Summary
用微泡剂聚焦超声波可以聚焦和瞬时打开血脑屏障。这项技术已被用于通过血脑屏障提供广泛的制剂。本文提供了一个详细的协议，本地化交付给啮齿动物的大脑有或没有MRI指导。
Abstract
立体税手术是局部药物和基因输送到啮齿动物大脑的黄金标准。与系统传递相比，这项技术有许多优点，包括精确定位到目标大脑区域和减少目标外的副作用。然而，立体轴手术是高度侵入性的，它限制了其转化功效，需要很长的恢复时间，并在瞄准多个大脑区域时提供挑战。聚焦超声波 （FUS） 可与循环微泡结合使用，在毫米大小的区域瞬时打开血脑屏障 （BBB）。这允许系统交付的代理的颅内本地化，这些代理通常不能穿过 BBB。这项技术提供了立体轴手术的非侵入性替代方法。然而，由于获得设备和标准化方法的机会有限，该技术迄今尚未在神经科学实验室得到广泛采用。该协议的总体目标是为 FUS BBB 开启 （BBBO） 提供一种台面方法，这种方法经济实惠且可重复，因此很容易被任何实验室采用。
Introduction
尽管在基础神经科学方面有许多发现，但神经发育和神经退行性疾病的新疗法数量仍然相对有限。对神经紊乱中涉及的基因、分子和细胞回路的更深入的了解表明，用目前的技术3，人类无法实现有希望的治疗方法。有效的治疗往往受到大脑渗透和特定地点4，5，6，7，8的需要的限制。然而，现有的局部药物输送到特定大脑区域的方法（例如，通过注射或针管分娩）是侵入性的，需要在头骨9中打开。这种手术的侵入性防止了将局部分娩的常规使用到人脑中。此外，组织损伤和由此产生的炎症反应是无处不在的混淆的基本和前科研究，依靠颅内注射10。非侵入性地通过血脑屏障（BBB）输送制剂并将其靶向特定大脑区域的能力可能会对神经系统疾病的治疗产生巨大影响，同时为术前研究提供强大的研究工具。
在BBB上以最小的组织损伤进行定向传输的方法之一是颅内聚焦超声波（FUS）和微泡，以聚焦和瞬时打开BBB 11、12、13、14、15、16。FUS BBB 的开放最近因神经退行性疾病的治疗而备受关注， 中风和胶质瘤通过本地化治疗目标大脑区域，如神经营养因子17，18，19，基因疗法20，21，22，抗体23，神经递质24，和纳米粒子25，26，27，28，29。FUS BBB 具有广泛的应用范围和非侵入性30、31，是常规立体轴心颅内注射的理想替代品。此外，由于它目前在人类中使用30，32，使用这种技术的术前研究可以被认为是高度转化的。然而，由于缺乏可访问性，FUS BBB的开放尚未成为基础科学和学前研究中广泛确立的技术。因此，我们为 FUS BBB 开启的台面方法提供了详细的协议，作为有兴趣建立此技术的实验室的起点。
这些研究要么使用大功率空气支持的FUS特定超声波传感器，要么使用低功率阻尼聚焦超声波浸入式传感器进行。传感器由专为活性负载设计的 RF 功率放大器和标准台面功能发生器驱动。这些物品的详情可在 材料表中找到。
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Protocol
所有实验程序均按照 UAB 机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 准则进行。
1. 聚焦超声波驾驶设备设置
- 使用 50 Ohm 同轴 BNC 电缆将超声波传感器的输入连接到 RF 放大器的输出中，（2） RF 放大器对功能发生器输出的输入。
- 将函数生成器模式设置为每秒一次的鼻窦爆裂，其工作周期为 1%。
- 对于带 50 dB RF 放大器使用的 0.8 英寸焦距的阻尼 1 MHz 低功耗浸入式传感器，将启动设置设置为：1 MHz sine 波、1 V 峰值到峰值、10k 周期、1 s 间隔（或句点）。
