Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En bänktop till den platsspecifika blodhjärnbarriäröppningen med fokuserat ultraljud i en råttmodell

Published: June 13, 2020 doi: 10.3791/61113
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

Summary

Fokuserat ultraljud med mikrobubble agenter kan öppna blod hjärnbarriären focally och övergående. Denna teknik har använts för att leverera ett brett spektrum av medel över blodhjärnbarriären. Denna artikel ger ett detaljerat protokoll för lokaliserad leverans till gnagare hjärnan med eller utan MRI vägledning.

Abstract

Stereotaxisk kirurgi är guldstandarden för lokaliserad läkemedels- och genleverans till gnagarhjärnan. Denna teknik har många fördelar jämfört med systemisk leverans inklusive exakt lokalisering till en målhjärnregion och minskning av off target biverkningar. Stereotaxisk kirurgi är dock mycket invasiv vilket begränsar dess translationella effekt, kräver långa återhämtningstider och ger utmaningar när man riktar in sig på flera hjärnregioner. Fokuserat ultraljud (FUS) kan användas i kombination med cirkulerande mikrobubblor för att tillfälligt öppna blodhjärnbarriären (BBB) i millimeterstora regioner. Detta möjliggör intrakraniell lokalisering av systemiskt levererade agenter som normalt inte kan korsa BBB. Denna teknik ger ett noninvasive alternativ till stereotaxic kirurgi. Hittills har dock denna teknik ännu inte antagits i stor utsträckning i neurovetenskapliga laboratorier på grund av begränsad tillgång till utrustning och standardiserade metoder. Det övergripande målet med detta protokoll är att tillhandahålla en bänktop till FUS BBB-öppning (BBBO) som är prisvärd och reproducerbar och därför lätt kan antas av vilket laboratorium som helst.

Introduction

Trots de många upptäckterna i grundläggande neurovetenskap är antalet framväxande behandlingar för neurodevelopmental och neurodegenerativa störningar fortfarande relativt begränsat1,2. En djupare förståelse för de gener, molekyler och cellulära kretsar som är involverade i neurologiska sjukdomar har föreslagit lovande behandlingar som är orealiserbara hos människor med nuvarande tekniker3. Effektiva behandlingar begränsas ofta av behovet av att vara hjärngenomtränglig och platsspecifik4,5,6,7,8. Befintliga metoder för lokaliserad läkemedelsleverans till specifika hjärnregioner (t.ex. leverans via injektion eller kanyl) är dock invasiva och kräver en öppning som ska göras i skallen9. Invasiviteten i denna kirurgi förhindrar rutinmässig användning av lokaliserad leverans till den mänskliga hjärnan. Dessutom är vävnadsskador och de resulterande inflammatoriska svaren allestädes närvarande confounds för grundläggande och prekliniska studier som förlitar sig på intrakraniell injektion10. Förmågan att noninvasively leverera medel över blodhjärnbarriären (BBB) och rikta dem till specifika hjärnregioner kan ha en enorm inverkan på behandlingar för neurologiska sjukdomar, samtidigt som det ger ett kraftfullt undersökningsverktyg för preklinisk forskning.

En metod för riktad transport över BBB med minimal vävnadsskada är transkraniellt fokuserat ultraljud (FUS) tillsammans med mikrobubblor för att fokusera och tillfälligt öppna BBB11,12,13,14,15,16. FUS BBB-öppning har fått ny uppmärksamhet för behandling av neurodegenerativa störningar, stroke och gliom genom att lokalisera terapier för att rikta in sig på hjärnregioner som neurotrofafaktorer 17,18,19, genterapier20,21,22, antikroppar23, neurotransmittorer24och nanopartiklar25,26,27,28,29. Med sitt breda utbud av applikationer och sin icke-invasiva natur30,31, FUS BBB öppning är ett idealiskt alternativ till rutinmässiga stereotaxiska intrakraniell injektioner. Dessutom, på grund av dess nuvarande användning hos människor30,32, prekliniska undersökningar med denna teknik kan betraktas som mycket translationella. FUS BBB-öppning har dock ännu inte varit en allmänt etablerad teknik inom grundvetenskap och preklinisk forskning på grund av bristande tillgänglighet. Därför tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för en bänktop till FUS BBB-öppning som utgångspunkt för labb som är intresserade av att etablera denna teknik.

Dessa studier genomfördes med antingen en hög effekt luftstödd FUS specifika ultraljud givare eller en låg effekt dämpade fokuserade ultraljud nedsänkning givare. Givaren drevs av en RF-effektförstärkare avsedd för reaktiva belastningar och en vanlig bänkfunktionsgenerator. Information om dessa artiklar finns i materialförteckningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella procedurer gjordes i enlighet med UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) riktlinjer.

1. Fokuserad ultraljudskörningsutrustning setup

  1. Använd 50 Ohm koaxial BNC-kablar för att ansluta (1) ingången av ultraljudsgivaren till utgången av RF-förstärkaren och (2) ingången av RF-förstärkaren till funktionsgeneratorns utgång.
  2. Ställ in funktionsgeneratorläget på en sinusoid burst en gång per sekund med en 1% arbetscykel.
    1. För den dämpade 1 MHz lågeffektsgivaren med en 0,8 tums brännvidd som används med en 50 dB RF-förstärkare ställer du in startinställningarna på: 1 MHz sinusvåg, 1 V topp till topp, 10k cykel, 1 s intervall (eller period).
    2. För den luftstödda, 1,1 MHz högeffektsgivare, ställ in de ursprungliga inställningarna på: 1,1 MHz sinusvåg, 50 mV topp till topp, 11k cykler, 1 s intervall.
      OBS: Använd inte givaren om de inte är nedsänkta. Placera inte en hand eller annan kroppsdel i ultraljudsfokus eller rör vid givarens ansikte medan den är i drift.

