Summary
Gli ultrasuoni focalizzati con agenti microbolli possono aprire la barriera ematica in modo focale e transitorio. Questa tecnica è stata utilizzata per fornire una vasta gamma di agenti attraverso la barriera eencefalica. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la consegna localizzata al cervello del roditore con o senza guida per la risonanza prima.
Abstract
La chirurgia stereotassica è il gold standard per la somministrazione localizzata di farmaci e geni al cervello dei roditori. Questa tecnica ha molti vantaggi rispetto alla consegna sistemica, tra cui una localizzazione precisa in una regione cerebrale bersaglio e la riduzione degli effetti collaterali fuori bersaglio. Tuttavia, la chirurgia stereotassica è altamente invasiva, il che limita la sua efficacia traslizionale, richiede lunghi tempi di recupero e fornisce sfide quando si prendono di mira più regioni cerebrali. Gli ultrasuoni focalizzati (FUS) possono essere utilizzati in combinazione con microbolle circolanti per aprire transitoriamente la barriera emiencefalica (BBB) in regioni di dimensioni millimetriche. Ciò consente la localizzazione intracranica di agenti forniti sistemicamente che normalmente non possono attraversare la BBB. Questa tecnica fornisce un'alternativa non invasiva alla chirurgia stereotassica. Tuttavia, ad oggi questa tecnica deve ancora essere ampiamente adottata nei laboratori di neuroscienze a causa del limitato accesso alle attrezzature e ai metodi standardizzati. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un approccio da banco all'apertura FUS BBB (BBBO) che sia conveniente e riproducibile e possa quindi essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio.
Introduction
Nonostante le numerose scoperte nelle neuroscienze di base, il numero di trattamenti emergenti per i disturbi neurosviluppo e neurodegenerativirimane relativamente limitato 1,2. Una comprensione più profonda dei geni, delle molecole e dei circuiti cellulari coinvolti nei disturbi neurologici ha suggerito trattamenti promettenti irrealizzabili nell'uomo con le tecniche attuali3. I trattamenti efficaci sono spesso limitati dalla necessità di essere penetrabili cerebralmente e specifici del sito4,5,6,7,8. Tuttavia, i metodi esistenti di somministrazione localizzata di farmaci in specifiche regioni cerebrali (ad esempio, parto tramite iniezione o cannula) sono invasivi e richiedono un'apertura da fare nel cranio9. L'invasività di questo intervento previene l'uso di routine del parto localizzato nel cervello umano. Inoltre, i danni ai tessuti e le conseguenti risposte infiammatorie sono onnipresenti confondimenti per studi di base e preclinici che si basano sull'iniezione intracerebrale10. La capacità di fornire in modo non invasivo agenti attraverso la barriera epatica (BBB) e indirizzarli verso specifiche regioni cerebrali potrebbe avere un enorme impatto sui trattamenti per i disturbi neurologici, fornendo allo stesso tempo un potente strumento investigativo per la ricerca preclinica.
Un metodo di trasporto mirato attraverso la BBB con danni minimi ai tessuti è l'ecografia transcranici focalizzata (FUS) insieme alle microbolle per aprire focalmente e transitoriamente la BBB11,12,13,14,15,16. L'apertura della FUS BBB ha attirato la recente attenzione per il trattamento dei disturbi neurodegenerativi, dell'ictus e del glioma localizzando le terapie per colpire le regioni cerebrali come i fattorineurotrofici 17,18,19,le terapie geniche20,21,22,anticorpi 23,neurotrasmettitori24e nanoparticelle25,26,27,28,29. Con la sua vasta gamma di applicazioni e la sua natura non invasiva30,31, l'aperturaFUS BBB è un'alternativa ideale alle iniezioni intracranici stereotassiche di routine. Inoltre, a causa del suo uso attualenell'uomo 30,32, le indagini precliniche che utilizzano questa tecnica possono essere considerate altamente trasmissizionali. Tuttavia, l'apertura della FUS BBB deve ancora essere una tecnica ampiamente consolidata nella scienza di base e nella ricerca preclinica a causa della mancanza di accessibilità. Pertanto, forniamo un protocollo dettagliato per un approccio da banco all'apertura di FUS BBB come punto di partenza per i laboratori interessati a stabilire questa tecnica.
Questi studi sono stati condotti con un trasduttore ad ultrasuoni specifico FUS ad alta potenza o con un trasduttore ad immersione ad ultrasuoni focalizzato a bassa potenza. I trasduttori erano azionati da un amplificatore di potenza RF progettato per carichi reattivi e da un generatore di funzioni da banco standard. I dettagli per questi articoli sono disponibili nella tabella dei materiali.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state fatte in conformità con le linee guida dell'UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Configurazione mirata delle apparecchiature di guida ad ultrasuoni
- Utilizzare 50 cavi BNC coassiali Ohm per collegare (1) l'ingresso del trasduttore ad ultrasuoni all'uscita dell'amplificatore RF e (2) l'ingresso dell'amplificatore RF all'uscita del generatore di funzioni.
- Impostare la modalità generatore di funzioni su un'esplosione sinusoidale una volta al secondo con un duty cycle dell'1%.
- Per il trasduttore ad immersione a bassa potenza da 1 MHz con una distanza focale di 0,8 pollici utilizzato con un amplificatore RF da 50 dB, impostare le impostazioni di partenza su: 1 onda sine MHz, 1 V picco al picco, ciclo 10k, intervallo 1 s (o periodo).
- Per il trasduttore ad alta potenza a 1,1 MHz, impostare le impostazioni iniziali su: onda sine da 1,1 MHz, picco a picco di 50 mV, cicli 11k, intervallo 1 s.