- 对于空气支持，1.1 MHz 大功率传感器，将初始设置设置为：1.1 MHz sine 波、50 mV 峰值到峰值、11k 周期、1s 间隔。
注意：除非传感器被淹没，否则不要操作传感器。操作时，不要将手或其他身体部位放在超声波聚焦处或触摸传感器面部。
2. 聚焦超声台式设置
- 3D 打印立体声轴图框架和立体定向框架支架。
- 使用握有PVC管道的夹子将传感器连接到XYZ定位器（图1a）。将夹子固定在 X 轴滑梯上，然后用翼螺母锁定。
- 如果使用大功率超声波传感器，则使用匹配的磁铁将其连接到 PVC 管道上。确保一个磁铁有一个孔，另一个有一个匹配的突起。盖上PVC管的底部，用环氧树脂将其中一块磁铁附着在管道上（见图1b）。
- 使用环氧树脂将第二块磁铁连接到大功率超声波传感器的顶部中心。确保它是在传感器的中心（图1c）。
- 如果使用大功率超声波传感器，则制作一个用于取消 XYZ 定位器的指点。当超声波传感器连接到 XYZ 定位器时，此指尖表示传感器对焦中心的空间位置。用 18 G 针切出一个指针，作为传感器焦距的长度加上传感器的厚度（图 1d）。
- 将环氧树脂涂抹到第三块磁铁上（这种磁铁也与PVC帽磁铁配对），并将其附着在指尖顶部。然后，指点将能够连接到PVC管上的磁铁上，用于XYZ空（图1d）。
- 如果使用低功耗浸入式传感器，则 3D 打印指针和安装夹的文件。
- 将低功耗浸入式传感器连接到PVC管道，将安装夹剪切到PVC管道上，并将传感器插入环（图1f）。
- 将丙烯酸纸上切开的碎片粘在一起，使水浴成为水浴，这些碎块可以放在动物头顶上，高于立体定向框架（图1e）。
- 在浴缸底部切开一个与动物头部大小差不多的开口。用聚酰胺胶带盖住水浴中的孔。
注意：必须小心，确保水不会泄漏周围的多酰胺胶带，因为它可以湿老鼠的毛皮，并导致体温过低。
- 在浴缸底部切开一个与动物头部大小差不多的开口。用聚酰胺胶带盖住水浴中的孔。
- 通过用 MRI 可见液体（如维生素 E 油）填充直径为 4 mm 的薄壳塑料或玻璃球，制成 MRI 纤维，并将其密封。将其放置在 3D 打印立体轴框架右侧的 MRI 支架中（图 2a）。
- 牢固地将 3D 打印的框架支架固定在 XYZ 定位器上，以放置动物。将框架支架的旋端选项卡滑入 Y 轴轨道上的匹配通道，并使用固定螺钉（图 1h，红色箭头）进行固定。
- 要驾驶 XYZ 定位器，请按照制造商的指示将 USB 安装到计算机上的串行转换器，并插入转换器。在 PC 上安装运行时间环境和电机控制器软件。
- 通过在控制器软件前面板上的端口选择下拉控制中选择 USB 到串行转换器，确保在软件中选择正确的串行端口。使用 9 针串行交叉电缆（例如 RS232 空调制解调器电缆）将 USB 连接到串行转换器到继子电机控制器盒。
- 运行控制器软件，以测试步进电机可以在软件控制下驱动。此步骤可能需要本地 IT 支持的帮助。
3. 颅内定位程序
注：雄性斯普拉格道利大鼠体重250-350克用于这些实验。动物可以自由获得水和老鼠圈，并保持在12：12小时的光：黑暗循环。
- 将动物置于麻醉下（3%含氧异氟），并检查脚趾捏缺乏反应。然后插入如下所述的导管。
- 用灯加热尾巴，使触脉更容易。小心不要使动物过热或烫伤尾巴。
- 一旦动物睡着了（不回应脚趾捏），插入24G尾静脉导管，将用于提供微泡泡，埃文斯蓝色染料（EBD），加多布特罗MRI对比，如果使用MRI，和实验剂的兴趣。一旦静脉被击中，血液将充满护套，慢慢取出内针，同时将护套进一步推入静脉。
注意：如果第一次注射大鼠尾静脉，请参阅像斯图亚特和施罗德33 这样的指南。 - 如果没有血流，慢慢将导管护套移出静脉，以测试针头可能戳穿了静脉。如果血液流动时，导管被稍微拉回，然后首先戳通过静脉和导管放置将需要重新启动在尾部的另一个位置，是旋转到以前的位置。
