Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

גישה ספסל למיקום ספציפי מחסום הדם מוח פתיחת באמצעות אולטרסאונד ממוקד במודל עכברוש

Published: June 13, 2020 doi: 10.3791/61113
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

Summary

אולטרסאונד ממוקד עם סוכני microbubble יכול לפתוח את מחסום הדם מוח מוקדי חולף. טכניקה זו שימשה כדי לספק מגוון רחב של סוכנים על פני מחסום הדם מוח. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עבור מסירה מקומית למוח מכרסמים עם או בלי הדרכה MRI.

Abstract

ניתוח סטראוטקסי הוא תקן הזהב להעברת סמים וגנים מקומיים למוח המכרסמים. טכניקה זו יש יתרונות רבים על פני אספקה מערכתית כולל לוקליזציה מדויקת לאזור המוח היעד והפחתת תופעות לוואי מחוץ ליעד. עם זאת, ניתוח סטראוטקסי הוא פולשני מאוד אשר מגביל את היעילות התרגומית שלה, דורש זמני התאוששות ארוכים, ומספק אתגרים כאשר מיקוד אזורי מוח מרובים. אולטרסאונד ממוקד (FUS) יכול לשמש בשילוב עם microbubbles במחזור כדי לפתוח באופן ארעי את מחסום הדם מוח (BBB) באזורים בגודל מילימטר. הדבר מאפשר לוקליזציה תוך נדרית של סוכנים המועברים באופן שיטתי שאינם יכולים בדרך כלל לחצות את ה- BBB. טכניקה זו מספקת חלופה לא פולשנית לניתוח סטראוטקסי. עם זאת, עד כה טכניקה זו טרם אומצה באופן נרחב במעבדות מדעי המוח בשל הגישה המוגבלת לציוד ושיטות סטנדרטיות. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק גישה ספסל לפתיחת FUS BBB (BBBO) כי הוא סביר לשחזור ולכן ניתן לאמץ בקלות על ידי כל מעבדה.

Introduction

למרות התגליות הרבות במדעי המוח הבסיסיים, מספר הטיפולים המתעוררים להפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות נותר מוגבל יחסית1,2. הבנה מעמיקה יותר של הגנים, המולקולות והמעגלים התאיים המעורבים בהפרעות נוירולוגיות הציעה טיפולים מבטיחים שאינם ניתנים למימוש בבני אדם בטכניקות הנוכחיות3. טיפולים יעילים מוגבלים לעתים קרובות על ידי הצורך להיות חדירה למוח ו ספציפי לאתר4,5,6,7,8. עם זאת, שיטות קיימות של אספקת תרופות מקומיות לאזורי מוח ספציפיים (למשל, משלוח באמצעות הזרקה או קנולה) הן פולשניות ודורשות פתח להתבצע בגולגולת9. הפולשנות של ניתוח זה מונעת שימוש שגרתי באספקה מקומית למוח האנושי. בנוסף, נזק לרקמות והתגובות הדלקתיות הנובעות מכך הם מבלבלים בכל מקום למחקרים בסיסיים ופרה-קוליניים המסתמכים על הזרקה תוך-מוחית10. היכולת לספק סוכנים באופן לא פולשני על פני מחסום הדם מוח (BBB) ולמקד אותם לאזורי מוח ספציפיים יכולה להיות השפעה עצומה על טיפולים בהפרעות נוירולוגיות, ובו זמנית לספק כלי חקירה רב עוצמה למחקר פרה-קליני.

שיטה אחת של הובלה ממוקדת על פני BBB עם נזק מינימלי לרקמות היא אולטרסאונד ממוקד transcranial (FUS) יחד עם microbubbles כדי לפתוח את BBB11,12,13,14,15,16. פתיחת FUS BBB צברה תשומת לב לאחרונה לטיפול בהפרעות ניווניות, שבץ וגליומה על ידי לוקליזציה של טיפולים כדי למקד אזורים במוח כגון גורמים נוירוטרופיים17,18,19, טיפוליםגנטיים 20,21,22, נוגדנים23, נוירוטרנסמיטורים24, וננו חלקיקים25,26,27,28,29. עם מגוון רחב של יישומים ואופיו הלא פולשני30,31, פתיחת FUS BBB היא חלופה אידיאלית לזריקות תוך ורידי סטראוטקסיות שגרתיות. יתר על כן, בשל השימוש הנוכחי שלה בבני אדם30,32, חקירות פרה-קוליניות באמצעות טכניקה זו יכול להיחשב תרגום מאוד. עם זאת, פתיחת FUS BBB עדיין לא הייתה טכניקה מבוססת נרחבת במדע בסיסי ומחקר פרה-קליני בשל חוסר נגישות. לכן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגישה ספסל לפתיחת FUS BBB כנקודת מוצא למעבדות המעוניינות לבסס טכניקה זו.

מחקרים אלה נערכו עם מתמר אולטרסאונד ספציפי FUS מגובה אוויר בהספק גבוה או מתמר טבילה קולי ממוקד בהספק נמוך. המתמרים הונעו על ידי מגבר כוח RF המיועד לעומסים תגובתיים ומחולל פונקציה סטנדרטי על הספסל. פרטים על פריטים אלה ניתן למצוא בטבלת החומרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים נעשו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של UAB.

1. הגדרת ציוד נהיגה אולטרסאונד ממוקד

  1. השתמש 50 אוהם כבלי BNC קואקסיאליים כדי לחבר (1) את הקלט של מתמר אולטרסאונד לפלט של מגבר RF ו (2) את הקלט של מגבר RF לפלט של מחולל הפונקציות.
  2. הגדר את מצב מחולל הפונקציות לפרץ סינוסואיד פעם בשנייה עם מחזור חובה של 1%.
    1. עבור מתמר טבילה בהספק נמוך של 1 מגה-הרץ עם מרחק מוקד של 0.8 אינץ' המשמש עם מגבר RF של 50 dB, הגדר את הגדרות ההתחלה ל: גל סינוס של 1 מגה-הרץ, שיא V אחד לשיא, מחזור 10k, מרווח זמן של 1 (או נקודה).
    2. עבור מגובה האוויר, מתמר בהספק גבוה של 1.1 מגה-הרץ, הגדר את ההגדרות הראשוניות ל: גל סינוס של 1.1 מגה-הרץ, שיא של 50 mV לשיא, מחזורי 11k, מרווח של 1 שניות.
      הערה: אל תפעיל את המתמרים אלא אם כן הם שקועים. אין להניח יד או חלק גוף אחר במוקד אולטרסאונד או לגעת בפנים מתמר בזמן שהוא פועל.

