Summary
El ultrasonido enfocado con agentes de microburbuja puede abrir la barrera hematoencefálica de forma focal y transitoria. Esta técnica se ha utilizado para entregar una amplia gama de agentes a través de la barrera hematoencefálica. Este artículo proporciona un protocolo detallado para la entrega localizada al cerebro de roedores con o sin orientación de RMN.
Abstract
La cirugía estereotáxica es el estándar de oro para la administración localizada de fármacos y genes en el cerebro de roedores. Esta técnica tiene muchas ventajas sobre la entrega sistémica, incluyendo la localización precisa a una región cerebral objetivo y la reducción de los efectos secundarios fuera del objetivo. Sin embargo, la cirugía estereotáxica es altamente invasiva que limita su eficacia traslacional, requiere largos tiempos de recuperación y proporciona desafíos cuando se dirige a múltiples regiones cerebrales. El ultrasonido enfocado (FUS) se puede utilizar en combinación con microburbujas circulantes para abrir transitoriamente la barrera hematoencefálica (BBB) en regiones del tamaño de un milímetro. Esto permite la localización intracraneal de agentes entregados sistémicamente que normalmente no pueden cruzar el BBB. Esta técnica proporciona una alternativa no invasiva a la cirugía estereotáxica. Sin embargo, hasta la fecha esta técnica aún no ha sido ampliamente adoptada en los laboratorios de neurociencia debido al acceso limitado a equipos y métodos estandarizados. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un enfoque de sobremesa para la apertura de FUS BBB (BBBO) que sea asequible y reproducible y, por lo tanto, pueda ser adoptado fácilmente por cualquier laboratorio.
Introduction
A pesar de los muchos descubrimientos en neurociencia básica, el número de tratamientos emergentes para trastornos neurodesarrollo y neurodegenerativos sigue siendo relativamente limitado1,2. Una comprensión más profunda de los genes, moléculas y circuitos celulares involucrados en trastornos neurológicos ha sugerido tratamientos prometedores irrealizables en los seres humanos con técnicas actuales3. Los tratamientos eficaces a menudo están limitados por la necesidad de ser penetrables en el cerebro y específicos del sitio4,5,6,7,8. Sin embargo, los métodos existentes de administración localizada de fármacos en regiones cerebrales específicas (por ejemplo, la administración mediante inyección o cánula) son invasivos y requieren una abertura que se debe hacer en el cráneo9. La invasión de esta cirugía impide el uso rutinario del parto localizado en el cerebro humano. Además, el daño tisular y las respuestas inflamatorias resultantes son confundaciones omnipresentes para estudios básicos y preclínicos que se basan en la inyección intracerebral10. La capacidad de entregar agentes no invasivas a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y dirigirse a regiones cerebrales específicas podría tener un tremendo impacto en los tratamientos para trastornos neurológicos, al mismo tiempo que proporciona una poderosa herramienta de investigación para la investigación preclínica.
Un método de transporte dirigido a través del BBB con daño mínimo en el tejido es el ultrasonido centrado transcraneal (FUS) junto con microburbujas para abrir focal y transitoriamente el BBB11,12,13,14,15,16. Fus BBB apertura ha ganado atención reciente para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, accidente cerebrovascular y glioma mediante la localización de terapias para dirigirse a regiones cerebrales como factores neurotróficos17,18,19,terapias génicas20,21,22,anticuerpos23,neurotransmisores24,y nanopartículas25,26,27,28,29. Con su amplia gama de aplicaciones y su naturaleza no invasiva30,31,la apertura FUS BBB es una alternativa ideal a las inyecciones intracraneales estereotáxicas rutinarias. Además, debido a su uso actual en humanos30,32,investigaciones preclínicas utilizando esta técnica pueden considerarse altamente traslacionales. Sin embargo, la apertura de FUS BBB aún no ha sido una técnica ampliamente establecida en ciencia básica e investigación preclínica debido a la falta de accesibilidad. Por lo tanto, proporcionamos un protocolo detallado para un enfoque de sobremesa para la apertura de FUS BBB como punto de partida para los laboratorios interesados en establecer esta técnica.
Estos estudios se llevaron a cabo con un transductor de ultrasonido específico FUS de respaldo de aire de alta potencia o un transductor de inmersión ultrasónico enfocado en amortiguación de baja potencia. Los transductores fueron impulsados por un amplificador de potencia de RF diseñado para cargas reactivas y un generador de funciones de sobremesa estándar. Los detalles de estos artículos se pueden encontrar en la Tabla de materiales.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (UAB).
1. Configuración del equipo de conducción de ultrasonido enfocado
- Utilice cables BNC coaxiales de 50 Ohmios para conectar (1) la entrada del transductor de ultrasonido a la salida del amplificador rf y (2) la entrada del amplificador rf a la salida del generador de funciones.
- Ajuste el modo generador de funciones a una ráfaga sinusoide una vez por segundo con un ciclo de trabajo del 1%.
- Para el transductor de inmersión de baja potencia amortiguado de 1 MHz con una distancia focal de 0,8 pulgadas utilizada con un amplificador rf de 50 dB, establezca los ajustes iniciales en: onda sinusoidal de 1 MHz, pico de 1 V a pico, ciclo de 10k, intervalo de 1 s (o período).
- Para el transductor de alta potencia de 1,1 MHz respaldado por aire, establezca la configuración inicial en: onda sinusoidal de 1,1 MHz, pico de 50 mV a pico, ciclos de 11k, intervalo de 1 s.