- 用盐水填充导管插头，并在端口充满血液后立即将导管插头拧入导管端口的末端。小心地将实验室胶带缠绕在导管和尾部，使其保持原位。从顶部的一小块开始，朝方向工作，使导管插头的末端暴露在外。
- 将麻醉线插入立体轴（图2a）上的麻醉连接器上，将嘴放在咬杆上，引导耳栏进入两个耳道，然后拧紧固定螺丝，将动物头部固定在镜框内。确保动物头部的安全和水平。
- 将动物移入核磁共振成像（MRI）床，并将麻醉线连接到鼻锥。在此协议中使用了 9.4 T 小孔动物 MRI。
- 收集冠状和轴向T2加权图像，捕捉整个大脑以及MRI信托（图2b）进行坐标测量。提供当地的核磁共振成像物理学家或技术人员以下信息，以便他们能够构建 MRI 协议。
- 对于日冕图像（图2b顶部），使用以下参数：图像数量：27，宽度：62.2毫米，高度：62.2毫米，深度：37.97毫米，Voxel大小：0.24 x 0.24 x 1.41毫米3。
- 对于轴向图像（图2b底部），使用以下参数：图像数量：13，宽度：61.47毫米，高度：53.81毫米，深度：16.7毫米，Voxel大小：0.41 x 0.21 x 1.29毫米3。
注：只要平面分辨率的日冕接近0.25毫米，图像覆盖整个大脑和受体，就没有必要有这些确切的参数。
- 通过记录从 MRI 受托到以 FUS 为目标的大脑区域的距离，从上述图像中收集坐标测量结果。
- 在扫描仪上，在步骤 3.5 中收集的日冕图像上，找到受体最大的图像，指示受体的中心。在介质/横向方向和右心室方向（图2b，顶部）记录从受体顶部到对毫米感兴趣的大脑区域的距离（MRI软件将有一个刻度或点测量工具，咨询当地的MRI技术或物理学家如何做到这一点）。
- 在扫描仪上，在步骤 3.5 中收集的轴向图像上，找到显示受体顶部的图像，并测量从受体中心到目标大脑区域在指端/腹向和中间/横向方向的距离（图 2b，底部）。
- 比较两个介质/横向测量，如果它们是不同的使用平均值。这些坐标测量将在第 4.3 步晚些时候使用，用于用 XYZ 定位器引导 FUS 焦点到目标大脑区域。
- 收集 MRI 预扫描图像。将这些图像与 FUS BBB 打开后收集的图像进行比较（图 4）。T1 加权图像稍后将用于可视化 BBB 开口，T2 加权图像稍后将用于确保 FUS 治疗34后不会发生组织损伤。
- 对于 T1 加权轴向图像，请使用以下参数：宽度：30 毫米，高度：51.2 毫米，深度：3.0 毫米，voxel 大小：0.23 x 0.2 x 0.23 mm3，图像数量：13。
- 对于 T2 加权轴向图像，请使用以下参数：宽度：30 毫米，高度：51.2 毫米，深度：2.6 毫米，voxel 大小：0.2 x 0.2 x 0.2 mm3，图像数量：13。
- 对于T1加权日冕图像，请使用以下参数：宽度：30毫米，高度：30毫米，深度：27毫米，体型：0.16 x 0.16 x1毫米3，图像数量：27。
- 对于 T2 加权日冕图像，请使用以下参数：宽度：30 毫米，高度：30 毫米，深度：27 毫米，体型：0.12 x 0.12 x 1 mm3，图像数量：27。
注：与第 3.5 步一样，这些成像参数不必与列出的参数完全相同。这些图像的 FOV 更小，分辨率也高于第 3.5 步收集的图像。
- 将动物保持在立体轴框架中，快速将动物从 MRI 床运送到台面 FUS 设置。确保动物在麻醉作用下保持睡眠以进行转移。
- 对于更长的传输时间，使用足够大的盒子进行传输，以适应动物和框架。麻醉塞仍然连接，将动物和框架放在盒子内，让多余的异氟化物填充盒子几分钟。拔下麻醉线，快速转移。