2. הגדרת ספסל אולטרסאונד ממוקדת

  1. הדפס תלת-ממד את המסגרת הסטראוטקסית ואת מחזיק המסגרת הסטריאוטיפית.
  2. חבר את המתמר לממקם XYZ באמצעות מלחציים המחזיקים צינור PVC(איור 1a). בורג מהדק על שקופית X-ציר ולנעול עם אגוז כנף.
    1. אם אתה משתמש במתמר אולטרסאונד בהספק גבוה, חבר אותו לצינור PVC באמצעות זוג מגנטים תואמים. ודא כי מגנט אחד יש חור והשני יש בליטה תואמת. כיפה בתחתית צינור ה-PVC וחיבר אליו את אחד המגנטים באמצעות אפוקסי (ראו איור 1b).
    2. חבר את המגנט השני למרכז העליון של מתמר אולטרסאונד בהספק גבוה באמצעות אפוקסי. ודאו שהוא נמצא ממש במרכז המתמר(איור 1c).
  3. אם אתם משתמשים במתמר אולטרסאונד בהספק גבוה, תצביעו על ביטול מיקום XYZ. קצה מצביע זה מציין את המיקום בחלל של מרכז מוקד מתמר כאשר מתמר אולטרסאונד מחובר לממקם XYZ. הפוך מצביע מתוך 18 G מחט לחתוך להיות אורך המרחק המוקד של מתמר בתוספת עובי של מתמר(איור 1d).
    1. החל אפוקסי על מגנט שלישי (מגנט זה גם זוגות עם מגנט כובע PVC) ולחבר אותו לחלק העליון של המצביע. לאחר מכן יוכל המצביע להתחבר למגנט בצינור ה-PVC לביטול XYZ(איור 1d).
  4. בשעת שימוש במתמר הטבילה בהספק נמוך, הדפסו תלת-ממד את הקובץ למצביע ולקליפ ההרכבה.
    1. חבר את מתמר הטבילה בהספק נמוך לצינור PVC על-ידי גזירת קליפ ההרכבה לצינור PVC והכנס את המתמר לטבעת (איור 1f).
  5. הפוך אמבט מים על ידי הדבקת חתיכות חתוכות מסדין אקרילי שיוכלו לנוח על ראש החיה מעל המסגרת הסטריאוטיפית(איור 1e).
    1. חותכים פתח בתחתית האמבטיה כי הוא בערך בגודל של ראש החיה. מכסים את החור באמבט המים עם סרט פולימיד.
      הערה: יש להקפיד על מנת להבטיח כי המים אינם דולפים סביב סרט פולימיד כפי שהוא יכול להרטיב את פרוות החולדה ולגרום היפותרמיה.
  6. הפוך MRI fiducial על ידי מילוי 4 מ"מ קוטר פלסטיק דק פגזים או כדור זכוכית עם נוזל MRI גלוי (למשל, שמן ויטמין E) ולאטום אותו. הניחו אותו במחזיק ה-MRI בצד ימין של המסגרת הסטראוטקסית המודפסת בתלת-ממד (איור 2a).
  7. אבטחו היטב את מחזיק המסגרת המודפס בתלת-ממד לממקם XYZ במיקום טוב למיקום בעלי חיים. החלק את הלשונית בקצה הרוטאלי של מחזיק המסגרת לתוך הערוץ התואם על מסילת ציר Y ואבטחתו באמצעות ברגים מוגדרים(איור 1h, חצים אדומים).
  8. להנעת מיקום XYZ, התקן את ה- USB לממיר טורי במחשב על-ידי ביצוע הוראות היצרן וחבר את הממיר. התקן את סביבת זמן הריצה ואת תוכנת בקר המנוע במחשב.
    1. ודא שהיציאה הטורית המתאימה נבחרה בתוכנה על-ידי בחירת ה- USB לממיר טורי בפקד הנפתח של בחירת היציאה בלוח הקדמי של תוכנת הבקר. חבר את ה- USB לממיר טורי לתיבת הבקר של מנוע הצעד באמצעות כבל מוצלב טורי בן 9 פינים (למשל, כבל מודם מסוג RS232 Null).
    2. הפעל את תוכנת הבקר כדי לבדוק שניתן לנהוג במנועי Stepper תחת בקרת תוכנה. שלב זה עשוי לדרוש סיוע של תמיכת IT מקומית.

3. הליך מיקוד תוך נדרי

הערה: חולדות זכר Sprague Dawley במשקל 250-350 גרם שימשו לניסויים אלה. לבעלי חיים הייתה גישה חופשית למים ולאוכל עכברושים, ונשמרו על מחזור אור:כהה של 12:12 שעות.