NOTA: No utilice los transductores a menos que estén sumergidos. No coloque una mano u otra parte del cuerpo en el enfoque de ultrasonido ni toque la cara del transductor mientras está funcionando.
2. Configuración de la encimera de ultrasonido enfocada
- Imprima en 3D el marco estereotáxico y el soporte de marco estereotáctico.
- Conecte el transductor al posicionador XYZ utilizando una abrazadera que sujeta una tubería de PVC (Figura 1a). Atornilla la abrazadera en la diapositiva del eje X y bloquea con una tuerca de ala.
- Si utiliza el transductor de ultrasonido de alta potencia, adjúntelo a la tubería de PVC utilizando un par de imanes coincidentes. Asegúrese de que un imán tiene un agujero y el otro tiene una protuberancia coincidente. Tapar la parte inferior de la tubería de PVC y fijar uno de los imanes a ella utilizando epoxi (ver Figura 1b).
- Conecte el segundo imán al centro superior del transductor de ultrasonido de alta potencia utilizando epoxi. Asegúrese de que está en el centro mismo del transductor (Figura 1c).
- Si utiliza el transductor de ultrasonido de alta potencia, haga un puntero para anular el posicionador XYZ. La punta de este puntero indica la ubicación en el espacio del centro del enfoque del transductor cuando el transductor de ultrasonido está unido al posicionador XYZ. Haga un puntero de un corte de aguja de 18 G para que sea la longitud de la distancia focal del transductor más el grosor del transductor (Figura 1d).
- Aplicar epoxi a un tercer imán (este imán también se empareja con el imán de la tapa de PVC) y fijarlo a la parte superior del puntero. A continuación, el puntero podrá fijarse al imán de la tubería de PVC para la anulación de XYZ (Figura 1d).
- Si utiliza el transductor de inmersión de baja potencia, imprima 3D el archivo para el puntero y el clip de montaje.
- Conecte el transductor de inmersión de baja potencia a la tubería de PVC recortando el clip de montaje a la tubería de PVC e inserte el transductor en el anillo (Figura 1f).
- Hacer un baño de agua pegando piezas cortadas de lámina acrílica que será capaz de descansar sobre la cabeza del animal por encima del marco estereotáctico (Figura 1e).
- Corta una abertura en la parte inferior del baño que es del tamaño de la cabeza del animal. Cubra el agujero en el baño de agua con una cinta poliimida.
NOTA: Se debe tener cuidado para asegurarse de que el agua no se filtre alrededor de la cinta poliimida, ya que puede mojar el pelaje de la rata y causar hipotermia.
- Corta una abertura en la parte inferior del baño que es del tamaño de la cabeza del animal. Cubra el agujero en el baño de agua con una cinta poliimida.
- Haga una resonancia magnética fiducial llenando una esfera de plástico o vidrio de cáscara fina de 4 mm de diámetro con un líquido visible por RMN (por ejemplo, aceite de vitamina E) y sellarlo. Colóquelo en el soporte fiducial MRI en el lado derecho del marco estereotáxico impreso en 3D (Figura 2a).
- Asegure firmemente el soporte de marco impreso en 3D al posicionador XYZ en una buena ubicación para el posicionamiento animal. Deslice la lengüeta en el extremo rostral del soporte del bastidor en el canal coincidente del riel del eje Y y ajástelo con tornillos de ajuste(Figura 1h,flechas rojas).
- Para conducir el posicionador XYZ, instale el convertidor USB a serie en un ordenador siguiendo las instrucciones del fabricante y conecte el convertidor. Instale el entorno de tiempo de ejecución y el software del controlador de motor en el PC.
- Asegúrese de que el puerto serie adecuado está seleccionado en el software seleccionando el convertidor USB a serie en el control desplegable de selección de puertos en el panel frontal del software del controlador. Conecte el convertidor USB al serial a la caja del controlador del motor paso a paso mediante un cable de cruce serie de 9 pines (por ejemplo, cable de módem nulo RS232).
- Ejecute el software del controlador para probar que los motores paso a paso se pueden conducir bajo control de software. Este paso puede requerir la asistencia del soporte de TI local.
3. Procedimiento de segmentación intracraneal
NOTA: Las ratas macho Sprague Dawley que pesaban 250-350 g fueron utilizadas para estos experimentos. Los animales tenían acceso gratuito al agua y a la comida para ratas, y se mantenían en un ciclo claro de 12:12 h.
- Poner al animal bajo anestesia (3% isoflurano con oxígeno) y comprobar la falta de respuesta a la pizca de dedo del pie. A continuación, inserte el catéter como se describe a continuación.
- Calentar la cola con una lámpara para hacer es más fácil golpear la vena. Tenga cuidado de no sobrecalentar al animal o quemar la cola.
- Una vez que el animal esté dormido (no responde a una pizca de dedo del pie), inserte el catéter de vena trasera de 24 G que se utilizará para entregar microburbujas, tinte azul Evans (EBD), contraste de RMN de gadobutrol si utiliza RMN y el agente experimental de interés. Una vez que se golpea la vena, la sangre llenará la vaina, retirará lentamente la aguja interna mientras empuja la vaina más lejos en la vena.
