Summary
Målet med protokollet är att jämföra olika extracellulära matrisbeläggningsförhållanden (ECM) för att bedöma hur differentiell beläggning påverkar tillväxthastigheten för inducerade pluripotenta stamceller (iPSC). I synnerhet strävar vi efter att skapa förutsättningar för att uppnå optimal tillväxt av iPSC-kulturer.
Abstract
Denna studie fokuserar på att förstå hur växande iPSC på olika ECM-beläggningssubstrat kan påverka cellsammanflödet. Ett protokoll för att bedöma iPSC-sammanflöde i realtid har upprättats utan att celler behöver räknas i encellssuspension för att undvika tillväxtstörningar. Ett bildanalyssystem med hög innehåll användes för att bedöma iPCS-sammanflödet på 4 olika ECM över tid på ett automatiserat sätt. Olika analysinställningar användes för att bedöma cellsammanflödet av vidhäftande iPSC och endast en liten skillnad (vid 24 och 48 timmar med laminin) har observerats om en 60, 80 eller 100% mask applicerades. Vi visar också att laminin leder till det bästa sammanflödet jämfört med Matrigel, vitronektin och fibronektin.
Introduction
Inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) erhålls från somatiska celler och kan differentieras till olika celltyper. De används ofta som ett system för att modellera sjukdomspatogenes eller utföra läkemedelsscreening och erbjuder också potential att användas i samband med personlig medicin. Eftersom iPSC har stor potential är det viktigt att fullt ut karakterisera dem för användning som ett pålitligt modellsystem. Vi har tidigare visat vikten av att odla iPSC i en hypoxisk miljö eftersom dessa celler är beroende av glykolys och en aerob miljö kan orsaka redoxobalans1. iPSC är också sårbara för andra odlingsförhållanden, särskilt den extracellulära miljön. Optimering av odlingsförhållanden är en nyckelfråga för att hålla dem friska och spridande. En hälsosam iPSC-odling kommer att leda till friska differentierade celler som i allmänhet är slutpunkten för modellen som används för att förstå molekylära, cellulära och funktionella egenskaper hos specifika mänskliga störningar eller cellulära processer.
I denna studie har ett enkelt protokoll använts för att testa sammanflödet av iPSC med olika beläggningsförhållanden i separata brunnar. iPSC kräver ett matarskikt av murina embryonala fibroblaster (MEF) för att fästa ordentligt, men samexistensen mellan iPSC och MEF gör det svårt att utföra analyser som RNA eller proteinextraktion eftersom två populationer av celler är närvarande. För att undvika matarskiktet har olika proteiner som tillhör den extracellulära matrisen (ECM) använts för att återskapa den naturliga cellnischen och för att ha matarfri iPSC-kultur. I synnerhet är Matrigel ett solubiliserat källarmembranpreparat extraherat från Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mussarkom, som berikas i extracellulära matrisproteiner (dvs laminin, kollagen IV, heparansulfatproteoglykaner, entaktin / nidogen och tillväxtfaktorer)2,3. De andra använda beläggningsförhållandena är istället renade proteiner med känd relevans för att bygga ECM: laminin-521 är känt för att utsöndras av humana pluripotenta stamceller (hPSC) i embryots inre cellmassa och det är en av de vanligaste lamininerna i kroppen efter födseln 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronektin är en xenofri cellodlingsmatris som är känd för att stödja tillväxt och differentiering av hPSC 12,13,14,15,16; fibronektin är ett ECM-protein som är viktigt för ryggradsdjurens utveckling och bindning och underhåll av embryonala stamceller i ett pluripotent tillstånd 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Eftersom olika beläggningsförhållanden är tillgängliga jämför vi dem när det gäller deras effekt på iPSC: s sammanflöde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beläggning 96 brunnsplattor
OBS: Olika beläggningar testades i samma platta men separata brunnar (se Tilläggsfil).
- Späd matrigeln 1:100 i DMEM. Tillsätt 100 μl per brunn till de 96 brunnsplattorna och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur. Efter detta, ta bort lösningen och tvätta brunnarna med 100 μL DMEM två gånger.
- Späd laminin (20 μg/ml, LN-521) i PBS (med kalcium och magnesium). Tillsätt 100 μl till brunnen och inkubera vid 4 °C över natten. Följande dag utför två tvättar med DMEM innan du sår cellerna.
- Späd vitronektin (10 μg/ml) i utspädningsbuffert. Tillsätt 100 μl per brunn till 96-brunnsplattan och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur. Tvätta brunnarna med PBS (utan kalcium och magnesium) innan du pläterar cellerna.
- Späd HU-Fibronectin (30 μg/ml) i ddH2O. Tillsätt 100 μl till brunnarna och inkubera vid rumstemperatur i 45 minuter. Tvätta sedan brunnarna med mediet innan du sår cellerna.
