Summary
Detta protokoll försöker upprätta ett repeterbart protokoll för primära nervceller och glia isolering från råtta urinblåsan för ytterligare cellulära experiment.
Abstract
Det nedre urinvägarna har två huvudfunktioner, nämligen periodisk urinlagring och micturition; dessa funktioner förmedlas genom central och perifer neuroregulation. Även om omfattande forskning om nedre urinvägarna nervsystemet har utförts, har de flesta studier fokuserat på primär kultur. Detta protokoll introducerar en metod för isolering och kultur av blåsneuroner och glia från Sprague-Dawley råttor. I denna metod inkuberades nervcellerna och glia i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 5-7 dagar. Som ett resultat växte de till mogna former som lämpar sig för relaterade efterföljande immunofluorescens experiment. Cellerna observerades morfologiskt med hjälp av ett optiskt mikroskop. Nervceller, synaptiska vesiklar och glia identifierades av β-III-tubulin och MAP-2, Synapsin-1 och GFAP färgning, respektive. Under tiden utfördes immunocytochemistry på flera signalsubstans-relaterade proteiner, såsom kolin acetyltransferase, DYNLL2 och SLC17A9.
Introduction
Nedre urinvägarna har två huvudfunktioner: periodisk urinlagring och micturition1. Nedre urinvägarna nervsystemet (LUTNS) kontrollerar dessa funktioner och är känsliga och mottagliga för många neuropathies, som kan vara medfödda (porfyri), förvärvat (Lyme sjukdom), sekundärt till sjukdom stater (diabetiker cystopati), drog inducerad (hemorragisk cystit), kirurgi orsakad (abdominoperin samband), eller skada orsakad (traumatisk ryggmärgsskada)2,3,4,5,6,7. I fysiologiska/patologiska studier är in vivo- och in vitro-experiment lika viktiga. Medan in vivo-forskning om LUTNS har utförts på organ-, cellulära och molekylära nivåer under en tid, är in vitro-forskning om primära nervceller från urinblåsan nästan obefintlig8,9. Även om den nuvarande studien är begränsad hoppas vi kunna bana väg för forskning på detta område så att andra forskare kan förbättra den. På detta sätt kan denna samkultur leda till en cellulär förståelse av fysiologisk dysfunktion i fenotyper, såsom urinblåsan neuron dysfunktion.
I motsats till enteriska muskler med en tydlig riktning av muskelcellerna i diskreta lager är urinblåsans muskler oorganiserade10. Därför föreslår denna metod, istället för att skala av urinblåsans yttre skikt, att smälta hela blåsan för att minska svårigheten att fungera och förkorta förbearbetningstiden för en hög cellöverlevnad.
Enligt denna metod kan vi få en blandad kultur av nervceller och andra celler. De andra cellerna är oumbärliga eftersom deras närvaro efterliknar en in vivo-miljö11. Dessutom ger sådana celler de ämnen som inte är tillgängliga i mediet.
Denna metod innebär två steg för matsmältningen. För det första används kollagen typ II för att hydrolysera kollagen, följt av trypsin, för att skilja vävnaden icellerna 10. På detta sätt sprids blåsvävnader till enstaka celler och växer sedan relativt oberoende. När neuronkulturen mognar kan nervcellerna användas för avbildning eller funktionella analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella protokoll och djurförsök följde nationella forskningsrådets etiska principriktlinjer.
1. Beredning av material
- Sterilisera alla instrument och ddH2O med hjälp av en autoklav innan du utför experimentet. Instrumenten inkluderar men är inte begränsade till kirurgisk sax, oftalmisk sax, tång, skedar kärna av avdelare, glasfat (60-100 mm i diameter) och glasbrytare.
- Bered Krebs-lösningen enligt följande (Tabell 1): Lös upp alla kemikalier tillsammans med ddH2O före användning. Lös caCI2 separat och tillsätt långsamt i den blandade lösningen under omrörning för att undvika sediment.
