範囲にわたって、アメリカ大陸(ZIKV Mex 1-7、チアパス州、メキシコ、2015)からのZIKVの発生株にさらされました。2日目、4日目、7日目、10日目、14日目に、蚊のサブセットを処理して感染、播種、および潜在的な伝染率を決定した。

ZIKV Mex 1-7の4ログ10 FFU/mLの血中タイターでは、サルバドールのAe.aegyptiは、4日と14日間の外挿インキュベーションの後、それぞれ12.5%と11.1%の割合で感染し、相感染の証拠はなく、ウイルスは検出されなかった。力価を5ログ10 FFU/mLに増加させると、4日目、10日、14日目にそれぞれ22.2%、33.3%、22.2%の感染率で感染率がわずかに増加しました。4ログ10 FFU/mLに曝露されたコホートで観察されたものと同様に、どの時点でも感染や伝染能力が認められなかった(図1b)。最も高い検査力器(6ログ10 FFU/mL)では2日間の潜伏後に感染は認められなかったが、他のすべての時点で感染は観察され、外挿潜伏の10日間で88.9%をピークにした。ZIKVは、感染後10日および14日(それぞれ22.2%および66.7%)で検査された蚊の足(それぞれ22.2%および66.7%)で検出され、これらの時点で唾液中に感染性ZIKVが観察されたが、ジKVがヘモコエルに播種したことを示す(図1c)。

ドミニカ共和国からのAe.aegyptiの人口は、ZIKV感染の最も感受性が証明され、すべてのテストされた血中性器への暴露後に有能な伝染であった。感染のいくつかのレベルは、3つの試験用量すべてにおいてすべての時点で全ての時点で観察され、最も低い率は4ログ10 FFU/mL(25%)で感染後2日間観察された(図1d)。5ログ10と6ログ10の血液量体感染率は100%でピークに達し、感染率は100%でピークに達し、100%の感染は6ログ10ログ10 FFU/mL ZIKVにさらされた蚊の集団で感染後早々に4日観察された(図1e、f)。3回の投与はすべて感染後7日間の播精を示し、44.4%(4ログ10 FFU/mL、14日後感染)、88.9%(5ログ10 FFU/mL、1および14日の感染後)、100%(6ログ10 FFU/mL、10日の感染後)透過能力は、3回の投与(それぞれ4、5、6ログ10 FFU/mLで11.1%、22.2%、22.2%)の後に観察されたが、14日間の外挿潜伏期間(EIP)に続くだけである(図1d-f)。

リオグランデ渓谷(TX)のAe.aegyptiの人口は、ZIKV感染に比較的難治性であることが判明した。4ログ10 FFU/mLの血中科力器にさらされた蚊は、感染後早ければ4日間に感染し、感染率は22.2%から44.4%であった。これらの暴露条件では、感染後14日間で11.1%の割合で播種感染が観察され、伝染能力は認められなかった(図1g)。血中科用タイターの10倍の増加は、曝露後4日後(33.3%および44.4%)から感染が観察され、22.2%の割合で外挿潜伏の14日後に感染が見つかった(図1h)最後に、6ログ10 FFU/mLの血中粉にさらされたコホートでは、感染は2日の感染後の時点(22.2%)から始まり、感染後4、10、および14日(66.7%)でピークに達した。この状態での播種感染は、感染後7日間(11.1%)で観察され始め、感染後14日で44.4%でピークに達した。単一の蚊(11.1%)のみが、感染後10日で伝染可能であることが観察された(図1i)。

Figure 1
図1:ZIKV Mex 1-7の様々なAe.aegypti集団の代表的なベクトル能力データ。(a -c) ブラジルのサルバドールからのAe. aegypti のベクトル能力 (F2).(d-f)ドミニカ共和国からのAe.aegyptiのベクトル能力(F6)。(g-i)リオグランデ渓谷からのAe.aegyptiのベクトル能力、TX(F4)。(a,d,g)Ae. aegyptiは、ZIKV メックスの 4 つのログ10 FFU/mL に曝露しました 1-7.(b,e,h)Ae. aegyptiは ZIKV メックス 1-7 の 5 ログ10 FFU/mL にさらされました。(c,f,i)Ae. aegyptiは、ZIKV メックスの 6 ログ10 FFU/mL に曝露しました。各時点(2、4、7、10、および14日後感染後)に、蚊のサブセットを採取し、サンプリングした。感染、播種、および伝染率は、その時点でアッセイされた蚊の数に対する陽性死体/脚/唾液サンプルの数として提示される。青色で表される感染、緑色で表される感染の普及、および赤色で表される感染率。この図のデータは、丸みとAzarららから変更されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ここで説明する方法は、ベクトル能力分析を行う一般化されたワークフローを提供します。一般的な枠組みとして、これらの方法論の多くは文献全体に保存されています。しかし、変更の余地は大きくあります(AzarとWeaver1でレビュー)。ウイルス(例えば、ウイルス系統、チャレンジウイルスの保存、ウイルス通過歴)、昆虫学(例えば、蚊集団の実験室コロニー形成、先天性免疫、蚊の微生物叢/ビローム)、および実験変数(例えば、血中粉組成物、順次血液供給、およびインキュベーション温度)は、すべてベクター能力に影響を及ぼすと知られている。それは正式なメタ分析を排除しているので、能力研究の方法論的変動は、ZIKVの流行の文脈で問題を証明している1,33.

この一般的な方法論の中で、蚊と血粉のメイクアップの適切な飢餓の重要性は誇張することはできません。脱水は、感染性の血液を提供する前に砂糖と水の飢餓の価値を強調し、実験室のパラダイム34で蚊の血液供給行動を駆動することが知られています。36~48時間の砂糖の剥奪は、血中粉への暴露前に2~4時間の水が十分に許容 されますが、これらの蚊は実験室の条件2で働きやすい悪名高いということは注目に値します。このような積極的な飢餓レジメンは、他の蚊種によってほとんど容認されない可能性があり、ある程度の社内最適化が必要です。同様に、血液中身は宿主好により通知され得る。例えば 、Ae.aegypti のような人類学者用蚊のための血液を調製するために人間の血液を使用することは完全に適切であるが 、Culex quinquefasciatus のような鳥類性種のために作られたヒトの血液食事はあまり効果的ではない35を証明するかもしれない。さらに、血中体組立に関しては、比較的新鮮な血液製剤の使用は、赤血球の血化を最小限に抑えることが非常に推奨される。

ベクター能力評価全体の最大の制限の1つと本明細書に記載されている手順は、これらの研究は、主に実験室の条件で維持することができる蚊を使用してウイルスを調査することに限定されることである。Ae. aegyptiは、臨床的に重要な多数の病原体に対して非常に関連性の高いベクターである一方で、実験室コロニー1、31、36、37で飼育および維持する最も容易な蚊の1つでもある。当然のことながら、Ae.aegypti集団の能力は、多くの場合、一般的なベクター蚊の中で最も特徴づけられる最も優れています2.これは、一般的に、より難しい都市蚊の文脈でのみベクター能力が行われるため、エンズーティックおよび都市透過サイクル38、39、40の両方を維持するアルボウイルスの文脈で特に問題となる。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

我々は、新興ウイルスおよびアルボウイルスのための世界参照センター(WRCEVA):ロバート・テッシュ博士、ヒルダ・グスマン、ケネス・プランテ博士、ジェシカ・プランテ博士、ディオンナ・シャルトン、ディヴィヤ・ミルチャンダニ博士が、私たちの他のグループのベクター能力実験に使用されるウイルス株の多くをキュレーションし、提供するたゆまぬ努力をしていることを認めます。提示された作品は、マクラフリン・フェローシップ・ファンド(SRA)とNIH助成金AI120942とAI121452によって資金提供されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

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References

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免疫学と感染症 問題 159 蚊 ベクター能力 Aedes Aedes aegypti アルボウイルス ジカ
ジカウイルスを用いた <em>Aedes aegypti蚊の</em> ベクターコンピテンス分析
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Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).

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