2. Underhåll av iPSC i kulturen
OBS: iPSC köptes kommersiellt. iPSC: erna härleddes från friska humana fibroblaster och omprogrammerades med hjälp av episomal teknik.
- Från frysen -80 °C eller flytande kväve tinar du de kryokonserverade iPSC:erna i ett 37 °C vattenbad. Rengör injektionsflaskan som innehåller cellerna med 70% etanol innan du flyttar den in i det biologiska säkerhetsskåpet.
- Tillsätt cellsuspensionen till 5 ml förvärmda cellodlingsmedier (t.ex. mTeSR1) droppe för droppe med en 1000 μl pipett i ett 15 ml sterilt koniskt rör.
- Centrifugera cellerna vid 304 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort mediet och återsuspendera cellpelleten i 4 ml cellodlingsmedium.
- Platta cellsuspensionen i två brunnar av de 6 brunnsplattorna (105 iPSC per 6-brunns cellodlingsskål), där musembryonala fibroblaster (MEF) har pläterats tidigare. Frö MEF två dagar före plätering av iPSC med en densitet av 2,4 x 104/cm2 i DMEM (innehållande 10% Fetal Bovine Serum, 1% L-glutamin och 1% Penicillin-Streptomycin).
- Efter sådd, komplettera cellmediet med 10 μM ROCK-hämmare Y-27632.
- Odla iPSC: erna på MEF under de första 4-5 veckorna och sedan i matarfritt tillstånd (MEF-fritt tillstånd), med hjälp av en av beläggningen av intresse (se steg 1 och tabell 1) i mTeSR1.
- När iPSC: erna är 70-80% sammanflytande, passera 1: 4 med 0,5 mM EDTA-behandling i 3-5 minuter vid RT. Tillsätt 1 ml 0,5 mM EDTA för en 6-brunnsplatta (eller proportionella mängder för andra typer av plattor). Överför till nya brunnar under matarfria förhållanden och inkubera vid 37 °C, 5 % CO2, 20 %O2.
- Byt media med färsk mTeSR1 varje dag och dela cellerna var 2: e dag.
3. Karakterisering av cellsammanflöde
- Använd 96 brunnsplattor för experimenten.
- Frö 10 000 celler per brunn efter minst 1 månads odling i matarfritt tillstånd för att vara säker på att MEF: erna inte passerades. Använd engångsräkningsglas för att räkna cellerna med det optiska mikroskopet.
- Utför experimenten i tre exemplar. Testa därför varje såddtillstånd i tre brunnar.
- Utför automatiserad bildinsamling från dag 1 efter sådd med hjälp av en cytometer i ljusfältsläge. Utför automatiserad bildinsamling var 24: e timme i 5 dagar. Detaljerad information om de experimentella parametrarna finns i tilläggsfilen.
- Använd automatisk kontrast och automatisk exponering för att bättre visualisera celler.
- Ställ in analysinställningen (se Kompletterande fil) för sammanflödesanalys för att applicera en mask på 60%, 80% och 100% per brunn, för att utvärdera förändringarna i fokus på grund av ljusbrytningen vid brunnarnas kant. Använd de olika maskanalysinställningarna som nämns ovan för att analysera cellsammanflödet vid varje tidpunkt.
4. Statistiska analyser
- Rapportera kvantitativa resultat som medel ± medelmåttet (SEM).
- För att jämföra övergripande skillnader mellan de olika beläggningsförhållandena, skaffa data med samma prover och utför studentens parade prov t-test. P-värden mindre än 0,05 anses vara statistiskt signifikanta och alla rapporterade p-värden är tvåsidiga.
5. Karakterisering av cytoskelettmikrofilamenten
- Fixera celler med 4% paraformaldehyd (4% PFA) i PBS i 10 min vid RT, följt av två tvättar i PBS (totalt 10 min).
- Tillsätt 100 μl blockerande lösning (sammansatt av 5% BSA, 0,1% Triton i PBS) till varje brunn i 1 h vid RT.
- Ta bort blockeringslösningen och tvätta proverna två gånger med PBS i 10 min.
- Tillsätt 100 μl av falloidinkonjugatarbetslösningen per prov och inkubera i 1 timme vid RT.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS (10 min vid RT).
- Färga kärnor med Hoechst 33342 utspädd 1:10000 i PBS i 10 min vid RT.
- Ta bort Hoechst-lösningen och tvätta cellerna två gånger med PBS i 10 minuter varje gång.
- Tvätta provet medH2Ooch låt torka under en kemisk huva.
- Tillsätt 100 μl monteringsmedium (dvs. PBS:glycerol, 1:1) för att täcka cellerna och bevara fluorescensen hos proverna.
