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Immunology and Infection

वेक्टर क्षमता जीका वायरस का उपयोग कर एडीज एजिप्टी मच्छरों पर विश्लेषण

Published: May 31, 2020 doi: 10.3791/61112
Automatic Translation
1,2, 1,3,4
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

Summary

प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक रोकथाम सेटिंग में Zika जैसे दिए गए वायरस के लिए एडीज एजिप्टी मच्छर आबादी की वेक्टर क्षमता निर्धारित कर सकता है ।

Abstract

प्रस्तुत प्रक्रियाओं में संक्रमण की दर, प्रसारित संक्रमण, और प्रश्न में मच्छरों की आबादी में वायरस के संभावित संचरण का निर्धारण करने के लिए प्रयोगशाला की स्थितियों के तहत जीका वायरस के साथ एडीज एजिप्टी मच्छरों को संक्रमित करने के लिए एक सामान्यीकृत पद्धति का वर्णन किया गया है । इन प्रक्रियाओं का व्यापक रूप से विश्व स्तर पर वेक्टर क्षमता मूल्यांकन में विभिन्न संशोधनों के साथ उपयोग किया जाता है। वे संभावित भूमिका का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण हैं कि किसी दिए गए मच्छर (यानी, प्रजातियां, जनसंख्या, व्यक्ति) किसी दिए गए एजेंट के संचरण में खेल सकते हैं।

Introduction

वेक्टर क्षमता को प्रजातियों, जनसंख्या और यहां तक कि एक व्यक्ति के स्तर पर क्षमता के रूप में परिभाषित किया गया है, जैसे मच्छर, टिक, या फ्लेबोटोमाइन रेत फ्लाई, आर्थ्रोपोड1,2में प्रतिकृति या विकास के साथ जैविक रूप से एक एजेंट को प्राप्त करने और संचारित करने के लिए। मच्छरों और आर्थ्रोपोड-जनित वायरस (यानी, आर्बोवायरस) के संबंध में, एजेंट को मादा मच्छर द्वारा एक विरेमिक होस्ट से आत्मसात किया जाता है। घूस के बाद, वायरस को मिडगुट एपिथेलियल कोशिकाओं 3 की एक छोटी आबादी में से एक को उत्पादक रूप से संक्रमित करना चाहिए, पाचन एंजाइमों द्वारा प्रोटियोलिटिक क्षरण, माइक्रोबायोटा (मिडगुट संक्रमण बाधा, या एमआईबी) की उपस्थिति और स्रावित पेरिट्रोफिक मैट्रिक्स जैसी विभिन्न शारीरिक बाधाओं परकाबूपाना चाहिए। मिडगुट एपिथेलियम के संक्रमण के बाद वायरस की प्रतिकृति और अंततः मच्छर की खुली संचार प्रणाली, या हीमोलिम्फ में मिडगुट से बच जाना चाहिए, जो मिडगुट एस्केप बैरियर (एमईबी) पर काबू पाने वाले प्रसारित संक्रमण की शुरुआत का प्रतिनिधित्व करता है। इस बिंदु पर वायरस माध्यमिक ऊतकों (जैसे, नसों, मांसपेशियों, और वसा निकायों) के संक्रमण को स्थापित कर सकता है और दोहराने के लिए जारी रख सकता है, हालांकि लार ग्रंथियों (लार ग्रंथि संक्रमण बाधा पर काबू पाने) की acinar कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस तरह के माध्यमिक प्रतिकृति वायरस के लिए सख्ती से आवश्यक नहीं हो सकता है। लार ग्रंथि से कोशिकाओं को उनके एपिकल गुहाओं में ले जाते हैं और फिर लार वाहिनी में आवाजाही करने से वायरस का टीका काटने पर बाद के मेजबानों में होता है और संचरणचक्र 1 ,2, 4,5,6,7को पूराहोताहै ।

मच्छर वेक्टर के भीतर प्रसार के इस अच्छी तरह से विशेषता और आम तौर पर संरक्षित तंत्र को देखते हुए, प्रयोगशाला वेक्टर क्षमता मूल्यांकन अक्सर पद्धति से समान होते हैं, हालांकि प्रोटोकॉल में अंतर1,2मौजूद है। आम तौर पर, मौखिक वायरस के संपर्क में आने के बाद, मच्छरों को विच्छेदित किया जाता है ताकि मिडगट, पैर, अंडाशय या लार ग्रंथियों जैसे व्यक्तिगत ऊतकों को वायरल संक्रमण, प्रसारित संक्रमण, प्रसारित संक्रमण/संभावित ट्रांसोवेरियल ट्रांसमिशन, और प्रसारित संक्रमण/संभावित संचरण क्षमता, क्रमशः8के लिए किया जा सके । लार ग्रंथियों में एक वायरस की उपस्थिति, हालांकि, संचरण क्षमता का निश्चित सबूत नहीं है, कुछ वेक्टर/वायरस संयोजनों में लार ग्रंथि से बचने/एग्रेस बैरियर (एसजीईबी) के सबूत दिए गए हैं1,2,4,5,7, 9। संचरण क्षमता को सिद्ध करने की मानक विधि 10,11 ,12अतिसंवेदनशील पशुओं में मच्छरों का संचरणरहताहै . हालांकि, यह देखते हुए कि कई आर्बोवायरस के लिए यह इम्यूनोसमझौतामुरीन मॉडल13, 14,15,16के उपयोग की आवश्यकता है, यह विधि अक्सर लागत-निषेधात्मक होती है। आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला विकल्प मच्छर लार का संग्रह है, जिसका विश्लेषण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) या वायरल जीनोम या संक्रामक कणों की उपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए एक संक्रामक परख द्वारा किया जा सकता है। यह देखने लायक है कि इस तरह के इन विट्रो लार संग्रह विधियों12 अधिक अनुमान लगा सकते है या17 वायरस की मात्रा को कम आंकना विवो खिला में के दौरान जमा, यह दर्शाता है कि इस तरह के डेटा सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए । बहरहाल, इन विट्रो विधि अत्यधिक मूल्यवान है जब लार में वायरस की मात्र उपस्थिति के नजरिए से विश्लेषण किया, संचरण क्षमता का संकेत है ।