2. Fokuserad ultraljud bänkskiva setup

  1. 3D-printa stereotaxiska ramen och den stereotaktiska ramhållaren.
  2. Anslut givaren till XYZ-positioneraren med hjälp av en klämma som håller ett PVC-rör (figur 1a). Skruva fast klämman på X-axelns glid och lås med en vingmutter.
    1. Om du använder ultraljudsgivaren med hög effekt, fäst den på PVC-röret med hjälp av ett matchat par magneter. Se till att den ena magneten har ett hål och den andra har en matchande utskjutning. Kapsej undersidan av PVC-röret och fäst en av magneterna på det med epoxi (se figur 1b).
    2. Fäst den andra magneten på den övre mitten av ultraljudsgivaren med hög effekt med epoxi. Se till att den är i mitten av givaren (Bild 1c).
  3. Om du använder ultraljudsgivaren med hög effekt, gör en pekare för att upphäva XYZ-positioneraren. Spetsen på denna pekare anger platsen i utrymmet i mitten av givarens fokus när ultraljudsgivaren är ansluten till XYZ-positioneraren. Gör en pekare av ett 18 G nålskuret för att vara längden på givarens brännvidd plus givarens tjocklek (figur 1d).
    1. Applicera epoxi på en tredje magnet (denna magnet parar sig också med PVC-lockets magnet) och fäst den på toppen av pekaren. Pekaren kommer då att kunna fästas på magneten på PVC-röret för XYZ-nulling (Figur 1d).
  4. Om du använder den strömsnåla nedsänkningsgivaren skriver 3D-ut filen för pekaren och monteringsklämman.
    1. Fäst den strömsnåla nedsänkningsgivaren på PVC-röret genom att fästa monteringsklämman på PVC-röret och för in givaren i ringen (figur 1f).
  5. Gör ett vattenbad genom att limma ihop bitar som skurits av akrylplåt som kan vila ovanpå djurets huvud ovanför stereotaktiska ramen (Figur 1e).
    1. Skär en öppning i botten av badet som är ungefär lika stort som djurets huvud. Täck hålet i vattenbadet med en polyimidtejp.
      OBS: Var försiktig så att vatten inte läcker runt polyimidtejpen eftersom det kan blöta råttans päls och orsaka hypotermi.
  6. Gör en MR-fiducial genom att fylla en tunnskalad plast- eller glassfär med 4 mm diameter med en MR-synlig vätska (t.ex. E-vitaminolja) och försegla den. Placera den i MRI-fiducialhållaren på höger sida av den 3D-utskrivna stereotaxiska ramen (figur 2a).
  7. Fäst den 3D-printade ramhållaren ordentligt på XYZ-positioneraren på ett bra läge för djurpositionering. Skjut fliken på ramhållarens rostrala ände i den matchande kanalen på Y-axelskenan och fäst med inställda skruvar (Bild 1h, röda pilar).
  8. För att köra XYZ-positioneraren installerar du USB till seriell omvandlare på en dator genom att följa tillverkarens anvisningar och ansluta omvandlaren. Installera programvaran för körningsmiljö och motorstyrenhet på datorn.
    1. Se till att rätt seriell port väljs i programvaran genom att välja USB till seriell omvandlare i rullgardinskontrollen för val av port på styrenhetens frontpanel. Anslut USB till serieomvandlaren till steppermotorns styrenhetslåda med en 9-stifts seriell crossover-kabel (t.ex. RS232 null modemkabel).
    2. Kör styrenhetens programvara för att testa att steppermotorerna kan köras under programvarukontroll. Det här steget kan kräva hjälp av lokal IT-support.

3. Förfarande för intrakraniell inriktning

OBS: Manliga Sprague Dawley råttor som väger 250-350 g användes för dessa experiment. Djur hade fri tillgång till vatten och råtta chow, och bibehölls på en 12:12 h ljus: mörk cykel.