NOTA: Non azionare i trasduttori a meno che non siano sommersi. Non posizionare una mano o un'altra parte del corpo alla messa a fuoco ad ultrasuoni o toccare il viso del trasduttore mentre è in funzione.
2. Configurazione mirata del banco ad ultrasuoni
- Stampa 3D il telaio stereotassico e il porta telaio stereotattico.
- Collegare il trasduttore al posizionatore XYZ utilizzando un morsetto che tiene un tubo in PVC (Figura 1a). Bullonare il morsetto sullo scivolo dell'asse X e bloccarlo con un dado dell'ala.
- Se si utilizza il trasduttore ad ultrasuoni ad alta potenza, attaccarlo al tubo in PVC utilizzando una coppia di magneti abbinati. Assicurarsi che un magnete abbia un foro e l'altro abbia una sporgenza corrispondente. Fissare la parte inferiore del tubo in PVC e attaccarne uno dei magneti utilizzando l'epossidico (vedere figura 1b).
- Attaccare il secondo magnete al centro superiore del trasduttore ad ultrasuoni ad alta potenza utilizzando epossidico. Assicurarsi che si trova al centro del trasduttore (Figura 1c).
- Se si utilizza il trasduttore ad ultrasuoni ad alta potenza, creare un puntatore per annullare il posizionatore XYZ. La punta di questo puntatore indica la posizione nello spazio del centro della messa a fuoco del trasduttore quando il trasduttore ad ultrasuoni è collegato al posizionatore XYZ. Creare un puntatore da un ago da 18 G tagliato per essere la lunghezza della distanza focale del trasduttore più lo spessore del trasduttore (Figura 1d).
- Applicare epossidico su un terzo magnete (questo magnete si abbina anche al magnete del cappuccio in PVC) e attaccarlo alla parte superiore del puntatore. Il puntatore sarà quindi in grado di attaccare al magnete sul tubo in PVC per l'annullamento di XYZ (Figura 1d).
- Se si utilizza il trasduttore ad immersione a bassa potenza, stampare in 3D il file per il puntatore e la clip di montaggio.
- Collegare il trasduttore ad immersione a bassa potenza al tubo in PVC ritagliando la clip di montaggio sul tubo in PVC e inserire il trasduttore nell'anello (Figura 1f).
- Fare un bagno d'acqua incollando insieme pezzi tagliati da lamiera acrilica che saranno in grado di riposare sopra la testa dell'animale sopra il telaio stereotattico (Figura 1e).
- Tagliare un'apertura nella parte inferiore del bagno che ha circa le dimensioni della testa dell'animale. Coprire il buco nel bagno d'acqua con un nastro di poliimmide.
NOTA: Fare attenzione a garantire che l'acqua non perda intorno al nastro di poliimmide in quanto può bagnare la pelliccia del topo e causare ipotermia.
- Tagliare un'apertura nella parte inferiore del bagno che ha circa le dimensioni della testa dell'animale. Coprire il buco nel bagno d'acqua con un nastro di poliimmide.
- Rendere una risonanza prima fiduciaria riempiendo una sfera di plastica o vetro a guscio sottile di 4 mm di diametro con un fluido visibile mri (ad esempio, olio di vitamina E) e sigillarlo. Posizionarlo nel supporto fiduciario MRI sul lato destro del telaio stereotassico stampato in 3D (Figura 2a).
- Fissare saldamente il porta telaio stampato in 3D al posizionatore XYZ in una buona posizione per il posizionamento degli animali. Far scorrere la linguetta sull'estremità rostrale del supporto del telaio nel canale corrispondente sulla rotaia dell'asse Y e fissando con viti impostate (Figura 1h, frecce rosse).
- Per guidare il posizionatore XYZ, installare il convertitore DA USB a seriale su un computer seguendo le indicazioni del produttore e collegare il convertitore. Installare l'ambiente di runtime e il software del controller del motore nel PC.
- Assicurarsi che la porta seriale corretta sia selezionata nel software selezionando il convertitore da USB a seriale nel controllo a discesa di selezione delle porte sul pannello frontale del software del controller. Collegare l'USB al convertitore seriale alla scatola del controller del motore stepper utilizzando un cavo crossover seriale a 9 pin (ad esempio, cavo modem null RS232).
- Eseguire il software del controller per verificare che i motori stepper possano essere guidati sotto il controllo del software. Questo passaggio potrebbe richiedere l'assistenza del supporto IT locale.
3. Procedura di targeting intracraniciale
NOTA: Per questi esperimenti sono stati utilizzati ratti maschi Sprague Dawley del peso di 250-350 g. Gli animali avevano libero accesso all'acqua e al chow dei topi, e venivano mantenuti su un ciclo chiaro:scuro delle 12:12.
- Mettere l'animale in anestesia (3% di isoflurane con ossigeno) e verificare la mancanza di risposta al dito del piedino. Quindi inserire il catetere come descritto di seguito.
- Riscaldare la coda con una lampada da fare è più facile colpire la vena. Fare attenzione a non surriscaldare l'animale o a bruciare la coda.
- Una volta che l'animale dorme (non risponde a un dito del dito), inserire il catetere della vena di coda da 24 G che verrà utilizzato per fornire microbolle, colorante blu Evans (EBD), contrasto RM gadobutrolo se si utilizza la risonanza prima e l'agente sperimentale di interesse. Una volta colpita la vena, il sangue riempirà la toria, rimuoverà lentamente l'ago interno mentre spinge la toria ulteriormente nella vena.