NOTA: Vea a un guía como Stuart y Schroeder33 si hace las inyecciones de vena de cola de rata por primera vez. - Si no hay flujo sanguíneo, mueva lentamente la vatina del catéter fuera de la vena para comprobar que la aguja puede haber atravesado la vena. Si la sangre fluye cuando el catéter se retira ligeramente, primero poke pasó por la vena y la colocación del catéter tendrá que reiniciarse en otra ubicación de la cola que sea rostral a la ubicación anterior.
- Llene el tapón del catéter con solución salina y atornille el tapón del catéter en el extremo del puerto del catéter tan pronto como el puerto se haya llenado de sangre. Envuelva cuidadosamente la cinta de laboratorio alrededor del catéter y la cola para mantenerla en su lugar. Comience con una pequeña pieza en la parte superior y trabaje en la dirección caudal, dejando el extremo mismo del tapón del catéter expuesto.
- Conecte la línea de anestesia al conector de anestesia en el marco estereotáxico(Figura 2a)y fije la cabeza de los animales en el marco colocando la boca en la barra de mordida y guiando las barras de los oídos a ambos canales auditivos, luego apriete los tornillos establecidos. Asegúrese de que la cabeza de los animales esté segura y nivelada.
- Mueva el animal a la cama de resonancia magnética y conecte la línea de anestesia al cono nasal. En este protocolo se utilizó una resonancia magnética de animales de pequeño calibre de 9,4 T.
- Recoge imágenes coronales y axiales ponderadas por T2 que capturan todo el cerebro, así como la resonancia magnética fiducial(Figura 2b)para mediciones de coordenadas. Proporcione al físico de resonancia magnética local o a la tecnología la siguiente información para que puedan crear el protocolo de RMN.
- Para imágenes coronales(figura 2b superior), utilice los siguientes parámetros: número de imágenes: 27, anchura: 62,2 mm, altura: 62,2 mm, profundidad: 37,97 mm, tamaño Voxel: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
- Para imágenes axiales(figura 2b inferior), utilice los siguientes parámetros: número de imágenes: 13, Ancho: 61,47 mm, Altura: 53,81 mm, Profundidad: 16,7 mm, Tamaño voxel: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3.
NOTA: No es necesario tener estos parámetros exactos siempre y cuando el coronal en resolución plana esté cerca de 0,25 mm y las imágenes cubran todo el cerebro y la fiducial.
- Recopile las mediciones de coordenadas de las imágenes anteriores grabando la distancia desde la resonancia magnética fiducial a la región cerebral que se destinará con FUS.
- En el escáner, en las imágenes coronales recogidas en el paso 3.5, encuentra la imagen en la que el fiducial es el más grande, indicando el centro del fiducial. Registre la distancia desde la parte superior del fiducial a la región cerebral de interés en mm (el software de RMN tendrá una herramienta de medición de escala o punto, consulte la tecnología de resonancia magnética local o físico sobre cómo hacerlo) tanto en la dirección medial/lateral como en la dirección ventral dorsal(Figura 2b,parte superior).
- En el escáner, en las imágenes axiales recogidas en el paso 3.5, encuentra la imagen que muestra la parte superior del fiducial y mide la distancia desde el centro del fiducial hasta la región cerebral objetivo tanto en la dirección dorsal/ventral como en la dirección medial/lateral(Figura 2b,abajo).
- Compare las dos mediciones mediales/laterales y si son diferentes utilice el promedio. Estas mediciones de coordenadas se utilizarán más adelante en el paso 4.3 para guiar el punto focal FUS a la región cerebral objetivo con el posicionador XYZ.
- Recopile imágenes prescanes de RMN. Compare estas imágenes con las imágenes recopiladas después de la apertura de FUS BBB (Figura 4). Las imágenes ponderadas por T1 se utilizarán más tarde para visualizar la apertura de BBB, las imágenes ponderadas por T2 se utilizarán más tarde para garantizar que no se haya producido ningún daño tisular después del tratamiento fus34.
- Para imágenes axiales ponderadas por T1, utilice los siguientes parámetros: ancho: 30 mm, altura: 51,2 mm, profundidad: 3,0 mm, tamaño del voxel: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3,número de imágenes: 13.
- Para imágenes axiales ponderadas por T2, utilice los siguientes parámetros: ancho: 30 mm, altura: 51,2 mm, profundidad: 2,6 mm, tamaño del voxel: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3,número de imágenes: 13.
- Para imágenes coronales ponderadas por T1, utilice los siguientes parámetros: anchura: 30 mm, altura: 30 mm, profundidad: 27 mm, tamaño de voxel: 0,16 x 0,16 x 1 mm3,número de imágenes: 27.
- Para imágenes coronales ponderadas por T2, utilice los siguientes parámetros: ancho: 30 mm, altura: 30 mm, profundidad: 27 mm, tamaño de voxel: 0,12 x 0,12 x 1 mm3,número de imágenes: 27.
NOTA: Al igual que en el paso 3.5, estos parámetros de imagen no tienen por qué ser exactamente los mismos que se enumeran. Estas imágenes tienen un FOV más pequeño y una resolución más alta que las recogidas en el paso 3.5.
- Manteniendo al animal en el marco estereotáxico, transporte rápidamente al animal desde la cama de resonancia magnética a la configuración de FUS de sobremesa. Asegúrese de que el animal permanezca dormido para la transferencia bajo el efecto de la anestesia.
- Para tiempos de transferencia más largos, utilice una caja para la transferencia que sea lo suficientemente grande como para adaptarse al animal y al marco. Con el tapón de anestesia todavía unido, coloque el animal y el marco dentro de la caja y permita que el exceso de isofluranos llene la caja durante unos minutos. Desenchufe la línea de anestesia y transfiéralo rápidamente.
4. Procedimiento de ultrasonido enfocado
- Al llegar a la configuración de la encimera FUS, conecte inmediatamente la línea de anestesia en el cono nasal y continúe funcionando 1,5-3% isoflurano con oxígeno. Haga esto lo más rápido posible para evitar que el animal se despierte.
- Deslice el marco en el soporte del marco y colóquelo firmemente en su lugar. Usa clippers para afeitar la cabeza del animal. Cepille el exceso de cabello y aplique crema para quitar el cabello en el cuero cabelludo. Deje reposar durante 3 minutos y limpie con agua y gasa.
- Si la RMN no está disponible para la segmentación, utilice un marco estereotáctico estándar (no impreso en 3D) para anular la posición del puntero a bregma tocando la punta del puntero a bregma (se necesitará una incisión del cuero cabelludo para esto) y anulando el software o grabando las coordenadas. Mueva el carro XYZ hacia arriba 50 mm haciendo clic en el botón arriba 50 del software e intercambiando el puntero por el transductor. Basado en un atlas cerebral de rata como se describió anteriormente35,muévase a las coordenadas cerebrales deseadas utilizando los botones de paso en el software. Si utiliza este método en lugar de RMN, vaya a la sección 4.6.
- Si utiliza instrucciones de RMN, adjunte el puntero y mueva el puntero a la ubicación de la resonancia magnética fiducial (Figura 1d,g). Coloque el puntero en la parte superior y central de la resonancia magnética fiducial (se proporciona un pequeño agujero en la parte superior del soporte fiducial para apuntar). Haga clic en el botón de posición nula, que es el punto desde el que se calcularon todas las distancias de la imagen de RMN.
- Retire el puntero y mueva el posicionador a las coordenadas medial/lateral y a las coordenadas rostrales/caudales. Levante el posicionador pulsando el botón hasta 50 para permitir la colocación del baño de agua y el gel de ultrasonido. Si se alcanza la parte superior del recorrido del eje Z, se invalidará la ubicación de anulación de valores NULL. La coordenada dorsal/ventral se establecerá después de añadir el transductor.
- Aplicar gel de ultrasonido en el cuero cabelludo del animal y colocar el baño de agua sobre el animal con la ventana de cinta poliimida presionada en el gel. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el gel de ultrasonido.
- Llene el baño de agua con agua desgasada.
- Si utiliza el transductor de alta potencia, baje el posicionador para que el imán esté justo encima del agua. Conecte el transductor al posicionador bajando cuidadosamente el transductor al agua en un ángulo para evitar que las burbujas de aire queden atrapadas debajo de la cara y conecten los imanes.
- Si utiliza el transductor de inmersión de baja potencia, baje el posicionador en el agua justo encima del clip del transductor. A continuación, clip el transductor en su lugar bajando lentamente en el agua en un ángulo para evitar que las burbujas de aire queden atrapadas debajo de la cara.
NOTA: Un baño transparente es útil cuando se busca burbujas debajo de la cara del transductor. - Baje el posicionador a la coordenada dorsal/ventral.
- Encienda el amplificador de potencia rf.
- Inyecte 1 ml/kg de tinte azul Evans (EBD) 3% pegando la punta de la aguja en el tapón del catéter e inyectándose. Deje que circule durante 5 minutos.
- Activa los microburbujas sacudiéndolos violentamente con el agitador de burbujas.
- Preparar 5 veces la dosis de 30 μL/kg de microburbujas (conc. de burbujas 1,2 x 1010/ml) en 0,2 ml de solución salina para tener en cuenta los 2 tratamientos fusibles y el tubo en el conjunto de perfusión alada de 18 G. Por ejemplo, si la rata pesa 200 g, luego llene la jeringa que contiene punta de aguja de 18 G con 30 μL de microburbujas en 1 ml de solución salina.
NOTA: Asegúrese de utilizar puntas de aguja de 18 G para tomar e inyectar con el conjunto de perfusión alada. - Invierta la jeringa varias veces para obtener una distribución uniforme de microburbujas. A continuación, acople y llene el conjunto de perfusión alada. Coloque la jeringa en la bomba de perfusión y coloque la bomba de perfusión para entregar 0,2 ml a una velocidad de 6 ml/h. Esto proporcionará una infusión lenta de los microburbujas durante la exposición al FUS de 2 minutos.
- Inserte la aguja alada en el tapón del catéter.
- Preparar 5 veces la dosis de 30 μL/kg de microburbujas (conc. de burbujas 1,2 x 1010/ml) en 0,2 ml de solución salina para tener en cuenta los 2 tratamientos fusibles y el tubo en el conjunto de perfusión alada de 18 G. Por ejemplo, si la rata pesa 200 g, luego llene la jeringa que contiene punta de aguja de 18 G con 30 μL de microburbujas en 1 ml de solución salina.
- En primer lugar, ejecute la bomba de perfusión, espere 3 s e inicie el tratamiento FUS pulsando el botón de activación de salida en el generador de funciones (etiquetado "en" en el generador de funciones en la Tabla de Materiales). Repita estos dos veces por región con 5 minutos en el medio para permitir que los microburbujas se despejen.
- Pulse de nuevo el botón de encendido en el generador de funciones para detener el tratamiento fus cuando la bomba de perfusión se detenga a 2 min.
- Espere 5 minutos para que los microburbujas se despejen. A continuación, inicie la perfusión y el segundo tratamiento fusible.
- Inmediatamente después del segundo tratamiento fus, inyectar contraste de gadobutrol (si se utiliza RMN) y el agente de interés, por ejemplo, partículas virales. El volumen total entregado de todos los agentes no debe exceder de 5 ml/kg.
NOTA: El tiempo de entrega (por ejemplo, antes o después de la apertura de FUS BBB) del agente de interés puede variar dependiendo del agente utilizado.
- Apague el amplificador de potencia rf y transporte inmediatamente animal de vuelta a la resonancia magnética.
5. Confirmación por RMN de la apertura de BBB
- Si la RMN no está disponible, vaya a la sección 6 y utilice la expresión EBD para confirmar la apertura de BBB.
- Coloque el animal de nuevo en la cama de resonancia magnética en el mismo lugar exacto que en el paso 3.7 y conecte la línea de anestesia.
- Recoja las exploraciones posteriores a la RMN con los mismos parámetros de imagen utilizados en el paso 3.7 para visualizar la mejora de la RMN de gadobutrol en la región de apertura BBB (Figura 3b,e).
6. Perfusión y recolección de tejidos
- Perfundir al animal con un frío 4% de formalina hasta que la sangre se despeje por completo.
- Retire el cerebro y colóquelo en un 4% de formalina o PFA a 4 °C durante la noche. A continuación, coloque el cerebro en una solución de sacarosa al 30% hasta que el cerebro se hunda (aproximadamente 2-3 días). Por último, el flash se congela en nitrógeno líquido o en hielo seco y almacena a -80°C hasta la criosección.
- Congelar el cerebro en OCT y tomar criosecciones.
- Arregle y cubra las secciones para la microscopía de fluorescencia. La excitación ebd alcanza picos de 470 y 540 nm y los picos de emisión en 680 nm. Coverslip con medio de montaje DAPI con el fin de visualizar la morfología celular general.
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Representative Results
Aquí, demostramos que el ultrasonido enfocado con microburbujas puede inducir la apertura BBB localizada utilizando los parámetros especificados anteriormente con el transductor de inmersión de baja potencia (Figura 3) y el transductor FUS (Figura 4). En primer lugar, en los primeros experimentos, el transductor de inmersión de baja potencia estaba dirigido a un hemisferio cerebral ya sea anterior(Figura 3b)o medial (Figura 3a). Los animales fueron sacrificados 2 horas más tarde con perfusión(Figura 3a)o sin perfusión(Figura 3b)y se recogieron 10 secciones cerebrales congeladas de μm. La apertura de FUS BBB fue evidente por autofluorescencia EBD (excitación: 470 y 540 nm, emisión: 680 nm) en el hemisferio objetivo (flechas blancas Figura 3a y 3b).
Hemos encontrado lo mejor para perfundir a los animales para una visualización clara de la apertura BBB con autofluorescencia EBD. Sin embargo, la apertura de BBB todavía se puede visualizar sin limpiar los vasos sanguíneos(Figura 3b). La absorción celular y el aclaramiento de EBD después de la apertura de BBB comienza tan pronto como 30 minutos después de la apertura de BBB y aumenta más de 24 horas37. Para la evaluación de la apertura BBB con autofluorescencia EBD, lo mejor es sacrificar al animal entre 15 minutos y 3 horas de apertura BBB. Aunque en última instancia, el tiempo de sacrificio dependerá del agente que fue entregado. Por ejemplo, en un estudio de AAV, 3 semanas después de la apertura de BBB y la entrega de AAV(Figura 5c)pueden ser apropiadas.
En experimentos posteriores, el transductor FUS estaba dirigido al hipocampo (Figura 4ac) o a la corteza cingulada anterior (ACC) (Figura 4 d-f) y además de ebd, el agente de contraste de RMN gadorol (0,1 ml/kg) se inyectó IV para verificar la apertura específica del BBB in vivo. Figura 4b,e mostrar contraste de RMN mejorado donde el contraste de gadobutrol ha entrado en el tejido 1 hora después de la inyección del agente de apertura y contraste BBB. Este cambio de contraste es evidente al comparar con los preescanes de RMN tomados antes del procedimiento FUS (Figura 4a,d). Los animales fueron sacrificados por perfusión 1,5 horas después de la apertura del BBB y se recogieron 10 criosecciones de μm. La autofluorescencia ebd es evidente en las regiones específicas de FUS que indican aún más la ubicación de la apertura BBB (Figura 4c,f). Esta figura destaca cómo el contraste por RMN a veces puede ser difícil de ver (como en la diferencia entre la Figura 4b y la Figura 4e); por lo tanto, es útil confirmar la apertura BBB con visualización de autofluorescencia EBD como en el micrografo de fluorescencia de la Figura 4f.