- Förbered sköljmedierna, som består av F12-media med 10% fetala nötkreatursserum (FBS) och 1% antibiotikum/antimykotiskt (100x). Tillsätt 5 ml FBS och 0,5 ml antibiotika/antimykotisk till 44,5 ml F12-media.
- Förbered neuron media A, som består av neurobasala A media med 2% B-27, 1% FBS, 1% L-glutamin, 1% antibiotikum/antimycotic (100x) och 0,1% glia-härledda neurotrofisk faktor (GDNF). Tillsätt 200 μL B-27, 100 μL FBS, 100 μL L-glutamin, 100 μL antibiotika/antimykotika (100x) och 10 μL GDNF (10 μg/ml) till 9,5 ml neurobasala A-medier.
OBS: Förbered neuron media A inom en vecka efter användning för att säkerställa friskhet av B-27, L-glutamin och GDNF. - Förbered neuron media B med samma förfarande som beredning av neuron media A men utan att lägga till FBS.
- Förbered matsmältningslösning 1 genom att lösa upp 20 mg kollagenas typ II, 6 mg bovint serumalbumin och 200 μL antibiotika/antimykotisk (100x) i 10 ml syrestabil Krebslösning.
- Förbered matsmältningslösning 2 genom att späda ut 1 ml 0,25% trypsin med 4 ml av Hanks balanserade saltlösning.
- Förbered en tallrik med belagda täcken.
- Använd tång i en laminär flödesbänk när du placerar glaslock i en 48-brunns odlingsplatta.
- Späd poly-D-lysin med ddH2O till en koncentration av 0, 1 mg/ml som poly-D-lysinbuljong. Förvara lagret på –20 °C och tina före användning.
- Tillsätt 40 μL poly-D-lysinbuljong ovanpå varje täckglas och inkubera lösningen vid rumstemperatur i 10 minuter.
OBS: För olika plattor med olika basala områden, justera koncentrationen till 4 μg/cm2. Till exempel, om basalområdet för en brunn från en 24-brunnsplatta är 2 cm2, bör vi överföra 80 μL poly-D-lysinlager i en brunn. Varje cm2 skulle innehålla 4 μg poly-D-lysin. - Ta bort poly-D-lysin i 48-brunnsplattan och skölj täcken med ddH2O tre gånger.
- Torka plattan i en laminär flödeshuv i minst 30 minuter för att säkerställa att plattan är vattenfri.
- Förvara plattan vid 4 °C före lamininbeläggning i högst 1 dag. Förvaring av plattan vid −20 °C är att föredra för långtidslagring.
- Tina laminin vid 4 °C. Späd laminin med ddH2O till en koncentration av 50 μg/ml som lamininlager. Förvara lagret vid –20 °C och tina vid 4 °C före användning.
- Använd en pipett för att överföra 100 μL utspädd laminin till toppen av varje täckglas och inkubera laminin vid 4 °C i 1 timme.
OBS: För olika plattor med olika basala områden, justera koncentrationen till 5 μg/cm2. Till exempel, om basalområdet för en brunn från en 24-brunnsplatta är 2 cm2, överför sedan 200 μL utspädd laminin i en brunn. Varje cm2 skulle innehålla 5 μg laminin. - Ta bort lamininlösningen och skölj täcken med ddH2O en gång. Utför den här åtgärden på kanten av täckglaset för att undvika skrapning.
OBS: Överdragna täcken kan förvaras vid högst 4 °C i högst 2 veckor.
2. Blåsskörd
- Få fem veckor gamla Sprague-Dawley råttor.
- Infusera karbin (95% syre, 5% CO2)i Krebs-lösningen i minst 30 minuter i ett isbad för att nå en stabil syrestatus och pH-nivå.
- Efter dödshjälp via livmoderhalscancer förskjutning, blötlägg råttorna i 75% etanol i 30 s för sterilisering.
- Placera råttor på en steriliserad kirurgisk handduk och exponera buken. Öppna bukhålan och avslöja blåsan med en uppsättning saxar och tång.
- Lyft blåsan försiktigt och skär blåsan från blåshalsen med en annan uppsättning saxar och tångar för att undvika korskontaminering. Placera urinblåsan snabbt i kall syrestabil Krebs-lösning för att förbättra cellöverlevnaden.
OBS: När blåsan har tagits bort, utför följande åtgärder snabbt för att förbättra utsikterna till neuron överlevnad. - Tillsätt Krebs lösning i tre glasfat och glaskross.
- Förbered glasfat och glaskross med Krebs lösning i ett isbad för förkylning.
- Markera dessa behållare med siffrorna 1–3 på motsvarande sätt för att förhindra förvirring.
- Para ihop varje glasfat med tång och en skedkärna.
- Skär upp blåsan med oftalmisk sax i glasform 1 och veckla ut den med tång och en skedkärna.
- Skölj blåsan i glaskross 1 och placera den i glasform 2.
- Eliminera vidhäftande fett på vävnadsytan med hjälp av tång och oftalmisk sax i glasform 2.
- Skölj blåsan i glaskross 2 och placera den i glasform 3.
- Skrapa försiktigt blåsan med hjälp av tången och skedar kärnan avdelare på glas skål 3 för att ta bort exogena tillbehör.
- Skölj blåsan i glaskross 3, överför blåsan till ett 15 ml centrifugeringsrör med 14 ml kall Krebs-lösning och snurra provet i 1 min vid 356 x g och 4 °C.
- Upprepa föregående steg två gånger i två andra rör med Krebs lösning för att minska föroreningen.
3. Tvåstegs urinblåsans matsmältning
- Överför urinblåsan från centrifugröret till en 2 ml injektionsflaska som innehåller 1 ml matsmältningslösning 1. Använd oftalmisk sax för att skära blåsan i små bitar (mindre än 1 mm) i lösningen.
- Blanda blåslösningen med 9 ml matsmältningslösning 1 i en steril cellkulturrätt (100 mm i diameter). Utför steg 1 matsmältning i en skakande inkubator i 1 h under 5% CO2,37 °C och 200 rpm.
- Efter steg 1 matsmältning, centrifugera lösningen vid 356 x g vid 4 °C i 8 min.
- Placera rötningslösning 2 i ett vattenbad på 37 °C för förvärmning.
- Efter centrifugation, ta bort supernatanten som innehåller matsmältningslösning 1 och skörda cellsedimentet. Viss återstående vätska är tillåten. Fullständig borttagning av lösningen kan främja cellförlust.
- Blanda cellsediment med varm matsmältningslösning 2 i ett 15 ml centrifugeringsrör och skaka blandningen medan du smälter i ett 37 °C vattenbad i 5 minuter. Överskrid inte 7 min steg 2 matsmältning eller nervceller kommer att förgås.
- Efter matsmältningen, inaktivera omedelbart trypsin i blandningen med 10 ml kallsköljningsmedier.
OBS: Utför följande steg vid 0 °C–4 °C. Ett isbad kan ge ett sådant tillstånd. - Skörda cellsedimentet efter centrifugering vid 356 x g vid 4 °C i 8 min. Ta bort så mycket media som möjligt eftersom det återstående trypsinet är skadligt för celltillväxten.
- Återanvänd sediment med 3 ml neuron media försiktigt. Se till att luftbubblor inte genereras i lösningen som innehåller celler med hög överlevnadsgrad.
- Filtrera blandningsmedlet genom en 70 μm cellsil till ett 50 ml centrifugeringsrör.
- Håll filtratet på en shaker vid 30 varv/min i ett isbad i 30 minuter. Det här steget är inte nödvändigt men rekommenderas.
- Samla celler genom centrifugering vid 356 x g vid 4 °C i 8 min och återanvänd försiktigt cellpelletsen i 1 ml neuronmedel A.
- Tillsätt 500 μL cellblandning i varje brunn på den beredda 48-brunnsplattan.
- Odlingsceller i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
- Ersätt alla medier med neuronmedia B i 1 h för att ge en serumfri kultur.
- Byt hälften av neuronmedia B var tredje dag.
OBS: Neuroner är redo för immunocytochemical experiment efter 5-7 dagar av kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I processen med primär cellkultur var de förvärvade cellerna runda med ljusa och tydliga gränser före det bifogade tillståndet. När nervcellerna växte började dendriter och axoner vara distinkta. Efter 5-7 dagar av kultur nådde nervcellerna en mogen form med långa projektioner, som var idealiska för bildbehandling eller funktionsstudier. Även om de flesta föroreningar och cellskräp kunde avlägsnas på grund av förändrade medier, var vissa rester fästa vid poly-D-lysin- och lamininbeläggning synliga (figur 1).
Efter rätt kultur kunde nervceller identifieras via typiska β-III-tubulin och MAP-2 immunostaining10,12. Dessutom identifierades glia specifikt via GFAP immunostaining10. Mogna nervceller utvecklat synaptiska ryggrader, som var nära de presynaptiska specialiseringar som identifierats av immunostaining av synaptic protein maker, synapsin-1 (Figur 2)12. Dessa resultat anges att mogna celler med välutvecklade synapser erhölls genom denna metod. Detta resultat tyder på dess viktiga roll i framtida funktionsstudier.
Under tiden erkändes flera neuron subtyper genom immunocytokemi experiment (Figur 3). Peptidergiska nervceller, som innehåller olika neuropeptider, var immunstained med substans P13. Purinergic nervceller med uttryckt vesicular nukleotid transportörer identifierades via SLC17A9 färgning14. Nitrergic nervceller visualiserades med DYNLL-2, som förbinder nNOS med motoriska proteiner i nervceller15. Kolinerga nervceller var immunreaktiva med kolin acetyltransferas16.
Figur 1. Faskontrastbilder av primära celler isolerade från råttblåsans kultur tagna 1, 3 och 7 dagar efter plätering (A, B, C, respektive). Skalstång: 50 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Immunofluorescens bilder av primära celler isolerade från råtta urinblåsan. Confocal mikroskopi analys visade neuron cytoskeleton protein färgning (β-III-tubulin, RRID: AB_2827688, 1:200) i primär kultur nervceller (A) och i hela mount urinblåsan beredning (B). I primära kulturneuroner visualiserades neuronal phosphoprotein immunostaining (MAP 2, RRID:AB_2827689, 1:200) också (C). Glia identifierades via gliafibrillary acidic protein färgning (D; RRID: AB_627673, 1:50). Synapsiner visualiserades via synapsin protein färgning (Synapsin-1, RRID: AB_2798146, 1:200) i cellulära (E) och vävnad (F) nivåer. De sekundära antikropparna som användes var följande: Alexa Fluor 488 (grön, get anti-kanin lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (röd, get antimus lgG, 1:200). Kärnan visualiserades med Hoechst 33342 (A, C, D, E; blå, 1 μg/ ml). Skalstång: 50 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3. Immunofluorescens bilder av flera neuron subtyper av primära nervceller. Peptidergiska nervceller var immunstained med ämne P (A; RRID: AB_785913, 1:50). Purinergiska nervceller identifierades via SLC17A9 färgning (B; RRID: AB_10597575, 1:200). Nitrergic nervceller visualiserades via DYNLL-2 färgning (C; RRID: AB_654147, 1:50). Kolinerga nervceller var immunreaktiva med kolin acetyltransferas (D; RRID: AB_2244867, 1:100). De sekundära antikropparna som användes var följande: Alexa Fluor 488 (grön, get anti-kanin lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (röd, get antimus lgG, 1:200). Kärnan visualiserades med Hoechst 33342 (A, B, C, D, blå, 1 μg / ml). Skalstång: 50 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Ingredienser | Molaritet (mM) |
| NaCI (NaCI) | 120 |
| Kci | 5.9 |
| NaHCO3 (på NaHCO) | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 (på 2) | 2.5 |
| Glukos | 11.5 |
Tabell 1. Krebs lösningskomposition
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förberedelse av tallrikar
Användningen av glasöverdrag i 6-, 12- eller 48-brunns odlingsplattor för immunofluorescerande eller kalciumavbildningsexperiment är en ekonomisk och provskonskonande operation. Celler växer bra i tallrikar utan täcken under beredningen av primära cellkulturer. Därför är täcklips dispenserbara i experiment, såsom western blot eller polymeraskedjereaktion. Dessutom är beläggning ett nödvändigt steg före plätering av celler, med eller utan täcken. Laminin och poly-D-lysin är vanliga val vid beläggning av nervceller, särskilt laminin, vilket är viktigt för neurontillväxt17.