  1. שים את החיה תחת הרדמה (3% isoflurane עם חמצן) ולבדוק את חוסר התגובה לצביטת בוהן. לאחר מכן הכנס את הקטטר כמתואר להלן.
    1. לחמם את הזנב עם מנורה לעשות קל יותר להכות את הווריד. היזהר לא לחמם יתר על המידה את החיה או לשרוף את הזנב.
    2. ברגע שהחיה ישנה (אינה מגיבה לצביטת בוהן), הכנס את קטטר וריד הזנב 24 G שישמש להעברת microbubbles, צבע כחול אוונס (EBD), ניגוד MRI gadobutrol אם באמצעות MRI, ואת הסוכן הניסיוני של עניין. ברגע שהווריד נפגע, הדם ימלא את הנדן, יסיר לאט את המחט הפנימית תוך דחיפת הנדן עוד יותר לתוך הווריד.
      הערה: ראה מדריך כמו סטיוארט שרודר33 אם עושים את זריקות וריד זנב החולדה בפעם הראשונה.
    3. אם אין זרימת דם, לאט להזיז את נדן קטטר מתוך הווריד כדי לבדוק כי המחט אולי דקר את הווריד. אם הדם זורם כאשר הקטטר נמשך מעט לאחור, אז הראשון לתקוע עבר את הווריד ואת מיקום הקטטר יהיה צורך להפעיל מחדש במקום אחר על הזנב כי הוא rostral למיקום הקודם.
  2. ממלאים את תקע הקטטר בתמיסת מלח ומזיין את תקע הקטטר לסוף יציאת הקטטר ברגע שהנמל מתמלא בדם. לעטוף בזהירות את קלטת המעבדה סביב הקטטר והזנב כדי לשמור אותו במקום. התחל עם חתיכה קטנה בחלק העליון ולעבוד בכיוון caudal, משאיר את הקצה מאוד של תקע קטטר חשוף.
  3. חבר את קו ההרדמה למחבר ההרדמה במסגרת הסטראוטקסית(איור 2a)ותקן את ראש בעלי החיים למסגרת על-ידי הנחת הפה על סרגל הנשיכה ועל-ידי הנחיית מוטות האוזניים לשתי תעלות האוזן, ולאחר מכן הדק את הברגים שנקבעו. ודא שראש החיות מאובטח ומאוזן.
  4. מעבירים את החיה למיטת ה-MRI ומחברים את קו ההרדמה לקונוס האף. בפרוטוקול זה נעשה שימוש ב- MRI של בעלי חיים קטנים 9.4 T.
  5. אסוף תמונות משוקללות T2 קורנל ואקסיאליות הלוכדות את המוח כולו, כמו גם את ה- MRI fiducial (איור 2b) למדידות קואורדינטות. ספק לפיזיקאי MRI המקומי או לטכנולוגיה את המידע הבא כדי שיוכלו לבנות את פרוטוקול ה- MRI.
    1. לתמונות קורנל(איור 2b למעלה), השתמש בפרמטרים הבאים: מספר תמונות: 27, רוחב: 62.2 מ"מ, גובה: 62.2 מ"מ, עומק: 37.97 מ"מ, גודל Voxel: 0.24 x 0.24 x 1.41 מ"מ3.
    2. לתמונות ציריות(איור 2b למטה), השתמש בפרמטרים הבאים: מספר תמונות: 13, רוחב: 61.47 מ"מ, גובה: 53.81 מ"מ, עומק: 16.7 מ"מ, גודל Voxel: 0.41 x 0.21 x 1.29 מ"מ3.
      הערה: אין צורך בפרמטרים מדויקים אלה כל עוד הקורונל ברזולוציית המטוס קרוב ל-0.25 מ"מ והתמונות מכסות את כל המוח ואת הפידו-סוציאלי.
  6. לאסוף מדידות קואורדינטות מן התמונות לעיל על ידי הקלטת המרחק מן fiducial MRI לאזור המוח כי יהיה ממוקד עם FUS.
    1. בסורק, על תמונות הכתר שנאספו בשלב 3.5, למצוא את התמונה שבה fiducial הוא הגדול ביותר, המציין את מרכז fiducial. רשום את המרחק מהחלק העליון של fiducial לאזור המוח של עניין מ"מ (תוכנת MRI תהיה כלי מדידת קנה מידה או נקודה, להתייעץ עם טק MRI מקומי או פיזיקאי על איך לעשות את זה) הן בכיוון המדיאלי / לרוחב בכיוון הגחון הגבי (איור 2b, למעלה).
    2. בסורק, בתמונות הציריות שנאספו בשלב 3.5, מצאו את התמונה המציגה את החלק העליון של הדו-גזעי ומדדו את המרחק ממרכז הסיב לאזור המוח היעד הן בכיוון הגבי/גחוני והן בכיוון המדיאלי/לרוחב (איור 2b, למטה).
    3. השווה בין שתי המדידות המדיאליות/לרוחב ואם הן שונות השתמש בממוצע. מדידות קואורדינטות אלה ישמשו בשלב מאוחר יותר בשלב 4.3 להנחיית מוקד FUS לאזור מוח היעד עם מיקום XYZ.
  7. לאסוף תמונות PRESCAN MRI. השווה תמונות אלה לתמונות שנאספו לאחר פתיחת FUS BBB (איור 4). תמונות משוקלל T1 ישמשו מאוחר יותר כדי לדמיין את פתיחת BBB, תמונות T2 משוקלל ישמש מאוחר יותר כדי להבטיח שלא נגרם נזק לרקמות בעקבות טיפול FUS34.
    1. עבור תמונות ציריות משוקללות T1, השתמש בפרמטרים הבאים: רוחב: 30 מ"מ, גובה: 51.2 מ"מ, עומק: 3.0 מ"מ, גודל voxel: 0.23 x 0.2 x 0.23 מ"מ3, מספר תמונות: 13.
    2. עבור תמונות ציריות משוקללות T2, השתמש בפרמטרים הבאים: רוחב: 30 מ"מ, גובה: 51.2 מ"מ, עומק: 2.6 מ"מ, גודל voxel: 0.2 x 0.2 x 0.2 מ"מ3, מספר תמונות: 13.
    3. עבור תמונות קורנל משוקללות T1, השתמש בפרמטרים הבאים: רוחב: 30 מ"מ, גובה: 30 מ"מ, עומק: 27 מ"מ, גודל voxel: 0.16 x 0.16 x 1 מ"מ3, מספר תמונות: 27.
    4. עבור תמונות קורנל משוקללות T2, השתמש בפרמטרים הבאים: רוחב: 30 מ"מ, גובה: 30 מ"מ, עומק: 27 מ"מ, גודל voxel: 0.12 x 0.12 x 1 מ"מ3, מספר תמונות: 27.
      הערה: כמו בשלב 3.5, פרמטרי דימות אלה אינם צריכים להיות זהים לאלה המפורטים. תמונות אלה יש FOV קטן יותר ברזולוציה גבוהה יותר מאלה שנאספו בשלב 3.5.
  8. שמירה על החיה במסגרת סטראוטקסית, להעביר במהירות את החיה ממיטת MRI למערך FUS הספסל. ודא כי החיה להישאר ישן להעברה תחת השפעת הרדמה.
  9. עבור זמני העברה ארוכים יותר, השתמש בתיבה להעברה גדולה מספיק כדי להתאים את החיה ואת המסגרת. עם תקע הרדמה עדיין מחובר, מניחים את החיה ואת המסגרת בתוך התיבה ולאפשר isoflurane עודף למלא את התיבה במשך כמה דקות. נתק את קו ההרדמה והעבר במהירות.

