Summary
이 프로토콜의 목표는 다양한 세포외 기질(ECM) 코팅 조건을 비교하여 차등 코팅이 유도만능줄기세포(iPSC)의 성장 속도에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것입니다. 특히, 우리는 iPSC 배양의 최적 성장을 얻기위한 조건을 설정하는 것을 목표로합니다.
Abstract
이 연구는 다양한 ECM 코팅 기판에서 성장하는 iPSC가 세포 합류에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 데 중점을 둡니다. 성장 섭동을 피하기 위해 단일 세포 현탁액의 세포를 계산할 필요 없이 실시간으로 iPSC 합류를 평가하는 프로토콜이 확립되었습니다. 고함량 이미지 분석 시스템을 사용하여 시간이 지남에 따라 4개의 서로 다른 ECM에서 iPCS 합류를 자동화된 방식으로 평가했습니다. 부착성 iPSC의 세포 합류를 평가하기 위해 다양한 분석 설정을 사용했으며 60, 80 또는 100% 마스크가 적용되었는지 여부에 관계없이 약간의 차이(라미닌의 경우 24시간 및 48시간)만 관찰되었습니다. 우리는 또한 라미닌이 Matrigel, vitronectin 및 fibronectin에 비해 가장 좋은 합류로 이어진다는 것을 보여줍니다.
Introduction
유도 만능 줄기 세포 (iPSC)는 체세포에서 얻어지며 다른 세포 유형으로 분화 될 수 있습니다. 그들은 종종 질병 발병 기전을 모델링하거나 약물 스크리닝을 수행하는 시스템으로 사용되며 개인화 된 의학의 맥락에서 사용될 수있는 잠재력을 제공합니다. iPSC는 큰 잠재력을 가지고 있기 때문에 신뢰할 수 있는 모델 시스템으로 사용하기 위해 완전히 특성화하는 것이 중요합니다. 우리는 이전에 저산소 환경에서 iPSC를 성장시키는 것의 중요성을 보여주었습니다.이 세포는 해당 과정에 의존하고 호기성 환경은 산화 환원 불균형을 유발할 수 있습니다1. iPSC는 또한 다른 배양 조건, 특히 세포 외 환경에 취약합니다. 배양 조건의 최적화는 그들을 건강하고 증식시키는 핵심 문제입니다. 건강한 iPSC 배양은 일반적으로 특정 인간 장애 또는 세포 과정의 분자, 세포 및 기능적 특징을 이해하는 데 사용되는 모델의 종말점인 건강한 분화 세포로 이어질 것입니다.
이 연구에서는 간단한 프로토콜을 사용하여 별도의 웰에서 서로 다른 코팅 조건을 사용하여 iPSC의 합류를 테스트했습니다. iPSC가 제대로 부착되기 위해서는 쥐 배아 섬유아세포(MEF)의 영양층이 필요하지만 iPSC와 MEF가 공존하면 두 개의 세포 집단이 존재하기 때문에 RNA 또는 단백질 추출과 같은 분석을 수행하기가 어렵습니다. 피더 층을 피하기 위해 세포 외 기질 (ECM)에 속하는 다양한 단백질을 사용하여 천연 세포 틈새를 재현하고 피더가없는 iPSC 배양을 가졌습니다. 특히, Matrigel은 엥겔브레스-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종에서 추출한 가용화된 기저막 제제로, 세포외 기질 단백질(즉, 라미닌, 콜라겐 IV, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴/니도겐 및 성장 인자)이 풍부합니다2,3. 다른 사용 된 코팅 조건은 대신 ECM을 구축하는 데 관련성이 알려진 정제 된 단백질입니다 : 라미닌 -521은 배아의 내부 세포 덩어리에서 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC)에 의해 분비되는 것으로 알려져 있으며 출생 후 신체에서 가장 흔한 라미닌 중 하나입니다 4,5,6,7,8,9, 10,11; 비트로넥틴은 hPSC 12,13,14,15,16의 성장 및 분화를 지원하는 것으로 알려진 이종 무함유 세포 배양 매트릭스입니다. 피브로넥틴은 척추동물의 발달과 만능 상태의 배아 줄기세포의 부착 및 유지에 중요한 ECM 단백질이다 17,18,19,20,21,22,23,24,25. 다양한 코팅 조건을 사용할 수 있기 때문에 iPSC의 합류에 미치는 영향 측면에서 비교합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 96웰 플레이트 코팅
참고: 동일한 플레이트에서 다른 코팅을 테스트했지만 별도의 웰에서 테스트했습니다( 보충 파일 참조).