आर्बोवायरल रोग फैलने में मच्छर वैक्टर की भूमिका निर्धारित करने के लिए दो प्रमुख दृष्टिकोण मौजूद हैं। पहली विधि में क्षेत्र निगरानी शामिल है, जिसमें सक्रिय संचरण18, 19,20, 21, 22,23,24केसंदर्भ में मच्छरों को एकत्र कियाजाताहै। हालांकि, यह देखते हुए कि संक्रमण की दर आम तौर पर काफी कम होती है (उदाहरण के लिए, संयुक्त राज्य अमेरिका में सक्रिय जीका वायरस (ZIKV) परिसंचरण के क्षेत्रों में मच्छरों की अनुमानित०.०६१%संक्रमण दर 21), संभावित वेक्टर प्रजातियों का अपराध पद्धति25,26 और यादृच्छिक मौका (उदाहरण के लिए, 1,600 असंक्रमितव्यक्ति से बाहर एक का नमूना लेने से भारी पक्षपाती हो सकता है) . इसे ध्यान में रखते हुए, दिए गए अध्ययन से संचरण में शामिल मच्छरों का सही नमूना लेने के लिए कच्चे नंबरों या प्रजातियों की विविधता दोनों में पर्याप्त मच्छर प्राप्त नहीं हो सकते हैं। इसके विपरीत, वेक्टर क्षमता विश्लेषण एक प्रयोगशाला सेटिंग में किए जाते हैं, जिससे मौखिक खुराक जैसे मापदंडों पर सख्त नियंत्रण की अनुमति होती है। हालांकि एक क्षेत्र की स्थापना में मच्छर संक्रमण और संचरण क्षमता की सही जटिलता का प्रतिनिधित्व करने में पूरी तरह से सक्षम नहीं है, ये प्रयोगशाला आकलन arbovirology के क्षेत्र में शक्तिशाली उपकरण बने हुए हैं।

मच्छरों की कई प्रजातियों, आबादी औरतरीकों27, 28, 29,30,31,32में ZIKV के साथ विभिन्न वेक्टर क्षमता विश्लेषण के आधारपर,साथ ही वेक्टर क्षमता आकलन की हाल ही में समीक्षा1,हम यहां एक विशिष्ट वेक्टर क्षमता कार्यप्रवाह से जुड़े कई प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इन प्रयोगों में, अमेरिका (साल्वाडोर शहर) से तीन एई. एजिप्टी आबादी, ब्राजील; डोमिनिकन गणराज्य; और निचले रियो ग्रांडे वैली, TX, यूएसए) को कृत्रिम रक्तमेलों के माध्यम से 4, 5, या 6 लॉग10 फोकस-फॉर्मिंग यूनिट्स (FFU) /mL खुराक पर ZIKV (Mex 1-7, GenBank परिग्रहण: KX247632.1) के एक तनाव के संपर्क में थे । बाद में, विच्छेदन और सेल संस्कृति आधारित संक्रामक परख के माध्यम से बाह्य इनक्यूबेशन (2, 4, 7, 10 और 14 दिनों) के विभिन्न समयों के बाद संक्रमण, प्रसारित संक्रमण और संचरण क्षमता के सबूतों के लिए उनका विश्लेषण किया गया। यद्यपि वर्तमान वर्कफ्लो/प्रोटोकॉल ZIKV के लिए अनुकूलित हैं, कई तत्व सीधे आर्थ्रोपोड रोकथाम और जैवसंवाही स्तर 2 और 3 (एसीएल/बीएसएल2 या एसीएल/बीएसएल 3) में अन्य मच्छर जनित आर्बोवायरस में अनुवाद योग्य हैं।

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Protocol

इन प्रोटोकॉलों में की गई सभी प्रक्रियाओं को संस्थागत जैव सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल और गैलवेस्टन में टेक्सास चिकित्सा शाखा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के पूर्ण अनुपालन में किया गया था।