  1. Sätt djuret under anestesi (3% isofluran med syre) och kontrollera för bristen på svar på tånypan. Sätt sedan in katetern enligt beskrivningen nedan.
    1. Värm svansen med en lampa att göra är lättare att träffa venen. Var försiktig så att du inte överhettar djuret eller bränner svansen.
    2. När djuret sover (svarar inte på en tå nypa), sätt in 24 G svansven kateter som kommer att användas för att leverera mikrobubblor, Evans blå färgämne (EBD), gadobutrol MRI kontrast om du använder MRT, och experimentella agenten av intresse. När venen är träffad kommer blodet att fylla mantlarna, långsamt ta bort den inre nålen medan du trycker mantinen längre in i venen.
      OBS: Se en guide som Stuart och Schroeder33 om du gör råttsvansen veninjektioner för första gången.
    3. Om det inte finns något blodflöde, flytta långsamt katetersyltet ur venen för att testa att nålen kan ha petat genom venen. Om blodet strömmar när katetern dras tillbaka något, gick först poke genom venen och kateterplaceringen måste startas om på en annan plats på svansen som är rostral till föregående plats.
  2. Fyll kateterkontakten med saltlösning och skruva fast kateterpluggen i kateterportens ände så snart porten har fyllts med blod. Linda försiktigt labbtejpen runt katetern och svansen för att hålla den på plats. Börja med en liten bit upptill och arbeta i kaudal riktning, lämna själva änden av kateterpluggen exponerad.
  3. Anslut anestesiledningen till anestesikontakten på stereotaxisk ram (figur 2a) och fäst djurens huvud i ramen genom att placera munnen på bettstången och genom att styra öronstängerna i båda öronkanalerna och dra sedan åt de inställda skruvarna. Se till att djurens huvud är säkert och jämnt.
  4. Flytta djuret i MR-sängen och anslut anestesilinjen till näskonen. I detta protokoll användes en 9,4 T liten bore djur MRI.
  5. Samla koronal och axiell T2-viktade bilder som fångar hela hjärnan samt MR-fiducialen (Figur 2b) för koordinatmätningar. Ge den lokala MR-fysikern eller tekniken följande information så att de kan bygga MR-protokollet.
    1. För koronarbilder (Bild 2b överst), använd följande parametrar: antal bilder: 27, bredd: 62,2 mm, höjd: 62,2 mm, djup: 37,97 mm, Voxel storlek: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
    2. För axiella bilder (Bild 2b nederkant), använd följande parametrar: antal bilder: 13, Bredd: 61,47 mm, Höjd: 53,81 mm, Djup: 16,7 mm, Voxel storlek: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3.
      OBS: Det är inte nödvändigt att ha dessa exakta parametrar så länge koronan i flygplansupplösning är nära 0,25 mm och bilderna täcker hela hjärnan och fiducial.
  6. Samla in koordinatmätningar från ovanstående bilder genom att registrera avståndet från MR-fiducialen till hjärnregionen som kommer att riktas mot FUS.
    1. Vid skannern, på de koronalbilder som samlats in i steg 3.5, hittar du bilden där fiducialen är den största, vilket indikerar mitten av fiducialen. Registrera avståndet från toppen av fiducialen till hjärnregionen av intresse för mm (MR-programvaran kommer att ha ett skal- eller punktmätningsverktyg, konsultera lokal MR-teknik eller fysiker om hur man gör detta) i både medial / lateral riktning och i dorsal ventral riktning (Figur 2b, överst).
    2. Vid skannern, på de axiella bilderna som samlats in i steg 3.5, hittar du bilden som visar toppen av fiducialen och mäter avståndet från mitten av fiducialen till målhjärnregionen i både dorsal/ ventral riktning och i mediala / laterala riktningen (Figur 2b, botten).
    3. Jämför de två mediala/laterala mätningarna och använd genomsnittet om de är olika. Dessa koordinatmätningar kommer att användas senare i steg 4.3 för att styra FUS-brännpunkten till målhjärnregionen med XYZ-positioneraren.
  7. Samla mri prescan bilder. Jämför dessa bilder med de bilder som samlats in efter FUS BBB-öppning (Bild 4). T1-viktade bilder kommer senare att användas för att visualisera BBB-öppning, T2-viktade bilder kommer senare att användas för att säkerställa att inga vävnadsskador har uppstått efter FUS-behandling34.
    1. För T1-viktade axiella bilder, använd följande parametrar: bredd: 30 mm, höjd: 51,2 mm, djup: 3,0 mm, voxelstorlek: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3, antal bilder: 13.
    2. För T2-viktade axiella bilder, använd följande parametrar: bredd: 30 mm, höjd: 51,2 mm, djup: 2,6 mm, voxelstorlek: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3, antal bilder: 13.
    3. För T1-viktade koronarbilder, använd följande parametrar: bredd: 30 mm, höjd: 30 mm, djup: 27 mm, voxelstorlek: 0,16 x 0,16 x 1 mm3, antal bilder: 27.
    4. För T2-viktade koronarbilder, använd följande parametrar: bredd: 30 mm, höjd: 30 mm, djup: 27 mm, voxelstorlek: 0,12 x 0,12 x 1 mm3, antal bilder: 27.
      SOM i steg 3.5 behöver dessa bildparametrar inte vara exakt desamma som anges. Dessa bilder har en mindre FOV och högre upplösning än de som samlas in i steg 3.5.
  8. Håll djuret i den stereotaxiska ramen, transportera snabbt djuret från MR-sängen till bänktop fus-installationen. Se till att djuret förblir sovande för överföringen under effekten av anestesi.
  9. För längre överföringstider, använd en låda för överföring som är tillräckligt stor för att passa djuret och ramen. Med anestesipluggen fortfarande fastsatt, placera djuret och ramen inuti lådan och låt överskottet av isofluran fylla lådan i några minuter. Koppla ur anestesilinjen och överför snabbt.