- 매트리겔을 DMEM에서 1:100으로 희석한다. 96웰 플레이트에 웰당 100μL를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 용액을 제거하고 100μL의 DMEM으로 웰을 두 번 세척합니다.
- PBS (칼슘 및 마그네슘 포함)에 희석 된 라미닌 (20 μg / mL, LN-521). 웰에 100 μL를 첨가하고 4°C에서 밤새 배양한다. 다음날 세포를 파종하기 전에 DMEM으로 두 번 세척하십시오.
- 희석 완충액에 비트로넥틴(10μg/mL)을 희석합니다. 96웰 플레이트에 웰당 100μL를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양한다. 세포를 도금하기 전에 PBS (칼슘과 마그네슘이없는)로 우물을 씻으십시오.
- HU-피브로넥틴(30μg/mL)을ddH2O에 희석하고 웰에 100μL를 넣고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포를 파종하기 전에 배지로 웰을 씻으십시오.
2. 배양에서 iPSC의 유지 관리
참고: iPSC는 상업적으로 구입했습니다. iPSC는 건강한 인간 섬유아세포에서 파생되었으며 에피솜 기술을 사용하여 재프로그래밍되었습니다.
- -80°C 냉동고 또는 액체 질소로부터, 동결보존된 iPSCs를 37°C 수조에서 해동시킨다. 생물학적 안전 캐비닛으로 옮기기 전에 세포가 들어있는 바이알을 70 % 에탄올로 청소하십시오.
- 15mL 멸균 원뿔형 튜브에서 1000μL 피펫으로 5mL의 사전 예열된 세포 배양 배지(예: mTeSR1)에 세포 현탁액을 한 방울씩 추가합니다.
- 실온(RT)에서 5분 동안 304 x g 의 셀을 원심분리합니다.
- 배지를 제거하고 세포 펠릿을 4mL의 세포 배양 배지에 재현탁합니다.
- 세포 현탁액을 6웰 플레이트(6웰 세포 배양 접시당5 iPSC 10개)의 2개 웰에 플레이팅하고, 여기서 마우스 배아 섬유아세포(MEF)가 이전에 플레이팅되었습니다. DMEM (10 % 태아 소 혈청, 1 % L- 글루타민 및 1 % 페니실린-스트렙토 마이신 함유)에서 2.4 x 104 / cm2 의 밀도로 iPSC를 도금하기 이틀 전에 MEF를 시드합니다.
- 파종 후 세포 배지에 10μM의 ROCK 억제제 Y-27632를 보충합니다.
- 처음 4-5주 동안 MEF에서 iPSC를 성장시킨 다음 mTeSR1에서 관심 있는 코팅 중 하나(1단계 및 표 1 참조)를 사용하여 피더 프리 조건(MEF 프리 조건)에서 성장시킵니다.
- iPSC가 70-80% 합류점일 때 RT에서 3-5분 동안 0.5mM EDTA 처리를 사용하여 1:4 통과합니다. 6웰 플레이트의 경우 0.5mM EDTA 1mL를 추가합니다(또는 다른 유형의 플레이트의 경우 비례 양). 피더가없는 조건에서 새 웰로 옮기고 37 ° C, 5 % CO2, 20 % O2에서 배양합니다.
- 매일 새로운 mTeSR1로 배지를 교체하고 2일마다 세포를 분할합니다.
3. 세포 합류의 특성 분석
- 실험을 위해 96웰 플레이트를 사용하십시오.
- MEF가 계대배양되지 않았는지 확인하기 위해 피더가 없는 상태에서 최소 1개월 배양한 후 웰당 10,000개의 세포를 시드합니다. 일회용 계수 슬라이드를 사용하여 광학 현미경으로 세포를 계수하십시오.
- 실험을 세 번 수행하십시오. 따라서 3 개의 웰에서 각 파종 조건을 테스트하십시오.
- 명시야 모드에서 세포분석기를 사용하여 파종 후 1일째부터 자동 이미지 획득을 수행합니다. 5일 동안 24시간마다 자동 이미지 획득을 수행합니다. 실험 파라미터에 대한 자세한 내용은 보충 파일을 참조하십시오.