1. वेरो कोशिकाओं में ZIKV बढ़ाना

  1. ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (डीएमईएम) के Dulbecco के संशोधन में वेरो कोशिकाओं (सीसीएल-81 या वेरो 6) को 10% v/v हीट-निष्क्रिय भ्रूण बोविन सीरम (एफबीएस) और 1% (v/v) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमीसिन (100 यू/स्ट्रेप्टोमामाइसिन और 100 μg/mL, के साथ पूरक किया गया क्रमशः) एक आर्द्रीकृत 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के साथ 150 सेमी 2 ऊतक संस्कृति फ्लास्क में 80−90% की मजबूती के बीच।
  2. एक जैवसेफ्टी कैबिनेट (बीएससी) में, माध्यम को हटा दें और या तो 10% ब्लीच या दोहरी क्वाटरेरी अमोनियम(सामग्री की तालिका) केकाम में पतला करें। तुरंत वायरल स्टॉक के 1 मिलील के साथ मोनोलेयर टीका, प्रति सेल 0.1−1 संक्रामक वायरल कण के लिए लक्ष्य। फ्लास्क को तुरंत इस तरह उत्तेजित करें कि इनोकुलम मोनोलेयर को अपनी संपूर्णता में संपर्क करता है।
  3. डीएमईएम का उपयोग करके 5 एमएल की मात्रा तक माध्यम को ऊपर करें 2% v/v हीट-इनएक्टिवेटेड एफबीएस के साथ पूरक, और 1% (v/v) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन। फिर फ्लास्क को 60 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ आर्द्रीकृत 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ले जाएं।
  4. इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालकर बीएससी में लाएं। 2% v/v हीट-इनएक्टिवेटेड एफबीएस, और 1% (v/v) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक डीएमईएम का उपयोग करके 15 एमएल की कुल मात्रा में अतिरिक्त माध्यम जोड़ें । फ्लास्क को 5% सीओ2के साथ एक आर्द्रीकृत 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ले जाएं।
  5. साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) के साक्ष्य के लिए फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के तहत रोजाना फ्लास्क की जांच करें। वायरल फसल (चरण 1.7) पर आगे बढ़ें जब केवल लगभग 40−50% कोशिकाएं मोनोलेयर में रहती हैं, आम तौर पर ZIKV के तनाव के आधार पर 3−5 दिन बाद उपयोग किया जा रहा है।
  6. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और 50 एमएल शंकुशील शीशी में रखें। अपकेंद्रित्र (20 मिनट के लिए 3,500 x ग्राम) द्वारा सेलुलर मलबे के सुपरनेट को स्पष्ट करें।
    नोट: यदि कई फ्लास्क समान रूप से संक्रमित थे, तो कई फ्लास्क से सुपरनेटैंट को 50 एमएल शंकु ट्यूबों में जोड़ा जा सकता है।
  7. 50 एमएल शंकु नली से एक ताजा करने के लिए सुपरनैंट निकालें, ध्यान रखना कि गोली को बाधित न करें। 30% (v/v) की अंतिम एकाग्रता के लिए गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस के साथ सुपरनैंट पूरक। इस मिश्रण को व्यक्तिगत स्क्रू कैप ट्यूबों में डालें और उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।

2. कृत्रिम रक्तमील की तैयारी

  1. जिस दिन मच्छरों को संक्रामक रक्तमेलों के संपर्क में आना होता है, एक आर्थ्रोपोड रोकथाम सुविधा में बिजली स्रोत(सामग्री की तालिका)को चालू करें ताकि मच्छरों के जोखिम के लिए तैयार होने के समय तक भोजनइकाइयों (सामग्रियों की तालिका)पहले से गरम हो।
  2. नीचे वर्णित तरीकों में से एक का उपयोग करके कृत्रिम रक्तमील तैयार करें।
    1. विधि 1: ताजा काटा (एक सप्ताह के भीतर) citrated या heparinized मानव रक्त वायरल स्टॉक के साथ व्यावसायिक रूप से खरीदा 1:1 v/v (धारा 1 में वर्णित के रूप में तैयार) गठबंधन ।
      नोट: यह विधि वायरस/वायरस परिवार के लिए किसी भी एंटीबॉडी की अनुपस्थिति पर आकस्मिक है रक्त में मौजूद किया जा रहा है ।
    2. यदि एंटीबॉडी की अनुपस्थिति की पुष्टि नहीं की जा सकती है या रक्त स्रोत को पूर्व फ्लेविवायरस एक्सपोजर, धोने और मैन्युअल रूप से एरिथ्रोसाइट्स पैक करने के लिए जाना जाता है।
      1. बीएससी में, 50 एमएल शंकु नली में पूरे मानव रक्त के 30 एमएल जोड़ें और फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ 50 एमएल तक ऊपर करें।
      2. 20 मिनट के लिए 3,500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
      3. अधिष्ठाता या तो धीरे से एक ट्रे पैन में डालने के द्वारा या तो 10% ब्लीच या दोहरी क्वाटरेरी अमोनियम के काम कमजोर पड़ने से, एरिथ्रोसाइट गोली त्यागने के लिए नहीं ध्यान रखते हुए ।
      4. पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें और धीरे से बीएससी के नीचे के खिलाफ शंकुदाता ट्यूब के नीचे नल इस तरह है कि एरिथ्रोसाइट गोली का पुनर्गठन किया गया है । पीबीएस के साथ 50 एमएल तक सस्पेंशन की मात्रा लाएं। कोमल उलटा द्वारा मिलाएं।
      5. कुल 4−6x के चरण 2.2.2.1−2.2.2.4 दोहराएं। पुष्टि करें कि सुपरनैंट स्पष्ट है या केवल थोड़ा गुलाबी है और अब अपारदर्शी नहीं है। सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सभी सुपरनेट निकालें। पीबीएस के 1−2 एमएल में एरिथ्रोसाइट पेलेट को फिर से रीसस्ट करें।
      6. रक्तमील को इकट्ठा करें: पैक एरिथ्रोसाइट्स के 350 माइक्रोन, 10% सुक्रोज के 100 माइक्रोन, हीट-इनएक्टिवेटेड एफबीएस के 200 माइक्रोन, 900 माइक्रोन रीकॉम्बिनेंट एटीपी, और डीएमईएम का उपयोग करके उचित रूप से पतला वायरस स्टॉक का 2 एमएल 2% v/v हीट-इनएक्टिवेटेड एफबीएस, और 1% (v/v) पेनिसिलिन-स्ट्रीप्टॉमीसिन के साथ पूरक है।
  3. एक असंक्रमित माउस की त्वचा के साथ एक मानक 3 एमएल जलाशय इकाई(सामग्री की तालिका)ओवरले (अन्य विकल्पों में पैराफिन फिल्म, कोलेजनस झिल्ली, या सॉसेज आवरण शामिल हैं)।
  4. कवर्ड जलाशय को सफेद कागज के तौलिए पर रखें। जलाशय में संक्रामक रक्तमील के ~ 2 एमएल जोड़ें 1 समय में 1 एमएल। रिसाव के किसी भी साक्ष्य के लिए फीडर के नीचे तौलिया का निरीक्षण करें। यदि लीक मौजूद हैं, तो फीडरों से ख़ून को ठीक करें और कवर को त्याग दें। प्लग के साथ फीडर सील। एक बार फिर इस बात की पुष्टि करते हैं कि कोई लीक मौजूद नहीं है ।