4. Fokuserad ultraljudsprocedur

  1. När du anländer till FUS bänkskiva, anslut omedelbart anestesilinjen i näskonen och fortsätt att köra 1,5-3% isofluran med syre. Gör detta så snabbt som möjligt för att undvika att djuret vaknar.
  2. Skjut in ramen i ramhållaren och fäst den ordentligt. Använd klippare för att raka djurets huvud. Borsta bort överflödigt hår och applicera hårborttagningskräm på hårbotten. Låt sitta i 3 min och torka bort med vatten och gasväv.
  3. Om MRT inte är tillgängligt för inriktning, använd en standard (inte 3D-utskriven) stereotaktisk ram för att upphäva pekarpositionen till bregma genom att röra pekarspetsen till bregma (ett hårbottensnitt kommer att behövas för detta) och upphäva programvaran eller spela in koordinaterna. Flytta XYZ-vagnen uppåt med 50 mm genom att klicka på upp 50-knappen i programvaran och byta pekaren mot givaren. Baserat på en råtta hjärnatlas som beskrivitstidigare 35, flytta till önskade hjärnkoordinater med hjälp av stegknapparna i programvaran. Om du använder den här metoden i stället för MRT går du ner till avsnitt 4.6.
  4. Om du använder MRT-vägledning, fäst pekaren och flytta pekaren till platsen för MR-fiducialen(figur 1d,g). Placera pekaren högst upp och i mitten av MR-fiducialen (ett litet hål i toppen av fiducialhållaren är placeringen för pek). Klicka på nullpositionsknappen som är den punkt från vilken alla avstånd i MR-bilden beräknades.
  5. Ta bort pekaren och flytta positioneraren till de mediala/laterala koordinaterna och rostrala/kaudala koordinaterna. Lyft upp positioneraren genom att trycka på upp 50-knappen för att möjliggöra placering av vattenbadet och ultraljudsgelen. Om toppen av Z-axelns resa nås ogiltigförklaras nulling-platsen. Dorsal/ventral koordinaten ställs in efter att givaren har lagts till.
  6. Applicera ultraljudsgel på djurets hårbotten och placera vattenbadet över djuret med polyimidtejpfönstret pressat på gelén. Se till att det inte finns några luftbubblor i ultraljudsgelen.
  7. Fyll vattenbadet med avgasat vatten.
  8. Om du använder högeffektsgivaren, sänk positioneraren så att magneten är precis ovanför vattnet. Fäst givaren på positioneraren genom att försiktigt sänka givaren i vattnet i en vinkel för att förhindra att luftbubblor fastnar under ansiktet och ansluter magneterna.
  9. Om du använder lågeffektsgivaren, sänk ned positioneraren i vattnet precis ovanför givarens klämma. Fäst sedan givaren på plats genom att långsamt sänka den i vattnet i en vinkel för att förhindra att luftbubblor fastnar under ansiktet.
    OBS: Ett genomskinligt bad är till hjälp när du tittar under givarens ansikte efter bubblor.
  10. Sänk positioneraren till dorsal/ventral koordinat.
  11. Slå på RF-strömförstärparna.
  12. Injicera 1 ml/kg 3% Evans blå färgämne (EBD) genom att sticka in nålspetsen i kateterkontakten och injicera. Låt den cirkulera i 5 minuter.
  13. Aktivera mikrobubblorna genom att skaka dem våldsamt med bubbelskakapparaten.
    1. Bered 5x dosen 30 μL/kg mikrobubblor (bubbelkonkak. 1,2 x10 10/ml) i 0,2 ml saltlösning för att ta hänsyn till de 2 FUS-behandlingarna och slangarna i det 18 G bevingade infusionssetet. Om råttan till exempel väger 200 g, fyll sedan sprutan som innehåller 18 G nålspets med 30 μL mikrobubblor i 1 ml saltlösning.
      OBS: Se till att använda 18 G nålspetsar för både upptagande och injektion med det vingade infusionssetet.
    2. Vänd sprutan flera gånger för att få en jämn fördelning av mikrobubblor. Fäst sedan och fyll det vingade infusionssetet. Placera sprutan på infusionspumpen och ställ in infusionspumpen så att den levererar 0,2 ml med en hastighet av 6 ml/h. Detta kommer att ge långsam infusion av mikrobubblorna under 2-minuters FUS-exponeringen.
    3. Sätt in den vingade nålen i kateterkontakten.
  14. Kör först infusionspumpen, vänta 3 s och starta FUS-behandlingen genom att trycka på strömbrytaren på funktionsgeneratorn (märkt "på" på funktionsgeneratorn i materialtabellen). Upprepa dessa två gånger per region med 5 minuter däremellan så att mikrobubblorna kan rensas.
    1. Tryck på på-knappen igen på funktionsgeneratorn för att stoppa FUS-behandlingen när infusionspumpen stannar vid 2 min.
    2. Vänta i 5 minuter tills mikrobubblorna är klara. Starta sedan infusionen och den andra FUS-behandlingen.
    3. Omedelbart efter den andra FUS-behandlingen, injicera gadobutrol kontrast (om du använder MRI) och medlet av intresse, till exempel virala partiklar. Den totala levererade volymen av alla agenser får inte överstiga 5 ml/kg.
      OBS: Tidpunkten för leverans (t.ex. före eller efter FUS BBB-öppning) för det medel som är av intresse kan variera beroende på vilket medel som används.
  15. Stäng av RF-strömförstätarna och transportera omedelbart djuret tillbaka till MRI.

5. MR-bekräftelse av BBB-öppning

  1. Om MRT inte är tillgängligt, hoppa till avsnitt 6 och använd EBD-uttryck för bekräftelse av BBB-öppning.
  2. Placera djuret tillbaka på MR-sängen på exakt samma plats som i steg 3.7 och anslut anestesilinjen.
  3. Samla mri post skanningar med samma bildparametrar som används i steg 3.7 för att visualisera gadobutrol MRI förbättring i regionen BBB öppning (Figur 3b,e).