NOTA: Vedi una guida come Stuart e Schroeder33 se fai le iniezioni di vene della coda del topo per la prima volta. - Se non c'è flusso sanguigno, spostare lentamente la torcia del catetere fuori dalla vena per testare che l'ago potrebbe aver infilato nella vena. Se il sangue scorre quando il catetere viene tirato leggermente indietro, prima il poke è passato attraverso la vena e il posizionamento del catetere dovrà essere riavviato in un'altra posizione sulla coda che è rostrale alla posizione precedente.
- Riempire la spina del catetere con soluzione salina e avvitare la spina del catetere all'estremità della porta del catetere non appena la porta si è riempita di sangue. Avvolgere con cura il nastro da laboratorio intorno al catetere e alla coda per mantenerlo in posizione. Inizia con un piccolo pezzo in alto e lavora in direzione caudale, lasciando esposta l'estremità stessa della spina del catetere.
- Collegare la linea di anestesia al connettore di anestesia sul telaio stereotassico (Figura 2a) e fissare la testa degli animali nel telaio posizionando la bocca sulla barra del morso e guidando le barre dell'orecchio in entrambi i canali uditori, quindi stringere le viti impostate. Assicurati che la testa degli animali sia sicura e livellata.
- Spostare l'animale nel letto della risonanza prima e collegare la linea di anestesia al cono del naso. In questo protocollo è stata utilizzata una risonanza prima di un piccolo foro da 9,4 T.
- Raccogli immagini coronali e assiali ponderate T2 che catturano l'intero cervello e il fiduciario MRI (Figura 2b) per le misurazioni delle coordinate. Fornire al fisico o alla tecnologia della risonanza mondiale locale le seguenti informazioni in modo che possano creare il protocollo MRI.
- Per le immagini coronali(Figura 2b in alto), utilizzare i seguenti parametri: numero di immagini: 27, larghezza: 62,2 mm, altezza: 62,2 mm, profondità: 37,97 mm, dimensione Voxel: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
- Per le immagini assiali(Figura 2b in basso), utilizzare i seguenti parametri: numero di immagini: 13, Larghezza: 61,47 mm, Altezza: 53,81 mm, Profondità: 16,7 mm, dimensione Voxel: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3.
NOTA: Non è necessario avere questi parametri esatti purché la risoluzione coronale in piano sia vicina a 0,25 mm e le immagini coprano l'intero cervello e fiduciale.
- Raccogli le misurazioni delle coordinate dalle immagini di cui sopra registrando la distanza dal fiduciario mri alla regione cerebrale che sarà presa di mira con FUS.
- Allo scanner, sulle immagini coronali raccolte nel passaggio 3.5, trovare l'immagine in cui il fiduciario è il più grande, indicando il centro del fiduciario. Registrare la distanza dalla parte superiore del fiduciario alla regione cerebrale di interesse per mm (il software MRI avrà uno strumento di misurazione della scala o del punto, consultare la tecnologia o il fisico della risonanza prima industriale locale su come farlo) sia nella direzione mediale / laterale che nella direzione ventrale dorsale(Figura 2b, in alto).
- Allo scanner, sulle immagini assiali raccolte nel passaggio 3.5, trovare l'immagine che mostra la parte superiore del fiduciario e misurare la distanza dal centro del fiduciario alla regione cerebrale bersaglio sia nella direzione dorsale / ventrale che nella direzione mediale / laterale(Figura 2b, in basso).
- Confrontare le due misurazioni mediali/laterali e se sono diverse utilizzare la media. Queste misurazioni delle coordinate saranno utilizzate più avanti nel passaggio 4.3 per guidare il punto focale FUS verso la regione cerebrale bersaglio con il posizionatore XYZ.
- Raccogli immagini di prescan risonanza da mente. Confrontare queste immagini con le immagini raccolte dopo l'apertura di FUS BBB (Figura 4). Le immagini ponderate T1 verranno successivamente utilizzate per visualizzare l'apertura della BBB, le immagini ponderate T2 verranno successivamente utilizzate per garantire che non si siano verificati danni ai tessuti dopo il trattamento FUS34.
- Per le immagini assiali ponderate T1, utilizzare i seguenti parametri: larghezza: 30 mm, altezza: 51,2 mm, profondità: 3,0 mm, dimensione voxel: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3,numero di immagini: 13.
- Per le immagini assiali ponderate T2, utilizzare i seguenti parametri: larghezza: 30 mm, altezza: 51,2 mm, profondità: 2,6 mm, dimensione voxel: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3,numero di immagini: 13.
- Per le immagini coronali ponderate T1, utilizzare i seguenti parametri: larghezza: 30 mm, altezza: 30 mm, profondità: 27 mm, dimensione voxel: 0,16 x 0,16 x 1 mm3,numero di immagini: 27.
- Per le immagini coronali ponderate in T2, utilizzare i seguenti parametri: larghezza: 30 mm, altezza: 30 mm, profondità: 27 mm, dimensione voxel: 0,12 x 0,12 x 1 mm3,numero di immagini: 27.
NOTA: Come nel passaggio 3.5, questi parametri di imaging non devono essere esattamente gli stessi elencati. Queste immagini hanno un FOV più piccolo e una risoluzione più elevata rispetto a quelle raccolte nel passaggio 3.5.
- Mantenendo l'animale nel telaio stereotassico, trasportare rapidamente l'animale dal letto mri alla configurazione FUS da banco. Assicurarsi che l'animale rimanga addormentato per il trasferimento sotto l'effetto dell'anestesia.
- Per tempi di trasferimento più lunghi, utilizzare una scatola per il trasferimento abbastanza grande da adattarsi all'animale e al telaio. Con la spina di anestesia ancora attaccata, posizionare l'animale e il telaio all'interno della scatola e lasciare che l'isoflurane in eccesso riempia la scatola per alcuni minuti. Scollegare la linea di anestesia e trasferire rapidamente.
4. Procedura ecografiche mirata
- All'arrivo alla configurazione da banco FUS, collegare immediatamente la linea di anestesia al cono del naso e continuare a eseguire l'isoflurane dell'1,5-3% con ossigeno. Fallo il più rapidamente possibile per evitare che l'animale si svegli.
- Far scorrere il telaio nel supporto del telaio e agganciarlo saldamente. Usa i tosaerba per radere la testa all'animale. Spazzolare via i capelli in eccesso e applicare la crema per rimozionei sul cuoio capelluto. Lasciare riposare per 3 minuti e asciugare con acqua e garza.
- Se la risonanza RM non è disponibile per il targeting, utilizzare un fotogramma stereotattico standard (non stampato in 3D) per annullare la posizione del puntatore al bregma toccando la punta del puntatore al bregma (per questo sarà necessaria un'incisione del cuoio capelluto) e annullando il software o registrando le coordinate. Spostare il carrello XYZ verso l'alto di 50 mm facendo clic sul pulsante verso l'alto di 50 nel software e scambiando il puntatore con il trasduttore. Sulla base di un atlante cerebrale del topo come descritto inprecedenza 35, passare alle coordinate cerebrali desiderate utilizzando i pulsanti di passo nel software. Se si utilizza questo metodo anziché la risonanza prima di mri, passare alla sezione 4.6.
- Se si utilizzano linee guida per la risonanza nota, collegare il puntatore e spostare il puntatore nella posizione del fiduciario mri (Figura 1d,g). Posizionare il puntatore nella parte superiore e centrale del fiduciario MRI (è previsto un piccolo foro nella parte superiore del supporto fiduciario per il puntamento). Fare clic sul pulsante posizione null che è il punto da cui sono state calcolate tutte le distanze nell'immagine MRI.
- Rimuovere il puntatore e spostare il posizionatore sulle coordinate mediali/laterali e sulle coordinate rostrali/caudali. Sollevare il posizionatore verso l'alto premendo il pulsante fino a 50 per consentire il posizionamento del bagno d'acqua e del gel ad ultrasuoni. Se viene raggiunta la parte superiore della corsa dell'asse Z, la posizione di annullamento verrà invalidata. La coordinata dorsale/ventrale verrà impostata dopo l'aggiunta del trasduttore.
- Applicare il gel ad ultrasuoni sul cuoio capelluto dell'animale e posizionare il bagno d'acqua sull'animale con la finestra a nastro in poliimmide premuta sul gel. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nel gel ad ultrasuoni.
- Riempire il bagno d'acqua con acqua degassata.
- Se si utilizza il trasduttore ad alta potenza, abbassare il posizionatore in modo che il magnete sia appena sopra l'acqua. Attaccare il trasduttore al posizionatore abbassando accuratamente il trasduttore nell'acqua con un angolo per evitare che le bolle d'aria si intrappolano sotto il viso e colleghino i magneti.
- Se si utilizza il trasduttore ad immersione a bassa potenza, abbassare il posizionatore nell'acqua appena sopra la clip del trasduttore. Quindi agganciare il trasduttore in posizione abbassarlo lentamente nell'acqua con un angolo per evitare che le bolle d'aria si intrappolano sotto il viso.
NOTA: Un bagno trasparente è utile quando si guarda sotto il viso del trasduttore per le bolle. - Abbassare il posizionatore alla coordinata dorsale/ventrale.
- Accendere l'amplificatore di alimentazione RF.
- Iniettare 1 mL/kg di colorante blu Evans al 3% (EBD) infilando la punta dell'ago nella spina del catetere e iniettando. Lasciare circolare per 5 minuti.
- Attivare le microbolle scuotendole violentemente con lo shaker con la bolla.
- Preparare 5 volte la dose di 30 μL/kg di microbolle (bolla conc. 1,2 x 1010/mL) in 0,2 mL di soluzione salina per tenere conto dei 2 trattamenti FUS e dei tubi nel set di infusione alato da 18 G. Ad esempio, se il ratto pesa 200 g, riempire la siringa contenente 18 G di punta dell'ago con 30 μL di microbolle in 1 ml di soluzione salina.
NOTA: Assicurarsi di utilizzare punte dell'ago da 18 G sia per l'assunzione che per l'iniezione con il set di infusione alato. - Invertire la siringa più volte per ottenere una distribuzione uniforme delle microbolle. Quindi attaccare e riempire il set di infusione alato. Posizionare la siringa sulla pompa per infusione e impostare la pompa per infusione in modo che esegni 0,2 ml a una velocità di 6 ml/h. Ciò fornirà un'infusione lenta delle microbolle durante l'esposizione a FUS di 2 minuti.
- Inserire l'ago alato nella spina del catetere.
- Preparare 5 volte la dose di 30 μL/kg di microbolle (bolla conc. 1,2 x 1010/mL) in 0,2 mL di soluzione salina per tenere conto dei 2 trattamenti FUS e dei tubi nel set di infusione alato da 18 G. Ad esempio, se il ratto pesa 200 g, riempire la siringa contenente 18 G di punta dell'ago con 30 μL di microbolle in 1 ml di soluzione salina.
- In primo luogo, eseguire la pompa di infusione, attendere 3 s e avviare il trattamento FUS premendo il pulsante di abilitazione dell'uscita sul generatore di funzioni (etichettato "on" sul generatore di funzioni nella tabella dei materiali). Ripetere queste due volte per regione con 5 minuti in mezzo per consentire alle microbolle di sgombro.
- Premere di nuovo il pulsante on sul generatore di funzioni per interrompere il trattamento FUS quando la pompa di infusione si ferma a 2 minuti.
- Attendere 5 minuti per la sgombro delle microbolle. Quindi iniziare l'infusione e il secondo trattamento FUS.
- Subito dopo il secondo trattamento FUS, iniettare il contrasto del gadobutrolo (se si utilizza la risonanza prima) e l'agente di interesse, ad esempio particelle virali. Il volume totale consegnato di tutti gli agenti non deve superare i 5 mL/kg.
NOTA: I tempi di consegna (ad esempio, prima o dopo l'apertura di FUS BBB) dell'agente di interesse possono variare a seconda dell'agente utilizzato.
- Spegnere l'amplificatore di alimentazione RF e trasportare immediatamente l'animale nella risonanza prima.
5. Conferma MRI dell'apertura della BBB
- Se la risonanza ff en-mail non è disponibile, passare alla sezione 6 e utilizzare l'espressione EBD per la conferma dell'apertura BBB.
- Riposizionare l'animale sul letto della risonanza prima nella stessa posizione del passaggio 3.7 e collegare la linea di anestesia.
- Raccogliere le scansioni post MRI con gli stessi parametri di imaging utilizzati nel passaggio 3.7 per visualizzare il miglioramento della risonanza magnetica del gadobutrolo nella regione di apertura della BBB (Figura 3b,e).
6. Perfusione e raccolta dei tessuti
- Perfondi l'animale con formalina fredda al 4% fino a quando il sangue scorre completamente limpido.
- Rimuovere il cervello e posizionare in formalina al 4% o PFA a 4 °C durante la notte. Quindi, posizionare il cervello in una soluzione di saccarosio al 30% fino a quando il cervello affonda (circa 2-3 giorni). Infine, congelare il flash nell'azoto liquido o sul ghiaccio secco e conservare a -80°C fino alla criosezione.
- Congelare il cervello negli OCT e prendere le criosezioni.
- Fissare e coprele sezioni per microscopia a fluorescenza. Picchi di eccitazione EBD a 470 e 540 nm e picchi di emissione a 680 nm. Coverslip con supporto di montaggio DAPI al fine di visualizzare la morfologia cellulare complessiva.
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Representative Results
Qui dimostriamo che gli ultrasuoni focalizzati con microbolle possono indurre l'apertura localizzata della BBB utilizzando i parametri sopra specificati sia con il trasduttore ad immersione a bassa potenza (Figura 3) che con il trasduttore FUS (Figura 4). In primo luogo, nei primi esperimenti, il trasduttore ad immersione a bassa potenza è stato preso di mira in un emisfero cerebrale anteriore (Figura 3b) o mediale (Figura 3a). Gli animali sono stati poi sacrificati 2 ore dopo con perfusione (figura 3a) o senza perfusione(figura 3b) e sono state raccolte sezioni cerebrali congelate da 10 μm. L'apertura FUS BBB è stata evidente dall'autofluorescenza EBD (eccitazione: 470 e 540 nm, emissione: 680 nm) nell'emisfero bersaglio (frecce bianche Figura 3a e 3b).
Abbiamo trovato meglio perfondere gli animali per una chiara visualizzazione dell'apertura BBB con autofluorescenza EBD. Tuttavia, l'apertura della BBB può ancora essere visualizzato senza sgombrare il campo dai vasi sanguigni (Figura 3b). L'assorbimento cellulare e la clearance dell'EBD dopo l'apertura della BBB iniziano non appena 30 minuti dopo l'apertura della BBB e aumentano oltre 24ore 37. Per la valutazione dell'apertura BBB con autofluorescenza EBD, è meglio sacrificare l'animale tra 15 minuti e 3 ore di apertura BBB. Anche se alla fine, il tempo del sacrificio dipenderà dall'agente che è stato consegnato. Ad esempio, in uno studio AAV, 3 settimane dopo l'apertura della BBB e la consegna dell'AAV (Figura 5c) possono essere appropriate.
In esperimenti successivi, il trasduttore FUS è stato preso di mira sia all'ippocampo (Figura 4a-c) che alla corteccia cingolata anteriore (ACC)(Figura 4 d-f) e, oltre all'EBD, è stato iniettato l'agente di contrasto MRI gadobutrolo (0,1 mL/kg) per verificare l'apertura mirata della BBB in vivo. Figura 4b,e mostrano un maggiore contrasto mri in cui il contrasto del gadobutrolo è entrato nel tessuto 1 ora dopo l'apertura della BBB e l'iniezione di agente di contrasto. Questo cambiamento di contrasto è evidente quando si confrontano con i prescans mri presi prima della procedura FUS (figura 4a,d). Gli animali sono stati poi sacrificati per perfusione 1,5 ore dopo l'apertura della BBB e sono state raccolte criosezioni da 10 μm. L'autofluorescenza EBD è evidente nelle regioni mirate del FUS che indicano ulteriormentel'ubicazione dell'aperturadella BBB ( figura 4c,f). Questa figura evidenzia come il contrasto della RISONANZA possa talvolta essere difficile da vedere (come nella differenza tra la figura 4b e la figura 4e); pertanto, è utile confermare l'apertura della BBB con la visualizzazione dell'autofluorescenza EBD come nella micrografia a fluorescenza nella figura 4f.
Per valutare se questa tecnica potesse essere utilizzata per la somministrazione di geni mirati AAV9-hsyn-GFP e il contrasto del gadobutrolo sono stati iniettati IV (titolo: 1,32 x 1014 GC/mL, 0,05 mL/kg) subito dopo l'apertura della BBB nell'ippocampo. L'animale è stato quindi mr immaginato 30 minuti dopo l'apertura BBB e sacrificato 3 settimane dopo per perfusione. Sono state raccolte criosezioni da 10 μm per l'imaging fluorescente dell'espressione GFP. L'apertura della BBB è stata evidente dal contrasto del gadobutrolo nell'ippocampo bersaglio (Figura 5a,b). Inoltre, la somministrazione di geni è stata confermata dall'espressione della GFP nell'ippocampo bersaglio evidente dalla fluorescenza verde (Figura 5c). Si noti che in questo momento L'EBD è stato eliminato ed è evidente solo nei ventricoli (Figura 5c).
Figura 1: Configurazione da banco FUS. (a) Configurazione FUS, incluso il posizionatore XYZ, un tubo in PVC di 30 mm di diametro per il fissaggio del trasduttore, il telaio stereotassico stampato in 3D e la pompa per infusione. (b) L'estremità del tubo in PVC è limitata e ad esso è attaccato un magnete con epossidico. (e) Un altro magnete corrispondente è attaccato al centro superiore del trasduttore ad alta potenza con epossidico. (d) Inoltre, un altro magnete corrispondente è attaccato al puntatore per annullare il posizionatore nella parte superiore e centrale del fiduciario MRI. ( e ) Il puntatore viene infine sostituitocon iltrasduttore ad alta potenza e un bagno d'acqua è accoppiato alla testa dell'animale con gel ad ultrasuoni. (f) Il trasduttore ad immersione a bassa potenza può essere collegato al tubo in PVC con la clip trasduttore stampata in 3D. (g) Per il posizionamento, il trasduttore viene sostituito con il puntatore stampato in 3D e il posizionatore viene annullato nella parte superiore e centrale del fiduciario MRI. h )Il porta telaio stazionario stampato in 3D consente di riportare l'animale nella stessa posizione dopo la risonanza prima della risonanza prima della mento se sono necessari più trattamenti FUS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Telaio stereotassico con fiduciario MRI per coordinate guidate dalla risonanza prima. (a) Gli animali sono posizionati per la prima volta in un telaio stereotassico stampato in 3D dotato di un fiduciario MRI. (b) Il telaio viene quindi posizionato all'interno del letto di risonanza prima e la distanza dal fiduciario (cerchio punteggiato) alla regione cerebrale bersaglio viene misurata utilizzando sia immagini coronali per le misurazioni dorsali/ventrali (D/V) che immagini assiali per le misurazioni rostrali/caudali (R/C), la misurazione mediale/laterale (M/L) può essere raccolta da entrambi gli assi. Gli animali vengono tenuti nel telaio e trasferiti alla stazione FUS dove un puntatore viene utilizzato per annullare il posizionatore XYZ nella posizione del fiduciario. Il puntatore viene quindi sostituito con il trasduttore e che può quindi essere spostato in base alle coordinate raccolte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La tintura blu Evans (EBD) conferma l'apertura di FUS BBB sia con che senza perfusione. (a) Micrografia di una sezione cerebrale di 10 μm 2 ore dopo l'apertura della FUS BBB con il trasduttore ad immersione a bassa potenza destinato all'emisfero sinistro mediale. Questa è un'immagine rappresentativa di un animale che è stato perfuso con formalina tamponata al 4% prima della raccolta dei tessuti. L'apertura BBB è evidente dall'autofluorescenza rossa EBD (freccia). bMicrografiadi una sezione cerebrale di 10 μm 2 ore dopo l'apertura della FUS BBB mirata all'emisfero sinistro anteriore. Questa è un'immagine rappresentativa di un animale che non è stato perfuso prima della raccolta dei tessuti, quindi, l'EBD rimane nei vasi sanguigni. L'apertura della BBB è evidente dove l'EBD è fuoriuscito dai vasi sanguigni (freccia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Apertura FUS BBB confermata con contrasto mri gadobutrolo ed espressione EBD. Immagini MR prima (a e d) e dopo (b ed e) apertura BBB. il miglioramento del contrasto del gadobutrolo conferma la posizione dell'apertura BBB in vivo(b ed e, frecce). csezione cerebraleda 10 μm che mostra un'ulteriore conferma dell'apertura della BBB con autofluorescenza EBD (rosso) nell'ippocampo (macchia nucleare DAPI blu). Barra di scala; 500 μm. (f) Micrografia di una sezione cerebrale di 10 μm dopo l'apertura della BBB nella corteccia cingolata anteriore evidente dall'autofluorescenza rossa (freccia) EBD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Consegna localizzata di AAV9-hsyn-GFP all'ippocampo tramite apertura FUS BBB. Conferma MRI dell'apertura BBB con agente di contrasto MRI, contrasto MRI (frecce) sia nelle immagini coronali (a) che assiali (b) ponderate T1. cconfermaistologica dell'espressione della FPG nell'ippocampo mirato FUS (verde) 3 settimane dopo l'apertura della FUS BBB e l'iniezione di AAV9-hsyn-GFP IV. Il blu indica la macchia nucleare DAPI per la morfologia cellulare complessiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui abbiamo descritto un approccio da banco all'apertura assistita da microbolle FUS BBB con approcci alternativi tra cui due diversi trasduttori e metodi per il targeting intracraniciale con e senza guida mri. Attualmente, al fine di stabilire l'apertura FUS BBB guidata dalla risonanza prima di MRI in laboratorio, c'è la possibilità di acquistare eccellenti dispositivi pronti all'uso che forniscono risultati altamente standardizzati e riproducibili con interfacce intuitive. Tuttavia, molti laboratori non sono preparati per il costo di tali strumenti. Pertanto, l'obiettivo principale di questo protocollo è fornire un punto di partenza che qualsiasi laboratorio potrebbe stabilire per costruire la propria esperienza nella tecnica.
L'apertura FUS BBB è ora una tecnica ampiamente utilizzata ed è spesso vero che diversi gruppi utilizzano una varietà di agenti e anestetici, ognuno dei quali può influenzare il grado di apertura ed estravasazione della BBB. È importante sottolineare che il particolare anestetico utilizzato può influire sull'entità dell'apertura della BBB, quindi è importante considerare questo aspetto quando si esegue questo protocollo38. Qui, l'isoflurane anestetico viene utilizzato perché gli animali possono essere mantenuti sotto isoflurane per la lunghezza del protocollo e i livelli di gas isoflurane possono essere facilmente regolati in base alla frequenza respiratoria e alla frequenza cardiaca dell'animale. Inoltre, abbiamo consegnato isoflurane con ossigeno perché era più accessibile dell'aria medica; tuttavia, l'aria medica può consentire un'apertura BBBpiù estesa 39. Alcuni agenti di contrasto mri sono più appropriati per questo protocollo rispetto ad altri. Ad esempio, nelle nostre mani, il gadoteridol non ha prodotto alcun miglioramento del contrasto anche quando la perdita di EBD era chiaramente presente nel postmortem tissutale. Anche la formulazione delle microbolle è importante. Qui usiamo microsfere lipidiche perflutren. Altre formulazioni di microbolle come le microbolle A di proteine perflutren sono prontamente disponibili, ma il tipo di microbolle utilizzata influenzerà i risultati15.
I controlli dei generatori di funzioni possono variare un po ', quindi fai riferimento al manuale per istruzioni su come inserire le impostazioni elencate nel passaggio 1. L'appropriata tensione di comando (V peak to peak sul generatore di funzioni) dipende fortemente dalle proprietà del trasduttore, dal guadagno dell'amplificatore RF, dall'amplificatore RF al trasduttore corrispondente, dall'età e dalle dimensioni dell'animale, dal tipo e dalla concentrazione di microbolle e dall'effetto di trattamento desiderato. Il picco al picco V dovrà essere determinato da tentativi ed errori. Inizia con le impostazioni suggerite nel passaggio 1 e determina l'effetto istologicamente. In caso di danni ai tessuti, abbassare il picco al picco V del 10% e riprovare. Allo stesso modo, se non c'è BBBO, alza il picco al picco V del 10% e riprova. L'impostazione troppo alta di una V può danneggiare il trasduttore ad immersione a bassa potenza. Ciò sarà evidente come una fessurazione o distorsione della faccia del trasduttore. I tempi di produzione sui trasduttori possono essere lunghi, quindi all'avvio, si consiglia di acquistare più di un trasduttore come backup. I trasduttori ad ultrasuoni possono anche danneggiare gli amplificatori se sono abbinati in modo improprio. Per semplicità e affidabilità, si consiglia di utilizzare un robusto amplificatore di potenza in grado di guidare carichi complessi (come l'amplificatore di potenza RF nella tabella dei materiali). Si noti che mentre il trasduttore ad alta potenza viene fornito con un circuito corrispondente, il trasduttore ad immersione a bassa potenza no. L'amplificatore RF suggerito è in grado di gestire la potenza riflessa dal trasduttore mal abbinato, ma alcuni amplificatori potrebbero essere danneggiati in questa configurazione. Inoltre, se il passaggio 2.7 si rivela problematico dopo l'installazione del driver e del software, verificare che nel software sia selezionata la porta seriale corretta. Prova quindi un cavo seriale diverso. In caso contrario, cercare il supporto IT locale.
Per esperienza, ci prenderà pratica e molteplici regolazioni per ottenere una precisione stretta nel targeting della regione cerebrale. Ciò si può vedere nelle differenze di targeting tra i primi esperimenti (figura 3) e gli esperimenti più recenti (figura 5). Abbiamo iniziato gli esperimenti usando un classico telaio stereotassico e lo includiamo come opzione qui se non c'è accesso a una stampante 3D o se non c'è accesso alla risonanza prima del roditore. Tuttavia, la guida per la risonanza testl con fiducials MRI e il telaio stampabile 3D fornito (o di un design personalizzato) è il metodo ideale. In primo luogo, spiega le differenze individuali tra gli animali raccogliendo le coordinate all'interno dell'animale piuttosto che affidarsi a un atlante cerebrale medio del ratto. Inoltre, l'uso della risonanza prima del 000 consente la conferma del targeting per posizione FUS in vivo piuttosto che affidarsi all'espressione EBD post mortem. Ciò è importante quando si forniscono agenti che possono richiedere più di 24 ore per avere effetto, ad esempio gli AAV (Figura 5). Infine, il supporto del telaio fornito consente di riportare l'animale nella stessa posizione dopo la risonanza prima della risonanza prima di correggere eventuali errori di targeting o di ripetere FUS dopo un'apertura BBB insufficiente senza dover rifare le coordinate. Il telaio stereotassico portatile stampato in 3D può essere utilizzato in qualsiasi risonanza prima dell'uso con un foro chiaro di 200 mm o più largo.
A seconda della distribuzione dei vasi sanguigni nella posizione del bersaglio, dello spessoredel cranio 40, della presenza di ventricoli e di altri fattori, il grado di apertura della BBB può variare. Per questo motivo, forniamo un metodo per il targeting ripetuto con il telaio e il supporto del telaio. L'accuratezza del targeting dipende in modo critico dal mantenimento dello stato attivo del trasduttore in una posizione coerente rispetto al puntatore di destinazione. La punta di questo puntatore dovrebbe indicare la posizione nello spazio del centro dello stato attivo del trasduttore quando il trasduttore è collegato al posizionatore XYZ. I magneti consentono di scambiare facilmente il puntatore e il trasduttore mantenendo questa colocalizzazione. Il foro e la sporgenza nei magneti dovrebbero corrispondere nel modo più preciso possibile. Qualsiasi variabilità in questa connessione riduce la ripetibilità del targeting per lo stato attivo FUS. Tuttavia, ci sarà un offset spaziale tra la punta del puntatore e la messa a fuoco ad ultrasuoni. Una volta confermato che l'offset è coerente, può essere corretto utilizzando le immagini MR per calcolare la differenza in mm della posizione di apertura BBB risultante (posizione del contrasto MRI) e la posizione di destinazione prevista. Questa differenza può quindi essere fattorizzare nella posizione nulla. L'accuratezza e la ripetibilità traggono grande vantaggio anche dall'utilizzo della stessa frequenza ad ultrasuoni e dall'utilizzo di ratti di dimensioni ed età simili in una determinata serie di esperimenti. L'attenuazione degli ultrasuoni da parte del cervello del ratto e del cranio del ratto varia con la frequenza e le dimensioni del cranio e lo spessore del cranio varia con l'età. Il cranio è anche una piccola cavità rispetto all'impulso ultrasonico e l'ecografia incidente interagisce con i riflessi all'interno del cranio per produrre un campo sonoro complesso che dipende dal tessuto, dal cranio, dalla frequenza e dalla posizione del trasduttore40.
Come affermato altrove, questo protocollo ha lo scopo di fornire un'alternativa di investimento bassa a eccellenti soluzioni commerciali compatibili con la risonanza prima di 000 che sono già disponibili per l'acquisto. Ci sono limitazioni importanti che derivano dal mantenere basso il costo. Ci sono anche limitazioni inerenti alla tecnica data la fisica e allo stato attuale dell'arte. Sorprendentemente, nonostante queste limitazioni, e come mostrato nei risultati rappresentativi, possiamo ottenere una consegna coerente di coloranti, particelle e virus all'ippocampo dei ratti con precisione submillimetrica. I limiti più importanti sono che (1) la forma della messa a fuoco FUS dipende dal tessuto intermedio e in particolare dalla forma e dallo spessore del cranio{...}. La necessità di rimuovere l'animale dalla risonanza prima per eseguire il trattamento FUS impedisce il feedback in tempo reale sulla localizzazione e l'intensità della messa a fuoco FUS. Senza questo feedback in tempo reale è necessario fare diversi esperimenti per confermare l'impostazione per ogni combinazione di posizione di targeting. Una volta che le impostazioni sono "chiamato", abbiamo trovato una buona ripetibilità. (2) Il sistema di posizionamento xyz e fiduciario così come è stato costruito, per quanto preciso, non fornisce precisione nel quadro di coordinate del posizionatore dall'esperimento all'esperimento. Le posizioni relative della casa XYZ, del cranio del roditore e del telaio possono spostarsi l'una rispetto all'altra dall'esperimento all'esperimento. Ciò viene evitato utilizzando un'immagine MRI per il targeting, un puntatore di targeting e fiduciario con posizione nota nello spazio rispetto allo stato attivo FUS, assicurando che il sistema di coordinate MRI sia parallelo al sistema di posizionamento XYZ, eseguendo trattamenti di test prima dell'insieme di trattamenti reali e eseguendo l'intera procedura all'interno di una sessione in modo che l'animale non sia necessario riposizionare nel frame. Si noti che, poiché viene utilizzato un solo fiduciario, le rotazioni del telaio non sono correggibili, quindi è fondamentale assicurarsi che il telaio sia livellato rispetto al letto e al foro mri. In sintesi, la posizione del puntatore non indica la vera messa a fuoco FUS, ma abbiamo scoperto che l'offset è coerente per una data posizione cerebrale a condizione che il cranio non ruoti rispetto al trasduttore ad ultrasuoni. Si noti inoltre che la tempistica coerente della consegna del gadobutrolo rispetto all'apertura della BBB e l'imaging è fondamentale per risultati coerenti, soprattutto se la modifica del contrasto della risonanza magnetica viene utilizzata come proxy per la quantità di apertura BBB (vedere 36).
Abbiamo iniziato l'apertura di FUS BBB in laboratorio con il trasduttore ad immersione a bassa potenza sopra descritto. Abbiamo scoperto che è un'opzione conveniente per iniziare con questa tecnica. Ancora più importante, l'adattamento di questo protocollo può fornire un'alternativa non invasiva alla chirurgia stereotassica intracranica e la ricerca preclinica eseguita con questa tecnica può essere considerata altamente traslatoria a causa dell'uso corrente di FUS transcraniconell'uomo 30,32,41. Una volta stabilita in laboratorio, questa tecnica può essere utilizzata come alternativa non invasiva alla chirurgia stereotassica. Pertanto, trasformando uno strumento strettamente investigativo in uno strumento altamente traslazionale. Il nostro laboratorio utilizzerà questa tecnica per la somministrazione guidata e localizzata di virus e nanoparticelle per sviluppare nuove tecniche di neuromodulazione non invasive che possono essere utilizzate per comportarsi liberamente roditori svegli e primati non umani. L'attuale lavoro si concentra sui farmaci di design progettati esclusivamente per i recettori di design (DREADD) e sulla sensibilizzazione dei neuroni a basse dosi di particelle ad alta energia come i raggi X. Il laboratorio sta anche lavorando a una nuova versione di questo protocollo che può essere eseguita in uno scanner 3 T umano per eliminare la necessità di spostare l'animale durante il trattamento e consentire un feedback mirato in tempo reale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta in parte da una sovvenzione NSF EPSCoR Research Infrastructure alla Clemson University (1632881). Inoltre, questa ricerca è stata sostenuta in parte dal Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Gli autori riconoscono con gratitudine l'uso dei servizi e delle strutture dell'Università dell'Alabama a Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Gli autori riconoscono Rajiv Chopra per il suo sostegno e la sua guida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
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