Para evaluar si esta técnica podría utilizarse para la administración selectiva de genes AAV9-hsyn-GFP y el contraste de gadobutrol se inyectaron IV (título: 1,32 x 1014 GC/mL, 0,05 ml/kg) inmediatamente después de la apertura de BBB en el hipocampo. El animal fue entonces MR imagenado 30 minutos después de la apertura de BBB y sacrificado 3 semanas más tarde por perfusión. Se recogieron criosecciones de 10 μm para imágenes fluorescentes de la expresión GFP. La apertura BBB fue evidente por el contraste gadobutrol en el hipocampo objetivo(Figura 5a,b). Además, la administración de genes fue confirmada por la expresión GFP en el hipocampo objetivo evidente por fluorescencia verde (Figura 5c). Tenga en cuenta que en este momento ebd se ha despejado y sólo es evidente en los ventrículos (Figura 5c).
Figura 1: Configuración de la encimera FUS. (a) Configuración de FUS que incluye el posicionador XYZ, una tubería de PVC de 30 mm de diámetro para la fijación del transductor, el marco estereotáxico impreso en 3D y la bomba de perfusión. (b) El extremo de la tubería de PVC está tapado, y un imán se une a él con epoxi. (c) Otro imán a juego se une al centro superior del transductor de alta potencia con epoxi. (d) Además, se adjunta otro imán coincidente al puntero para anular la anulación de la posición en la parte superior y central del fiducial de RMN. (e) El puntero es finalmente reemplazado por el transductor de alta potencia y un baño de agua se acopla a la cabeza del animal con gel de ultrasonido. (f) El transductor de inmersión de baja potencia se puede conectar a la tubería de PVC con el clip del transductor impreso en 3D. (g) Para su posicionamiento, el transductor se sustituye por el puntero impreso en 3D y el posicionador se anula en la parte superior y central de la resonancia magnética fiducial. (h) El soporte de marco impreso en 3D estacionario permite que el animal sea devuelto a la misma posición después de la RMN si se necesitan varios tratamientos fusibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Marco estereotáxico con resonancia magnética fiducial para coordenadas guiadas por RMN. (a) Los animales se colocan por primera vez en un marco estereotáxico impreso en 3D equipado con una resonancia magnética fiducial. (b) A continuación, el marco se coloca dentro del lecho de resonancia magnética y la distancia desde el círculo fiducial (círculo punteado) hasta la región cerebral objetivo se mide utilizando imágenes coronales para las mediciones dorsales/ventrales (D/V) e imágenes axiales para las mediciones rostrales/caudales (R/C), la medición medial/lateral (M/L) se puede recoger de ambos ejes. Los animales se mantienen en el marco y se transfieren a la estación FUS donde se utiliza un puntero para anular el valor en posición XYZ en la ubicación del fiducial. A continuación, el puntero se reemplaza por el transductor y, a continuación, se puede mover en función de las coordenadas recopiladas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El tinte azul Evans (EBD) confirma la apertura de FUS BBB tanto con y sin perfusión. (a) Micrografía de una sección cerebral de 10 μm 2 horas después de la apertura de FUS BBB con el transductor de inmersión de baja potencia dirigido al hemisferio izquierdo medial. Esta es una imagen representativa de un animal que fue perfundido con formalina tamponada del 4% antes de la recolección de tejidos. La apertura BBB es evidente por autofluorescencia roja EBD (flecha). b) Micrografía de una sección cerebral de 10 μm 2 horas después de la apertura de FUS BBB dirigida al hemisferio izquierdo anterior. Esta es una imagen representativa de un animal que no fue perfundido antes de la recolección de tejidos, por lo tanto, la EBD permanece en los vasos sanguíneos. La apertura BBB es evidente cuando la EBD se ha filtrado fuera de los vasos sanguíneos (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Apertura fus BBB confirmada con contraste de RMN Gadobutrol y expresión EBD. Imágenes MR antes (a y d) y después (b y e) apertura BBB. La mejora del contraste de gadobutrol confirma la ubicación de la abertura BBB in vivo (b y e, flechas). (c) Sección cerebral de 10 μm que muestra una confirmación adicional de la apertura BBB con autofluorescencia EBD (rojo) en el hipocampo (mancha nuclear DAPI azul). Barra de escala; 500 μm. (f) Micrografo de una sección cerebral de 10 μm después de la apertura de BBB en la corteza cingulada anterior evidente por autofluorescencia roja EBD (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Entrega localizada de AAV9-hsyn-GFP al hipocampo a través de la apertura fus BBB. Confirmación por RMN de apertura BBB con agente de contraste de RMN, contraste de RMN (flechas) tanto en imágenes coronales(a)como axiales(b)ponderadas por T1. (c) confirmación histológica de la expresión GFP en el hipocampo objetivo fus (verde) 3 semanas después de la apertura de FUS BBB y la inyección AAV9-hsyn-GFP IV. El azul indica la mancha nuclear DAPI para la morfología celular general. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí describimos un enfoque de sobremesa para la apertura fus BBB asistida por microburbuja con enfoques alternativos, incluyendo, dos transductores diferentes y métodos para la segmentación intracraneal con y sin orientación de RMN. Actualmente, con el fin de establecer la apertura FUS BBB guiada por RMN en el laboratorio, existe la opción de comprar excelentes dispositivos listos para usar que proporcionan resultados altamente estandarizados y reproducibles con interfaces fáciles de usar. Sin embargo, muchos laboratorios no están preparados para el costo de tales instrumentos. Por lo tanto, el objetivo principal de este protocolo es proporcionar un punto de partida que cualquier laboratorio podría establecer con el fin de construir su experiencia en la técnica.
Fus BBB apertura es ahora una técnica ampliamente utilizado y es a menudo el caso de que diferentes grupos utilizan una variedad de agentes y anestésicos, cada uno de los cuales puede afectar el grado de apertura bbb y extravasación. Es importante destacar que el anestésico particular utilizado puede afectar a la magnitud de la apertura BBB por lo que es importante tener esto en cuenta al ejecutar este protocolo38. Aquí, el isoflurano anestésico se utiliza porque los animales se pueden mantener bajo isoflurano para la longitud del protocolo y los niveles de gas isoflurano se pueden ajustar fácilmente en función de la frecuencia de respiración y frecuencia cardíaca del animal. Además, entregamos isofluranos con oxígeno porque era más accesible que el aire médico; sin embargo, el aire médico puede permitir una apertura BBB más extensa39. Algunos agentes de contraste de RMN son más adecuados para este protocolo que otros. Por ejemplo, en nuestras manos, el gadoteridol no produjo ninguna mejora del contraste incluso cuando la fuga de EBD estaba claramente presente en la postmortem tisular. La formulación de microburbujas también es importante. Aquí utilizamos microesferas lipídicas perflutren. Otras formulaciones de microburbujas como microburbujas de proteínas perflutrenas tipo A están disponibles fácilmente, pero el tipo de microburbuja utilizado afectará a los resultados15.
Los controles de los generadores de funciones pueden variar bastante, así que consulte el manual para obtener instrucciones sobre cómo introducir los ajustes enumerados en el paso 1. El voltaje de comando adecuado (pico V a pico en el generador de funciones) depende en gran medida de las propiedades del transductor, ganancia del amplificador de RF, amplificador de RF a la coincidencia del transductor, la edad y el tamaño del animal, el tipo de microburbuja y la concentración, y el efecto de tratamiento deseado. El pico al pico V tendrá que ser determinado por prueba y error. Comience con la configuración sugerida en el paso 1 y determine el efecto histológicamente. Si hay daño tisular, baje el pico a pico V en un 10% e inténtelo de nuevo. Del mismo modo, si no hay BBBO, entonces aumente el pico a pico V en un 10% e inténtelo de nuevo. El ajuste demasiado alto de una V puede dañar el transductor de inmersión de baja potencia. Esto será evidente como un agrietamiento o distorsión de la cara del transductor. Los plazos de fabricación de los transductores pueden ser largos, por lo que al iniciar, sugerimos comprar más de un transductor como copia de seguridad. Los transductores de ultrasonido también pueden dañar los amplificadores si se emparejan incorrectamente. Para mayor simplicidad y fiabilidad, sugerimos utilizar un amplificador de potencia resistente que pueda impulsar cargas complejas (como el amplificador de potencia rf en la tabla de materiales). Tenga en cuenta que mientras que el transductor de alta potencia viene con un circuito coincidente, el transductor de inmersión de baja potencia no lo hace. El amplificador de RF sugerido puede manejar la potencia reflejada del transductor mal emparejado, pero algunos amplificadores pueden dañarse en esta configuración. Además, si el paso 2.7 resulta problemático después de instalar el controlador y el software, compruebe dos veces que el puerto serie adecuado está seleccionado en el software. A continuación, pruebe un cable serie diferente. Si se produce un error, busque compatibilidad con TI local.
A partir de la experiencia, se necesitará práctica y múltiples ajustes para lograr una precisión estricta en la orientación de la región cerebral. Esto se puede ver en las diferencias de segmentación entre los primeros experimentos (Figura 3) y los experimentos más recientes (Figura 5). Comenzamos los experimentos usando un marco estereotáxico clásico y lo incluimos como una opción aquí si no hay acceso a una impresora 3D o si no hay acceso a resonancia magnética de roedores. Sin embargo, la orientación por RMN con fiduciales de RMN y el marco imprimible 3D proporcionado (o de un diseño personalizado) es el método ideal. En primer lugar, explica las diferencias individuales entre los animales mediante la recolección de coordenadas dentro del animal en lugar de depender de un atlas cerebral de rata promediado. Además, el uso de RMN permite la confirmación de la segmentación de ubicación de FUS in vivo en lugar de depender de la expresión EBD postmortem. Esto es importante cuando se entregan agentes que pueden requerir más de 24 horas para surtir efecto como AAVs (Figura 5). Por último, el soporte de bastidor proporcionado permite devolver al animal de nuevo a la misma posición después de la RMN para corregir cualquier error de segmentación o repetir FUS después de una apertura BBB insuficiente sin tener que rehacer las coordenadas. El marco estereotáxico portátil impreso en 3D se puede utilizar en cualquier RESONANCIA MAGNÉTICA con un orificio transparente de 200 mm o más ancho.
