Summary
마이크로 버블 에이전트를 가진 집중한 초음파는 혈액 두뇌 장벽을 초점하고 일시적으로 열 수 있습니다. 이 기술은 혈액 뇌 장벽을 통해 에이전트의 넓은 범위를 제공하기 위해 사용되었습니다. 이 문서에서는 MRI 지침유무이드 없이 설치류 뇌에 국소화된 전달을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
스테레오탁스 수술은 설치류 뇌에 국소화된 약물 및 유전자 전달을 위한 금본위제입니다. 이 기술은 대상 뇌 영역에 정확한 국소화및 대상 부작용의 감소를 포함하여 전신 전달에 비해 많은 장점이 있습니다. 그러나, 스테레오 탁스 수술은 그것의 번역 효능을 제한 하는 매우 침략, 긴 복구 시간을 필요, 여러 뇌 영역을 대상으로 할 때 도전을 제공. 집중 초음파(FUS)는 순환 마이크로버블과 함께 밀리미터 크기의 영역에서 혈액 뇌 장벽(BBB)을 일시적으로 개방하는 데 사용될 수 있다. 이를 통해 일반적으로 BBB를 교차할 수 없는 체계적으로 전달된 에이전트의 원두개 내 지역화를 가능하게 합니다. 이 기술은 스테레오 탁스 수술에 대한 비침습적 대안을 제공합니다. 그러나 현재까지이 기술은 장비 및 표준화 된 방법에 대한 제한된 접근으로 인해 신경 과학 실험실에서 널리 채택되지 않았습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 저렴하고 재현 가능하므로 모든 실험실에서 쉽게 채택 할 수있는 FUS BBB 개방 (BBBO)에 벤치 탑 접근 방식을 제공하는 것입니다.
Introduction
기본적인 신경과학에서 많은 발견에도 불구하고, 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환에 대한 새로운 치료의 수는 상대적으로 제한된남아1,2. 신경 장애에 관여하는 유전자, 분자 및 세포 회로에 대한 깊은 이해는 현재 기술3을가진 인간에서 실현 할 수없는 유망한 치료법을 제안했습니다. 효과적인 치료는 종종 뇌 침투 및 사이트 별4,5,6,7,8의필요성에 의해 제한됩니다. 그러나, 특정 뇌 부위에 국소화된 약물 전달의 기존 방법(예를 들어, 주사 또는 캐뉼라를 통한 전달)은 침습적이며 두개골9에서개구부를 필요로 한다. 이 수술의 침습성은 인간의 뇌에 국소 전달의 일상적인 사용을 방지. 또한, 조직 손상 및 그 결과 염증 반응은 유비쿼터스 상반신 주사에 의존하는 기본 및 전임상 연구를 위해 혼동된다10. 비침습적으로 혈액 뇌 장벽에 걸쳐 에이전트를 제공 하는 기능 (BBB) 특정 뇌 영역에 그들을 대상으로 신경 장애에 대 한 치료에 엄청난 영향을 미칠 수 있습니다., 동시에 전임상 연구에 대 한 강력한 조사 도구를 제공 하는 동안.
최소한의 조직 손상을 가진 BBB를 가로지르는 표적 수송의 한 가지 방법은 마이크로버블과 함께 경두개 중형 초음파(FUS)로BBB11,12,13,14,15,16을집중적으로 열고 일시적으로 개방한다. FUS BBB 개구부는 신경영양인자17,18,19,유전자 치료20,21,22,항체23,신경전달물질24,나노입자25,26,27, 28,28, 29등뇌 영역을 대상으로 치료제를 국소화하여 신경퇴행성 질환, 뇌졸중 및 신경교종의 치료에 대한 최근 주목받고 있다. 광범위한 응용 분야와 비침습적 특성30,31을통해 FUS BBB 개방은 일상적인 입체 적 내 주사에 이상적인 대안입니다. 더욱이,인간30,32에서의현재 사용으로 인해, 이 기술을 이용한 전임상 조사는 매우 번역적인 것으로 간주될 수 있다. 그러나, FUS BBB 개방은 접근성의 부족으로 인해 기초 과학 및 전임상 연구에서 널리 확립 된 기술이 될 아직. 따라서 FUS BBB 개구부에 대한 벤치탑 접근 방식에 대한 자세한 프로토콜을 이 기술을 수립하는 데 관심이 있는 실험실의 출발점으로 제공합니다.
이러한 연구는 FUS 특이적 초음파 트랜스듀서 또는 저전력 댐프 형 초음파 침지 변환기중 고출력 공기로 수행되었다. 트랜스듀서는 반응형 부하및 표준 벤치탑 기능 발생기를 위해 설계된 RF 전원 증폭기로 구동되었습니다. 이러한 항목에 대한 자세한 내용은 재료 표에서찾을 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 실험 절차는 UAB 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 중점 초음파 운전 장비 설정
- 50개의 Ohm 동축 BNC 케이블을 사용하여 RF 증폭기의 출력에 초음파 트랜스듀서의 입력(1)을 연결하고 (2) RF 증폭기의 입력을 기능 발생기의 출력에 연결한다.
- 기능 발생기 모드를 1% 듀티 사이클로 초당 한 번 부비동성 버스트로 설정합니다.
- 50dB RF 앰프와 함께 사용되는 0.8인치 초점 거리를 가진 댐프드 1 MHz 저전력 침지 변환기의 경우 시작 설정을 설정합니다: 1 MHz 의 신파, 1V 피크에서 피크, 10k 사이클, 1s 간격(또는 기간).
- 공기 백업의 경우 1.1 MHz 고출력 트랜스듀서가 초기 설정을 1.1MHz 의 시네 파, 50mV 피크에서 피크까지, 11k 사이클, 1s 간격으로 설정합니다.