4. 聚焦超声波手术
- 到达 FUS 台面设置后，立即将麻醉线插入鼻锥，并继续用氧气运行 1.5-3% 异氟化物。尽快这样做，以避免动物醒来。
- 将框架滑入框架支架，并牢牢地将其捕捉到位。用剪子剃动物的头。刷掉多余的头发，在头皮上涂抹脱发霜。让我们坐3分钟，用水和纱布擦去。
- 如果 MRI 不可定位，请使用标准（非 3D 打印）立体定向框架，通过触摸指尖到 bregma（为此需要头皮切口）并取消软件或记录坐标，将指点位置无效。通过单击软件中的 向上 50 个按钮并将指头换成传感器，将 XYZ 车厢向上移动 50 mm。根据之前描述的35个鼠脑地图集，使用软件中的步进按钮移动到所需的大脑坐标。如果使用此方法而不是 MRI，请跳到第 4.6 节。
- 如果使用 MRI 指导，则将指点连接起来，并将指头移动到 MRI 受体的位置（图 1d，g）。将指头放置在 MRI 支架的顶部和中心（为指点提供了支架顶部的一个小孔）。单击空位按钮，该按钮是计算 MRI 图像中所有距离的点。
- 取下指头，将定位器移动到中/横向坐标和旋翼/腹地坐标。通过按 下向上 50 按钮将定位器抬起来，以便放置水浴和超声波凝胶。如果到达 Z 轴旅行的顶部，则无效位置将失效。在添加传感器后，将设置正向/腹腔坐标。
- 将超声波凝胶涂在动物的头皮上，将水浴放在动物身上，将聚酰胺胶带窗口压在凝胶上。确保超声波凝胶中没有气泡。
- 在水浴中加满脱气水。
- 如果使用大功率传感器，降低定位器，使磁铁就在水面上。将传感器连接到定位器上，小心地将传感器以角度放入水中，以防止气泡困在面部下方并连接磁铁。
- 如果使用低功耗浸入式传感器，则将定位器降低到传感器剪辑正上方的水中。然后通过以一个角度缓慢地将其降低到水中，将传感器夹在原位，以防止气泡被困在脸部下面。
注意：透明浴池在传感器表面下寻找气泡时很有帮助。 - 将定位器降低到右/室坐标。
- 打开RF电源放大。
- 通过将针尖插入导管插头并注射，将 1 mL/kg 的 3% 埃文斯蓝色染料 （EBD） 注入。允许它循环5分钟。
- 用气泡摇床剧烈摇动微泡，激活微泡。
- 在 0.2 mL 盐水中准备 30 μL/kg 微泡（气泡凝结 1.2 x10 10/mL）的 5 倍剂量，以考虑 2 FUS 处理和 18 G 有翼输液集中的管子。例如，如果大鼠体重为 200 克，则用 1 mL 盐水中的 30 μL 微泡填充含有 18 G 针尖的注射器。
注意：请务必使用 18 G 针尖，同时使用有翼输液装置进行取药和注射。 - 多次倒置注射器以获得微泡的均匀分布。然后连接并填充有翼输液集。将注射器放置在输液泵上，并设置输液泵以 6 mL/h 的速度提供 0.2 mL。这将在 2 分钟的 FUS 暴露下提供微泡的缓慢输注。
- 将有翼针插入导管插头。
- 在 0.2 mL 盐水中准备 30 μL/kg 微泡（气泡凝结 1.2 x10 10/mL）的 5 倍剂量，以考虑 2 FUS 处理和 18 G 有翼输液集中的管子。例如，如果大鼠体重为 200 克，则用 1 mL 盐水中的 30 μL 微泡填充含有 18 G 针尖的注射器。
- 首先，运行输液泵，等待3s，然后通过按下功能发生器上的输出启用按钮（标记为"在材料表中的功能发生器上"）启动FUS处理。每个区域重复两次，中间5分钟，让微泡清除。
- 当输液泵在 2 分钟内停止时，再次按下功能生成器 上的打开按钮 以停止 FUS 处理。
- 等待 5 分钟，微泡清除。然后开始输液和第二次FUS治疗。
- 在第二次 FUS 治疗后，立即注射加多布特罗对比度（如果使用 MRI）和感兴趣的代理，例如病毒颗粒。所有代理的总交付量不应超过 5 mL/kg。
