Summary
L’objectif du protocole est de comparer différentes conditions de revêtement de la matrice extracellulaire (ECM) afin d’évaluer comment le revêtement différentiel affecte le taux de croissance des cellules souches pluripotentes induites (CSPi). En particulier, nous visons à mettre en place les conditions pour obtenir une croissance optimale des cultures iPSC.
Abstract
Cette étude vise à comprendre comment la croissance des CSPi sur différents substrats de revêtement ECM peut affecter la confluence cellulaire. Un protocole permettant d’évaluer la confluence des CSPi en temps réel a été établi sans qu’il soit nécessaire de compter les cellules en suspension unicellulaire pour éviter toute perturbation de la croissance. Un système d’analyse d’images à haut contenu a été utilisé pour évaluer de manière automatisée la confluence iPCS sur 4 ECM différents au fil du temps. Différents paramètres d’analyse ont été utilisés pour évaluer la confluence cellulaire des CSPi adhérentes et seule une légère différence (à 24 et 48 heures avec la laminine) a été observée si un masque à 60, 80 ou 100% a été appliqué. Nous montrons également que la laminine conduit à la meilleure confluence par rapport à Matrigel, la vitronectine et la fibronectine.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) sont obtenues à partir de cellules somatiques et peuvent être différenciées en différents types de cellules. Ils sont souvent utilisés comme système pour modéliser la pathogenèse des maladies ou effectuer le dépistage de médicaments, et offrent également le potentiel d’être utilisés dans le contexte de la médecine personnalisée. Étant donné que les CSPi ont un grand potentiel, il est important de les caractériser pleinement pour les utiliser en tant que système modèle fiable. Nous avons déjà montré l’importance de cultiver des CSPi dans un environnement hypoxique, car ces cellules dépendent de la glycolyse et un environnement aérobie peut provoquer un déséquilibre redox1. Les CSPi sont également vulnérables à d’autres conditions de culture, en particulier l’environnement extracellulaire. L’optimisation des conditions de culture est un enjeu clé pour les maintenir en bonne santé et proliférer. Une culture saine de CSPi conduira à des cellules différenciées saines qui sont généralement le point final du modèle utilisé pour comprendre les caractéristiques moléculaires, cellulaires et fonctionnelles de troubles humains ou de processus cellulaires spécifiques.
Dans cette étude, un protocole simple a été utilisé pour tester la confluence des CSPi en utilisant différentes conditions de revêtement dans des puits séparés. Les CSPi nécessitent une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires murins (MEF) pour se fixer correctement, mais la coexistence des CSPi et du MEF rend difficile l’analyse comme l’extraction d’ARN ou de protéines puisque deux populations de cellules sont présentes. Afin d’éviter la couche nourricière, différentes protéines appartenant à la matrice extracellulaire (ECM) ont été utilisées pour recréer la niche cellulaire naturelle et pour avoir une culture iPSC sans nourrisseur. En particulier, Matrigel est une préparation solubilisée de membrane basale extraite du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), qui est enrichie en protéines de la matrice extracellulaire (c.-à-d. laminine, collagène IV, protéoglycanes sulfate d’héparane, entactine/nidogène et facteurs de croissance)2,3. Les autres conditions de revêtement utilisées sont plutôt des protéines purifiées dont la pertinence dans la construction des ECM est connue : la laminine-521 est connue pour être sécrétée par les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans la masse cellulaire interne de l’embryon et c’est l’une des laminines les plus courantes dans le corps après la naissance 4,5,6,7,8,9, 10,11; la vitronectine est une matrice de culture cellulaire exempte de xéno connue pour soutenir la croissance et la différenciation desCSPh 12,13,14,15,16; La fibronectine est une protéine ECM importante pour le développement des vertébrés et la fixation et le maintien des cellules souches embryonnaires à l’état pluripotent 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Étant donné que différentes conditions de revêtement sont disponibles, nous les comparons en termes d’effet sur la confluence des CSPi.
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Protocol
1. Revêtement de 96 plaques de puits
REMARQUE : Différents revêtements ont été testés dans la même plaque, mais dans des puits distincts (voir le dossier supplémentaire).