참고: 수중이 아니면 트랜스듀서를 작동하지 마십시오. 손이나 다른 신체 부위를 초음파 초점에 놓거나 작동 하는 동안 트랜스 듀서 얼굴을 만지지 마십시오.
2. 집중 초음파 벤치탑 설정
- 입체 프레임과 스테레오테틱 프레임 홀더를 3D 인쇄합니다.
- PVC파이프(도 1a)를들고 있는 클램프를 사용하여 트랜스듀서를 XYZ 포지셔에 연결합니다. 클램프를 X축 슬라이드에 고정하고 날개 너트로 고정합니다.
- 고출력 초음파 트랜스듀서를 사용하는 경우 일치하는 자석 쌍을 사용하여 PVC 파이프에 부착하십시오. 한 자석에 구멍이 있고 다른 자석에 일치하는 돌출부가 있는지 확인합니다. PVC 파이프의 바닥을 캡하고 에폭시를 사용하여 자석 중 하나를 부착합니다(그림 1b참조).
- 에폭시를 사용하여 고전력 초음파 트랜스듀서의 상단 중심에 두 번째 자석을 부착합니다. 트랜스듀서의 중심에 있는지 확인하십시오(도1c).
- 고출력 초음파 트랜스듀서를 사용하는 경우 XYZ 포지셔터를 무효화하기 위한 포인터를 만듭니다. 이 포인터의 끝은 초음파 트랜스듀서가 XYZ 포지셔에 부착될 때 트랜스듀서 초점 의 중심 의 공간에서 위치를 나타냅니다. 트랜스듀서의 초점 거리의 길이와 트랜스듀서의두께(도 1d)로절단된 18G 바늘의 포인터를 만든다.
- 제3 자석에 에폭시를 적용하여 (이 자석은 PVC 캡 자석과 페어링) 포인터의 상단에 부착합니다. 그런 다음 포인터는 XYZ nulling(그림1d)에대한 PVC 파이프의 자석에 부착할 수 있습니다.
- 저전력 침수 변환기를 사용하는 경우 포인터와 장착 클립의 파일을 3D 인쇄합니다.
- 장착 클립을 PVC 파이프에 클리핑하여 저전력 침지 변환기를 PVC 파이프에 연결하고 트랜스듀서를 링에삽입합니다(도 1f).
- 동물의 머리 위에 쉴 수 있는 아크릴 시트에서 잘라낸 조각을 함께 붙이면 수조를 만드십시오(그림1e).
- 동물의 머리 크기에 관한 욕조 바닥에 개구부를 잘라냅니다. 폴리이미드 테이프로 수조의 구멍을 덮습니다.
참고: 쥐의 털을 적시고 저체온증을 일으킬 수 있으므로 폴리이미드 테이프 주위에 물이 누출되지 않도록 주의해야 합니다.
- 동물의 머리 크기에 관한 욕조 바닥에 개구부를 잘라냅니다. 폴리이미드 테이프로 수조의 구멍을 덮습니다.
- MRI 가시유체(예: 비타민 E 오일)로 직경 4mm 직경의 얇은 껍질 플라스틱 또는 유리 구를 채우고 밀봉하여 MRI 우세물을 만듭니다. 3D 프린팅 스테레오탁스프레임(그림 2a)의오른쪽에 MRI 신탁 홀더에 놓습니다.
- 3D 프릭스 프레임 홀더를 XYZ 포지셔너에 단단히 고정하여 동물 포지셔닝을 위한 좋은 위치에 있습니다. 프레임 홀더의 로스트랄 끝에 있는 탭을 Y축 레일의 일치하는 채널로 밀어 넣고 세트나사(그림 1h,빨간색 화살표)로 고정합니다.
- XYZ 포지셔너를 구동하려면 제조업체의 지시에 따라 컴퓨터에 USB를 설치하여 변환기를 연결합니다. 런타임 환경 과 모터 컨트롤러 소프트웨어를 PC에 설치합니다.
- 컨트롤러 소프트웨어의 전면 패널의 포트 선택 드롭다운 컨트롤에서 USB를 직렬 변환기로 선택하여 소프트웨어에서 적절한 직렬 포트를 선택해야 합니다. 9핀 직렬 크로스오버 케이블(예: RS232 널 모뎀 케이블)을 사용하여 USB를 스테퍼 모터 컨트롤러 상자에 연결합니다.
- 컨트롤러 소프트웨어를 실행하여 스테퍼 모터를 소프트웨어 제어하에 구동할 수 있는 테스트합니다. 이 단계에서는 로컬 IT 지원의 도움이 필요할 수 있습니다.
3. 두개 내 타겟팅 절차
참고: 250-350 g의 남성 스프라그 Dawley 쥐가 이러한 실험에 사용되었습니다. 동물은 물과 쥐 차우에 무료로 접근할 수 있었고, 12:12h 의 빛:어두운 주기로 유지되었다.
- 마취 하에 동물을 넣고 (산소가있는 3 % 이소플루란)과 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하십시오. 그런 다음 아래에 설명된 대로 카테터를 삽입합니다.
- 정맥에 쉽게 닿을 수 있도록 램프로 꼬리를 따뜻하게 합니다. 동물을 과열하거나 꼬리를 태우지 않도록 주의하십시오.
- 동물이 잠들면 (발가락 핀치에 반응하지 않음), 마이크로 버블, 에반스 블루 염료 (EBD), MRI를 사용하는 경우 가도부트롤 MRI 대비를 제공하는 데 사용되는 24 G 꼬리 정맥 카테터를 삽입합니다. 정맥이 부딪히면 혈액이 칼집을 채우고 안쪽 바늘을 천천히 제거하고 칼집을 정맥으로 더 밀어 넣습니다.