- Observera cell vid Ex / Em 493/517 nm på ett laserscanningskonfokalmikroskop utrustat med en vit ljuslaser (WLL) -källa och en 405 nm diodlaser. Skaffa sekventiella konfokalbilder med hjälp av ett HC PLAPO 40x oljedoppningsmål. Använd samma lasereffekt, stråldelare, filterinställningar, håldiametrar och skanningsläge för alla undersökta prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie undersökte vi iPSCs sammanflöde när de odlas på olika beläggningsförhållanden. Med hjälp av en cytometer kunde vi få lättillgängliga resultat i tre exemplar på 5 dagar. Eftersom iPSC knappast fäster vid plastkärl och en beläggning är nödvändig för att stödja deras spridning, bestämde vi oss för att övervaka sammanflödet av humana iPSC eftersom det är en indikation på cellkulturens hälsa och det kan reflektera över deras differentieringspotential. Efter in vitro-expansion sådde vi iPSC: erna på olika ECM-substrat och analyserade celler genom observation av provbilderna som förvärvats i ljusfält och med falloidinfärgning (används för färgning av aktinfilament, även känd som F-aktin) för att förstå deras vidhäftning till kärlen (Figur 1). Faktum är att falloidinfärgning möjliggör visualisering av graden av cellvidhäftning till kärlets yta och därför till den specifika beläggningen som används för kärlet. Celler som är vidhäftande till beläggningen visade tydligt synliga cytoskelettmikrofilament istället för kollapsade mikrofilament. Observationen av ljusfältet i kombination med falloidinfärgning dokumenterar en god vidhäftningsnivå av iPSC till den belagda ytan.
För att undersöka sammanflödet sådde vi iPSC med Matrigel, LN-521, vitronektin och Hu-fibronektin i tredubblar och utförde experimentet tre gånger. För att undvika ljusbrytningen på grund av brunnens kant tillämpade vi tre typer av analysinställning med en mask på 60, 80 och 100% och observerade att de liknar att plocka cellerna och undvika bakgrunden (Figur 2). De erhållna resultaten visar att iPSC sådda på LN-521 visar en hög cellproliferation på ett linjärt sätt under tiden, jämför den med de andra beläggningarna och att dessa skillnader är statistiskt signifikanta (asterisker i figur 3A-C). Celler sådda på Matrigel, Vitronectin eller Hu-Fibronectin visar en linjär spridningshastighet under de första 96 timmarna men de visar också en ökad lutning av sammanflödeskurvan under de senaste 24 timmarna (oberoende av vilken mask som används, 60%, 80% eller 100%, figur 3A-C). Eftersom den initiala skillnaden vid 24 h för de olika beläggningarna kan bero på skillnader i cellbindning har celltillväxten normaliserats till 24 h för de senare tidpunkterna (från 48 till 120 h) (Figur 3D-F). Graferna som erhållits med hjälp av 60-, 80- och 100% -masken visar att det inte finns några skillnader när det gäller sammanflöde mellan de olika beläggningarna och att skillnaderna som observerats med LN-521 troligen beror på en ökad förmåga hos iPSC: erna att fästa vid denna beläggning när de passeras.
Figur 1. Representativa ljusfältsbilder och falloidinfärgning av iPSCs sådda på olika ECM-beläggningar efter 3 dagar. Ljusfältsbilder som visar att cellerna är friska på beläggningen som används och att de är väl fästa vid kärlen som dokumenteras av falloidinfärgningen som visar tydligt synliga cytoskelettmikrofilament. Skalstreck: 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa ljusfältsbilder som visar tre olika analysinställningar för de masker som används för att utföra sammanflödesanalyser. Mosaik erhållen med en cytometer med hjälp av ljusfältsbilder (16 bilder/brunn från en 96-brunnsplatta). I grönt visar analyssegmenteringen tydligt de olika maskerna som appliceras (60, 80 100%) för att undvika eller inkludera brunnens runda kant. Skalstreck: 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Cellsammanflödesanalys av iPSC sådda på olika belagda kärl. Graf som representerar cellsammanflödet av iPSCs sådda på olika belagda kärl. Data analyserades efter förvärv med lämplig programvara med hjälp av en (A) 60% mask (B) 80% (C) 100% i 5 dagar (120 h). Normalisering av sammanflödet av tidspunkterna 48 h till 120 h till den första tidspunkten (24 h) visas i (D, E, F). Uppgifterna erhölls från tre oberoende experiment. Data representeras som medelvärde ± SEM. n = 3 * p<0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Beläggning förening | Initial koncentration | Slutlig koncentration |
| HU-Fibronectin | 1 mg/ml | 10 μg/cm2 |
| Laminin 521 | 100 μg/ml | 20 μg/ml |
| Matrigel | * | 0.111111111 |
| Vitronektin XF | 250 μg/ml | 10 μg/ml |
Tabell 1. Lista över beläggningsföreningar som används för att analysera sammanflödet. Namn, initial och slutlig koncentration av olika beläggningar som används rapporteras. * Den initiala koncentrationen av Matrigel är variabel, beroende på satsen.
Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av iPSC för sjukdomsmodellering och framtida läkemedelsscreening tillsammans med deras möjliga tillämpning inom precisionsmedicin gör det till en teknik av stor relevans och av denna anledning anser vi att det är nödvändigt att tydligt förstå in vitro-odlingstillståndet som bättre liknar den fysiologiska situationen för embryonala stamceller. I detta sammanhang testade vi olika ECM-beläggningar med iPSC av vild typ för att förstå de förhållanden som gör att cellerna kan förbli i ett hälsosamt och odifferentierat tillstånd. Utöver detta är en kritisk punkt odlingen av iPSC i xenogena komponenter i MEF och Matrigel som kan stå för den experimentella variationen mellan tredubbla och detta hindrar förmågan att utföra mekanistiska studier26.
I denna studie testade vi iPSC: s sammanflöde på xenogenfria substrat (dvs. LN-521, Vitronectin, Hu-Fibronectin) med hjälp av en höginnehålls bildanalysatorcytometer. Anledningen till att använda det automatiserade bildanalyssystemet beror på det faktum att räkning av celler, med hjälp av Trypan blå uteslutningsmetod skulle kräva att man gör encellssuspensioner och detta rekommenderas inte vid manipulering av iPSC eftersom de bör förökas i cellkluster för att undvika celldöd. Data som erhållits med bildanalysen med högt innehåll gör att vi kan följa cellsammanflödet utan störande celler eftersom de helt enkelt avbildas varje dag i 5 dagar. Denna teknik kan betraktas som valmetoden för att karakterisera iPSC-linjer och den kan inkluderas för att utföra kvalitetskontrollpaneler av mänskliga iPSC. Medan vi använde ett kommersiellt programvarupaket kan metoden som beskrivs här framgångsrikt användas med hjälp av motsvarande bildanalysplattformar med högt innehåll / hög genomströmning och liknande analytiska programvarupaket. De erhållna data visar att iPSC: erna sådda på LN-521 presenterar en linjär sammanflöde under 5 dagar i odling utan att dela cellerna och är därför det bästa xenogenfria substratet som testats i denna studie. En begränsning av detta protokoll är att de erhållna resultaten måste normaliseras till den första tidpunkten för att överväga skillnader i iPSC-fastsättning på olika substrat. Intressant nog drivs de erhållna data troligen av en ökad cellbindningshastighet för iPSC till LN-521. Faktum är att när man normaliserar resultaten för första gången observeras ingen skillnad mellan de olika substraten.
Baserat på resultaten från studien skulle det vara intressant att bättre förstå biologin hos pluripotenta stamceller när det gäller att känna till de viktigaste cellytereceptorerna som förmedlar cell-ECM-kontakter och som kan vara ansvariga för upprätthållandet av deras självförnyelseförmåga snarare än spontan differentiering till specifika celltyper. Intressant nog finns det studier som visar att matriselasticiteten hos odlingsytan påverkade differentieringen mot olika celltyper och detta är förmodligen beroende av cell-ECM-interaktionerna som aktiverade någon intracellulär cellsignalväg som är relevant för celltypspecifik differentiering27. Utöver detta undersökte Vigilante et al.28 det genetiska bidraget till förändringar i iPSC-beteende genom att kombinera beräkningsmetoder med genuttryck och cellbiologiska datamängder. Arbetet av Vigilante et al.28 är därför ett stort framsteg i att försöka kartlägga genetisk variation till fenotypisk variation. Dessa studier kan leda till utveckling av standardiserade metoder som ska användas för att utföra iPSCs-experiment mot bakgrund av deras framtida möjliga användning i kliniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Studien stöddes av bidrag från Fondazione Bambino Gesù och Ricerca Corrente (italienska hälsoministeriet) till C.C. Vi vill tacka Dr Enrico Bertini (Institutionen för neurovetenskap, Enheten för neuromuskulära och neurodegenerativa sjukdomar, Laboratoriet för molekylär medicin, Bambino Gesù Children's Research Hospital), Dr Stefania Petrini (Confocal Microscopy Core Facility, Research Laboratories, Bambino Gesù Children's Research Hospital), Giulia Pericoli (Institutionen för onko-hematologi, gen- och cellterapi, Children's Research Hospital Bambino Gesù) och Roberta Ferretti (Institutionen för onko-hematologi, gen- och cellterapi, Children's Research Hospital Bambino Gesù) för vetenskapliga diskussioner och teknisk hjälp. Maria Vinci är mottagare av ett "Children with Cancer UK fellowship".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