- Diluer le Matrigel 1:100 dans DMEM. Ajouter 100 μL par puits aux plaques de 96 puits et incuber pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, retirez la solution et lavez les puits avec 100 μL de DMEM deux fois.
- Laminine diluée (20 μg/mL, LN-521) dans du PBS (avec calcium et magnésium). Ajouter 100 μL au puits et incuber à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain, effectuez deux lavages avec DMEM avant d’ensemencer les cellules.
- Diluer la vitronectine (10 μg/mL) dans un tampon de dilution. Ajouter 100 μL par puits à la plaque de 96 puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Lavez les puits avec du PBS (sans calcium ni magnésium) avant de plaquer les cellules.
- Diluer la HU-fibronectine (30 μg/mL) dans le ddH2O. Ajouter 100 μL dans les puits et incuber à température ambiante pendant 45 minutes. Ensuite, lavez les puits avec le milieu avant d’ensemencer les cellules.
2. Maintien des CSPi en culture
REMARQUE : Les CSPi ont été achetées dans le commerce. Les CSPi ont été dérivées de fibroblastes humains sains et reprogrammées à l’aide de la technologie épisomique.
- À partir du congélateur à -80 °C ou de l’azote liquide, décongeler les CSPi cryoconservés dans un bain-marie à 37 °C. Nettoyez le flacon contenant les cellules avec de l’éthanol à 70 % avant de le déposer dans l’enceinte de sécurité biologique.
- Ajouter goutte à goutte la suspension cellulaire à 5 mL de milieu de culture cellulaire préchauffé (p. ex. mTeSR1) goutte à goutte à l’aide d’une pipette de 1000 μL dans un tube conique stérile de 15 mL.
- Centrifuger les cellules à 304 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).
- Retirer le milieu et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 4 mL de milieu de culture cellulaire.
- Plaquer la suspension cellulaire dans deux puits des 6 plaques de puits (105 CSPi par boîte de culture cellulaire à 6 puits), où les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ont été plaqués précédemment. Semencez des MEF deux jours avant le placage de CSPi à une densité de 2,4 x 104/cm2 dans du DMEM (contenant 10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de L-glutamine et 1 % de pénicilline-streptomycine).
- Après l’ensemencement, compléter le milieu cellulaire avec 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y-27632.
- Cultiver les CSPi sur MEF pendant les 4-5 premières semaines, puis à l’état sans alimentation (condition sans MEF), en utilisant l’un des revêtements d’intérêt (voir l’étape 1 et le tableau 1) dans mTeSR1.
- Lorsque les CSPi sont confluentes à 70-80%, passage 1:4 en utilisant un traitement EDTA de 0,5 mM pendant 3-5 min à TA. Ajouter 1 mL d’EDTA 0,5 mM pour une plaque à 6 puits (ou des quantités proportionnelles pour les autres types de plaques). Transférer dans de nouveaux puits dans des conditions sans alimentation et incuber à 37 °C, 5% CO2, 20% O2.
- Changez le support avec mTeSR1 frais tous les jours et divisez les cellules tous les 2 jours.
3. Caractérisation de la confluence cellulaire
- Utilisez 96 plaques de puits pour les expériences.
- Ensemencer 10 000 cellules par puits après au moins 1 mois de culture en conditions exemptes de mangeoire afin de s’assurer que les MEF n’ont pas été transmis. Utilisez des lames de comptage jetables pour compter les cellules avec le microscope optique.
- Effectuez les expériences en trois exemplaires. Par conséquent, testez chaque condition d’ensemencement dans trois puits.
- Effectuer l’acquisition automatisée d’images dès le jour 1 suivant l’ensemencement à l’aide d’un cytomètre en mode fond clair. Effectuez une acquisition d’image automatisée toutes les 24 heures pendant 5 jours. Pour obtenir des informations détaillées sur les paramètres expérimentaux, reportez-vous au fichier supplémentaire.
- Utilisez le contraste automatique et l’exposition automatique pour mieux visualiser les cellules.