참고 : 처음으로 쥐 꼬리 정맥 주사를하는 경우 스튜어트와 슈뢰더(33)와 같은 가이드를 참조하십시오. - 혈류량이 없는 경우, 카테터 칼집을 정맥 밖으로 천천히 움직이면 바늘이 정맥을 뚫었을 수 있다는 것을 테스트합니다. 카테터가 약간 뒤로 당겨질 때 혈액이 흐르는 경우, 먼저 찌르고 카테터 배치는 이전 위치로 장밋빛 꼬리의 다른 위치에서 다시 시작해야합니다.
- 카테터 플러그를 식염수로 채우고 카테터 플러그를 카테터 포트 끝에 나사로 꽂아 포트가 피로 가득 차자마자 카테터 포트의 끝에 넣습니다. 실험실 테이프를 카테터와 꼬리 주위에 조심스럽게 감싸서 제자리에 유지합니다. 상단에 작은 조각으로 시작하고 카테터 플러그의 맨 끝을 노출 떠나, caudal 방향으로 작동합니다.
- 마취 라인을 스테레오탁스프레임(도 2a)의마취 커넥터에 연결하고 입에 입을 물린 막대에 놓고 이어바를 두 외이도로 안내하여 동물의 머리를 프레임안으로 고정한 다음 세트 나사를 조입니다. 동물의 머리가 안전하고 수준인지 확인하십시오.
- 동물을 MRI 침대로 옮기고 마취 선을 코 콘에 연결합니다. 이 프로토콜에서 9.4 T 작은 보어 동물 MRI가 사용되었다.
- 좌표 측정을 위해 전체 뇌뿐만 아니라 MRI신탁(도 2b)을캡처하는 관상 및 축 T2 가중 이미지를 수집합니다. MRI 프로토콜을 빌드할 수 있도록 로컬 MRI 물리학자 또는 기술에게 다음 정보를 제공합니다.
- 관상 이미지(그림 2b 상단)의 경우 이미지 수 : 27, 너비 : 62.2 mm, 높이 : 62.2 mm, 깊이 : 37.97 mm, 복셀 크기 : 0.24 x 0.24 x 1.41 mm3.
- 축 이미지(그림 2b 아래)의 경우 이미지 수 : 13, 너비 : 61.47 mm, 높이 : 53.81 mm, 깊이 : 16.7 mm, 복셀 크기 : 0.41 x 0.21 x 1.29 mm3.
참고: 평면 해상도의 관상 동맥이 0.25mm에 가깝고 이미지가 전체 뇌와 fiducial을 커버하는 한 이러한 정확한 매개 변수를 가질 필요는 없습니다.
- FUS를 대상으로 하는 MRI fiducial에서 뇌 영역까지의 거리를 기록하여 위의 이미지에서 좌표 측정을 수집합니다.
- 스캐너에서 3.5 단계에서 수집된 관상 이미지에서 수탁이 가장 큰 이미지를 찾아 서체의 중심을 나타냅니다. 내측/측면 방향과 등쪽 복부 방향 모두에서(MRI 소프트웨어는 스케일 또는 포인트 측정 도구를 가지고, 로컬 MRI 기술 또는 물리학자와 상의)에 대한 뇌 영역의 상부에서 의외의 거리를 기록합니다(그림2b,상단).
- 스캐너에서, 3.5 단계에서 수집된 축 상에서, 신탁의 중심에서 표적 뇌 영역까지의 거리를 측정하고 내측/측면방향(도 2b,아래쪽)에서 형상의 맨 위를 측정하는 이미지를 찾아낸다.
- 두 개의 내측/측면 측정을 비교하고 서로 다른 경우 평균을 사용합니다. 이러한 좌표 측정은 XYZ 포지셔너를 사용하여 대상 뇌 영역으로 FUS 초점을 안내하기 위해 4.3 단계에서 나중에 사용됩니다.
- MRI 프레스스캔 이미지를 수집합니다. FUS BBB 개구부(그림4)를촬영한 이미지와 이러한 이미지를 비교합니다. T1 가중 이미지는 나중에 BBB 개방을 시각화하는 데 사용되며, T2 가중 이미지는 나중에 FUS 치료34이후 조직 손상이 발생하지 않도록 하기 위해 사용될 것이다.
- T1 가중 축 이미지의 경우 너비: 30mm, 높이: 51.2mm, 깊이: 3.0mm, 복셀 크기: 0.23 x 0.2 x 0.23 mm3,이미지 수: 13.
- T2 가중 축 이미지의 경우 너비: 30mm, 높이: 51.2mm, 깊이: 2.6mm, 복셀 크기: 0.2 x 0.2 x 0.2 mm3,이미지 수: 13.
- T1 가중 관상 이미지의 경우 너비 : 30mm, 높이 : 30mm, 깊이 : 27mm, 복셀 크기 : 0.16 x 0.16 x 1mm3,이미지 수 : 27.
- T2 가중 관상 이미지의 경우 너비 : 30mm, 높이 : 30mm, 깊이 : 27mm, 복셀 크기 : 0.12 x 0.12 x 1mm3,이미지 수 : 27.
참고: 3.5 단계에서와 마찬가지로 이러한 이미징 매개 변수는 나열된 것과 정확히 동일할 필요는 없습니다. 이러한 이미지는 3.5 단계에서 수집된 것보다 더 작은 FOV 및 더 높은 해상도를 가지고 있습니다.
- 동물을 스테레오탁 프레임에 보관하고 MRI 침대에서 벤치탑 FUS 설정으로 신속하게 동물을 운반합니다. 동물은 마취의 효과에 따라 전송을 위해 잠을 유지있는지 확인합니다.
- 전송 시간이 길어지면 동물과 프레임에 맞게 충분히 큰 전송을 위해 상자를 사용합니다. 마취 플러그가 여전히 부착되어 있는 가운데, 동물과 프레임을 상자 안에 놓고 여분의 이소플루란이 몇 분 동안 상자를 채울 수 있도록 합니다. 마취 라인을 분리하고 신속하게 전송합니다.
4. 집중 초음파 절차
- FUS 벤치탑 설정에 도착하면 즉시 마취 라인을 코 콘에 연결하고 산소로 1.5-3 %의 이소플루란을 계속 실행합니다. 동물이 깨어나지 않도록 가능한 한 빨리 이 작업을 수행하십시오.
- 프레임을 프레임 홀더에 밀어 넣고 제자리에 단단히 놓습니다. 클리퍼를 사용하여 동물의 머리를 면도합니다. 여분의 모발을 닦고 모발 리무버 크림을 두피에 바치십시오. 3 분 동안 앉아서 물과 거즈로 닦아.
- MRI를 대상으로 사용할 수 없는 경우 표준(3D 인쇄되지 않음) 스테레오테틱 프레임을 사용하여 포인터 팁을 bregma에 터치하고 소프트웨어 또는 좌표를 기록하여 포인터 위치를 bregma에 null합니다. 소프트웨어의 최대 50 버튼을 클릭하고 변환기포인터를 교체하여 XYZ 캐리지를 50mm 위로 이동합니다. 이전에 설명 된 쥐 뇌 아틀라스에 따라35,소프트웨어의 스테핑 버튼을 사용하여 원하는 뇌 좌표로 이동. MRI 대신 이 메서드를 사용하는 경우 섹션 4.6로 건너뜁니다.
- MRI 안내를 사용하는 경우 포인터를 연결하고 포인터를 MRI 신탁의 위치로 이동합니다(도1d,g). 포인터를 MRI 신탁의 맨 위와 중앙에 배치합니다(주체 홀더 상단에 작은 구멍이 포인팅을 위해 제공됩니다). MRI 이미지의 모든 거리가 계산된 지점인 null 위치 단추를 클릭합니다.
- 포인터를 제거하고 위치 이동을 내측/측면 좌표 및 로스트랄/caudal 좌표로 이동합니다. 수조와 초음파 젤의 배치를 허용하기 위해 최대 50 버튼을 눌러 포지셔너를 올립니다. Z축 이동의 상단에 도달하면 nulling 위치가 무효화됩니다. 등/복부 좌표는 트랜스듀서가 추가된 후에 설정됩니다.
- 동물의 두피에 초음파 젤을 바르고 폴리이미드 테이프 창을 젤에 눌러 동물 위에 수조를 놓습니다. 초음파 젤에 기포가 없는지 확인하십시오.
- 수조를 탈가스로 채웁니다.
- 고출력 트랜스듀서를 사용하는 경우, 자석이 물 바로 위에 있도록 포지셔너를 낮춥다. 트랜스듀서를 비스듬히 물에 적어 기포가 얼굴 아래에 갇히지 않도록 하고 자석을 연결합니다.
- 저전력 침수 변환기를 사용하는 경우, 트랜스듀서 클립 바로 위에 있는 물속으로 포지셔를 낮춥시다. 그런 다음 투명기가 얼굴 아래에 갇히는 것을 방지하기 위해 비스듬히 물 속으로 낮춤으로써 트랜스듀서를 제자리에 잘라냅니다.
참고: 투명 한 목욕 거품에 대 한 트랜스듀서 얼굴 아래 를 볼 때 도움이 됩니다. - 포지셔너를 등쪽/복부 좌표로 낮춥춥시다.
- RF 전원 앰프를 켭니다.
- 3% 에반스 블루 염료(EBD)의 1mL/kg을 주입하여 바늘 끝을 카테터 플러그에 집어 넣고 주입합니다. 5 분 동안 순환할 수 있습니다.
- 거품 셰이커로 심하게 흔들어 마이크로 버블을 활성화합니다.
- 18G 날개 주입 세트에서 2개의 FUS 처리 및 튜빙을 고려하여 식염수의 0.2 mL에서30μL/kg의 용량을 30 μL/kg의 용량을 0.2 mL의 식염수로 준비합니다. 예를 들어, 쥐의 무게가 200g인 경우, 18G 바늘 끝을 포함하는 주사기를 식염수 1mL에 마이크로 버블 30 μL로 채웁니다.
참고: 날개 달린 주입 세트로 복용하고 주입하는 데 18 G 바늘 팁을 사용해야 합니다. - 주사기를 여러 번 반전하여 마이크로 버블의 균일한 분포를 얻습니다. 그런 다음 날개 달린 주입 세트를 부착하고 채웁니다. 주사기를 주입 펌프에 배치하고 주입 펌프를 설정하여 0.2 mL의 속도로 6mL/h를 제공합니다. 이것은 2 분 FUS 노출을 통해 마이크로 버블의 느린 주입을 제공할 것입니다.
- 날개 달린 바늘을 카테터 플러그에 삽입합니다.
- 18G 날개 주입 세트에서 2개의 FUS 처리 및 튜빙을 고려하여 식염수의 0.2 mL에서30μL/kg의 용량을 30 μL/kg의 용량을 0.2 mL의 식염수로 준비합니다. 예를 들어, 쥐의 무게가 200g인 경우, 18G 바늘 끝을 포함하는 주사기를 식염수 1mL에 마이크로 버블 30 μL로 채웁니다.
- 먼저, 주입 펌프를 실행하고 3s를 기다린 후 기능 발생기의 출력 활성화 버튼을 눌러 FUS 처리를 시작합니다(재료 의 표에서기능 발생기에 "라벨"). 마이크로 버블이 지울 수 있도록 5 분 사이에 이 두 번 영역당 이 두 번 반복하십시오.
- 주입 펌프가 2 분 에서 중지 할 때 FUS 치료를 중지 기능 생성기에서 다시 켜진 버튼을 누릅니다.
- 마이크로 버블이 지울 때까지 5 분 기다립니다. 그런 다음 주입 및 두 번째 FUS 치료를 시작합니다.
- 두 번째 FUS 치료 직후, 가도부트롤 대비(MRI를 사용하는 경우) 및 관심 있는 제제, 예를 들어 바이러스 성 입자를 주입한다. 모든 에이전트의 총 전달 량은 5mL/kg을 초과해서는 안됩니다.
참고: 관심 있는 에이전트의 납품 타이밍(예: FUS BBB 개장 전후)은 사용되는 에이전트에 따라 다를 수 있습니다.
- RF 전원 앰프를 끄고 즉시 동물을 MRI로 다시 운반합니다.
5. BBB 오픈MRI 확인
- MRI를 사용할 수 없는 경우 섹션 6으로 건너 뛰고 EBD 식을 사용하여 BBB 개구부를 확인합니다.
- 동물을 MRI 침대에 다시 3.7 단계와 동일한 위치에 놓고 마취 라인을 연결합니다.
- BBB 개구부 영역에서 가도부트롤 MRI 향상을 시각화하기 위해 3.7 단계에서 사용되는 동일한 이미징 매개변수로 MRI 포스트 스캔을 수집한다(도3b,e).
6. 관류 및 조직 수집
- 혈액이 완전히 명확 해질 때까지 차가운 4 % 포르말린으로 동물을 perfuse.
- 뇌를 제거하고 하룻밤 사이에 4 % 포르말린 또는 PFA에 배치하십시오. 다음으로, 뇌가 가라 앉을 때까지 30 % 자당 용액 (약 2-3 일)에 뇌를 배치합니다. 마지막으로 액체 질소 나 드라이 아이스에 플래시 동결 및 냉동 절제 될 때까지 -80 ° C에 저장합니다.
- 10 월에 뇌를 동결 하 고 냉동 섹션을.
- 형광 현미경 검사법을 위한 고정 및 커버슬립 섹션. EBD 여기는 470 과 540 nm에서 피크와 680 nm에서 배출 피크. 전반적인 세포 형태를 시각화하기 위해 DAPI 마운팅 매체를 사용하여 커버슬립.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기서, 우리는 마이크로버블을 이용한 집중초음파가 저전력 침수 트랜스듀서(도3)와FUS 트랜스듀서(도4)를모두 사용하여 위에 지정된 파라미터를 사용하여 국소화된 BBB 개방을 유도할 수 있음을 입증한다. 첫째, 초기 실험에서 저전력 침수 트랜스듀서는전방(도 3b)또는 내측(도3a)의뇌 반구 를 표적으로 삼았다. 동물은 2시간 후에 관류(도3a)또는 관류(도3b)및 10μm 냉동 뇌 섹션으로 희생하였다. FUS BBB 개방은 대상 반구에서 EBD 자동 불발 (여기 : 470 및 540 nm, 방출 : 680 nm)에 의해 분명했다 (흰색 화살표 그림 3a 및 3b).
우리는 EBD 자동 불발력으로 BBB 개방의 명확한 시각화를 위해 동물을 perfuse하는 것이 가장 좋습니다. 그러나, BBB 개구부는 혈관을 지우지 않고 여전히 시각화될 수있다(도 3b). BBB 개통 후 EBD의 세포 섭취 및 클리어런스는 BBB 개통 후 30분 만에 시작하여 24시간37시간이상 증가합니다. EBD 자동 불경을 가진 BBB 개방의 평가를 위해, BBB 개방의 15 분 3 시간 사이에서 동물을 희생하는 것이 가장 좋습니다. 희생시간은 궁극적으로 전달된 요원에 달려 있습니다. 예를 들어, AAV 연구에서, BBB 개장 후 3주 후 BAV 및 AAV전달(도 5c)이적절할 수 있다.
이후 실험에서 FUS 트랜스듀서는 해마(도 4a-c)또는 전방 cingulate 피질(ACC)(도4 d-f)을대상으로 하고 EBD 이외에 MRI 조영제 가도부트롤(0.1 mL/kg)을 주입하여 생체내 BBB의 표적 개방을 검증하였다. 도 4b,e는 BBB 개폐 및 조영제 주입 후 1시간 후에 가도부트롤 대비가 조직에 진입한 MRI 대비를 향상시켰습니다. 이러한 대비 변화는 FUS절차(그림 4a,d)전에취한 MRI 사전 스캔과 비교할 때 분명합니다. 그런 다음 BBB 개구부 후 1.5시간 동안 관류에 의해 동물을 희생하고 10 μm 저온분면이 수집되었다. EBD 자동 불발성은 FUS 표적 지역에서 BBB 개방의 위치를 더욱 나타내는 것이분명하다(그림 4c,f). 이 그림은 MRI 대비가 때때로 보기 어려울 수 있는 방법을 강조합니다(그림 4b와 도 4e의차이와 같이); 따라서, 도 4f의형광 현미경그래프에서와 같이 EBD 자동형광의 시각화를 통해 BBB 개구부를 확인하는 것이 도움이 된다.
이 기술이 표적 유전자 전달 AAV9-hsyn-GFP 및 gadobutrol 대비를 위해 사용될 수 있는지 여부를 평가하기 위해 해마에서 BBB 개구부 직후 IV(titer: 1.32 x10 14 GC/mL, 0.05 mL/kg)를 주입하였다. 동물은 BBB 개통 후 30 분 이미지를 촬영한 후 3 주 후에 관혈에 의해 희생되었습니다. 10 μm 극저온 섹션은 GFP 발현의 형광 이미징을 위해 수집되었다. BBB 개구부는 표적 해마에서 가도부트롤 대비에 의해분명했다(그림 5a,b). 또한, 유전자 전달은 녹색 형광(도5c)에의해 명백한 표적 해마에서 GFP 발현에 의해 확인되었다. 이 시점에서 EBD는 지워졌으며 심실(그림5c)에서만분명합니다.
도 1: FUS 벤치탑 설정. (a)XYZ 포지셔너, 트랜스듀서의 부착을 위한 30mm 직경 PVC 파이프, 3D 프린팅 스테레오탁스 프레임 및 주입 펌프를 포함하는 FUS 설정. (b)PVC 파이프의 끝이 덮여 있고, 자석은 에폭시로 부착된다. (c)또 다른 일치하는 자석은 에폭시와 고출력 트랜스듀서의 상단 중심에 부착된다. (d)또한, MRI 신탁의 상단과 중앙에 포지셔널을 무효화하기 위해 포인터에 또 다른 매칭 자석이 부착된다. (e)포인터는 결국 고출력 트랜스듀서로 대체되고 수조는 동물의 머리에 초음파 젤을 결합한다. (f)저전력 침지 트랜스듀서는 3D 프릭 트러서 클립으로 PVC 파이프에 부착할 수 있다. (g)포지셔닝을 위해 트랜스듀서는 3D 프렌팅 포인터로 대체되고 위치가 MRI 신탁의 상단과 중앙에 무효화된다. (h)고정된 3D 프릭 프레임 홀더는 여러 FUS 치료가 필요한 경우 MRI 후 동물을 동일한 위치로 돌려받을 수 있도록 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MRI 가이드 좌표용 MRI 서두얼이 있는 스테레오탁스 프레임. (a)동물은 MRI 수탁이 장착된 3D 프린팅 스테레오탁스 프레임에 먼저 배치됩니다. (b)프레임은 MRI 침대 내부에 배치되고 대상 뇌 영역까지의 거리(점선)에서 대상 뇌 영역까지의 거리는 등/복부(D/V) 측정및 로스트랄/코달(R/C) 측정, 내측/측면(M/L) 측정을 위한 관상 동맥 이미지를 모두 사용하여 측정된다. 동물은 프레임에 보관되어 있으며 포인터가 프록시 위치에 XYZ 포지셔터를 null하는 데 사용되는 FUS 스테이션으로 전송됩니다. 그런 다음 포인터를 트랜스듀서로 교체한 다음 수집된 좌표에 따라 이동할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 에반스 블루 염료(EBD)는 관류 유무에 관계없이 FUS BBB를 열어 확인합니다. (a)FUS BBB가 개방된 후 2시간 후, 좌반구 내측을 대상으로 하는 저전력 침수 트랜스듀서를 가진 10 μm 뇌 부의 현미경 사진. 이것은 조직 수집 전에 4 % 완충 된 포르말린으로 인하여 처리 된 동물의 대표적인 이미지입니다. BBB 개구부는 EBD 빨간 자동 발광 (화살표)에 의해 분명하다. (b)FUS BBB 개구 후 2시간 후 10 μm 뇌 부의 현미경 그래프는 전방 좌반구를 표적으로 하였다. 이것은 조직 수집 전에 퍼프지지 않은 동물의 대표적인 이미지이므로 EBD는 혈관에 남아 있습니다. BBB 개구부는 EBD가 혈관 (화살)에서 유출 된 곳에서 분명하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: FUS BBB 오프닝가 가도부트롤 MRI 콘트라스트 및 EBD 발현으로 확인되었습니다. MR 이미지 전(a 및 d)및 이후(b 및 e)BBB 개구부. gadobutrol 대비 향상 생체 내에서 BBB 개방의 위치를 확인(b 및 전자,화살표). (c)해마(파란색 DAPI 핵얼룩)에서 EBD 자동불광(red)을 사용하여 BBB 개구부를 추가로 확인하였다. 스케일 바; 500 μm.(f)EBD 적색 자동 형광(arrow)에 의해 명백한 전방 cingulate 피질에서 BBB 개구부 다음 10 μm 뇌 섹션의 현미경 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: FUS BBB 개구부를 통해 해마에 AAV9-hsyn-GFP의 국산 전달. MRI 콘트라스트 에이전트, MRI 콘트라스트(arrow)를 결합한 BBB 개구부의 MRI확인(a)및축(b)T1 가중 이미지 모두에서. (c)FUS 표적 해마(green)에서 GFP 발현의 조직학적 확인(green) 3주 후 FUS BBB 개구부 및 AAV9-hsyn-GFP IV 주입. 파란색은 전반적인 세포 형태에 대한 DAPI 핵 얼룩을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에서 우리는 마이크로 버블에 대한 벤치탑 접근 방식이 MRI 지침의 유무에 관계없이 두개 내 표적화에 대한 두개 내 표적화 방법, 두개 내 표적을 위한 두가지 변형 및 방법을 포함하여 대체 접근 방식으로 FUS BBB 개방을 지원했습니다. 현재 랩에 MRI 유도 FUS BBB 개구부를 설치하기 위해 사용자 친화적인 인터페이스를 통해 매우 표준화되고 재현 가능한 결과를 제공하는 우수한 즉시 사용할 수 있는 장치를 구매할 수 있는 옵션이 있습니다. 그러나 많은 실험실은 이러한 기기의 비용에 대해 준비되지 않습니다. 따라서 이 프로토콜의 주요 목표는 기술 분야에서 전문 지식을 구축하기 위해 모든 실험실이 설정할 수 있는 출발점을 제공하는 것입니다.
FUS BBB 개방은 이제 널리 사용되는 기술이며, 종종 다른 그룹이 다양한 에이전트와 마취제를 활용하는 경우, 각각BBB 개방 및 사치의 정도에 영향을 미칠 수 있습니다. 중요한 것은, 사용된 특정 마취제는 BBB 개방의 크기에 영향을 미칠 수 있으므로 이프로토콜(38)을실행할 때 이를 고려하는 것이 중요하다. 여기서, 마취이소플루란은 동물의 호흡률과 심박수에 따라 쉽게 조절될 수 있는 프로토콜및 이소플루란 가스의 길이및 수준에 대해 이소플루란 하에서 동물이 유지될 수 있기 때문에 사용된다. 또한, 의료용 공기보다 접근성이 높기 때문에 산소로 이소플루란을 전달했습니다. 그러나, 의료 공기는 더 광범위한 BBB 개방을 허용할 수 있습니다39. 일부 MRI 조영제는 다른 프로토콜보다 이 프로토콜에 더 적합합니다. 예를 들어, 우리의 손에, gadoteridol는 EBD 누설이 조직 사후 에 명확하게 존재하는 경우에 아무 대조 향상을 생성하지 않습니다. 마이크로 버블 제형도 중요합니다. 여기서 우리는 퍼플루트렌 지질 마이크로스피어를 사용합니다. 퍼플루트렌 단백질 타입 A 마이크로버블과 같은 다른 마이크로버블 제형은 쉽게 사용할 수 있지만, 사용되는 마이크로버블의 유형은 결과에 영향을 미칠것이다(15).
함수 생성기의 컨트롤은 상당히 다를 수 있으므로 1단계에 나열된 설정을 입력하는 방법에 대한 설명서를 참조하십시오. 적절한 명령 전압(기능 발생기에 피크하는 V 피크)은 트랜스듀서 특성, RF 증폭기 게인, 트랜스듀서 매칭을 위한 RF 증폭기, 동물의 나이 및 크기, 마이크로버블 타입 및 농도 및 원하는 처리 효과에 크게 의존한다. V피크피크는 시행착오에 따라 결정되어야 합니다. 1단계에서 제안된 설정으로 시작하여 조직학적으로 효과를 결정합니다. 조직 손상이 있는 경우 피크를 낮기 위해 V를 10% 낮추고 다시 시도하십시오. 마찬가지로 BBBO가 없다면 피크 V를 10%까지 올리고 다시 시도하십시오. V를 너무 높게 설정하면 저전력 침수 변환기가 손상될 수 있습니다. 이것은 트랜스듀서 면의 균열 또는 왜곡으로 명백해질 것입니다. 트랜스듀서의 제조 리드 타임은 길 수 있으므로 시작할 때 두 개 이상의 트랜스듀서를 백업으로 구입하는 것이 좋습니다. 초음파 트랜스듀서는 부적절하게 일치하는 경우 앰프를 손상시킬 수 있습니다. 단순성과 신뢰성을 위해 복잡한 부하(예: 재료 테이블의 RF 전원 증폭기)를 구동할 수 있는 견고한 전원 증폭기사용이 좋습니다. 고출력 트랜스듀서는 일치하는 회로와 함께 제공되지만 저전력 침지 변환기는 그렇지 않습니다. 제안된 RF 증폭기는 제대로 일치하지 않는 트랜스듀서에서 반사된 전력을 처리할 수 있지만 일부 증폭기는 이 구성에서 손상될 수 있습니다. 또한 2.7 단계가 드라이버 및 소프트웨어를 설치한 후 문제가 있는 경우 소프트웨어에서 적절한 직렬 포트가 선택되었는지 다시 확인합니다. 다음으로 다른 직렬 케이블을 사용해 보십시오. 실패하면 로컬 IT 지원을 찾습니다.
경험에서, 그것은 연습과 뇌 영역 타겟팅에 꽉 정확성을 달성하기 위해 여러 조정을 취할 것입니다. 이는 초기실험(도 3)과가장 최근의 실험(도5)의표적차이에서 볼 수 있다. 우리는 고전적인 스테레오 테어틱 프레임을 사용하여 실험을 시작하고 우리는 3D 프린터에 액세스 할 수 없거나 설치류 MRI에 액세스 할 수없는 경우 여기에 옵션으로 포함. 그러나 MRI fiducials및 제공된 3D 인쇄 가능한 프레임(또는 사용자 지정 디자인)이 있는 MRI 가이던스가 이상적인 방법입니다. 첫째, 평균적인 쥐 뇌 아틀라스에 의존하지 않고 동물 내에서 좌표를 수집하여 동물 간의 개별적인 차이를 설명합니다. 또한 MRI를 사용하면 사후 EBD 표현에 의존하지 않고 생체 내에서 FUS 위치 타겟팅을 확인할 수 있습니다. 이는 AAV(그림5)와같이 적용되기까지 24시간 이상이 소요될 수 있는 에이전트를 제공할 때 중요합니다. 마지막으로 제공된 프레임 홀더는 MRI 후 동물을 동일한 위치로 되돌리거나 좌표를 다시 수행할 필요 없이 BBB 개구부가 부족한 후 FUS를 반복할 수 있습니다. 휴대용 3D 프린팅 스테레오탁 프레임은 200mm 이상의 투명한 보어가 있는 모든 MRI에서 사용할 수 있습니다.
표적 위치의 혈관 분포에 따라 두개골두께(40),심실의 존재, 및 기타 요인에 따라 BBB 개구도가 다를 수 있다. 이러한 이유로 프레임 및 프레임 홀더를 사용하여 반복 타겟팅하는 방법을 제공합니다. 타겟팅의 정확성은 타게팅 포인터와 관련하여 트랜스듀서의 초점을 일관된 위치에 유지하는 데 매우 중요합니다. 이 포인터의 끝은 트랜스듀서가 XYZ 포지셔에 부착될 때 트랜스듀서 초점 의 중심 의 공간에 있는 위치를 표시해야 합니다. 자석을 사용하면 포인터와 트랜스듀서를 쉽게 교체할 수 있으며 이 지역화를 유지합니다. 자석의 구멍과 돌출은 가능한 한 정확하게 일치해야 합니다. 이 연결의 가변성은 FUS 포커스 타겟팅의 반복성을 감소시킵니다. 그러나 포인터 팁과 초음파 초점 사이에 공간 오프셋이 있을 것입니다. 오프셋이 일관되다는 것이 확인되면 MR 이미지를 사용하여 생성된 BBB 개방 위치(MRI 대비 위치)와 의도된 대상 위치의 mm 차이를 계산하여 수정할 수 있습니다. 그런 다음 이 차이를 null 위치로 팩터링할 수 있습니다. 정확도와 반복성은 또한 동일한 초음파 주파수를 사용하고 주어진 실험 세트에서 비슷한 크기와 나이의 쥐를 사용하는 데 큰 이점을 제공합니다. 쥐 뇌와 쥐 두개골에 의한 초음파 감쇠는 주파수와 두개골 크기 및 두개골 두께는 연령에 따라 다릅니다. 두개골은 또한 초음파 펄스와 관련하여 작은 구멍이며 사고 초음파는 두개골 내부의 반사와 상호 작용하여 트랜스듀서(40)의조직, 두개골, 주파수 및 위치에 의존하는 복잡한 사운드 필드를 생성합니다.
다른 곳에서 언급 했듯이,이 프로토콜은 이미 구입할 수있는 우수한 MRI 호환 상용 솔루션에 대한 낮은 투자 대안을 제공하기위한 것입니다. 비용을 낮게 유지함으로써 발생하는 중요한 제한 사항이 있습니다. 또한 물리학과 현재 기술의 상태를 주어진 기술에 내재된 제한이 있습니다. 놀랍게도, 이러한 한계에도 불구하고, 대표적인 결과에 도시된 바와 같이, 우리는 부밀리미터 정확도를 가진 쥐의 해마에 염료, 입자 및 바이러스의 일관된 전달을 달성할 수 있습니다. 가장 중요한 한계는 (1) FUS 초점의 모양이 중간 조직, 특히 두개골의 모양과 두께에 달려 있다는 것입니다{...}. FUS 치료를 수행하기 위해 MRI에서 동물을 제거해야 하는 경우 FUS 초점의 국소화 및 강도에 대한 실시간 피드백을 방지할 수 있습니다. 이 실시간 피드백없이 여러 실험은 타겟팅 위치의 각 조합에 대한 설정을 확인해야합니다. 설정이 "전화 접속"되면 반복성이 좋았습니다. (2) 시공된 XYZ 포지셔닝 및 수탁 시스템은 정밀하면서도 실험에서 실험까지 포지셔너의 좌표 프레임에 정확성을 제공하지 않는다. XYZ 홈의 상대위치, 설치류의 두개골 및 프레임은 실험에서 실험으로 서로 를 기준으로 이동할 수 있습니다. 이는 표적화를 위한 MRI 이미지, FUS 초점에 비해 공간에서 알려진 위치와 의타겟팅 포인터 및 fiducial을 사용하여 MRI 좌표 시스템이 XYZ 포지셔너 시스템과 평행하게 되도록 하고, 실제 치료 세트 이전에 테스트 트리트먼트를 수행하고 동물이 프레임으로 재배치할 필요가 없도록 한 세션 내에서 전체 절차를 수행함으로써 사용되지 않습니다. 하나의 수탁인만 사용되기 때문에 프레임 회전을 교정할 수 없으므로 MRI 침대 및 보어와 관련하여 프레임이 레벨이 되도록 하는 것이 중요합니다. 요약하자면, 포인터 위치는 진정한 FUS 초점을 나타내지 않지만, 두개골이 초음파 트랜스듀서에 비해 회전하지 않는 한 주어진 뇌 위치에 대해 오프셋이 일관되어 있음을 발견했습니다. 또한 BBB 개구부및 이미징에 비해 가도부트롤 전달의 일관된 타이밍은 특히 MRI 콘트라스트 변화가 BBB 개구부양에 대한 대리자로 사용되는 경우 일관된 결과에 매우 중요하다는 점에 유의하십시오(참조 36).
우리는 먼저 위에서 설명한 저전력 침수 변환기와 함께 실험실에서 FUS BBB 오프닝을 시작했습니다. 우리는이 기술로 시작하기위한 저렴한 옵션임을 발견했습니다. 가장 중요한 것은,이 프로토콜의 적응은인간30,32,41에서경두개 FUS의 현재 사용으로 인해 이 기술로 수행된 두개 내 입체적 수술 및 전임상 연구에 대한 비침습적 대안을 제공할 수 있다. 일단 실험실에서 설치되면,이 기술은 스테레오 탁스 수술에 대한 비 침습적 대안으로 사용될 수 있습니다. 따라서 엄격하게 조사 도구를 매우 번역 도구로 변환합니다. 우리의 실험실은 MRI 유도, 바이러스 및 나노 입자의 현지화 된 전달에 이 기술을 사용하여 깨어있는 설치류와 비 인간 영장류를 자유롭게 행동하는 데 사용할 수있는 새로운 비 침습적 신경 변조 기술을 개발할 것입니다. 현재 작품은 디자이너 수용체 (DREADDs)를 위해 독점적으로 설계된 디자이너 약물과 X 선과 같은 고에너지 입자의 낮은 용량에 뉴런의 민감성에 초점을 맞추고 있습니다. 이 실험실은 또한 치료 중에 동물을 움직일 필요를 제거하고 실시간 타겟팅 피드백을 허용하기 위해 인간 3 T 스캐너에서 수행 할 수있는이 프로토콜의 새 버전에서 작업하고 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 클렘슨 대학에 NSF EPSCoR 연구 인프라 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 (1632881). 또한, 이 연구는 시비탄 국제 연구 센터, 버밍엄, AL에 의해 부분적으로 지원되었다. 저자는 감사 버밍엄 작은 동물 이미징 공유 시설 보조금 [NIH P30 CA013148]에서 앨라배마 대학의 서비스와 시설의 사용을 인정합니다. 저자들은 라지브 초프라의 지지와 지도에 대해 인정한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
- Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
- Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
- Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
- Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
- Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
- Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
- Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
- Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197 (2013).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
- Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
- Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15 (2018).
- Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986 (2018).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
- Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
- Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
- Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
- Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
- Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
- Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
- Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
- Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
- Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
- Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
- Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
- Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
- Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86 (2019).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
- Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
- Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
- O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
- Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).