4. הליך אולטרסאונד ממוקד

  1. עם ההגעה למערך ספסל FUS, לחבר מיד את קו ההרדמה לתוך חרוט האף ולהמשיך לרוץ 1.5-3% איזופלורן עם חמצן. לעשות את זה מהר ככל האפשר כדי למנוע את החיה מתעוררת.
  2. החלק את המסגרת למחזיק המסגרת והצמד אותה למקומם בחוזקה. השתמש בקוצץ כדי לגלח את ראשו של החיה. להבריש את השיער עודף ולהחיל קרם מסיר שיער על הקרקפת. בואו לשבת במשך 3 דקות ולנגב עם מים גזה.
  3. אם MRI אינו זמין למיקוד, השתמש במסגרת סטראוטקטית סטנדרטית (לא בהדפסת תלת-ממד) כדי לבטל את מיקום המצביע ל bregma על-ידי נגיעה בקצה המצביע ל bregma (חתך בקרקפת יהיה צורך בכך) וביטול התוכנה או הקלטת הקואורדינטות. הזז את גררת XYZ למעלה ב- 50 מ"מ על-ידי לחיצה על לחצן 50 כלפי מעלה בתוכנה והחלפת המצביע עבור המתמר. בהתבסס על אטלס מוח חולדה כמתואר קודםלכן 35, לעבור קואורדינטות המוח הרצוי באמצעות לחצני דריכה בתוכנה. אם אתה משתמש בשיטה זו במקום MRI, דלג מטה לסעיף 4.6.
  4. בשעת שימוש בהנחיות MRI, חברו את המצביע והזיזו את המצביע למיקום ה-MRI fiducial (איור 1d,g). מקם את המצביע בחלק העליון והמרכזי של FIDUCIAL MRI (חור קטן בחלק העליון של מחזיק fiducial מסופק עבור הצבעה). לחץ על לחצן מיקום ה- Null שהוא הנקודה שממנה חושבו כל המרחקים בתמונת ה- MRI.
  5. הסר את המצביע והזז את הממקם לקואורדינטות המדיאליות/לרוחב ולנקודות הציון rostral/caudal. הרם את המיקום על ידי לחיצה על כפתור 50 למעלה כדי לאפשר את המיקום של אמבט המים וג'ל אולטרסאונד. אם המערכת תגיע לראש הנסיעה בציר Z, תוקפו של מיקום הביטול יבוטל. הקואורדינטות הגביות/גחון ייקבעו לאחר הוספת המתמר.
  6. החל ג'ל אולטרסאונד על הקרקפת של החיה ומניחים את אמבט המים על החיה עם חלון סרט פולימיד לחוץ על הג'ל. ודא כי אין בועות אוויר בג'ל אולטרסאונד.
  7. ממלאים את אמבט המים במים דלים.
  8. אם משתמשים במתמר בעל העוצמה הגבוהה, הורידו את המיקום כך שהמגנט נמצא ממש מעל המים. חבר את המתמר לממקם על ידי הנמכה זהירה של המתמר למים בזווית כדי למנוע מבועות אוויר להילכד מתחת לפנים ולחבר את המגנטים.
  9. אם משתמשים במתמר טבילה בהספק נמוך, הורידו את המיקום למים ממש מעל קליפ המתמר. ואז לקצץ את המתמר במקום על ידי הנמכה איטית אותו לתוך המים בזווית כדי למנוע בועות אוויר מלהילכד מתחת לפנים.
    הערה: אמבטיה שקופה מועילה כאשר מסתכלים מתחת לפני מתמר עבור בועות.
  10. הורידו את המיקום לקואורדינטת הגב/גחון.
  11. הפעל את מגבר ההספק של RF.
  12. הזרק 1 מ"ל/ק"ג של 3% צבע כחול אוונס (EBD) על ידי הדבקת קצה המחט לתוך תקע קטטר והזרקה. אפשר לו להסתובב במשך 5 דקות.
  13. הפעל את microbubbles על ידי טלטול אותם באלימות עם שייקר הבועה.
    1. הכן 5x המינון של 30 μL / קילוגרם של microbubbles (בועה conc. 1.2 x 1010/ mL) ב 0.2 מ"ל של מלוחים כדי להסביר את 2 טיפולי FUS ואת צינורות 18 G מכונף עירוי להגדיר. לדוגמה, אם החולדה שוקלת 200 גרם, ואז למלא את המזרק המכיל 18 G קצה מחט עם 30 μL של microbubbles ב 1 מ"ל של מלוחים.
      הערה: הקפד להשתמש 18 G טיפים מחט הן לקחת והזרקת עם ערכת עירוי מכונף.
    2. הפוך את המזרק מספר פעמים כדי לקבל חלוקה אחידה של microbubbles. לאחר מכן צרף ומלא את ערכת העירוי המכונפת. מקם את המזרק על משאבת העירוי והגדר את משאבת העירוי כדי לספק 0.2 מ"ל בקצב של 6 מ"ל / שעה. זה יספק עירוי איטי של microbubbles על החשיפה FUS 2 דקות.
    3. הכנס את המחט המכונפת לתקע הקטטר.
  14. ראשית, להפעיל את משאבת העירוי, לחכות 3 s ולהתחיל את הטיפול FUS על ידי לחיצה על הפלט לאפשר כפתור על מחולל הפונקציה (שכותרתו " על "עלמחולל הפונקציות בטבלת החומרים). חזור על אלה פעמיים לכל אזור עם 5 דקות בין כדי לאפשר microbubbles לנקות.
    1. לחץ שוב על כפתור ההפעלה על מחולל הפונקציות כדי לעצור את הטיפול FUS כאשר משאבת העירוי מפסיק ב 2 דקות.
    2. המתן 5 דקות עד שהמיקרו-ביבים יתבהרו. ואז להתחיל את העירוי ואת הטיפול השני FUS.
    3. מיד לאחר הטיפול השני FUS, להזריק ניגודיות gadobutrol (אם באמצעות MRI) ואת הסוכן של עניין, למשל, חלקיקים ויראליים. סה"כ נפח שנמסר של כל הסוכנים לא יעלה על 5 מ"ל /ק"ג.
      הערה: עיתוי המסירה (למשל, לפני או אחרי פתיחת FUS BBB) של סוכן העניין עשוי להשתנות בהתאם לסוכן המשמש.
  15. כבו את מגבר החשמל של ה-RF והחזירו מיד את החיה ל-MRI.

5. אישור MRI לפתיחת BBB

  1. אם MRI אינו זמין, דלג לסעיף 6 והשתמש בביטוי EBD לאישור פתיחת BBB.
  2. מחזירים את החיה למיטת ה-MRI בדיוק באותו מיקום כמו בשלב 3.7 ומחברים את קו ההרדמה.
  3. אסוף את סריקות פוסט ה- MRI עם אותם פרמטרי הדמיה המשמשים בשלב 3.7 כדי לדמיין שיפור MRI gadobutrol באזור פתיחת BBB (איור 3b,e).