- Définissez le paramètre d’analyse (voir Fichier supplémentaire) pour l’analyse de confluence afin d’appliquer un masque de 60%, 80% et 100% par puits, afin d’évaluer les changements de focalisation dus à la réfraction de la lumière à la limite des puits. Utilisez les différents paramètres d’analyse de masque mentionnés ci-dessus pour analyser la confluence cellulaire à chaque point temporel.
4. Analyses statistiques
- Déclarez les résultats quantitatifs sous forme de moyennes ±'erreur-type de la moyenne (MEB).
- Pour comparer les différences globales des différentes conditions de revêtement, obtenez des données en utilisant les mêmes échantillons et effectuez le test t de l’échantillon apparié de Student. Les valeurs de p inférieures à 0,05 sont considérées comme statistiquement significatives, et toutes les valeurs p déclarées sont recto verso.
5. Caractérisation des microfilaments cytosquelettiques
- Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (4% PFA) dans PBS pendant 10 min à TA, suivi de deux lavages dans PBS (10 min au total).
- Ajouter 100 μL de solution de blocage (composée de 5% de BSA, 0,1% de Triton dans PBS) à chaque puits pendant 1 h à TA.
- Retirer la solution bloquante et laver les échantillons deux fois avec du PBS pendant 10 min.
- Ajouter 100 μL de la solution de travail conjuguée phalloïdine-conjuguée par échantillon et incuber pendant 1 h à TA.
- Lavez les cellules deux fois avec du PBS (10 min à TA).
- Colorer les noyaux avec Hoechst 33342 dilué 1:10000 dans PBS pendant 10 min à TA.
- Retirez la solution Hoechst et lavez les cellules deux fois avec du PBS pendant 10 minutes à chaque fois.
- Laver l’échantillon avec H2O et laisser sécher sous une hotte chimique.
- Ajouter 100 μL de support de montage (c.-à-d. PBS:glycérol, 1:1) pour couvrir les cellules et préserver la fluorescence des échantillons.
- Observez la cellule à Ex/Em 493/517 nm sur un microscope confocal à balayage laser équipé d’une source laser à lumière blanche (WLL) et d’un laser à diode de 405 nm. Acquérir des images confocales séquentielles à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile HC PLAPO 40x. Utilisez la même puissance laser, les mêmes séparateurs de faisceau, les mêmes réglages de filtre, les mêmes diamètres de trous d’épingle et le même mode de balayage pour tous les échantillons examinés.
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Representative Results
Dans cette étude, nous avons étudié la confluence des CSPi lorsqu’elles sont cultivées dans différentes conditions de revêtement. À l’aide d’un cytomètre, nous avons pu obtenir des résultats facilement informatifs en trois exemplaires en 5 jours. Étant donné que les CSPi se fixent à peine aux récipients en plastique et qu’un revêtement est nécessaire pour favoriser leur prolifération, nous avons décidé de surveiller la confluence des CSPi humaines car elle indique la santé de la culture cellulaire et peut refléter leur potentiel de différenciation. Après expansion in vitro, nous avons ensemencé les CSPi sur différents substrats ECM et analysé des cellules par observation des images d’échantillons acquises en champ clair et en utilisant la coloration à la phalloïdine (utilisée pour colorer les filaments d’actine, également appelée F-actine) afin de comprendre leur adhésion aux vaisseaux (Figure 1). En effet, la coloration à la phalloïdine permet de visualiser le degré d’adhérence cellulaire à la surface du vaisseau et donc au revêtement spécifique utilisé pour le vaisseau. Les cellules qui adhèrent au revêtement ont montré des microfilaments cytosquelettiques clairement visibles au lieu de microfilaments effondrés. L’observation du fond clair en combinaison avec la coloration à la phalloïdine documente un bon niveau d’adhérence des CSPi à la surface revêtue.
Pour étudier la confluence, nous avons ensemencé les CSPi avec Matrigel, LN-521, vitronectine et Hu-fibronectine en trois exemplaires, et effectué l’expérience trois fois. Afin d’éviter la réfraction de la lumière due au bord du puits, nous avons appliqué trois types de réglage d’analyse avec un masque de 60, 80 et 100%, et observé qu’ils sont similaires dans la cueillette des cellules et l’évitement du fond (Figure 2). Les résultats obtenus montrent que les CSPi ensemencées sur LN-521 présentent un taux élevé de prolifération cellulaire de manière linéaire au cours du temps, en le comparant aux autres revêtements et que ces différences sont statistiquement significatives (astérisques sur la figure 3A-C). Les cellules ensemencées sur Matrigel, Vitronectine ou Hu-Fibronectine montrent un taux de prolifération linéaire dans les 96 premières heures mais elles montrent également une pente accrue de la courbe de confluence au cours des dernières 24 heures (indépendamment du masque utilisé, 60%, 80% ou 100%, Figure 3A-C). Étant donné que la différence initiale à 24 h pour les différents revêtements peut être due à des différences de fixation cellulaire, la croissance cellulaire a été normalisée à 24 h pour les points temporels ultérieurs (de 48 à 120 h) (Figure 3D-F). Les graphiques obtenus à l’aide du masque 60, 80 et 100% montrent qu’il n’existe aucune différence en termes de confluence entre les différents revêtements et que les différences observées avec le LN-521 sont très probablement dues à une capacité accrue des CSPi à adhérer à ce revêtement lors du passage.
Graphique 1. Images représentatives en fond clair et coloration phalloïdine des CSPi ensemencées sur différents revêtements ECM après 3 jours. Images en fond clair montrant que les cellules sont saines sur le revêtement utilisé et qu’elles sont bien attachées aux vaisseaux, comme documenté par la coloration à la phalloïdine montrant des microfilaments cytosquelettiques clairement visibles. Barre d’échelle: 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Images représentatives en champ clair montrant trois paramètres d’analyse différents pour les masques utilisés pour effectuer des analyses de confluence. Mosaïque obtenue avec un cytomètre à l’aide d’images en fond clair (16 images/puits à partir d’une plaque de 96 puits). En vert la segmentation de l’analyse affiche clairement les différents masques appliqués (60, 80 100%) pour éviter ou inclure le bord arrondi du puits. Barre d’échelle: 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Analyse de confluence cellulaire de CSPi ensemencées sur des vaisseaux à revêtement différent. Graphique représentant la confluence cellulaire des CSPi ensemencées sur des vaisseaux à revêtement différent. Les données ont été analysées après acquisition avec le logiciel approprié à l’aide d’un masque (A) à 60% (B) 80% (C) 100% pendant 5 jours (120 h). La normalisation de la confluence des points temporels de 48 h à 120 h jusqu’au premier point temporel (24 h) est indiquée dans (D, E, F). Les données ont été obtenues à partir de trois expériences indépendantes. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM. n = 3 * p<0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composé de revêtement | Concentration initiale | Concentration finale |
| HU-Fibronectine | 1 mg/mL | 10 μg/cm2 |
| Laminine 521 | 100 μg/ml | 20 μg/mL |
| Matrigel | * | 0.111111111 |
| Vitronectine XF | 250 μg/mL | 10 μg/mL |
Tableau 1. Liste des composés de revêtement utilisés pour analyser la confluence. Le nom, la concentration initiale et finale des différents revêtements utilisés sont indiqués. * La concentration initiale de Matrigel est variable, selon le lot.
Fichier supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’utilisation des CSPi pour la modélisation des maladies et le dépistage futur des médicaments, ainsi que leur application possible en médecine de précision, en font une technologie d’une grande pertinence et, pour cette raison, nous pensons qu’il est nécessaire de comprendre clairement les conditions de culture in vitro qui ressemblent mieux à la situation physiologique des cellules souches embryonnaires. Dans ce contexte, nous avons testé différents revêtements ECM utilisant des CSPi de type sauvage afin de comprendre les conditions qui permettent aux cellules de rester dans un état sain et indifférencié. En outre, un point critique est la culture des CSPi dans les composants xénogènes des MEF et de Matrigel qui peut expliquer la variabilité expérimentale entre les triplicates et cela entrave la capacité d’effectuer des études mécanistes26.