- 자동 대비 및 자동 노출을 사용하여 셀을 더 잘 시각화합니다.
- 합류 분석에 대한 분석 설정( 보충 파일 참조)을 웰당 60%, 80% 및 100%의 마스크를 적용하여 웰 경계의 빛 굴절로 인한 초점 변화를 평가합니다. 위에서 언급한 다른 마스크 분석 설정을 사용하여 각 시점에서 세포 합류를 분석합니다.
4. 통계 분석
- 정량적 결과를 평균(SEM)의 표준 오차± 평균으로 보고합니다.
- 서로 다른 코팅 조건의 전반적인 차이를 비교하려면 동일한 표본을 사용하여 데이터를 얻고 스튜던트 쌍 표본 t-검정을 수행합니다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되며 보고된 모든 p-값은 양측입니다.
5. 세포골격 마이크로필라멘트의 특성 분석
- RT에서 10분 동안 PBS 중 4% 파라포름알데히드(4% PFA)로 세포를 고정한 후 PBS에서 2회 세척(총 10분)합니다.
- 100 μL의 블로킹 용액 (PBS 중 5 % BSA, 0.1 % 트리톤으로 구성)을 RT에서 1 시간 동안 각 웰에 첨가하십시오.
- 블로킹 용액을 제거하고 샘플을 PBS로 10분 동안 두 번 세척한다.
- 샘플당 100μL의 팔로이딘-접합체 작업 용액을 추가하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
- PBS로 세포를 두 번 세척합니다 (RT에서 10 분).
- Hoechst 33342로 핵을 염색하고 RT에서 10분 동안 PBS에서 1:10000으로 희석합니다.
- Hoechst 용액을 제거하고 매번 10분 동안 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
- 샘플을 H2O로 세척하고 화학 후드 아래에서 건조시킵니다.
- 100μL의 장착 매체(예: PBS:글리세롤, 1:1)를 추가하여 세포를 덮고 샘플의 형광을 보존합니다.
- 백색광 레이저(WLL) 소스와 405nm 다이오드 레이저가 장착된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 Ex/Em 493/517nm에서 세포를 관찰합니다. HC PLAPO 40x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 순차적 컨포칼 이미지를 획득합니다. 검사된 모든 샘플에 대해 동일한 레이저 출력, 빔 스플리터, 필터 설정, 핀홀 직경 및 스캔 모드를 사용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 연구에서는 다양한 코팅 조건에서 성장할 때 iPSC의 합류를 조사했습니다. 세포 분석기를 사용하여 5 일 만에 3 배로 쉽게 유익한 결과를 얻을 수있었습니다. iPSC는 플라스틱 용기에 거의 부착되지 않고 증식을 지원하기 위해 코팅이 필요하기 때문에 세포 배양의 건강을 나타내고 분화 가능성을 반영할 수 있으므로 인간 iPSC의 합류를 모니터링하기로 결정했습니다. 시험관 내 확장 후, 우리는 iPSC를 다른 ECM 기질에 파종하고 명시야에서 획득한 샘플 이미지를 관찰하고 혈관에 대한 접착력을 이해하기 위해 팔로이딘 염색(F-액틴이라고도 하는 액틴 필라멘트 염색에 사용됨)을 사용하여 세포를 분석했습니다(그림 1). 사실, phalloidin 염색은 용기 표면에 대한 세포 부착 정도와 용기에 사용되는 특정 코팅에 대한 세포 부착 정도를 시각화 할 수있게합니다. 코팅에 부착 된 세포는 붕괴 된 마이크로 필라멘트 대신 명확하게 보이는 세포 골격 마이크로 필라멘트를 보였다. phalloidin 염색과 함께 명시야를 관찰하면 코팅된 표면에 대한 iPSC의 우수한 수준의 접착력이 문서화됩니다.