6. זלוף ואיסוף רקמות

  1. לחלחל החיה עם קר 4% פורמלין עד הדם פועל ברור לחלוטין.
  2. הסר את המוח ואת המקום 4% פורמלין או PFA ב 4 מעלות צלזיוס לילה. לאחר מכן, מניחים את המוח בתמיסת סוכרוז 30% עד שהמוח שוקע (בערך 2-3 ימים). לבסוף, פלאש להקפיא חנקן נוזלי או על קרח יבש ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד cryosectioning.
  3. להקפיא את המוח באוקטובר ולקחת cryosections.
  4. תיקון וכיסוי מקטעים עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. פסגת עירור EBD ב 470 ו 540 ננומטר ופסגות פליטה ב 680 ננומטר. כריכה עם מדיום הרכבה DAPI על מנת לדמיין את המורפולוגיה הסלולרית הכוללת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, אנו מראים כי אולטרסאונד ממוקד עם microbubbles יכול לגרום לפתיחת BBB מקומית באמצעות הפרמטרים שצוינו לעיל הן עם מתמר טבילה בהספק נמוך (איור 3) והן מתמר FUS (איור 4). ראשית, בניסויים מוקדמים, מתמר הטבילה בהספק נמוך היה מכוון לחצי כדור מוח אחד או לפנייים (איור 3b) או למדיאלי(איור 3a). בעלי חיים הוקרבו שעתיים לאחר מכן בזלוף (איור 3a) או ללא זלוף (איור 3b) ו-10 מיקרומטרים של חלקי מוח קפואים נאספו. פתיחת FUS BBB ניכרה על ידי שפעת אוטומטית EBD (עירור: 470 ו 540 ננומטר, פליטה: 680 ננומטר) בחצי הכדור היעד (חצים לבנים איור 3a ו 3b).

מצאנו את זה הכי טוב להחדיר את בעלי החיים להדמיה ברורה של פתיחת BBB עם שפעת אוטומטית EBD. עם זאת, עדיין ניתן לדמיין את פתיחת BBB מבלי לנקות את כלי הדם (איור 3b). ספיגה סלולרית וסיווג של EBD לאחר פתיחת BBB מתחיל ברגע 30 דקות לאחר פתיחת BBB ועולה מעל 24 שעות37. להערכת פתיחת BBB עם שפעת אוטומטית EBD, עדיף להקריב את החיה בין 15 דקות ל 3 שעות של פתיחת BBB. למרות שבסופו של דבר, זמן ההקרבה יהיה תלוי בסוכן שנמסר. לדוגמה, במחקר AAV, 3 שבועות לאחר פתיחת BBB ומסירה של AAV (איור 5c) עשויים להיות מתאימים.

בניסויים מאוחרים יותר, מתמר FUS היה ממוקד או ההיפוקמפוס (איור 4a-c) או קליפת המוח הקדמית cingulate (ACC) (איור 4 d-f) ובנוסף EBD, סוכן ניגודיות MRI gadobutrol (0.1 מ"ל / קילוגרם) הוזרק כדי לאמת פתיחה ממוקדת של BBB ב vivo. איור 4b,e להראות ניגודיות MRI משופרת שבו ניגודיות gadobutrol נכנס לרקמה 1 שעה לאחר פתיחת BBB והזרקת סוכן ניגודיות. שינוי ניגודיות זה ניכר בהשוואה לקדם-סריקות ה-MRI שנלקחו לפני הליך FUS (איור 4a,d). בעלי חיים הוקרבו אז על ידי זלוף 1.5 שעות לאחר פתיחת BBB ו 10 μm cryosections נאספו. שפעת אוטומטית של EBD ניכרת באזורים ממוקדי FUS המצביעים עוד יותר על מיקום פתיחת BBB (איור 4c,f). נתון זה מדגיש כיצד ניגודיות MRI יכולה לפעמים להיות קשה לראות (כמו בהבדל בין איור 4b לאיור 4e); לכן, כדאי לאשר פתיחת BBB עם הדמיה של EBD חתימה כמו מיקרוגרף פלואורסצנטי באיור 4f.

כדי להעריך אם טכניקה זו יכולה לשמש עבור משלוח גנים ממוקד AAV9-hsyn-GFP וניגודיות gadobutrol הוזרקו IV (טיטר: 1.32 x 1014 GC / mL, 0.05 מ"ל / קילוגרם) מיד לאחר פתיחת BBB בהיפוקמפוס. החיה הייתה אז MR תמונה 30 דקות לאחר פתיחת BBB והקריב 3 שבועות מאוחר יותר על ידי זלוף. 10 μm cryosections נאספו עבור הדמיה פלואורסצנטית של ביטוי GFP. פתיחת BBB ניכרה על ידי ניגודיות גאדובוטול בהיפוקמפוס היעד(איור 5a,b). בנוסף, מסירת גנים אושרה על ידי ביטוי GFP בהיפוקמפוס היעד ניכר על ידי פלואורסצנטיות ירוקה (איור 5c). שים לב שבשלב זה EBD התבהר והוא ניכר רק בחדרים (איור 5c).