注：利息代理的交货时间（例如，FUS BBB 开张前后）可能因所使用的代理而异。
- 关闭 RF 电源放大，并立即将动物运回 MRI。
5. BBB 开口的 MRI 确认
- 如果MRI不可用，请跳到第6节，使用EBD表达式确认BBB开口。
- 将动物放回 MRI 床上，位置与步骤 3.7 完全相同，并插入麻醉线。
- 收集MRI后扫描与第3.7步中使用的相同成像参数，以可视化BBB开口区域的加多布特罗MRI增强（图3b，e）。
6. 注入和组织收集
- 用冷4%的正式素灌输动物，直到血液完全清除。
- 去除大脑，并在4°C的4%正式或PFA过夜。接下来，将大脑置于30%的蔗糖溶液中，直到大脑下沉（约2-3天）。最后，在液氮或干冰上闪光冻结，并储存在-80°C，直到低温。
- 冻结在OCT的大脑，并采取低温。
- 用于荧光显微镜的修复和盖片部分。EBD 激发峰值为 470 和 540 nm，排放峰值为 680 nm。带 DAPI 安装介质的封面滑动，以可视化整体细胞形态。
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Representative Results
在这里，我们演示了用微泡聚焦超声波可以使用上述低功耗浸入传感器（图3）和FUS传感器（图4）指定的参数诱导本地化BBB开口。首先，在早期实验中，低功耗浸入式传感器被瞄准一个大脑半球（图3b）或中位（图3a）。动物在2小时后被牺牲与注入（图3a）或没有注入（图3b）和10μm冷冻大脑部分被收集。EBD 自动荧光 （兴奋： 470 和 540 nm， 发射： 680 nm） 在目标半球 （白色箭头图 3a 和 3b）中明显可见 FUS B 开口。
我们发现最好用EBD自动荧光对BBB开口进行清晰的可视化。但是，BBB 开口仍然可以在不清除血管的情况下进行可视化（图 3b）。BBB 开启后，EBD 的蜂窝吸收和清除在 BBB 打开后 30 分钟就开始，并增加了超过 24 小时37小时。对于EBD自动荧光的BBB开口的评价，最好在15分钟到3小时的BBB开口时间之间牺牲动物。虽然最终，牺牲的时间将取决于交付的代理。例如，在 AAV 研究中，BBB 开启后 3 周和 AAV 交付（图 5c）可能是适当的。
在后来的实验中，FUS传感器被瞄准海马（图4a-c）或前结节皮层（ACC）（图4 d-f），除了EBD，MRI对比剂加多布特罗（0.1毫升/千克）被静脉注射，以验证BBB体内的定向打开。图4b，e显示增强的MRI对比度，其中加多布特罗对比度已进入组织1小时后BBB打开和对比剂注射。与 FUS 程序之前采集的 MRI 预扫描器（图 4a，d）相比，这种对比变化是显而易见的。然后，在BBB开张1.5小时后，动物被灌注牺牲，并收集了10μm低温。EBD自动荧光在FUS目标区域明显，进一步表明BBB开放的位置（图4c，f）。这个数字突出了 MRI 对比有时很难看到（如图 4b 和图 4e之间的差异）： 因此，在图4f中的荧光显微图中，通过EBD自发光的可视化来确认BB的开口是有帮助的。
为了评估这项技术是否可以用于靶向基因传递 AAV9-hsyn-GFP 和加多布特罗对比度注射 IV （滴答声： 1.32 x 1014 GC/mL， 0.05 mL/kg） 后立即在海马区 BBB 打开。这只动物在BBB开张30分钟后被M MR成像，3周后被灌注牺牲。收集了 10μm 低温部分，用于 GFP 表达的荧光成像。BBB 的开口明显表现在目标海马（图 5a，b）中的加多布特罗对比。此外，基因传递通过GFP表达在目标海马明显由绿色荧光（图5c）确认。请注意，此时 EBD 已清除，并且仅在心室中显示（图 5c）。
图1：FUS台面设置（a）FUS设置，包括XYZ定位器、用于传感器附件的直径30毫米PVC管、3D打印立体声轴和输液泵。（b） PVC管的末端被封顶，磁铁与环氧树脂相连。（c） 另一块匹配的磁铁与环氧树脂连接在大功率传感器的顶部中心。（d） 此外，在核磁共振成像仪的顶部和中心，还附着另一块匹配的磁铁，用于消除定位器。（e） 指尖最终被大功率传感器取代，水浴与超声波凝胶耦合到动物头部。（f） 低功耗浸入式传感器可与 3D 打印传感器夹连接到 PVC 管道上。（g） 对于定位，传感器被 3D 打印的指头替换，定位器在 MRI 金融的顶部和中心为空。（h） 如果需要多次 FUS 治疗，静止的 3D 打印框架架允许动物在 MRI 后返回同一位置。请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：立体轴图框架与MRI的MRI制导坐标。 （a） 动物首先被放置在一个3D打印的立体轴图框架中，该框架配备了核磁共振成像（ MRI）。（b） 框架然后放置在核磁共振成像床内，从受体（点圆）到目标大脑区域的距离使用日冕图像进行正弦/室（D/V）测量和轴向图像测量，从两个轴上可以收集中/侧（M/L）测量。动物被保存在框架中，并转移到FUS站，在那里使用指头在支架的位置取消XYZ定位器。然后用传感器替换指头，然后根据收集的坐标移动。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：埃文斯蓝色染料（EBD）确认FUS BBB打开有和不灌注。 （a） FUS BBB 打开后 2 小时 10μm 大脑部分的显微图，其低功耗浸入传感器瞄准了中左半球。这是一个动物的代表形象，在组织收集之前，它被注入了4%缓冲的甲醛。EBD 红色自动荧光（箭头）可以明显看出来 BBB 开口。（b） FUS BBB 开启后 2 小时，10μm 大脑部分的微图瞄准前左半球。这是动物的代表形象，在组织收集之前没有注入，因此，EBD留在血管中。BBB 开口在 EBD 从血管（箭头）中泄漏出来的地方很明显。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：FUS BBB开口确认与加多布特罗MRI对比度和EBD表达。 MR 图像之前（a 和 d）和之后（b 和 e） BBB 打开。加多布特罗对比度增强确认了 BBB 在体内打开的位置（b 和 e，箭头） 。（c） 10μm 大脑部分显示进一步确认 BBB 开口与 EBD 自动荧光 （红色） 在海马 （蓝色 DAPI 核污渍）.缩放条：500μm.（f） BBB 打开前结节皮层后 10μm 大脑部分的微图，由 EBD 红色自荧光（箭头）明显可见。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图5：通过FUS BBB开口将AAV9-hsyn-GFP本地化交付给海马。 MRI确认BBB打开与MRI对比剂，MRI对比（箭头）在日冕（a）和轴向（b）T1加权图像。（c） FUS 靶向海马（绿色）中 GFP 表达的组织确认，在 FUS B B 开启和 AAV9-hsyn-GFP IV 注射 3 周后。蓝色表示用于整体细胞形态的 DAPI 核污渍。 请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
在这里，我们描述了一个台面方法微泡协助FUS BBB打开与替代方法，包括，两个不同的传感器和方法的颅内瞄准有和没有MRI指导。目前，为了在实验室中建立 MRI 引导的 FUS BBB 开口，可以选择购买具有高度标准化和可重复效果的设备，并配备用户友好的界面。然而，许多实验室没有为此类仪器的成本做好准备。因此，此协议的主要目标是提供任何实验室都可以建立的起点，以建立他们在该技术方面的专业知识。