합류점을 조사하기 위해 iPSC에 Matrigel, LN-521, 비트로넥틴 및 Hu-피브로넥틴을 삼중으로 시딩하고 실험을 세 번 수행했습니다. 우물 가장자리로 인한 빛의 굴절을 피하기 위해 60, 80 및 100 %의 마스크로 세 가지 유형의 분석 설정을 적용하고 세포를 선택하고 배경을 피하는 데 유사하다는 것을 관찰했습니다 (그림 2). 얻은 결과는 LN-521에 파종된 iPSC가 다른 코팅과 비교하여 시간 동안 선형 방식으로 높은 세포 증식 속도를 나타내며 이러한 차이가 통계적으로 유의하다는 것을 보여줍니다( 그림 3A-C의 별표). Matrigel, Vitronectin 또는 Hu-Fibronectin에 파종 된 세포는 처음 96 시간 동안 선형 증식 속도를 보여 주지만 지난 24 시간 동안 합류 곡선의 기울기가 증가한 것을 보여줍니다 (사용 된 마스크와 무관하게 60 %, 80 % 또는 100 %, 그림 3A-C). 상이한 코팅에 대한 24 h에서의 초기 차이는 세포 부착의 차이 일 수 있기 때문에, 세포 성장은 이후 시점 (48 내지 120 h)에 대해 24 h로 표준화되었다 (도 3DF). 60, 80 및 100% 마스크를 사용하여 얻은 그래프는 서로 다른 코팅 간의 합류 측면에서 차이가 없으며 LN-521에서 관찰된 차이는 통과 시 iPSC가 이 코팅에 부착하는 능력이 증가했기 때문일 가능성이 큽니다.
그림 1. 3일 후 다른 ECM 코팅에 시딩된 iPSC의 대표적인 명시야 이미지 및 팔로이딘 염색. 명확하게 보이는 세포골격 마이크로필라멘트를 보여주는 팔로이딘 염색에 의해 문서화된 바와 같이 사용된 코팅에서 세포가 건강하고 혈관에 잘 부착되어 있음을 보여주는 명시야 이미지. 스케일 바: 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 합류 분석을 수행하는 데 사용되는 마스크에 대한 세 가지 다른 분석 설정을 보여주는 대표적인 명시야 이미지. 명시야 이미지를 사용하여 세포 분석기로 얻은 모자이크 (96 웰 플레이트에서 16 이미지 / 웰). 녹색으로 분석 분할은 웰의 둥근 모서리를 피하거나 포함하기 위해 적용된 다른 마스크 (60, 80 100 %)를 명확하게 표시합니다. 스케일 바: 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 다르게 코팅된 용기에 파종된 iPSC의 세포 합류 분석. 다르게 코팅된 용기에 파종된 iPSC의 세포 합류를 나타내는 그래프. 데이터는 5일(120h) 동안 (A) 60% 마스크 (B) 80%(C) 100%를 사용하여 적절한 소프트웨어로 획득 후 분석하였다. 48h 내지 120시간 시점의 합류점을 제1 시점(24시간)까지의 정규화는 (D, E, F)에 나타내었다. 데이터는 3 개의 독립적 인 실험으로부터 얻어졌다. 데이터는 평균± SEM으로 나타내었다. n= 3 * p<0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 코팅 화합물 | 초기 농도 | 최종 농도 |
| HU- 피브로넥틴 | 1 밀리그램 / 밀리람베르트 | 10 μg/센티미터2 |
| 라미닌 521 | 100 μg/밀리람베르트 | 20 μg/밀리람베르트 |
| 마트리겔 | * | 0.111111111 |
| 비트로넥틴 XF | 250 μg/밀리람베르트 | 10 μg/밀리리터 |
표 1. 합류를 분석하는 데 사용되는 코팅 화합물 목록. 사용 된 다양한 코팅의 이름, 초기 및 최종 농도가보고됩니다. * Matrigel의 초기 농도는 배치에 따라 가변적입니다.
보충 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
질병 모델링 및 향후 약물 스크리닝에 iPSC를 사용하고 정밀 의학에 적용 할 수 있기 때문에 iPSC는 관련성이 높은 기술이되며 이러한 이유로 배아 줄기 세포의 생리적 상황과 더 유사한 체외 배양 조건을 명확하게 이해할 필요가 있다고 생각합니다. 이러한 맥락에서 우리는 세포가 건강하고 미분화 상태를 유지할 수 있는 조건을 이해하기 위해 야생형 iPSC를 사용하여 다양한 ECM 코팅을 테스트했습니다. 이 외에도, 임계점은 MEFs 및 Matrigel의 이종 생성 성분에서 iPSC의 배양이며, 이는 삼중 간의 실험적 변동성을 설명 할 수 있으며 이는 기계 론적 연구26을 수행하는 능력을 방해합니다.