6. Perfusion och vävnadsinsamling

  1. Granska djuret med kallt 4% formalin tills blodet rinner helt klart.
  2. Ta bort hjärnan och placera i 4% formalin eller PFA vid 4 °C över natten. Placera sedan hjärnan i 30% sackaroslösning tills hjärnan sjunker (ca 2-3 dagar). Slutligen, blixt frysa i flytande kväve eller på torr is och lagra vid -80°C tills cryosectioning.
  3. Frys hjärnan i OCT och ta cryosections.
  4. Fixera och täck sektioner för fluorescensmikroskopi. EBD excitation toppar på 470 och 540 nm och utsläpp toppar på 680 nm. Täcklip med DAPI monteringsmedium för att visualisera övergripande cellulär morfologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här visar vi att fokuserat ultraljud med mikrobubblor kan inducera lokaliserad BBB-öppning med hjälp av de parametrar som anges ovan med både lågeffektssänkningsgivaren (figur 3) och FUS-givaren (Figur 4). För det första riktades nedsänkningsgivaren i tidiga experiment till en hjärnhalva antingen främre (figur 3b) eller mediala (Figur 3a). Djuren offrades sedan 2 timmar senare med perfusion (figur 3a) eller utan perfusion (figur 3b) och 10 μm frysta hjärnsektioner samlades in. FUS BBB-öppning var uppenbar av EBD autofluorescens (excitation: 470 och 540 nm, utsläpp: 680 nm) i målhalvan (vita pilar Figur 3a och 3b).

Vi har funnit det bäst att granska djuren för tydlig visualisering av BBB-öppning med EBD autofluorescens. BBB-öppningen kan dock fortfarande visualiseras utan att blodkärlen rensas (figur 3b). Mobilupptag och klarering av EBD efter BBB-öppning börjar så snart som 30 minuter efter BBB-öppning och ökar över 24 timmar37. För utvärdering av BBB-öppning med EBD autofluorescens är det bäst att offra djuret mellan 15 minuter och 3 timmars BBB-öppning. Men i slutändan kommer offertiden att bero på agenten som levererades. I en AAV-studie kan till exempel 3 veckor efter BBB-öppning och AAV-leverans (figur 5c) vara lämpligt.

I senare experiment var FUS-givaren inriktad på antingen hippocampus (figur 4a-c ) eller den främre cingulate cortex (ACC) (Figur 4 d-f) och förutom EBD injicerades MRI-kontrastmedlet gadobutrol (0,1 ml/kg) IV för att verifiera riktad öppning av BBB in vivo. Figur 4b,e visa förbättrad MRI kontrast där gadobutrol kontrasten har gått in i vävnaden 1 timme efter BBB öppning och kontrast agent injektion. Denna kontrastförändring är uppenbar när man jämför med de mri-prescans som togs före FUS-förfarandet(figur 4a,d). Djur offrades sedan genom perfusion 1,5 timmar efter BBB-öppning och 10 μm cryosections samlades in. EBD:s autofluorescens är uppenbar i FUS-målregioner som ytterligare anger var BBB öppnades(figur 4c,f). Denna siffra belyser hur MR-kontrast ibland kan vara svår att se (som i skillnaden mellan figur 4b och figur 4e). Därför är det bra att bekräfta BBB öppning med visualisering av EBD autofluorescens som i fluorescens mikrografen i figur 4f.

För att bedöma om denna teknik kunde användas för den riktade gen leverans AAV9-hsyn-GFP och gadobutrol kontrast injicerades IV (titer: 1,32 x 1014 GC/mL, 0,05 mL/kg) omedelbart efter BBB öppna i hippocampus. Djuret var sedan MR avbildas 30 minuter efter BBB öppning och offras 3 veckor senare genom perfusion. 10 μm cryosections samlades in för fluorescerande bildframställning av GFP uttryck. BBB öppning var uppenbart av gadobutrol kontrast i målet hippocampus (Figur 5a,b). Dessutom bekräftades gen leverans av GFP uttryck i målet hippocampus uppenbart av grön fluorescens (Figur 5c). Observera att EBD vid denna tidpunkt har rensat ut och endast är uppenbart i ventriklarna (figur 5c).