Figure 1
איור 1: הגדרת ספסל FUS. (a) הגדרת FUS כולל מיקום XYZ, צינור PVC בקוטר 30 מ"מ לחיבור של המתמר, המסגרת הסטראוטקסית המודפסת בתלת-ממד ומשאבת העירוי. (ב)קצה צינור ה-PVC מכוסה, ומגנט מחובר אליו באפוקסי. (ג)מגנט תואם נוסף מחובר למרכז העליון של מתמר בהספק גבוה עם אפוקסי. (ד)בנוסף, מגנט תואם נוסף מחובר למצביע לביטול המיקום בחלק העליון והמרכזי של ה- MRI fiducial. (ה)המצביע מוחלף בסופו של דבר עם מתמר בעוצמה גבוהה ואמבט מים מצמד לראשו של החיה עם ג'ל אולטרסאונד. (ו)מתמר טבילה בהספק נמוך יכול להיות מחובר לצינור PVC עם קליפ מתמר בהדפסה תלת-ממדית. (ז)למיקום, המתמר מוחלף במצביע המודפס בתלת-ממד והממקם מבוטל בחלק העליון והמרכזי של ה- MRI fiducial. (ח)מחזיק המסגרת הנייח המודפס בתלת-ממד מאפשר להחזיר את החיה לאותה תנוחה לאחר MRI אם יש צורך בטיפולי FUS מרובים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מסגרת סטראוטקסית עם MRI פידוקאלי לקואורדינטות מונחות MRI. בעליחיים ממוקמים לראשונה במסגרת סטראוטקסית המודפסת בתלת-ממד ומצוידת ב-MRI fiducial. (ב)המסגרת ממוקמת לאחר מכן בתוך מיטת ה- MRI והמרחק מהעיגול הפידו-חברתי (מעגל מנוקד) לאזור מוח היעד נמדד באמצעות שתי תמונות קורנל למדידות הגב/גחון (D/V) ותמונות ציריות למדידות rostral/caudal (R/C), מדידה מדיאלית/רוחבית (M/L) שניתן לאסוף משני הצירים. בעלי חיים נשמרים במסגרת ומועברים לתחנת FUS שבה מצביע משמש כדי לבטל את עמדת XYZ במיקום של fiducial. לאחר מכן, המצביע מוחלף במתמר ואשר לאחר מכן ניתן להזיזו בהתבסס על הקואורדינטות שנאספו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הצבע הכחול של אוונס (EBD) מאשר את פתיחת FUS BBB הן עם זלוף והן בלעדיו. (a)מיקרוגרף של קטע מוח 10 מיקרומטר 2 שעות לאחר פתיחת FUS BBB עם מתמר טבילה בהספק נמוך המיועד לחצי הכדור השמאלי המדיאלי. זוהי תמונה מייצגת של בעל חיים שהיה חדורים עם 4% פורמלין אגירה לפני איסוף רקמות. פתיחת BBB ניכרת על ידי שפעת אוטומטית אדומה EBD (חץ). (ב)מיקרוגרף של קטע מוח 10 מיקרומטר 2 שעות לאחר פתיחת FUS BBB ממוקד לחצי הכדור השמאלי השני. זוהי תמונה מייצגת של בעל חיים שלא התמלא לפני איסוף רקמות ולכן, EBD נשאר בכלי הדם. פתיחת BBB ניכרת היכן EBD דלף מתוך כלי הדם (חץ). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פתיחת FUS BBB אושרה עם ניגודיות MRI של Gadobutrol וביטוי EBD. תמונות MR לפני(a ו- d)ואחרי(b ו- e)פתיחת BBB. שיפור ניגודיות gadobutrol מאשר את המיקום של פתיחת BBB ב vivo(b ו- e,חצים). (ג)10 מיקרומטר קטע המוח מראה אישור נוסף של פתיחת BBB עם שפעת אוטומטית EBD (אדום) בהיפוקמפוס (כתם גרעיני DAPI כחול). סרגל קנה מידה; 500 מיקרוגרף שלקטע מוח של 10 מיקרומטר בעקבות פתיחת BBB בקליפת המוח הקדמית cingulate ניכרת על ידי שפעת אדומה EBD (חץ). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: משלוח מקומי של AAV9-hsyn-GFP להיפוקמפוס באמצעות פתיחת FUS BBB. אישור MRI של פתיחת BBB עם סוכן ניגודיות MRI, ניגודיות MRI (חצים) הן בקורונה (א)והן צירי (ב) T1 משוקלל תמונות. (ג)אישור היסטולוגי של ביטוי GFP בהיפוקמפוס ממוקד FUS (ירוק) 3 שבועות לאחר פתיחת FUS BBB והזרקת AAV9-hsyn-GFP IV. כחול מציין כתם גרעיני DAPI עבור מורפולוגיה תאית הכוללת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן תיארנו גישה ספסל כדי microbubble סייע FUS BBB פתיחת עם גישות חלופיות כולל, שני מתמרים שונים ושיטות למיקוד תוך חיים עם וללא הדרכה MRI. נכון לעכשיו, על מנת להקים MRI מונחה FUS BBB פתיחת במעבדה, יש אפשרות לרכוש מכשירים מוכנים לשימוש מעולה המספקים תוצאות סטנדרטיות מאוד לשחזור עם ממשקים ידידותיים למשתמש. עם זאת, מעבדות רבות אינן מוכנות לעלות של מכשירים כאלה. לכן, המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לספק נקודת התחלה שכל מעבדה יכולה להקים על מנת לבנות את המומחיות שלהם בטכניקה.

פתיחת FUS BBB היא כעת טכניקה בשימוש נרחב וזה לעתים קרובות המקרה כי קבוצות שונות לנצל מגוון רחב של סוכנים והרדמה, שכל אחד מהם יכול להשפיע על מידת הפתיחה BBB ופזרנות. חשוב לציין, ההרדמה המסוימת המשמשת יכולה להשפיע על סדר הגודל של פתיחת BBB ולכן חשוב לשקול זאת בעת ביצוע פרוטוקול זה38. כאן, isoflurane הרדמה משמש כי בעלי חיים ניתן לשמור תחת isoflurane לאורך הפרוטוקול ורמות של גז isoflurane ניתן להתאים בקלות בהתבסס על קצב הנשימה של החיה ואת קצב הלב. בנוסף, מסרנו isoflurane עם חמצן כי זה היה נגיש יותר מאשר אוויר רפואי; עם זאת, האוויר הרפואי עשוי לאפשר פתיחת BBB נרחבת יותר39. סוכני ניגודיות מסוימים של MRI מתאימים יותר לפרוטוקול זה מאחרים. לדוגמה, בידיים שלנו, gadoteridol הפיק שום שיפור ניגודיות גם כאשר דליפת EBD היה נוכח בבירור ברקמות נתיחה שלאחר המוות. ניסוח Microbubble חשוב גם. כאן אנו משתמשים במיקרוספרות שומנים פרפלוטרן. ניסוחים microbubble אחרים כגון חלבון perflutren סוג A microbubbles זמינים, אבל סוג של microbubble בשימוש ישפיע על התוצאות15.

פקדים של גנרטורים פונקציה יכול להשתנות לא מעט, אז עיין במדריך הוראות כיצד להזין את ההגדרות המפורטות בשלב 1. מתח הפיקוד המתאים (V שיא לשיא על מחולל הפונקציה) תלוי מאוד בתכונות מתמר, רווח מגבר RF, מגבר RF כדי מתמר התאמה, הגיל והגודל של החיה, סוג microbubble וריכוז, ואת אפקט הטיפול הרצוי. השיא לשיא V יצטרך להיקבע על ידי ניסוי וטעייה. התחל עם ההגדרות המוצעות בשלב 1 ולקבוע את האפקט מבחינה היסטולוגית. אם יש נזק לרקמות, להוריד את השיא לשיא V על ידי 10% ולנסות שוב. כמו כן, אם אין BBBO ואז להעלות את השיא לשיא V על ידי 10% ולנסות שוב. הגדרה גבוהה מדי של V עלולה לגרום נזק לתמר טבילה בהספק נמוך. זה יהיה ברור כמו פיצוח או עיוות של פני מתמר. זמני ההובלה בייצור על מתמרים יכולים להיות ארוכים, ולכן כאשר מתחילים, אנו מציעים לרכוש יותר מתמר אחד כגיבוי. מתמרים אולטראסאונד יכול גם לגרום נזק מגברים אם הם מתאימים כראוי. לקבלת פשטות ואמינות, אנו מציעים להשתמש במגבר הספק קשיח שיכול להניע עומסים מורכבים (כגון מגבר הספק RF בטבלת החומרים). שים לב כי בעוד מתמר בהספק גבוה מגיע עם מעגל תואם, מתמר טבילה בהספק נמוך לא. מגבר RF המוצע יכול להתמודד עם העוצמה המשתקפת של המתמר תואם בצורה גרועה, אבל כמה מגברים עלולים להיפגע בתצורה זו. כמו כן, אם שלב 2.7 מתגלה כבעייתי לאחר התקנת מנהל ההתקן והתוכנה, בדוק שוב שהיציאה הטורית המתאימה נבחרה בתוכנה. לאחר מכן נסה כבל טורי אחר. אם זה נכשל, פנה לתמיכה מקומית ב- IT.

מניסיון, זה ייקח תרגול והתאמות מרובות כדי להשיג דיוק הדוק באזור המוח מיקוד. ניתן לראות זאת בהבדלי המיקודביןהניסויים המוקדמים ( איור 3 ) לבין הניסויים האחרונים (איור 5). התחלנו את הניסויים באמצעות מסגרת סטראוטקסית קלאסית ואנחנו כוללים אותה כאופציה כאן אם אין גישה למדפסת תלת מימד או אם אין גישה ל- MRI מכרסמים. עם זאת, MRI-הדרכה עם fiducials MRI ואת מסגרת להדפסה 3D בתנאי (או של עיצוב מותאם אישית) היא השיטה האידיאלית. ראשית, הוא מסביר הבדלים אינדיבידואליים בין בעלי חיים על ידי איסוף קואורדינטות בתוך החיה במקום להסתמך על אטלס מוח עכברוש ממוצע. בנוסף, השימוש ב- MRI מאפשר אישור של מיקום FUS מיקוד vivo במקום להסתמך על ביטוי EBD נתיחה שלאחר המוות. הדבר חשוב בעת מסירת סוכנים שעשויים לדרוש יותר מ-24 שעות כדי להיכנס לתוקף כגון AAVs (איור 5). לבסוף, מחזיק המסגרת שסופק מאפשר להחזיר את החיה לאותה תנוחה לאחר MRI כדי לתקן שגיאות מיקוד או לחזור על FUS לאחר פתיחת BBB לא מספיקה מבלי לבצע שוב את הקואורדינטות. ניתן להשתמש במסגרת הסטראוטקסית הניידת המודפסת בתלת-ממד בכל MRI עם שעמום ברור של 200 מ"מ או רחב יותר.

בהתאם להתפלגות כלי הדם במיקום היעד, עובי הגולגולת40, נוכחות של החדרים, וגורמים אחרים מידת פתיחת BBB יכול להשתנות. מסיבה זו, אנו מספקים שיטה לפילוח חוזר עם המסגרת ומחזיק המסגרת. דיוק הפילוח תלוי באופן קריטי בשמירה על מיקוד המתמר במיקום עקבי ביחס למצביע הפילוח. קצה מצביע זה אמור לציין את המיקום במרחב של מרכז מוקד המתמר כאשר המתמר מחובר לממקם XYZ. המגנטים מאפשרים להחליף בקלות את המצביע והמתמר תוך שמירה על קולוקליזציה זו. החור והבליטה במגנטים צריכים להתאים בדיוק ככל האפשר. כל שונות בחיבור זה מפחיתה את יכולת החזרה של פילוח מוקד FUS. עם זאת, יהיה היסט מרחבי בין קצה המצביע לבין מוקד אולטרסאונד. לאחר אישור כי ההיסט הוא עקבי, ניתן לתקן אותו באמצעות תמונות MR כדי לחשב את ההבדל מ"מ של מיקום הפתיחה BBB וכתוצאה מכך (מיקום של ניגודיות MRI) ואת מיקום היעד המיועד. לאחר מכן ניתן לקחת בחשבון הבדל זה במיקום ה- Null. דיוק וחזרה גם להפיק תועלת רבה משימוש באותו תדר אולטרסאונד ושימוש בחולדות בגודל ובגיל דומים בסדרה נתונה של ניסויים. הנחתת אולטרסאונד על ידי מוח החולדה וגולגולת החולדה משתנה עם תדירות וגודל הגולגולת ועובי הגולגולת משתנה בהתאם לגיל. הגולגולת היא גם חלל קטן ביחס לדופק אולטרסאונד ואת האירוע אולטרסאונד אינטראקציה עם השתקפויות בתוך הגולגולת כדי לייצר שדה קול מורכב התלוי רקמה, גולגולת, תדירות ואת המיקום של מתמר40.

כאמור במקומות אחרים, פרוטוקול זה נועד לספק חלופת השקעה נמוכה לפתרונות מסחריים מעולים תואמי MRI שכבר זמינים לרכישה. קיימות מגבלות חשובות הנובעות מכך שהעלות נמוכה. יש גם מגבלות הטבועות בטכניקה שניתנה לפיזיקה ולמצב הנוכחי של האמנות. למרבה הפלא, למרות מגבלות אלה, וכפי שמוצג בתוצאות הייצוגיות, אנו יכולים להשיג אספקה עקבית של צבעים, חלקיקים ווירוסים להיפוקמפוס של חולדות בדיוק תת-מילימטר. המגבלות החשובות ביותר הן ש(1) צורת המיקוד FUS תלויה ברקמה המתערבת ובעיקר בצורה ובעובי של הגולגולת{...}. הצורך להסיר את החיה מה-MRI כדי לבצע את הטיפול ב-FUS מונע משוב בזמן אמת על הלוקליזציה והעוצמה של מוקד FUS. ללא משוב זה בזמן אמת יש לבצע מספר ניסויים כדי לאשר הגדרה עבור כל שילוב של מיקום פילוח. לאחר ההגדרות "חייג", מצאנו חזרה טובה. (2) מערכת המיקום והפידו-סוציאלית של XYZ כפי שנבנתה, אף שהיא מדויקת, אינה מספקת דיוק במסגרת הקואורדינטות של המיקום מניסוי לניסוי. המיקומים היחסיים של בית ה-XYZ, גולגולת המכרסם והמסגרת יכולים לנוע יחסית זה לזה מניסוי לניסוי. זה מיותר על ידי שימוש בתמונת MRI למיקוד, מצביע מיקוד ו fiducial עם מיקום ידוע בחלל ביחס למיקוד FUS, הבטחת מערכת קואורדינטות MRI מקבילה למערכת הצבת XYZ, על ידי ביצוע טיפולי בדיקה לפני הסט של טיפולים אמיתיים ועל ידי ביצוע ההליך כולו בתוך מושב אחד, כך החיה לא צריך להיות ממוקם מחדש לתוך המסגרת. שים לב כי, כי רק fiducial אחד משמש, סיבובי מסגרת אינם ניתנים לתיקון, ולכן זה קריטי כדי להבטיח את המסגרת היא ברמה ביחס למיטת MRI משעמם. לסיכום, מיקום המצביע אינו מציין את מוקד FUS האמיתי, אך מצאנו שההיסט עקבי עבור מיקום מוח נתון בתנאי שהגולגולת אינה מסתובבת ביחס לתמרן האולטרסאונד. כמו כן, שים לב כי תזמון עקבי של מסירת gadobutrol יחסית לפתיחת BBB וההדמיה היא חיונית לתוצאות עקביות במיוחד אם שינוי ניגודיות MRI משמש פרוקסי עבור כמות פתיחת BBB (ראה 36).

התחלנו לראשונה את פתיחת FUS BBB במעבדה עם מתמר הטבילה בהספק נמוך שתואר לעיל. מצאנו כי זוהי אפשרות סבירה לתחילת העבודה עם טכניקה זו. והכי חשוב, הסתגלות של פרוטוקול זה יכולה לספק חלופה לא פולשנית לניתוח סטראוטקסי תוך ורידי ומחקר פרה-קליני המבוצע בטכניקה זו יכול להיחשב תרגום מאוד בשל השימוש הנוכחי FUS transcranial בבני אדם30,32,41. לאחר שהוקם במעבדה, טכניקה זו יכולה לשמש כחלופה פולשנית לניתוח סטראוטקסי. לכן, הפיכת כלי חקירה קפדני לכלי תרגום מאוד. המעבדה שלנו תשתמש בטכניקה זו עבור MRI מודרך, משלוח מקומי של וירוסים וננו חלקיקים לפתח חדשני, טכניקות נוירומודולציה פולשנית שניתן להשתמש בהם באופן חופשי מתנהג מכרסמים ערים פרימטים שאינם אנושיים. העבודה הנוכחית מתמקדת בתרופות מעצבים המיועדות באופן בלעדי לקולטנים של מעצבים (DREADDs) וברגישות של נוירונים למינונים נמוכים של חלקיקי אנרגיה גבוהה כגון צילומי רנטגן. המעבדה עובדת גם על גרסה חדשה של פרוטוקול זה שניתן לבצע בסורק 3 T אנושי כדי למנוע את הצורך להזיז את החיה במהלך הטיפול ולאפשר משוב מיקוד בזמן אמת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק תשתית מחקר EPSCoR NSF לאוניברסיטת קלמסון (1632881). בנוסף, מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מרכז המחקר הבינלאומי Civitan, ברמינגהאם, AL. המחברים מודים בהכרת תודה על השימוש בשירותים ובמתקנים של אוניברסיטת אלבמה במתקן המשותף להדמיית בעלי חיים קטן בברמינגהאם [NIH P30 CA013148]. המחברים מכירים בראג'יב צ'ופרה על תמיכתו והנחייתו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bubble shaker Lantheus Medical Imaging VMIX VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles
Catheter plug/ Injection cap SAI infusion technologies Part Number: IC Catheter plug/ Injection cap
Evans blue dye Sigma E2129-10G Evans blue dye
Function generator Tektronix AFG3022B Dual channel, 250MS/s, 25MHz
FUS transducer, 1.1MHz FUS Instruments TX-110 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone
Heating pad for Mice and Rats Kent Scientific PS-03 Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats
Infusion pump KD Scientific 780100 KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump
Kapton tape Gizmo Dorks https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91		 Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack
Low power immersion transducer, 1MHz Olympus V303-SU Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF
Magnet sets WINOMO https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC		 WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets
RF amplifier E&I A075 75W
Tail vein catheter BD 382512/ Fisher Item: NC1228513 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged)
Ultrasound contrast microbubbles Lantheus Medical Imaging DE4, DE16 DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere)
Ultrasound gel Aquasonic https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		 Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle
Winged infusion sets, 22ga. Fisher Healthcare 22-258087 Terumo Surflo Winged Infusion Sets
motor controller software N/A N/A custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller
runtime environment for the motor controller software National Instruments LabView runtime engine version 2017 or better https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) Velmex
bolts Velmex MB-1 BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3
motor controller Velmex VXM-3 Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1
mounting cleats Velmex MC-2 Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6
mounting cleats Velmex MC-2 Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2
usb to serial converter Velmex VXM-USB-RS232 USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1
x-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
x-axis stepper motor Velmex PK266-03A-P1 Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
y-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
y-axis stepper motor Velmex PK266-03A-P1 Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis damper Velmex D6CL-6.3F D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
z-axis stepper motor Velmex PK266-03B-P2 Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
3D printable files
Immersion transducer mount and pointer https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq
Stereotaxic frame https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
Stereotaxic frame holder https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX
9.4T small bore animal MRI Bruker Bruker BioSpec 94/20 ParaVision version 5.1
AAV9-hsyn-GFP Addgene
Cream hair remover Church & Dwight Nair cream
gadobutrol MRI contrast agent Bayer Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)
Stereotactic frame Stoelting #51500 not MRI compatible
turnkey FUS delivery device FUS Instruments RK-300 ready to use MRI compatible FUS for rodents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
  2. Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
  3. Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
  6. Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
  7. Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
  8. Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
  9. Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
  10. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  11. Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197 (2013).
  12. Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
  13. Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
  14. Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15 (2018).
  15. Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986 (2018).
  16. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  17. Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
  18. Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
  19. Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
  20. Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
  21. Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
  22. Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
  23. Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
  24. Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
  25. Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
  26. Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
  27. Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
  28. Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
  29. Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
  30. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
  31. Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86 (2019).
  32. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
  33. Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
  34. Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
  35. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  36. Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
  37. Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
  38. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
  39. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
  40. O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
  41. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).

Tags

מדעי המוח גיליון 160 אולטרסאונד ממוקד מחסום מוח בדם נוירומודולציה לא פולשנית אספקת סמים משלוח תרופות לא פולשניות ניתוח סטראוטקסי
גישה ספסל למיקום ספציפי מחסום הדם מוח פתיחת באמצעות אולטרסאונד ממוקד במודל עכברוש
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rich, M., Whitsitt, Q., Lubin, F.,… More

Rich, M., Whitsitt, Q., Lubin, F., Bolding, M. A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model. J. Vis. Exp. (160), e61113, doi:10.3791/61113 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter