Summary
Denne protokol forsøger at etablere en gentagelig protokol for primære neuroner og glia isolation fra rotteblære for yderligere cellulære eksperimenter.
Abstract
Den nederste urinvej har to hovedfunktioner, nemlig periodisk urinopbevaring og micturition; disse funktioner formidles gennem central og perifer neuroregulering. Selvom der er udført omfattende forskning i det nedre urinvejsnervesystem, har de fleste undersøgelser fokuseret på primær kultur. Denne protokol introducerer en metode til isolation og kultur af blæreneuroner og glia fra Sprague-Dawley rotter. I denne metode blev neuronerne og gliaerne inkuberet i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 5-7 dage. Som følge heraf voksede de til modne former, der var egnede til relaterede efterfølgende immunfluorescenseksperimenter. Celler blev morfologisk observeret ved hjælp af et optisk mikroskop. Neuroner, synaptiske vesikler og glia blev identificeret ved henholdsvis β-III-tubulin og MAP-2, Synapsin-1 og GFAP-farvning. I mellemtiden blev immunokytokemi udført på flere neurotransmitter-relaterede proteiner, såsom cholin acetyltransferase, DYNLL2 og SLC17A9.
Introduction
Den nederste urinvej har to hovedfunktioner: periodisk urinopbevaring og micturition1. Det nederste urinvejsnervesystem (LUTNS) styrer disse funktioner og er delikat og modtagelig for mange neuropatier, som kan medfødte (porfyri), erhvervet (Lyme sygdom), sekundær til sygdomstilstande (diabetisk cystopati), narkotika induceret (hæmoragisk blærebetændelse), kirurgi forårsaget (abdominoperineal resektion), eller skade forårsaget (traumatisk rygmarvsskade)2,3,4 ,5,6,7. I fysiologiske/patologiske undersøgelser er in vivo- og in vitro-forsøg lige så vigtige. Mens in vivo forskning på LUTNS er blevet udført på organ-, cellulære og molekylære niveauer i nogen tid, in vitro forskning på primære neuroner fra urinblæren er næsten ikke-eksisterende8,9. Selv om denne undersøgelse er begrænset, håber vi at være banebrydende for forskning på dette område, så andre forskere kan forbedre den. På denne måde kan denne co-kultur føre til en cellulær forståelse af fysiologisk dysfunktion i fænotyper, såsom blære neuron dysfunktion.
I modsætning til enteriske muskler med en klar retningsbestemthed af muskelcellerne i diskrete lag er blæremusklerne uorganiserede10. Derfor foreslår denne metode i stedet for at skrælle blærens ydre lag at fordøje hele blæren for at reducere driftsbesværet og forkorte forbehandlingstiden for en høj celleoverlevelsesrate.
Efter denne metode kan vi opnå en blandet kultur af neuroner og andre celler. De andre celler er uundværlige, fordi deres tilstedeværelse efterligner et in vivo-miljø11. Derudover giver sådanne celler de stoffer, der ikke er tilgængelige i mediet.
Denne metode involverer to trin til fordøjelsen. For det første, kollagen type II bruges til at hydrolysere kollagen, efterfulgt af trypsin, at adskille vævet icellerne 10. På denne måde spredes blærevæv i enkelte celler og vokser derefter relativt uafhængigt. Når neuronernes kultur modnes, kan neuronerne bruges til billeddannelse eller funktionelle assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprotokoller og dyreforsøg var i overensstemmelse med det nationale forskningsråds retningslinjer for etiske principper.
1. Fremstilling af materialer
- Steriliser alle instrumenter og ddH2O ved hjælp af en autoklave, før du udfører eksperimentet. Instrumenter omfatter, men er ikke begrænset til kirurgisk saks, oftalmisk saks, pinceter, skeer kerne skillevæg, glas retter (60-100 mm i diameter), og glas afbrydere.
- Forbered Krebs-opløsningen på følgende måde (Tabel 1): Opløs alle kemikalierne sammen med ddH2O inden brug. CaCI2 opløses separat, og der tilsættes langsomt til den blandede opløsning under omrøring for at undgå sediment.
- Skylningsmediet, som består af F12-medier med 10% føtalt kvægserum (FBS) og 1% antibiotikum/antimycotisk (100x). Der tilsættes 5 mL FBS og 0,5 mL antibiotika/antimycotisk til 44,5 mL F12-medier.
- Forbered neuron medier A, som omfatter neurobasal Et medie med 2% B-27, 1% FBS, 1% L-glutamin, 1% antibiotikum / antimykotisk (100x), og 0,1% glia-afledt neurotrofisk faktor (GDNF). Der tilsættes 200 μL B-27, 100 μL FBS, 100 μL L-glutamin, 100 μL antibiotikum/antimykotisk (100x) og 10 μL GDNF (10 μg/mL) til 9,5 mL neurobasal A-medier.
BEMÆRK: Forbered neuron medier A inden for en uge efter brug for at sikre friskhed af B-27, L-glutamin og GDNF. - Forbered neuron medier B ved hjælp af samme procedure som forberedelsen af neuron medier A, men uden at tilføje FBS.
- Forbered fordøjelsesopløsning 1 ved at opløse 20 mg kollagen type II, 6 mg kvægserumalbumin og 200 μL antibiotikum/antimycotisk (100x) i 10 ml oxygenstabile Krebs-opløsning.
- Forbered fordøjelsesopløsning 2 ved at fortynde 1 ml 0,25% trypsin med 4 ml hanks afbalancerede saltopløsning.
- Forbered en plade med belagte coverlips.
- Brug tang i en laminar flow bænk, når du placerer glas coverslips i en 48-brønds kultur plade.
- Poly-D-lysin fortyndes med ddH2O til en koncentration på 0,1 mg/mL som poly-D-lysinbestand. Opbevar bestanden ved –20 °C, og tø op før brug.
- Der tilsættes 40 μL poly-D-lysinbestand oven på hver coverlip, og opløsningen inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
BEMÆRK: For forskellige plader med forskellige basale områder justeres koncentrationen til 4 μg/cm2. For eksempel, hvis det basale område af en brønd fra en 24-brønds plade er 2 cm2, så skal vi overføre 80 μL poly-D-lysin lager i en brønd. Hver cm2 ville indeholde 4 μg poly-D-lysin. - Fjern poly-D-lysin i 48-brønds pladen, og skyl coverslips med ddH2O tre gange.
- Tør pladen i en laminar flow hætte i mindst 30 minutter for at sikre, at pladen er vandfri.
- Pladen opbevares ved 4 °C før lamininbelægningen i højst 1 dag. Opbevaring af pladen ved −20 °C er at foretrække til langtidsopbevaring.
- Thaw laminin ved 4 °C. Fortynd laminin med ddH2O til en koncentration på 50 μg/mL som lamininbestand. Bestanden opbevares ved –20 °C, og den optøs ved 4 °C inden brug.
- Brug en pipette til at overføre 100 μL fortyndet laminin til toppen af hver coverslip og inkuber laminin ved 4 °C i 1 time.
BEMÆRK: For forskellige plader med forskellige basale områder justeres koncentrationen til 5 μg/cm2. For eksempel, hvis det basale område af en brønd fra en 24-brønds plade er 2 cm2, skal du overføre 200 μL fortyndet laminin i en brønd. Hver cm2 ville indeholde 5 μg laminin. - Lamininopløsningen fjernes, og der skylles coverslips med ddH2O én gang. Udfør denne handling på kanten af coverlipet for at undgå skrabning.
BEMÆRK: Coatede coverslips kan højst opbevares ved 4 °C i 2 uger.
2. Blærehøst
- Få fat i fem uger gamle Sprague-Dawley rotter.
- Infuse carbogen (95% ilt, 5% CO2) i Krebs opløsningen i mindst 30 minutter i et isbad for at nå en stabil iltstatus og pH-niveau.
- Efter aktiv dødshjælp via livmoderhalskræft dislokation, suge rotterne i 75% ethanol i 30 s for sterilisering.
- Placer rotter på et steriliseret kirurgisk håndklæde og udsætte deres mave. Åbn bukhulen, og afsløre blæren med et sæt saks og pincet.
- Løft blæren forsigtigt og skær blæren fra blærehalsen med et andet sæt saks og pincet for at undgå krydskontaminering. Placer blæren hurtigt i kold ilt-stabil Krebs løsning for at forbedre celle overlevelse.
BEMÆRK: Når blæren er fjernet, udføre følgende operationer hurtigt at forbedre udsigten til neuron overlevelse. - Tilsæt Krebs opløsning i tre glasretter og glasbrydere.
- Forbered glasretter og glasbrydere med Krebs-opløsning i et isbad til forkøling.
- Marker disse beholdere med nummer 1-3 tilsvarende for at undgå forvirring.
- Par hver glasskål med pincet og en skekernedeler.
- I glasfad 1 skæres blæren op med oftalmisk saks og foldes ud med pincet og en skekernedeler.
- Skyl blæren i glasbryder 1, og læg den i glasfad 2.
- Fjern vedhængende fedt på vævsoverfladen ved hjælp af pincet og oftalmisk saks i glasfad 2.
- Skyl blæren i glasbryder 2, og læg den i glasfad 3.
- Skrab forsigtigt blæren ved hjælp af pincet og skekerneskel på glasskål 3 for at fjerne udefrakommende vedhæftede filer.
- Blæren skylles i glasbryder 3, blæren overføres til et 15 ml centrifugerør med 14 ml kold Krebs-opløsning, og prøven drejes i 1 min ved 356 x g og 4 °C.
- Gentag det foregående trin to gange i to andre rør med Krebs-opløsning for at reducere forureningen.
3. To-trins blære fordøjelse
- Blæren overføres fra centrifugerøret til et 2 ml hætteglas, der indeholder 1 ml fordøjelsesopløsning 1. Brug oftalmisk saks til at skære blæren i små stykker (mindre end 1 mm) i opløsning.
- Blæreopløsningen blandes med 9 ml fordøjelsesopløsning 1 i en steril cellekulturskål (100 mm i diameter). Udfør trin 1-fordøjelse i en rysteinkubator i 1 time under 5% CO2,37 °C og 200 omdrejninger i minuttet.
- Efter trin 1-fordøjelsen centrifuges opløsningen ved 356 x g ved 4 °C i 8 min.
- Der anbringes fordøjelsesopløsning 2 i et 37 °C vandbad til forvarmning.
- Efter centrifugering fjernes det supernatant, der indeholder fordøjelsesopløsning 1, og cellesedimentet høstes. Nogle resterende væske er tilladt. Fuldstændig fjernelse af opløsningen kan fremme celletab.
- Celleaflejring blandes med varm fordøjelsesopløsning 2 i et 15 ml centrifugerør, og blandingen rystes, mens blandingen fordøjes i et 37 °C vandbad i 5 min. Må ikke overstige 7 min trin 2 fordøjelse eller neuroner vil omkomme.
- Efter fordøjelsen skal du straks deaktivere trypsin i blandingen med 10 mL koldt skyllemedie.
BEMÆRK: Udfør følgende trin ved 0 °C-4 °C. Et isbad kan give en sådan tilstand. - Cellesedimentet høstes efter centrifugering ved 356 x g ved 4 °C i 8 min. Fjern så mange medier som muligt, fordi de resterende trypsin er skadeligt for cellevækst.
- Opsuspend sediment med 3 mL neuron medier forsigtigt. Sørg for, at der ikke genereres luftbobler i den opløsning, der indeholder celler, for en høj overlevelsesrate.
- Blandingen filtreres gennem en 70 μm celle si i et 50 mL centrifugerør.
- Hold filtrat på en shaker ved 30 omdrejninger i en isbad i 30 min. Dette trin er ikke nødvendigt, men anbefales.
- Celler opsamles ved centrifugering ved 356 x g ved 4 °C i 8 min. og genbruges forsigtigt cellepillerne i 1 mL neuronmedie A.
- Der tilsættes 500 μL celleblanding i hver brønd af den forberedte 48-brønds plade.
- Dyrkningsceller i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2.
- Udskift alle medier med neuron medier B i 1 time for at give en serum-fri kultur.
- Skift halvdelen af neuronmediet B hver 3. dag.
BEMÆRK: Neuroner er klar til immunokytokemiske eksperimenter efter 5-7 dages kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I processen med primær cellekultur var de erhvervede celler runde med lyse og klare grænser før den tilknyttede tilstand. Som neuroner voksede, dendritter og axoner begyndte at være forskellige. Efter 5-7 dages kultur nåede neuronerne en moden form med lange fremskrivninger, som var ideelle til billeddannelse eller funktionsstudier. Selv om de fleste urenheder og cellerester kunne fjernes på grund af skiftende medier, var visse rester knyttet til poly-D-lysin og lamininbelægning synlige (Figur 1).
Efter korrekt kultur kunne neuroner identificeres via typisk β-III-tubulin og MAP-2 immunostaining10,12. Derudover blev glia specifikt identificeret via GFAP immunostaining10. Modne neuroner udviklede synaptiske rygsøjler, som var tæt på de præsynaptiske specialiseringer identificeret ved immunostaining af synaptisk protein maker, synapsin-1 (Figur 2)12. Disse resultater viste, at modne celler med veludviklede synapser blev opnået ved hjælp af denne metode. Dette resultat tyder på dets vigtige rolle i fremtidige funktionsstudier.
I mellemtiden blev flere neuron subtyper anerkendt gennem immunocytochemistry eksperimenter (Figur 3). Peptidergiske neuroner, som indeholder forskellige neuropeptider, blev immunostineret med stof P13. Purinergiske neuroner med udtrykte vesikulære nukleotidtransportører blev identificeret via SLC17A9 farvning14. Nitrergic neuroner blev visualiseret med DYNLL-2, som forbinder nNOS med motoriske proteiner i neuroner15. Cholinrgic neuroner var immunoreaktive med cholin acetyltransferase16.
Figur 1. Fasekontrastbilleder af primærceller isoleret fra rotteblærekulturen taget ved henholdsvis 1, 3 og 7 dage efter plating (henholdsvis A, B, C). Skalastang: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Immunfluorescensbilleder af primærceller isoleret fra rotteblæren. Confocal mikroskopi analyse viste neuron cytoskeleton protein farvning (β-III-tubulin, RRID: AB_2827688, 1:200) i primær kultur neuroner (A) og i hele mount blære forberedelse (B). I primærkulturen neuroner, neuronal fosfoprotein immunostaining (MAP 2, RRID:AB_2827689, 1:200) blev også visualiseret (C). Glia blev identificeret via glial fibrillary sur protein farvning (D; RRID: AB_627673, 1:50). Synapsiner blev visualiseret via synapsinproteinbegæring (Synapsin-1, RRID: AB_2798146, 1:200) i cellulær (E) og væv (F) niveauer. Den sekundære anvendte antistoffer var som følger: Alexa Fluor 488 (grøn, ged anti-kanin lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (rød, ged anti-mus lgG, 1:200). Kernen blev visualiseret ved hjælp af Hoechst 33342 (A, C, D, E; blå, 1 μg/mL). Skalastang: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Immunfluorescens billeder af flere neuron subtyper af primære neuroner. Peptidergiske neuroner blev immunostineret med stof P (A; RRID: AB_785913, 1:50). Purinergiske neuroner blev identificeret via SLC17A9 farvning (B; RRID: AB_10597575, 1:200). Nitrergic neuroner blev visualiseret via DYNLL-2 farvning (C; RRID: AB_654147, 1:50). Cholinrgiske neuroner var immunoreaktive med cholinacetyltransferase (D; RRID: AB_2244867, 1:100). Den sekundære anvendte antistoffer var som følger: Alexa Fluor 488 (grøn, ged anti-kanin lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (rød, ged anti-mus lgG, 1:200). Kernen blev visualiseret ved hjælp af Hoechst 33342 (A, B, C, D, blå, 1 μg/mL). Skalastang: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Ingredienser | Molarity (mM) |
| Naci | 120 |
| KCI | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| Glukose | 11.5 |
Tabel 1. Krebs opløsning sammensætning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forberedelse af plade
Brugen af glasovertræk i 6-, 12- eller 48-brønds kulturplader til immunfluorescerende eller calciumbilleddannelseseksperimenter er en økonomisk og prøvebesparende operation. Celler vokser godt i plader uden coverlips under forberedelsen af primære cellekulturer. Derfor kan coverslips dispenseres i eksperimenter, såsom vestlig blot eller polymerase kædereaktion. Desuden er belægning et nødvendigt skridt, før plating celler, med eller uden coverslips. Laminin og poly-D-lysin er almindelige valg i belægning neuroner, især laminin, som er afgørende for neuron vækst17.
Forberedelse af medier
Efter første medium udskiftning kræver celleisolation medier uden serum, fordi serum stimulerer celledeling og fører til et begrænset neuron voksende rum18. Således neuron vækstfaktorer er afgørende. Kvaliteten af B27 og GDNF kan variere meget fra forskellige partier og forårsage store virkninger på neuronvækst19. Derfor anbefales det at kontrollere partinummeret på mediet, når neuronudbyttet er dårligt. I mellemtiden er nye medier lager afgørende; det krævede beløb skal beregnes og udarbejdes på forhånd hver gang, før mediet udskiftes.
Dyr
Sprague-Dawley rotter anvendes i denne metode. C57BL/6 mus er også acceptable i dette eksperiment. Derfor kan andre stammer af rotter eller mus også vedtages for denne metode på trods af nogle få variationer i morfologi og neuronale kredsløb. Med hensyn til forskellige dyremodeller bør forskerne udvikle en optimeret og målrettet protokol. Desuden bør unge dyr altid tages i betragtning forud for anvendelsen af denne metode.
Vævsbehandling
Under forsøgene, bortset fra fordøjelsesprocessen, er det vigtigt at holde væv ved lav temperatur for at øge cellekraften, hvilket kan reducere cellemetabolismen og undgå energiunderskud. Ilt niveauer, ernæring, og pH kan også påvirke celle udbytte11. Desuden foreslår vi for andre væv, at forskere udfører denne metode med justeret fordøjelsestilstand.
Cellekultur
Et bemærkelsesværdigt træk ved neuroner, når de podes, er deres hurtige overholdelse af belagte plader20. I dette tilfælde anbefales det at skifte medie efter 1 time kultur for at få en høj andel af neuroner. Desuden, når de fleste af cellerne begynder at vokse pseudopodium, kan hyppigheden af skiftende medier reduceres korrekt afhængigt af mediets farve og cellulær tilstand. Primær cellekultur i god stand viser sort soma med en lys kant.
De fleste nerveceller isoleret fra blæren er blære intramural ganglier, som består af afferente og autonome brusende innervations af blæren13. Desuden er der ingen større bækkenganglier til stede i det høstede væv. Den fordeler sig under blærehalsen21.
Begrænsning
Dette er en indledende forskning for at isolere og kultur neuroner og glia. Mange forsøg var blevet gjort, som cytarabine behandling eller tæthed gradient centrifugering. Andelen af ønskede celler var dog stadig ikke ideel, og endnu mere celletab dukkede op. Desuden vil traditionelle fordøjelsesforhold i denne protokol, såsom 37 °C, sandsynligvis dræbe nogle følsomme neurontyper og forårsage potentielle genekspressionsartefakter22.
Afslutningsvis tilbyder denne protokol en metode til at dyrke neuroner og glia fra rotteblære. Isoleringen er let at gentage, tidseffektiv og involverer minimal mikrobiel forurening. Selvom forbedring, der fremkalder renheden af neuroner, er nødvendig, håber vi, at denne metode bidrager til LUTNS-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen større interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant no. 81673676) og Dongguan Science and Technology Bureau (Grant no. 2019622101002). Forfatterne takker Dr. Maryrose Sullivan (adjunkt i kirurgi, Harvard Medical School) for teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Golbidi, S., Laher, I.
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, Pt 9 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants - A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G.
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