Figure 1
Bild 1: FUS bänkskiva. (a) FUS-inställning inklusive XYZ-positioneraren, ett PVC-rör med 30 mm diameter för fastsättning av givaren, den 3D-printade stereotaxiska ramen och infusionspumpen. b)PVC-rörets ände är kapsejsad och en magnet är fäst vid den med epoxi. c)En annan matchande magnet är fäst vid den övre mitten av högeffektsgivaren med epoxi. d)Dessutom fästs en annan matchande magnet på pekaren för att nollställa positioneraren högst upp och i mitten av MR-fiducialen. ( e) Pekaren ersätts så småningom med högeffektsgivaren och ett vattenbad kopplas till djurets huvud med ultraljudsgel. f)Den strömsnåla nedsänkningsgivaren kan fästas på PVC-röret med den 3D-printade givarens klämma. g)För positionering ersätts givaren med den 3D-utskrivna pekaren och positioneraren är nulled högst upp och i mitten av MR-fiducialen. h)Den stationära 3D-printade ramhållaren gör det möjligt att återföra djuret till samma position efter MRT om flera FUS-behandlingar behövs. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Stereotaxisk ram med MR-fiducial för MR-styrda koordinater. a)Djuren placeras först i en 3D-printad stereotaxisk ram utrustad med en MR-fiducial. b) Ramen placeras sedan inuti MR-sängen och avståndet från den fiduciala (prickade cirkeln) till målhjärnregionen mäts med hjälp av både koronalbilder för dorsala/ventrala (D/V) mätningar och axiella bilder för rostral/kaudal (R/C) mätningar, mediala/laterala (M/L) mätning kan samlas in från båda axlarna. Djur hålls i ramen och överförs till FUS-stationen där en pekare används för att nollställa XYZ-positioneraren på fiducialens plats. Pekaren ersätts sedan med givaren och som sedan kan flyttas baserat på de insamlade koordinaterna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Evans blå färgämne (EBD) bekräftar FUS BBB öppning både med och utan perfusion. a)Mikrograf av en 10 μm hjärnsektion 2 timmar efter FUS BBB-öppning med den lågeffektiga nedsänkningsgivaren riktad mot den mediala vänstra halvklotet. Detta är en representativ bild av ett djur som perfused med 4% buffrade formalin före vävnad insamling. BBB-öppningen framgår av EBD:s röda autofluorescens (pil). b)Mikrograf av en 10 μm hjärnsektion 2 timmar efter FUS BBB öppning riktad mot främre vänstra halvklotet. Detta är en representativ bild av ett djur som inte perfused före vävnad insamling därför, EBD förblir i blodkärlen. BBB-öppningen är uppenbar där EBD har läckt ut ur blodkärlen (pil). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: FUS BBB öppning bekräftas med Gadobutrol MRI kontrast och EBD uttryck. MR-bilder före( a och d) och efter( b och e) BBB-öppning. gadobutrol kontrast förbättring bekräftar placeringen av BBB öppning in vivo (b och e, pilar). c)10 μm hjärnsektion som visar ytterligare bekräftelse av BBB-öppning med EBD autofluorescens (röd) i hippocampus (blå DAPI nukleär fläck). Skalbar; 500 μm. (f) Mikrograf av en 10 μm hjärnsektion efter BBB öppning i den främre cingulate cortex som framgår av EBD röd autofluorescens (pil). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Lokaliserad leverans av AAV9-hsyn-GFP till hippocampus via FUS BBB-öppning. MR-bekräftelse av BBB-öppning med MRI-kontrastmedel, MR-kontrast (pilar) i både koronal (a) och axiella (b) T1-viktade bilder. c)Histologisk bekräftelse av GFP-uttrycket i FUS riktade hippocampus (grön) 3 veckor efter FUS BBB-öppning och AAV9- hsyn-GFP IV injektion. Blått indikerar DAPI nukleära fläck för övergripande cellulära morfologi. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskrev vi en bänktop till mikrobubble assisterad FUS BBB öppning med alternativa tillvägagångssätt inklusive, två olika givare och metoder för intrakraniell inriktning med och utan MRI vägledning. För närvarande, för att upprätta MR-guidad FUS BBB-öppning i labbet, finns det möjlighet att köpa utmärkta färdiga enheter som ger mycket standardiserade och reproducerbara resultat med användarvänliga gränssnitt. Många laboratorier är dock inte förberedda för kostnaden för sådana instrument. Därför är huvudsyftet med detta protokoll att ge en utgångspunkt som alla labb kan upprätta för att bygga sin expertis inom tekniken.

FUS BBB-öppning är nu en allmänt använd teknik och det är ofta så att olika grupper använder en mängd olika medel och bedövningsmedel, som var och en kan påverka graden av BBB-öppning och extravasation. Det är viktigt att det särskilda bedövningsmedel som används kan påverka omfattningen av BBB-öppningen, så det är viktigt att överväga detta vid körning av detta protokoll38. Här används bedövningsisfluran eftersom djur kan hållas under isofluran under protokollets längd och nivåerna av isoflurangas lätt kan justeras baserat på djurets andningshastighet och hjärtfrekvens. Dessutom levererade vi isofluran med syre eftersom det var mer tillgängligt än medicinsk luft; Medicinsk luft kan dock tillåta mer omfattande BBB-öppning39. Vissa MR-kontrastmedel är lämpligare för detta protokoll än andra. Till exempel, i våra händer, gadoteridol producerade ingen kontrast förbättring även när EBD läckage var tydligt närvarande i vävnad postmortem. Mikrobubble formulering är också viktigt. Här använder vi perflutren lipidmikrosfärer. Andra mikrobubble formuleringar såsom perflutren protein-typ A mikrobubblor är lätt tillgängliga, men den typ av mikrobubble som används kommer att påverka resultaten15.

Kontroller av funktionsgeneratorer kan variera en hel del, så se manualen för instruktioner om hur du anger inställningarna som anges i steg 1. Lämplig kommandospänning (V-topp för att nå toppen på funktionsgeneratorn) beror starkt på givarens egenskaper, RF-förstärkarförstärkarförstärkare, RF-förstärkare till givarematchning, djurets ålder och storlek, mikrobubbletyp och koncentration och önskad behandlingseffekt. Toppen till topp V måste bestämmas av försök och fel. Börja med de inställningar som föreslås i steg 1 och bestäm effekten histologiskt. Om det finns vävnadsskador, sänk toppen till topp V med 10% och försök igen. På samma sätt, om det inte finns någon BBBO, höj sedan toppen till topp V med 10% och försök igen. Att ställa in för högt av ett V kan skada lågeffektsgivaren. Detta kommer att vara uppenbart som en sprickbildning eller förvrängning av givarens ansikte. Tillverkningsledtiderna på givare kan vara långa, så när vi startar föreslår vi att du köper mer än en givare som en säkerhetskopia. Ultraljudsgivare kan också skada förstärkare om de är felaktigt matchade. För enkelhet och tillförlitlighet föreslår vi att du använder en robust effektförstärkare som kan driva komplexa belastningar (till exempel RF-effektförstärkaren i materialbordet). Observera att även om högeffektsgivaren levereras med en matchande krets, gör inte den låga effektsänkningsgivaren det. Den föreslagna RF-förstärkaren kan hantera den reflekterade kraften från den dåligt matchade givaren, men vissa förstärkare kan skadas i den här konfigurationen. Om steg 2.7 visar sig vara problematiskt efter att ha installerat drivrutinen och programvaran, dubbelkolla att rätt seriell port är vald i programvaran. Prova sedan en annan seriell kabel. Om det misslyckas, sök då lokalt IT-stöd.