Förberedelse av media
Efter första medium ersättning kräver cell isolering media utan serum eftersom serum stimulerar celldelning och leder till ett begränsat neuronväxande utrymme18. Således är neuron tillväxtfaktorer avgörande. Kvaliteten på B27 och GDNF kan variera till stor del från olika partier och orsaka stora effekter på neurontillväxt19. Därför rekommenderas kontroll av mediets partinummer när neuronutbytet är dåligt. Samtidigt är nya medieaktier avgörande. Det erforderliga beloppet bör beräknas och beredas i förväg varje gång innan mediet byts ut.
Djur
Sprague-Dawley råttor används i denna metod. C57BL/6 möss är också acceptabla i detta experiment. Därför kan andra stammar av råttor eller möss också antas för denna metod trots några variationer i morfologi och neuronala kretsar. När det gäller olika djurmodeller bör forskare utveckla ett optimerat och riktat protokoll. Dessutom bör unga djur alltid övervägas innan denna metod används.
Vävnadsbehandling
Under experimenten, förutom matsmältningsprocessen, är det viktigt att hålla vävnader vid låg temperatur för att öka cellens livskraft, vilket kan minska cellmetabolismen och undvika energiunderskott. Syrenivåer, näring och pH kan också påverkacellutbytet 11. För andra vävnader föreslår vi dessutom att forskare utför denna metod med justerat matsmältningstillstånd.
Cellkultur
En anmärkningsvärd egenskap hos nervceller när de vaccinerades är deras snabba vidhäftning till belagda plattor20. I det här fallet rekommenderas att byta media efter 1 h kultur för att få en hög andel nervceller. Dessutom, när de flesta av cellerna börjar växa pseudopodium, kan frekvensen av förändrade medier minskas på lämpligt sätt beroende på mediets färg och celltillståndet. Primär cellkultur i gott skick visar svart soma med en ljus kantlinje.
De flesta nervceller isolerade från urinblåsan är urinblåsan intramurala ganglier, som består av afferenta och autonoma efferent innervations av urinblåsan13. Dessutom finns inga större bäckenliga ganglier i den skördade vävnaden. Den fördelas under blåshalsen21.
Begränsning
Detta är en preliminär forskning för att isolera och odla nervceller och glia. Många försök hade gjorts, som cytarabin behandling eller densitet gradient centrifugation. Andelen önskade celler var dock fortfarande inte idealisk, och ännu mer cellförlust uppträdde. Dessutom kommer traditionella matsmältningsförhållanden i detta protokoll, såsom 37 °C, sannolikt att döda vissa känsliga neurontyper och orsaka potentiella genuttrycksartefakter22.
Sammanfattningsvis erbjuder detta protokoll en metod för att odla nervceller och glia från råtta urinblåsan. Isoleringen är lätt att upprepa, tidseffektiv och innebär minimal mikrobiell förorening. Även om förbättring som framkallar nervcellers renhet är nödvändig, hoppas vi att denna metod bidrar till LUTNS-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen större intressekonflikt.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81673676) och Dongguan Science and Technology Bureau (Anslag nr 2019622101002). Författarna tackar Dr. Maryrose Sullivan (biträdande professor i kirurgi, Harvard Medical School) för teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Golbidi, S., Laher, I.
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, Pt 9 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants - A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G.
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