3. रक्तमील/पट्टिका परख का बैकटिट्रेशन

  1. तैयार ख़ून की शेष मात्रा का उपयोग करके, डीएमईएम का उपयोग करके 10x धारावाहिक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला (यानी 6 तनुशन, पतला 10x से 1,000,000x) का उपयोग करके डीएमईएम का उपयोग करके 2% v/v हीट-इनएक्टिवेटेड एफबीएस, और 1% (v/v) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टॉमीसिन का उपयोग करें।
  2. सबसे पतला से सबसे केंद्रित करने के लिए 24 या 12 अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं में कमजोर पड़ने के 100 μL Aliquot।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर।
  4. 1 घंटे इनक्यूबेशन अवधि के अंत में, प्लेटों को वापस बीएससी में लाएं और तदनुसार 24 अच्छी तरह से या 12 अच्छी प्लेटों में 1 एमएल या 2 एमएल मिथाइलसेलुलोस ओवरले जोड़ें।
  5. ओवरले प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर और 3−7 दिनों (वायरस स्ट्रेन-निर्भर) के लिए इनक्यूबेट में वापस रखें।
  6. इनक्यूबेशन बाद, इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें और बीएससी में लाएं। मिथाइलसेल्यूलोस ओवरले को 10% ब्लीच या दोहरी क्वाटररी अमोनियम कीटाणुनाशक युक्त ट्रे पैन में छोड़ दें।
  7. पीबीएस के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से 2x धोएं, धोने को 10% ब्लीच या दोहरी क्वाटररी अमोनियम वाले ट्रे पैन में छोड़ दें।
  8. मेथनॉल के ~ 1 एमसीएल जोड़ें: एसीटोन (1:1 वी:वी) और कोशिकाओं को कमरे के तापमान (आरटी) पर बीएससी में कम से कम 30 मिनट के लिए प्लेट पर ठीक करने की अनुमति दें। मेथनॉल को त्यागें: जैविक कचरे पर संस्थागत नीति के अनुसार एसीटोन।
  9. नीचे वर्णित दो तरीकों में से एक का उपयोग करके ज़िकव की कल्पना करें।
    1. मेथनॉल को हटाने के बाद: एसीटोन, 5 मिनट के लिए क्रिस्टल वायलेट समाधान (30% मेथनॉल में 0.25% डब्ल्यू/वी) के साथ तुरंत दाग दें। नल के पानी में 2x कुल्ला और सूखने के लिए छोड़ दें, तो सीधे सजीले टुकड़े या मोनोलेयर के विनाश के सबूत के लिए आंख से कल्पना ।
    2. वैकल्पिक रूप से, परख बनाने पर ध्यान केंद्रित करें।
      1. प्लेटों को तब तक सूखने दें जब तक कि कोई कार्बनिक फिक्सेटिव न हो जाए।
        नोट: यह बीएससी के बाहर ~ 2−3 घंटे लेना चाहिए, लेकिन बीएससी या रासायनिक धुएं हुड में हवा सुखाने से त्वरित किया जा सकता है।
      2. एक कक्षीय प्लेट घुमाव पर गैर बाँझ पीबीएस (एमजी2 + और सीए2 + मुक्त) में प्रत्येक 15 मिनट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 3x धोएं। पीबीएस निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान (पीबीएस + 3% एफबीएस) के 1 एमएल जोड़ें और आरटी में 15 मिनट के लिए रॉक करें।
      3. अवरुद्ध समाधान में 1:2,000 कमजोर पड़ने पर α-ZIKV या α-flavivirus प्राथमिक एंटीबॉडी (उदाहरण के लिए, फ्लैविवायरस समूह हाइब्रिडोमा डी 1-4G2-4-15 [4G2]) के प्रति अच्छी तरह से 100 μL जोड़ें। आरटी में न्यूनतम 4 घंटे (अधिमानतः रात ोंरात, 18 एच से अधिक नहीं) के लिए कमाल के साथ इनक्यूबेट।
      4. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और एक कक्षीय प्लेट घुमाव पर पीबीएस (एमजी2 + और सीए2 + मुक्त) के साथ 15 मिनट के लिए 3x धोएं।
      5. मध्यम एंटीबॉडी (बकरी α माउस एचआरपी-लेबल) के प्रति कुएं 100 माइक्रोन जोड़ें बफर को अवरुद्ध करने में 1:2,000 पतला। आरटी में 1 घंटे के लिए कमाल के साथ इनक्यूबेट ।
      6. एक कक्षीय प्लेट झूली कुरसी पर पीबीएस (एमजी2 + और सीए2 + मुक्त) के साथ 15 मिनट के लिए 3x धोएं।
      7. एलिकोट 100 माइक्रोन सब्सट्रेट डेवलपमेंट रिएजेंट(सामग्री की तालिका)प्रति अच्छी तरह से। 15 मिनट के लिए आरटी में रॉक प्लेटें ।
      8. सब्सट्रेट को हटाकर और प्लेटों को नल के पानी के साथ 2x करके फोसी/सजीले टुकड़े के विकास पर प्रतिक्रिया को रोकें । नल का पानी बंद डालो और प्लेटों को मात्रा निर्धारित करने से पहले सूखी हवा के लिए अनुमति देते हैं ।
      9. दिए गए नमूने में मौजूद एफएफयू की संख्या निर्धारित करने के लिए वायरल फोसी की गणना करें।