Dependiendo de la distribución de los vasos sanguíneos en la ubicación objetivo, el grosor del cráneo40,la presencia de ventrículos y otros factores el grado de apertura de BBB puede variar. Por esta razón, proporcionamos un método para la segmentación repetida con el soporte de marco y marco. La precisión de la segmentación depende fundamentalmente de mantener el enfoque del transductor en una ubicación coherente con respecto al puntero de segmentación. La punta de este puntero debe indicar la ubicación en el espacio del centro del foco del transductor cuando el transductor está conectado al posicionador XYZ. Los imanes permiten que el puntero y el transductor se intercambien fácilmente manteniendo esta colocación. El agujero y la protuberancia en los imanes deben coincidir con la mayor precisión posible. Cualquier variabilidad en esta conexión reduce la repetibilidad de la segmentación por foco FUS. Sin embargo, habrá un desplazamiento espacial entre la punta del puntero y el enfoque de ultrasonido. Una vez que se confirma que el desplazamiento es coherente, se puede corregir utilizando las imágenes MR para calcular la diferencia en mm de la ubicación de apertura BBB resultante (ubicación del contraste de RMN) y la ubicación de destino prevista. Esta diferencia se puede tener en cuenta en la ubicación nula. La precisión y la repetibilidad también se benefician en gran medida del uso de la misma frecuencia de ultrasonido y el uso de ratas de un tamaño y edad similares en un conjunto determinado de experimentos. La atenuación por ultrasonido por el cerebro de la rata y el cráneo de la rata varía con la frecuencia y el tamaño del cráneo y el grosor del cráneo varía con la edad. El cráneo también es una cavidad pequeña con respecto al pulso de ultrasonido y el ultrasonido incidente interactúa con reflejos dentro del cráneo para producir un campo de sonido complejo que depende del tejido, cráneo, frecuencia y la posición del transductor40.
Como se ha indicado en otros lugares, este protocolo pretende proporcionar una alternativa de baja inversión a excelentes soluciones comerciales compatibles con RMN que ya están disponibles para la compra. Hay limitaciones importantes que resultan de mantener el costo bajo. También hay limitaciones inherentes a la técnica dada física y el estado actual de la técnica. Notablemente, a pesar de estas limitaciones, y como se muestra en los resultados representativos, podemos lograr la entrega constante de tintes, partículas y virus al hipocampo de ratas con precisión de submiliímetro. Las limitaciones más importantes son que (1) la forma del enfoque FUS depende del tejido intermedio y especialmente de la forma y el grosor del cráneo{...}. La necesidad de extraer al animal de la resonancia magnética para realizar el tratamiento fus evita la retroalimentación en tiempo real sobre la localización y la intensidad del enfoque fus. Sin estos comentarios en tiempo real, es necesario realizar varios experimentos para confirmar la configuración de cada combinación de ubicación de segmentación. Una vez que los ajustes están "marcados", hemos encontrado una buena repetibilidad. (2) El sistema de posicionamiento y fiducial XYZ tal como está construido, aunque preciso, no proporciona precisión en el marco de coordenadas del posicionador desde el experimento hasta el experimento. Las ubicaciones relativas de la casa XYZ, el cráneo del roedor y el marco pueden moverse en relación entre sí del experimento al experimento. Esto se evita mediante el uso de una imagen de RMN para la segmentación, un puntero de segmentación y fiducial con ubicación conocida en el espacio en relación con el enfoque FUS, asegurando que el sistema de coordenadas de RMN es paralelo al sistema posicionador XYZ, haciendo tratamientos de prueba antes del conjunto de tratamientos reales y haciendo todo el procedimiento dentro de una sesión para que el animal no necesite ser reposicionado en el marco. Tenga en cuenta que, debido a que solo se utiliza un fiducial, las rotaciones de fotogramas no son corregibles, por lo que es fundamental asegurarse de que el marco está nivelado con respecto a la cama de resonancia magnética y el agujero. En resumen, la ubicación del puntero no indica el verdadero enfoque fus, pero hemos encontrado que el desplazamiento es consistente para una ubicación cerebral dada siempre que el cráneo no gire en relación con el transductor de ultrasonido. También tenga en cuenta que el tiempo consistente de la entrega de gadobutrol en relación con la apertura BBB y la imagen es crucial para resultados consistentes, especialmente si el cambio de contraste de RMN se utiliza como un proxy para la cantidad de apertura BBB (véase 36).
Comenzamos la apertura de FUS BBB en el laboratorio con el transductor de inmersión de baja potencia descrito anteriormente. Encontramos que es una opción asequible para comenzar con esta técnica. Lo más importante es que la adaptación de este protocolo puede proporcionar una alternativa no invasiva a la cirugía estereotáxica intracraneal y la investigación preclínica realizada con esta técnica puede considerarse altamente traslacional debido al uso actual de FUS transcraneales en humanos30,32,41. Una vez establecida en un laboratorio, esta técnica se puede utilizar como una alternativa no invasiva a la cirugía estereotáxica. Por lo tanto, transformar una herramienta estrictamente investigativa en una herramienta altamente traslacional. Nuestro laboratorio utilizará esta técnica para la administración guiada por RMN, localizada de virus y nanopartículas para desarrollar nuevas técnicas de neuromodulación no invasivas que se pueden utilizar en roedores despiertos y primates no humanos. El trabajo actual se centra en las drogas de diseño diseñadas exclusivamente para receptores de diseño (DREADDs) y la sensibilización de las neuronas a dosis bajas de partículas de alta energía como los rayos X. El laboratorio también está trabajando en una nueva versión de este protocolo que se puede realizar en un escáner humano de 3 T para eliminar la necesidad de mover al animal durante el tratamiento y permitir la retroalimentación de orientación en tiempo real.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada en parte por una subvención de infraestructura de investigación EPSCoR del NSF a la Universidad de Clemson (1632881). Además, esta investigación fue apoyada en parte por el Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Los autores reconocen con gratitud el uso de los servicios e instalaciones de la Universidad de Alabama en Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Los autores reconocen a Rajiv Chopra por su apoyo y orientación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
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