이 연구에서는 고함량 이미지 분석기 세포분석기를 사용하여 이종성이 없는 기질(예: LN-521, 비트로넥틴, Hu-Fibronectin)에 대한 iPSC의 합류를 테스트했습니다. 자동 이미지 분석 시스템을 사용하는 이유는 Trypan blue 배제 방법을 사용하여 세포를 계수하려면 단일 세포 현탁액을 만들어야하기 때문이며 iPSC는 세포 사멸을 피하기 위해 세포 클러스터에서 전파되어야하므로 조작 할 때는 권장되지 않습니다. 고 함량 이미지 분석으로 얻은 데이터를 사용하면 5 일 동안 매일 간단히 이미징되므로 세포를 교란하지 않고 세포 합류를 추적 할 수 있습니다. 이 기술은 iPSC 라인을 특성화하기 위한 선택 방법으로 간주될 수 있으며 인간 iPSC의 품질 제어 패널을 수행하는 데 포함될 수 있습니다. 상용 소프트웨어 패키지를 사용했지만 여기에 설명된 방법론은 동등한 고함량/고처리량 이미지 분석 플랫폼 및 유사한 분석 소프트웨어 패키지를 통해 성공적으로 사용할 수 있습니다. 얻은 데이터는 LN-521에 파종 된 iPSC가 세포를 분할하지 않고 배양에서 5 일 동안 선형 합류를 나타내므로이 연구에서 테스트 된 최고의 이종 생성이없는 기질임을 보여줍니다. 이 프로토콜의 한 가지 한계는 상이한 기판에 대한 iPSC 부착의 차이를 고려하기 위해 수득된 결과를 첫 번째 시점으로 정규화할 필요가 있다는 것이다. 흥미롭게도 얻은 데이터는 LN-521에 대한 iPSC의 세포 부착률 증가에 의해 주도될 가능성이 큽니다. 실제로, 첫 번째 시점의 결과를 정규화 할 때, 상이한 기판간에 어떠한 차이도 관찰되지 않는다.
이 연구에서 얻은 결과를 바탕으로, 세포 -ECM 접촉을 매개하고 특정 세포 유형으로의 자발적인 분화보다는 자기 재생 능력의 유지를 담당 할 수있는 주요 세포 표면 수용체를 아는 측면에서 다 능성 줄기 세포의 생물학을 더 잘 이해하는 것은 흥미로울 것입니다. 흥미롭게도 배양 표면의 기질 탄력성이 다른 세포 유형으로의 분화에 영향을 미쳤으며 이는 아마도 세포 유형 특이적 분화와 관련된 일부 세포내 세포 신호 전달 경로를 활성화한 세포-ECM 상호 작용에 의존할 수 있음을 보여주는 연구가 있습니다27. 이 외에도 Vigilante et al.28 은 전산 접근법과 유전자 발현 및 세포 생물학 데이터 세트를 결합하여 iPSC 행동의 변화에 대한 유전 적 기여를 탐구했습니다. 따라서 Vigilante et al.28 의 연구는 유전 적 변이를 표현형 변이에 매핑하려는 시도의 주요 발전입니다. 이러한 연구는 향후 클리닉에서 사용할 수 있는 iPSC 실험을 수행하는 데 사용할 표준화된 방법론의 개발로 이어질 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Fondazione Bambino Gesù와 Ricerca Corrente (이탈리아 보건부)의 C.C. 보조금으로 지원되었습니다. 엔리코 베르티니 박사(신경과학과, 신경근 및 신경퇴행성 질환 부서, 밤비노 제수 어린이 연구 병원 분자 의학 연구실), 스테파니아 페트리니 박사(공초점 현미경 핵심 시설, 연구 실험실, 밤비노 제수 어린이 연구 병원), 줄리아 페리콜리(종양혈액학과, 유전자 및 세포 치료과, 밤비노 제수 어린이 연구 병원) Roberta Ferretti(종양 혈액학, 유전자 및 세포 치료학과, 어린이 연구 병원 밤비노 제수)는 과학적 토론과 기술적 도움을 제공합니다. 마리아 빈치는 "Children with Cancer UK 펠로우십"을 수상했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