4. रक्तयनलता का प्रशासन

  1. एई. एजिप्टी मच्छरों का उपयोग करें 2−4 दिन बाद eclosion। मादा मच्छरों को जांच के साथ 0.5 एल कार्डबोर्ड कार्टन में सॉर्ट करें और उन्हें चीनी से वंचित करें (आमतौर पर संक्रामक रक्तमील से पहले 36−48 घंटे)। पानी संतृप्त कपास गेंदों के माध्यम से विज्ञापन लिबिटम पानी प्रदान करें।
  2. सुबह पानी से संतृप्त कपास की गेंदों को हटा दें कि मच्छर संक्रामक रक्तमील के संपर्क में आ जाएंगे।
  3. एक स्पष्ट प्लास्टिक दस्ताने बॉक्स के भीतर इकाई सुराग खिलाने के लिए कृत्रिम रक्तमैलियों युक्त जलाशयों संलग्न करें ।
  4. दस्ताने के भीतर, एक 0.5 एल कार्डबोर्ड कार्टन एक जांच ढक्कन के साथ रखें, जिसमें जलाशय से जुड़ी फीडिंग यूनिट के नीचे 50−100 भूखे एई. एजिप्टी मच्छर होते हैं।
    नोट: उचित रूप से भूखे मच्छर आम तौर पर 20 मिनट के भीतर खिलाएंगे। धीमी आबादी में नमूना आकार बढ़ाने के लिए आवश्यक भोजन लंबे समय तक किया जा सकता है, हालांकि यह 60 मिनट से परे नहीं होना चाहिए, क्योंकि (ZIKV) वायरल टाइटर ~ 60 मिनट के बाद फीडर के भीतर कम हो सकता है।
  5. भोजन पूरा होने पर, जलाशय को हटा दें और हौसले से बने 10% ब्लीच में विसर्जित करें।
  6. कोल्ड-एनेस्थेटाइज मच्छरों को -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए या रेफ्रिजरेटर में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेशन।
  7. दस्ताने के भीतर, मच्छरों को बर्फ पर पेट्री डिश में डालें। बिना एल्गोरिदम वाले मच्छरों से घिरे मादाओं की गणना करें और सॉर्ट करें। 70% इथेनॉल से भरी 50 एमएल ट्यूब शंकु नली में विसर्जन करके अनएंगोर्गेड मच्छरों का निपटान करें। जबकि मच्छरों को अभी भी एनेस्थेटाइज्ड किया गया है, उन्हें 0.5 एल कार्डबोर्ड दफ़्ती में वापस डालें और स्क्रीन और ढक्कन के साथ जल्दी से कवर करें। कार्टन के अतिरिक्त स्क्रीन जाल को ट्रिम करें और टेप के साथ जाल को सुरक्षित करें।
  8. प्रत्येक दफ़्ती की स्क्रीन पर बाँझ फ़िल्टर 10% जलीय सुक्रोज के साथ संतृप्त एक कपास गेंद जोड़ें। आर्द्रता बनाए रखने के लिए एक नम स्पंज के साथ एक बड़े प्लास्टिक माध्यमिक कंटेनर में सभी मच्छर कार्टन रखें।
  9. 80% ± 10% सापेक्ष आर्द्रता और 16:8 प्रकाश:अंधेरे चक्र) के साथ 27 ± 1 डिग्री सेल्सियस (या ब्याज के क्षेत्र में स्थितियों का अनुकरण करने के लिए उपयुक्त) के तापमान के साथ एक इनक्यूबेटर में मच्छरों के कार्टन युक्त माध्यमिक कंटेनर रखें। प्रयोगों के पूरा होने तक 10% सुक्रोज तक विज्ञापन लिबिटम पहुंच के साथ मच्छरों को बनाए रखें।

5. नमूना अधिग्रहण और प्रसंस्करण

  1. निर्दिष्ट दिनों में पोस्टफीडिंग, एक दस्ताने बॉक्स के भीतर एक यांत्रिक एस्पिरेटर का उपयोग करके उपयुक्त कार्टन से मच्छरों की एक पूर्व निर्धारित संख्या को एस्पिरेट करें। मच्छरों की अपेक्षित संख्या प्राप्त होने के बाद कपास के दौर के साथ संग्रह ट्यूब को कैप करें।
  2. कोल्ड-एनेस्थेटाइज मच्छरों को -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेशन।
  3. दस्ताने के भीतर, मच्छरों को बर्फ पर पेट्री डिश में डालें। दो जोड़ी संदंश का उपयोग करके, प्रत्येक मच्छर के पैरों में से सभी छह को हटा दें और एक प्रीलेबल 2 एमएलए राउंड बॉटम माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें एक स्टरलाइज्ड स्टेनलेस स्टील बॉल असर (7/32") और डीएमईएम से बना मच्छर संग्रह मीडिया (एमसीएम) का 500 माइक्रोल होता है, 2% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2.5 माइक्रोग्राम/एमएल एम्फोटेरिसिन।
  4. धीरे से खनिज तेल की एक बूंद पर मच्छर जगह इसे नियंत्रित करने के लिए, ध्यान रखने के लिए तेल और मच्छर के सिर और सूंड के बीच किसी भी संपर्क की अनुमति नहीं है ।
  5. मच्छर सूंड को 10 माइक्रोल पिपेट टिप में डालें जो गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस के 10 माइक्रोन से भरा हुआ है।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, पिपेट को सुक्रोज, रक्त या खनिज तेल से भरा जा सकता है। तेल प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से लार बुलबुले के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है।
  6. मच्छर को 30 मिनट तक लार की अनुमति दें। एम एमसीएम के 100 माइक्रोल युक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में एफबीएस + लार युक्त माइक्रोपिपेट टिप को बाहर निकालें, फिर शव को एक अलग 2 एमएल राउंड बॉटम माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें एक निष्फल स्टील बॉल बेयरिंग और एमसीएम का 500 माइक्रोल होता है। सुनिश्चित करें कि शरीर, पैर और लार के लिए उपयोग की जाने वाली ट्यूबों को लेबल किया जाता है ताकि यह स्पष्ट हो कि तीनों नमूने एक ही मच्छर से उत्पन्न होते हैं।
  7. जबकि मच्छर मुंह में पानी भर रहे हैं, शेष मच्छरों पर 5.3−5.5 कदम करेंगे।
  8. एक बीएससी के भीतर निहित एक मनका मिलिंग ऊतक समरूपता उपकरण के लिए शरीर और पैरों युक्त ट्यूबों परिवहन। वायरल कणों को सुपरनेट में मुक्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 26 हर्ट्ज पर सभी शरीर और पैर के नमूनों को ट्रिटेट करें। 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा सभी नमूनों को स्पष्ट करने के लिए गोली सेलुलर मलबे।
    नोट: इस बिंदु पर, नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया जा सकता है, या तुरंत परख लिया जा सकता है।

6. संक्रामक परख द्वारा ZIKV का पता लगाना

  1. एक बीएससी में, संक्रामक परख की शुरुआत से पहले वेरो कोशिकाओं (10 5 कोशिकाओं प्रति अच्छीतरह से) 24 घंटे के साथ 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटें तैयार करें। प्रत्येक को एक मच्छर/नमूने की पहचान के साथ अच्छी तरह से लेबल करें ।
  2. यदि नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए थे, तो गल जाने दें।
  3. एक समय में नमूनों एक प्लेट के साथ टीका से पहले वेरो सेल प्लेटों से मीडिया को हटा दें।
  4. शरीर या पैर वाले नमूनों के लिए, प्रत्येक कुएं में स्पष्ट सुपरनेट के 100 माइक्रोन को ध्यान से अलीकोट करें, इस बात का ध्यान रखें कि गोली से मच्छर कोशिका मलबे को परेशान न करें।
    नोट: लार के नमूनों को 1:1 (v/v) एमसीएम के साथ कोशिकाओं पर टीका लगाने से पहले पतला किया जा सकता है ताकि यदि आवश्यक हो तो बाद में टिटरेशन के लिए नमूनों का संरक्षण किया जा सके ।
  5. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर और1 घंटे के लिए इनक्यूबेट में ले जाएं।
  6. प्लेटों को बीएससी में लौटाएं और प्रत्येक कुएं में मेथाइलसेल्यूलोस ओवरले के ~ 1 एमएल जोड़ें। ओवरले प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर और इनक्यूबेट में 3−7 दिनों (वायरस/स्ट्रेन-निर्भर) में वापस रखें।
  7. चरण 3.6−3.9 में वर्णित निर्धारण और दृश्य प्रदर्शन करें।
  8. परख बनाने पर ध्यान केंद्रित करने के माध्यम से स्कोरिंग के बारे में, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत परीक्षा द्वारा सकारात्मक कुओं की मात्रा । एक कुएं में कोशिकाओं के इंट्रासाइटोप्लाज्मिक धुंधला का पता लगाना वायरस की उपस्थिति को इंगित करता है। नमूने पूरी तरह से फोकस-पॉजिटिव या-निगेटिव के रूप में बनाए जाते हैं ।

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Representative Results

अमेरिका से एई एजिप्टी की तीन आबादी (साल्वाडोर, ब्राजील; डोमिनिकन गणराज्य; और रियो ग्रांडे वैली, TX, यूएसए) अमेरिका (ZIKV Mex 1-7, Chiapas राज्य, मेक्सिको, २०१५) से ZIKV के प्रकोप तनाव के संपर्क में थे रक्तमील टाइटर्स की एक श्रृंखला पर (4, 5, और 6 लॉग10 FFU/mL) एक धोया मानव एरीथ्रोटे आधारित कृत्रिम रक्त में प्रस्तुत किया । 2, 4, 7, 10 और 14 पोस्टिनफेक्शन के दिनों में, संक्रमण, प्रसार और संभावित संचरण दरों को निर्धारित करने के लिए मच्छरों के सबसेट को संसाधित किया गया था।

ZIKV Mex 1−7 के 4 लॉग10 FFU/mL के ब्लडमील टाइटर पर, ब्राजील के साल्वाडोर से एई एजिप्टी क्रमशः 4 और 14 दिनों के बाह्य इनक्यूबेशन के बाद 12.5% और 11.1% की दरों से संक्रमित थे, जिसमें आसकोदार पैरों में देखे गए प्रसारित संक्रमण का कोई सबूत नहीं था, और लार(चित्र 1a)में कोई वायरस का पता नहीं चला। टाइटर को बढ़ाकर 5 लॉग10 एफएफयू/एमएल के परिणामस्वरूप क्रमशः 4, 10 और 14 पोस्टिनेक्शन के दिनों में 22.2%, 33.3%, और 22.2% की दरों के साथ संक्रमण में मामूली वृद्धि हुई। 4 लॉग10 एफएफयू/एमएल के संपर्क में आने वाली पलटन में जो कुछ देखा गया था, उसके समान, किसी भी समय बिंदु(चित्रा 1b)पर कोई प्रसारित संक्रमण या संचरण क्षमता नहीं देखी गई थी। उच्चतम जांच किए गए टाइटर (6 लॉग10 एफएफयू/एमएल) में 2 दिनों के इनक्यूबेशन के बाद किसी संक्रमण की पहचान नहीं की गई थी, लेकिन अन्य सभी समय बिंदुओं पर संक्रमण देखे गए, जो बाह्य इनक्यूबेशन के 10 दिनों तक ८८.९% पर बढ़ता जा रहा था । ZIKV मच्छरों के पैरों में पता चला था 10 और 14 दिनों के बाद की जांच की (२२.२% और ६६.७%, क्रमशः), यह दर्शाता है कि ZIKV हीमोकोल में प्रसारित किया था, हालांकि संक्रामक ZIKV लार में इन समय बिंदुओं(चित्रा 1c)में मनाया गया था ।

डोमिनिकन गणराज्य से एई. एजिप्टी आबादी ZIKV संक्रमण के लिए सबसे अधिक संवेदनशील साबित हुई और सभी परीक्षण रक्तमील टाइटर्स के संपर्क में आने के बाद सक्षम ट्रांसमिशन थे। संक्रमण के कुछ स्तर सभी तीन परीक्षण खुराक पर सभी समय अंक पर मनाया गया था, सबसे कम दर के साथ 4 लॉग10 FFU/mL (25%)(चित्रा 1d)पर 2 दिन के बाद मनाया । 5 लॉग 10 और 6 लॉग10/एमएल की स्थिति संक्रमण दर100% पर नुकीला के ख़ून के साथ, 100% संक्रमण के साथ 6 लॉग10 FFU/mL ZIKV(चित्रा 1e,f)के संपर्क में आने वाले मच्छरों की आबादी में 4 दिनों के बाद संक्रमण के रूप में मनाया गया। मच्छरों ने सभी तीन खुराकों को खिलाया, 7 दिनों के बाद प्रसार का प्रदर्शन किया, 44.4% (4 लॉग10 एफएफ्यू/एमएल, 14 दिन पोस्टिनफेक्शन), 88.9% (5 लॉग10 एफएफयू/एमएल, 1 और 14 दिन पोस्टिनफेक्शन), और 100% (6 लॉग10 एफएएफयू/एमएल, 10 दिन पोस्टिनेक्शन) पर बढ़ता जा रहा है। क्रमशः 4, 5 और 6 लॉग10 एफएफयू/एमएल पर तीनों खुराकों (11.1%, 22.2%, और 22.2%) के बाद ट्रांसमिशन-क्षमता देखी गई, लेकिन केवल 14 दिन के एक्सट्रॉनिक इनक्यूबेशन अवधि (ईआईपी)(चित्रा 1d−एफ)के बाद।

रियो ग्रांडे वैली, TX से एई एजिप्टी आबादी, ZIKV के साथ संक्रमण के लिए अपेक्षाकृत रिफ्रैक्टरी साबित हुई । 4 लॉग10 एफएफयू/एमएल के ब्लडमील टाइटर्स के संपर्क में आने वाले मच्छरों को 4 दिनों के बाद संक्रमण के रूप में संक्रमित किया गया था, जिसमें संक्रमण दर २२.२% और ४४.४% के बीच थी । इन एक्सपोजर स्थितियों के साथ, 11.1% की दर से 14 दिनों के बाद प्रसारित संक्रमण देखे गए, और कोई संचरण क्षमता(चित्रा 1 जी)नहीं देखी गई। ब्लडमील टाइटर में दस गुना वृद्धि ने काफी हद तक इसी तरह का परिणाम पैदा किया, जिसमें संक्रमण 4 दिन के बाद (३३.३% और ४४.४%) शुरू होते हैं, जबकि प्रसारित संक्रमण २२.२%(चित्रा 1h)की दर से बाह्य इनक्यूबेशन के 14 दिनों के बाद पाए गए । अंत में, एक 6 लॉग10 FFU/mL रक्त काल के संपर्क में पलटन में, संक्रमण 2 दिन के बाद संक्रमण समय बिंदु (२२.२%) से शुरू मनाया गया था और 4, 10 पर चोटियों तक पहुंच गया, और 14 दिनों के बाद (६६.७%) इस स्थिति में प्रसारित संक्रमण 7 दिनों के बाद (11.1%) पर मनाया जाने लगा और 14 दिनों के बाद 44.4% पर नुकीला। केवल एक मच्छर (11.1%) को 10 दिनों के बाद(चित्रा 1i)में सक्षम संचरण करने के लिए मनाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: ZIKV Mex 1−7 के लिए विभिन्न एई. एजिप्टी आबादी के प्रतिनिधि वेक्टर क्षमता डेटा। (a−c)साल्वाडोर, ब्राजील (F2) से एई एजिप्टी की वेक्टर क्षमता । (घ−f) डोमिनिकन गणराज्य (F6) से एई. एजिप्टी की वेक्टर क्षमता। (जी−i) रियो ग्रांडे वैली, TX (F4) से एई एजिप्टी की वेक्टर क्षमता । (a,d,g) Ae. एजिप्टी ZIKV Mex1-7 के 4 लॉग 10 FFU/mL के संपर्क में । (ख,ई,एच) Ae. एजिप्टी ZIKV Mex1-7 के 5 लॉग 10 FFU/mL के संपर्क में । (ग,च,मैं) Ae. एजिप्टी ZIKV Mex1-7 के 6 लॉग 10 FFU/mL के संपर्क में । हर समय बिंदु पर (2, 4, 7, 10, और 14 दिन के बाद संक्रमण) मच्छरों का एक सबसेट एकत्र किया गया था और नमूना लिया गया था। संक्रमण, प्रसार, और संचरण दरों को उस समय बिंदु पर परख मच्छरों की संख्या पर सकारात्मक शव/पैर/लार के नमूनों की संख्या के रूप में प्रस्तुत किया जाता है । नीले रंग में प्रतिनिधित्व संक्रमण, हरे रंग में प्रतिनिधित्व संक्रमण का प्रसार, और पारेषण दर लाल रंग में प्रतिनिधित्व किया । इस आंकड़े में डेटा राउंडी और अजार एट अल32से संशोधित कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां वर्णित विधियां वेक्टर क्षमता विश्लेषण करने के लिए एक सामान्यीकृत कार्यप्रवाह प्रदान करती हैं। एक सामान्य ढांचे के रूप में, इनमें से कई पद्धतियों को पूरे साहित्य में संरक्षित किया जाता है। हालांकि, संशोधनों के लिए पर्याप्त जगह है (अजार और बुनकर1में समीक्षा की गई)। वायरस (उदाहरण के लिए, वायरल वंश, चुनौती वायरस का भंडारण, वायरल मार्ग इतिहास), कीट विज्ञान (उदाहरण के लिए, मच्छर आबादी का प्रयोगशाला उपनिवेशीकरण, जन्मजात प्रतिरक्षा, मच्छर माइक्रोबायोम/विरोम), और प्रयोगात्मक चर (जैसे, रक्तमील संरचना, अनुक्रमिक रक्त आहार, और इनक्यूबेशन तापमान) सभी वेक्टर क्षमता को प्रभावित करने के लिए जाने जाते हैं। सक्षमता अध्ययनों में पद्धतिगत परिवर्तनशीलता ने ज़िकवी प्रकोप के संदर्भ में समस्याग्रस्त साबित किया है क्योंकि इसने औपचारिक मेटा-विश्लेषण1,33को पहले से ही निर्धारित किया है।

इस सामान्य पद्धति के भीतर, मच्छरों और रक्तमील श्रृंगार के उचित भुखमरी के महत्व को अतिरंजित नहीं किया जा सकता है। निर्जलीकरण प्रयोगशाला प्रतिमान३४में मच्छरों के रक्त खिला व्यवहार ड्राइव करने के लिए जाना जाता है, एक संक्रामक रक्तमील की पेशकश करने से पहले चीनी और पानी भुखमरी के मूल्य को रेखांकित । जबकि 36-48 घंटे के लिए चीनी और 2-4 घंटे के लिए पानी के लिए पानी के लिए ख़ून के संपर्क में आने से पहले एई. एजिप्टीद्वारा अच्छी तरह से सहन किया जाता है, यह देखने लायक है कि इन मच्छरों को प्रयोगशाला की स्थिति में काम करना बेहद आसान है2। भुखमरी के ऐसे आक्रामक रेजिस्टेंस को अन्य मच्छर प्रजातियों द्वारा लगभग सहन नहीं किया जा सकता है, जिससे कुछ हद तक इन-हाउस अनुकूलन की आवश्यकता होती है। इसी तरह, ख़ून सामग्री मेजबान वरीयता द्वारा सूचित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मानव रक्त का उपयोग एई जैसे मानववंशीय मच्छरों के लिए रक्तमील तैयार करने के लिए। एजिप्टी पूरी तरह से उपयुक्त है, लेकिन क्यूलेक्स क्विंक्विफासिटसिटस जैसी ऑर्निथोफिलिक प्रजातियों के लिए बनाए गए मानव रक्तमाइल कम प्रभावी साबित हो सकते हैं35। इसके अतिरिक्त, रक्तमील असेंबली के संबंध में, अपेक्षाकृत ताजा रक्त उत्पादों का उपयोग एरिथ्रोसाइट्स के हीमोलिसिस को कम करने के लिए अत्यधिक उचित है।

एक पूरे के रूप में वेक्टर क्षमता मूल्यांकन की सबसे बड़ी सीमाओं में से एक और यहां वर्णित प्रक्रियाओं में से एक यह है कि इन अध्ययनों को काफी हद तक मच्छरों का उपयोग कर वायरस है कि प्रयोगशाला की स्थिति में बनाए रखा जा सकता है की जांच करने तक ही सीमित हैं । एई एजिप्टी,जबकि नैदानिक महत्व के रोगजनकों की एक भीड़ के लिए एक अत्यधिक प्रासंगिक वेक्टर, प्रयोगशाला उपनिवेशों1, 31,36,37में पीछे और रखरखाव करने के लिए सबसे आसान मच्छरों में से एक होता है। आश्चर्य की बात है, एई. एजिप्टी आबादी की क्षमता अक्सर आम वेक्टर मच्छरों के बीच सबसे अच्छी विशेषता है2। यह विशेष रूप से आर्बोवायरस के संदर्भ में समस्याग्रस्त है जो एंजोटिक और शहरी ट्रांसमिशन चक्र38,39,40दोनों को बनाए रखता है, क्योंकि वेक्टर क्षमता आम तौर पर केवल अधिक ट्रैक्टेबल शहरी मच्छरों के संदर्भ में आयोजित की जाती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उभरते वायरस और Arboviruses (WRCEVA) के लिए विश्व संदर्भ केंद्र के कर्मचारियों को स्वीकार करते हैं: डॉ रॉबर्ट Tesh, हिल्डा Guzman, डॉ केनेथ Plante, डॉ जेसिका Plante, Dionna Scharton, और दिव्या Mirchandani, curating में अपने अथक काम के लिए और हमारे और अंय समूहों के वेक्टर दक्षता प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया वायरल उपभेदों के कई प्रदान करते हैं । प्रस्तुत काम McLaughlin फैलोशिप फंड (एसआरए) और NIH अनुदान AI120942 और AI121452 द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 159 मच्छर वेक्टर क्षमता एडीज, एडीज एजिप्टी,आरबोवायरस ज़िका
वेक्टर क्षमता जीका वायरस का उपयोग कर <em>एडीज एजिप्टी</em> मच्छरों पर विश्लेषण
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Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector… More

Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).

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