Dans cette étude, nous avons testé la confluence des CSPi sur des substrats exempts de xénogènes (LN-521, Vitronectine, Hu-Fibronectine) à l’aide d’un cytomètre analyseur d’images à haute teneur. La raison de l’utilisation du système automatisé d’analyse d’images est due au fait que le comptage des cellules, en utilisant la méthode d’exclusion du bleu de trypan, nécessiterait de fabriquer des suspensions de cellules uniques, ce qui n’est pas recommandé lors de la manipulation des CSPi car elles doivent être multipliées dans des grappes cellulaires pour éviter la mort cellulaire. Les données obtenues avec l’analyse d’images à haut contenu nous permettent de suivre la confluence cellulaire sans perturber les cellules car elles sont simplement imagées tous les jours pendant 5 jours. Cette technologie peut être considérée comme la méthode de choix pour caractériser les lignes iPSC et elle peut être incluse pour effectuer des panels de contrôle de la qualité des iPSC humaines. Bien que nous ayons utilisé un progiciel commercial, la méthodologie décrite ici peut être utilisée avec succès au moyen de plates-formes d’analyse d’images équivalentes à contenu élevé / haut débit et de progiciels d’analyse similaires. Les données obtenues montrent que les CSPi ensemencées sur LN-521 présentent une confluence linéaire pendant 5 jours en culture sans fendre les cellules et constituent donc le meilleur substrat sans xénogène testé dans cette étude. L’une des limites de ce protocole est que les résultats obtenus doivent être normalisés au premier point temporel afin de tenir compte des différences de fixation des CSPi à différents substrats. Il est intéressant de noter que les données obtenues sont très probablement dues à une augmentation du taux de fixation des cellules des CSPi au LN-521. En fait, lors de la normalisation des résultats pour le premier point temporel, aucune différence n’est observée entre les différents substrats.
Sur la base des résultats obtenus avec l’étude, il serait intéressant de mieux comprendre la biologie des cellules souches pluripotentes en termes de connaissance des principaux récepteurs de surface cellulaire qui interviennent dans les contacts cellule-ECM et qui peuvent être responsables du maintien de leur capacité d’auto-renouvellement plutôt que de la différenciation spontanée en types cellulaires spécifiques. Il est intéressant de noter que des études montrent que l’élasticité matricielle de la surface de culture a influencé la différenciation vers différents types de cellules, ce qui dépend probablement des interactions cellule-ECM qui ont activé une voie de signalisation cellulaire intracellulaire pertinente pour la différenciation spécifique du type cellulaire27. En outre, Vigilante et al.28 ont exploré la contribution génétique aux changements de comportement des CSPi, en combinant des approches informatiques avec des ensembles de données sur l’expression génique et la biologie cellulaire. Les travaux de Vigilante et al.28 constituent donc une avancée majeure dans la tentative de cartographier la variation génétique à la variation phénotypique. Ces études peuvent mener à l’élaboration de méthodologies normalisées à utiliser pour effectuer des expériences de CSPi à la lumière de leur utilisation future possible dans les cliniques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
L’étude a été financée par des subventions de la Fondazione Bambino Gesù et de Ricerca Corrente (ministère italien de la Santé) à C.C. Nous tenons à remercier le Dr Enrico Bertini (Département de neurosciences, Unité des maladies neuromusculaires et neurodégénératives, Laboratoire de médecine moléculaire, Hôpital de recherche pour enfants Bambino Gesù), le Dr Stefania Petrini (Centre central de microscopie confocale, Laboratoires de recherche, Hôpital de recherche pour enfants Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Département d’onco-hématologie, thérapie génique et cellulaire, Hôpital de recherche pour enfants Bambino Gesù) et Roberta Ferretti (Département d’onco-hématologie, thérapie génique et cellulaire, Hôpital de recherche pour enfants Bambino Gesù) pour des discussions scientifiques et une aide technique. Maria Vinci est récipiendaire d’une bourse « Children with Cancer UK ».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
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