FUS BBB 开口现在是一种广泛使用的技术，通常不同组使用各种制剂和麻醉剂，每种剂和麻醉剂都可能影响 BBB 开口和奢侈程度。重要的是，所使用的特定麻醉剂会影响BBB开口的大小，因此在执行此协议38时考虑这一点非常重要。在这里，使用麻醉异氟，因为动物可以保持在异氟的长度的协议和水平的异氟气可以很容易地调整根据动物的呼吸速率和心率。此外，我们用氧气输送异氟兰，因为它比医用空气更容易获得：然而，医疗空气可能允许更广泛的BBB打开39。某些 MRI 对比剂比其他对比剂更适合此协议。例如，在我们手中，即使EBD泄漏明显存在于组织验尸中，加多特利多也没有产生对比度增强。微泡配方也很重要。在这里，我们使用永久脂质微球。其他微泡配方，如全氟丁蛋白A型微泡是现成的，但使用的微泡类型将影响结果15。
功能生成器的控制可能变化很大，因此请参阅手册，了解如何输入第 1 步中列出的设置。适当的命令电压（V 峰值到峰值的功能发生器）强烈取决于传感器属性、RF 放大器增益、转导器匹配的 RF 放大器、动物的年龄和大小、微泡类型和浓度以及所需的处理效果。峰值到峰值 V 需要通过反复试验来确定。从第 1 步中建议的设置开始，并在形态学上确定效果。如果有组织损伤，将峰值降低到峰值 V 10%，再试一次。同样，如果没有BBBO，则将峰值提升至峰值V 10%，然后重试。设置过高的 V 可能会损坏低功耗浸入式传感器。这将明显地作为传感器表面的开裂或失真。传感器的制造提前时间可能很长，因此在启动时，我们建议购买多个传感器作为备份。超声波传感器如果匹配不当，也会损坏放大器。为了简单和可靠性，我们建议使用坚固耐用的功率放大器来驱动复杂的负载（如材料表中的射频功率放大器）。请注意，虽然大功率传感器带有匹配电路，但低功耗浸入传感器没有。建议的 RF 放大器可以处理匹配不良的传感器的反射功率，但此配置中可能会损坏某些放大器。此外，如果步骤 2.7 在安装驱动程序和软件后证明有问题，请仔细检查软件中是否选择了正确的串行端口。接下来尝试不同的串行电缆。如果失败，请寻求本地 IT 支持。
从经验来看，在大脑区域定位中实现精确性需要练习和多次调整。这可以从早期实验（图3）和最近的实验（图5）之间的定位差异中看出。我们开始使用经典的立体轴法框架进行实验，如果无法访问 3D 打印机或无法访问啮齿动物 MRI，我们将在此处将其作为选项。然而，MRI导引与MRI信托和提供的3D可打印框架（或自定义设计）是理想的方法。首先，它通过收集动物体内的坐标来说明动物之间的个体差异，而不是依靠平均老鼠的大脑地图集。此外，使用 MRI 允许确认以体内为目标的 FUS 位置，而不是依赖验尸 EBD 表达。当交付可能需要超过 24 小时才能生效的代理时（如 AAV（图 5）时，这一点很重要。最后，所提供的框架支架允许在 MRI 之后将动物返回到相同的位置，以修复任何定位错误，或在 BBB 开口不足后重复 FUS，而无需重做坐标。便携式 3D 打印立体轴框架可用于 200 mm 或更宽的清晰孔的 MRI。
根据目标位置的血管分布、头骨厚度40、心室的存在等因素，BBB开口的程度可能有所不同。因此，我们提供了一种与框架和框架持有人重复定位的方法。目标的准确性关键取决于将传感器对焦保持在目标指点的一致位置。当传感器连接到 XYZ 定位器时，此指尖应指示传感器对焦中心空间中的位置。磁铁使指尖和传感器在保持这种同位化的同时轻松交换。磁铁中的孔和突起应尽可能精确匹配。此方面的任何变异性都降低了 FUS 焦点定位的可重复性。但是，指尖和超声波对焦之间会有空间偏移。一旦确认偏移是一致的，就可以使用 MR 图像来计算由此产生的 BBB 开口位置（MRI 对比位置）和预期目标位置的毫米差来更正。然后，将此差异考虑在空位置中。准确性和可重复性也从使用相同的超声波频率和在给定一组实验中使用大小和年龄相近的大鼠中获益匪浅。大鼠大脑和大鼠头骨的超声衰减随频率和头骨大小而变化，头骨厚度随年龄而变化。头骨也是超声波脉冲的一个小腔，事件超声波与头骨内部的反射相互作用，产生一个复杂的声场，依赖于组织，头骨，频率和传感器40的位置。