Av erfarenhet kommer det att krävas övning och flera justeringar för att uppnå snäv noggrannhet i hjärnans regioninriktning. Detta kan ses i skillnaderna i inriktning mellan de tidiga experimenten(figur 3)och de senaste experimenten (figur 5). Vi började experimenten med en klassisk stereotaxisk ram och vi inkluderar det som ett alternativ här om det inte finns tillgång till en 3D-skrivare eller om det inte finns tillgång till gnagare MRI. MR-vägledning med MR-fiducials och den 3D-utskrivbara ramen (eller av en anpassad design) är dock den perfekta metoden. För det första står det för individuella skillnader mellan djur genom att samla koordinater inom djuret snarare än att förlita sig på en genomsnittlig råtthjärnatlas. Dessutom gör användningen av MRT det möjligt att bekräfta FUS-lokaliseringsinriktning in vivo snarare än att förlita sig på EBD-uttryck efter döden. Detta är viktigt vid leverans av agenter som kan ta mer än 24 timmar att träda i kraft,t.ex. Slutligen gör den medföljande ramhållaren det möjligt att återföra djuret till samma position efter MRT för att åtgärda eventuella inriktningsfel eller upprepa FUS efter otillräcklig BBB-öppning utan att behöva göra om koordinaterna. Den bärbara 3D-printade stereotaxiska ramen kan användas i alla MRI med ett klart borrhål på 200 mm eller bredare.

Beroende på blodkärlsfördelningen på målplatsen,skalltjocklek 40, närvaron av ventriklar och andra faktorer kan graden av BBB-öppning variera. Av denna anledning tillhandahåller vi en metod för upprepad inriktning med ram- och ramhållaren. Noggrannheten i inriktningen beror kritiskt på att hålla givaren fokuserad på en konsekvent plats med avseende på målpekaren. Spetsen på denna pekare ska ange platsen i utrymmet i mitten av givarens fokus när givaren är ansluten till XYZ-positioneraren. Magneterna gör det möjligt att enkelt byta pekare och givare samtidigt som denna colocalization bibehålls. Hålet och utskjutningen i magneterna bör matcha så exakt som möjligt. Eventuell variabilitet i detta sammanhang minskar repeterbarheten för FUS-fokusinriktningen. Det kommer dock att finnas en rumslig förskjutning mellan pekarspetsen och ultraljudsfokus. När det har bekräftats att förskjutningen är konsekvent kan den korrigeras med hjälp av MR-bilderna för att beräkna skillnaden i mm av den resulterande BBB-öppningsplatsen (platsen för MRI-kontrasten) och den avsedda målplatsen. Denna skillnad kan sedan räknas in i null-platsen. Noggrannhet och repeterbarhet drar också stor nytta av att använda samma ultraljudsfrekvens och använda råttor av liknande storlek och ålder i en viss uppsättning experiment. Ultraljud dämpning av råtta hjärnan och råtta skalle varierar med frekvens och skalle storlek och skalle tjocklek varierar med ålder. Skallen är också en liten hålighet med avseende på ultraljudspulsen och incidenten ultraljud interagerar med reflektioner inuti skallen för att producera ett komplext ljudfält som är beroende av vävnad, skalle, frekvens och givarens position40.

Som nämnts på annat håll är detta protokoll avsett att tillhandahålla ett låginvesteringsalternativ till utmärkta MRT-kompatibla kommersiella lösningar som redan finns att köpa. Det finns viktiga begränsningar som är resultatet av att hålla kostnaden låg. Det finns också begränsningar som är inneboende i tekniken med tanke på fysiken och det aktuella tillståndet i konsten. Anmärkningsvärt, trots dessa begränsningar, och som visas i de representativa resultaten, kan vi uppnå konsekvent leverans av färgämnen, partiklar och virus till hippocampus av råttor med submillimeter noggrannhet. De viktigaste begränsningarna är att (1) formen på FUS-fokus beror på den mellanliggande vävnaden och särskilt skallens form och tjocklek{...}. Behovet av att ta bort djuret från MRI för att utföra FUS-behandlingen förhindrar feedback i realtid om lokaliseringen och intensiteten i FUS-fokus. Utan denna realtidsfeedback måste flera experiment göras för att bekräfta inställningen för varje kombination av inriktningsplats. När inställningarna har "ringts in" har vi hittat god repeterbarhet. (2) XYZ-positionerings- och fiducialsystemet, även om det är exakt, ger inte exakthet i positionerarens koordinatram från experiment till experiment. De relativa platserna för XYZ-hemmet, gnagarens skalle och ramen kan röra sig i förhållande till varandra från experiment till experiment. Detta undanränks genom att använda en MR-bild för inriktning, en målpekare och fiducial med känd plats i rymden i förhållande till FUS-fokus, vilket säkerställer att MRI-koordinatsystemet är parallellt med XYZ-positionerarsystemet, genom att göra testbehandlingar före uppsättningen av verkliga behandlingar och genom att göra hela proceduren inom en session så att djuret inte behöver flyttas in i ramen. Observera att eftersom endast en fiducial används kan ramrotationer inte korrigeras, så det är viktigt att se till att ramen är jämn med avseende på MR-sängen och borrhålet. Sammanfattningsvis indikerar pekarplatsen inte det sanna FUS-fokuset, men vi har funnit att förskjutningen är konsekvent för en viss hjärnplats förutsatt att skallen inte roterar i förhållande till ultraljudsgivaren. Observera också att konsekvent tidpunkt för gadobutrol leverans i förhållande till BBB öppning och bildbehandling är avgörande för konsekventa resultat, särskilt om MRI kontrast förändring används som en proxy för mängden BBB öppning (se 36).