如其他地方所述，此协议旨在为已经可供购买的优秀 MRI 兼容商业解决方案提供低投资替代方案。保持低成本有重要的限制。鉴于物理学和目前的技术状况，该技术也有固有的局限性。值得注意的是，尽管有这些局限性，并且如代表性的结果所示，我们可以以低于毫米的精度实现染料、颗粒和病毒对大鼠海马的一致输送。最重要的局限性是：（1） FUS 聚焦的形状取决于干预组织，尤其是头骨的形状和厚度[...]将动物从 MRI 中取出以执行 FUS 治疗的需要可防止对 FUS 焦点的定位和强度进行实时反馈。如果没有这种实时反馈，需要做几个实验来确认每个目标位置组合的设置。一旦设置被"拨入"，我们发现良好的可重复性。（2） 所构建的XYZ定位和试管系统虽然精确，但从实验到实验的定位器坐标框架并不准确。XYZ家的相对位置、啮齿动物的头骨和框架可以相对地从实验移动到实验。通过使用 MRI 图像进行定位、定位指点和与 FUS 对焦相关的已知空间位置的坐标，确保 MRI 坐标系统与 XYZ 定位器系统平行，在一组实际处理之前进行测试处理，并在一个会话内完成整个过程，使动物无需重新定位到框架中，从而消除了这一影响。请注意，由于只使用一个保真器，框架旋转无法校正，因此确保框架与 MRI 床和孔的水平至关重要。总之，指点位置并不表示真正的 FUS 对焦，但我们发现，只要头骨相对于超声波传感器不旋转，则偏移对于给定的大脑位置是一致的。还要注意，相对于 BBB 开口和成像而言，gadobutrol 递送的一致时间对于一致的结果至关重要，特别是如果 MRI 对比度变化被用作 BBB 开口量的代理（见36）。
我们首先开始在实验室中打开FUS BBB，上面描述了低功耗浸入传感器。我们发现，这是一个负担得起的选择，开始使用这种技术。最重要的是，适应这个协议可以提供一个非侵入性的替代颅内立体轴手术和用这种技术进行的术前研究可以被认为是高度转化的，由于目前使用颅内FUS在人类30，32，41。一旦在实验室中建立，这项技术可以用作立体轴手术的非侵入性替代。因此，将严格的调查工具转变为高度翻译的工具。我们的实验室将利用这项技术进行MRI引导，病毒和纳米粒子的局部传递，以开发新的，非侵入性神经调节技术，可用于自由行为清醒啮齿动物和非人类灵长类动物。目前的工作重点是专为设计师受体（DREADDs）设计的设计师药物，以及神经元对低剂量高能粒子（如X射线）的敏感度。该实验室还在研究此协议的新版本，该协议可以在人类 3 T 扫描仪中执行，以消除在治疗过程中移动动物的需要，并允许实时定位反馈。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究部分得到了NSF EPSCoR研究基础设施基金（1632881）的支持。此外，这项研究部分得到了西维坦国际研究中心的支持，伯明翰，AL。作者感激地感谢阿拉巴马大学伯明翰小型动物成像共享设施赠款 [NIH P30 CA013148] 的服务和设施的使用。作者感谢拉吉夫·乔普拉的支持和指导。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
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