Vi började först FUS BBB öppning i labbet med låg effekt nedsänkning givare beskrivs ovan. Vi fann att det är ett prisvärt alternativ för att komma igång med denna teknik. Viktigast av allt, anpassning av detta protokoll kan ge ett icke-invasivt alternativ till intrakraniell stereotaxisk kirurgi och preklinisk forskning som utförs med denna teknik kan betraktas som mycket translationell på grund av den nuvarande användningen av transkraniell FUS hos människor30,32,41. När den väl har etablerats i ett labb kan denna teknik användas som ett icke-invasivt alternativ till stereotaxisk kirurgi. Således omvandlar ett strikt undersökande verktyg till ett mycket translationellt verktyg. Vårt labb kommer att använda denna teknik för MRI-guidad, lokaliserad leverans av virus och nanopartiklar för att utveckla nya, icke-invasiva neuromoduleringstekniker som kan användas för att fritt bete sig vakna gnagare och icke-mänskliga primater. Det nuvarande arbetet fokuserar på designerdroger uteslutande utformade för designerreceptorer (DREADDs) och sensibilisering av nervceller till låga doser av högenergipartiklar som röntgenstrålar. Labbet arbetar också på en ny version av detta protokoll som kan utföras i en mänsklig 3 T-skanner för att eliminera behovet av att flytta djuret under behandlingen och för att tillåta realtidsinriktad feedback.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes delvis av ett NSF EPSCoR Research Infrastructure-anslag till Clemson University (1632881). Dessutom stöddes denna forskning delvis av Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Författarna erkänner tacksamt användningen av tjänsterna och faciliteterna vid University of Alabama vid Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Författarna erkänner Rajiv Chopra för hans stöd och vägledning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bubble shaker Lantheus Medical Imaging VMIX VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles
Catheter plug/ Injection cap SAI infusion technologies Part Number: IC Catheter plug/ Injection cap
Evans blue dye Sigma E2129-10G Evans blue dye
Function generator Tektronix AFG3022B Dual channel, 250MS/s, 25MHz
FUS transducer, 1.1MHz FUS Instruments TX-110 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone
Heating pad for Mice and Rats Kent Scientific PS-03 Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats
Infusion pump KD Scientific 780100 KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump
Kapton tape Gizmo Dorks https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91		 Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack
Low power immersion transducer, 1MHz Olympus V303-SU Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF
Magnet sets WINOMO https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC		 WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets
RF amplifier E&I A075 75W
Tail vein catheter BD 382512/ Fisher Item: NC1228513 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged)
Ultrasound contrast microbubbles Lantheus Medical Imaging DE4, DE16 DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere)
Ultrasound gel Aquasonic https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		 Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle
Winged infusion sets, 22ga. Fisher Healthcare 22-258087 Terumo Surflo Winged Infusion Sets
motor controller software N/A N/A custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller
runtime environment for the motor controller software National Instruments LabView runtime engine version 2017 or better https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) Velmex
bolts Velmex MB-1 BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3
motor controller Velmex VXM-3 Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1
mounting cleats Velmex MC-2 Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6
mounting cleats Velmex MC-2 Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2
usb to serial converter Velmex VXM-USB-RS232 USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1
x-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
x-axis stepper motor Velmex PK266-03A-P1 Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
y-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
y-axis stepper motor Velmex PK266-03A-P1 Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis damper Velmex D6CL-6.3F D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
z-axis stepper motor Velmex PK266-03B-P2 Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
3D printable files
Immersion transducer mount and pointer https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq
Stereotaxic frame https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
Stereotaxic frame holder https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX
9.4T small bore animal MRI Bruker Bruker BioSpec 94/20 ParaVision version 5.1
AAV9-hsyn-GFP Addgene
Cream hair remover Church & Dwight Nair cream
gadobutrol MRI contrast agent Bayer Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)
Stereotactic frame Stoelting #51500 not MRI compatible
turnkey FUS delivery device FUS Instruments RK-300 ready to use MRI compatible FUS for rodents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
  2. Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
  3. Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
  6. Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
  7. Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
  8. Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
  9. Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
  10. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  11. Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197 (2013).
  12. Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
  13. Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
  14. Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15 (2018).
  15. Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986 (2018).
  16. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  17. Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
  18. Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
  19. Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
  20. Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
  21. Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
  22. Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
  23. Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
  24. Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
  25. Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
  26. Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
  27. Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
  28. Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
  29. Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
  30. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
  31. Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86 (2019).
  32. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
  33. Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
  34. Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
  35. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  36. Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
  37. Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
  38. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
  39. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
  40. O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
  41. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).

Tags

Neurovetenskap Nummer 160 Fokuserat ultraljud Blodhjärnbarriär icke-invasiv neuromodulering läkemedelsleverans icke-invasiv läkemedelsleverans stereotaxisk kirurgi
En bänktop till den platsspecifika blodhjärnbarriäröppningen med fokuserat ultraljud i en råttmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rich, M., Whitsitt, Q., Lubin, F.,… More

Rich, M., Whitsitt, Q., Lubin, F., Bolding, M. A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model. J. Vis. Exp. (160), e61113, doi:10.3791/61113 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter