Summary
Des études détaillées sur les stades des moustiques des parasites du paludisme sont essentielles pour concevoir des stratégies efficaces de blocage de la transmission. Ce protocole montre comment mettre en culture efficacement des gamétocytes infectieux, puis nourrir ces gamétocytes avec des moustiques pour générer des stades de moustiques de P. falciparum.
Abstract
Le paludisme reste l’un des problèmes de santé publique les plus importants, causant une morbidité et une mortalité importantes. Le paludisme est une maladie transmise par les moustiques transmise par une piqûre infectieuse du moustique anophèle femelle. La lutte contre le paludisme reposera éventuellement sur une multitude d’approches, notamment des moyens de bloquer la transmission vers, par et depuis les moustiques. Pour étudier les stades des moustiques des parasites du paludisme en laboratoire, nous avons optimisé un protocole de culture de gamétocytes hautement infectieux de Plasmodium falciparum, un stade parasitaire nécessaire à la transmission de l’hôte humain au moustique vecteur. Les gamétocytes de P. falciparum mûrissent à travers cinq étapes morphologiquement distinctes, ce qui prend environ 1 à 2 semaines. La culture de gamétocytes décrite dans ce protocole est terminée en 15 jours et est infectieuse pour les moustiques des jours 15 à 18. Ces protocoles ont été développés pour maintenir un cycle continu de gamétocytes compétents en matière d’infection et pour maintenir un approvisionnement ininterrompu des stades de moustiques du parasite. Ici, nous décrivons la méthodologie de culture de gamétocytes et comment infecter les moustiques avec ces parasites en utilisant des mangeoires à membrane de verre.
Introduction
Le paludisme est causé par les parasites Plasmodium et est transmis à leurs hôtes vertébrés par la piqûre infectieuse de moustiques anophèles femelles. Selon le rapport 2019 de l’Organisation mondiale de la santé (OMS), on estime à 405 000 le nombre de décès, sur un total de 228 millions de cas de paludisme1. La plupart des décès liés au paludisme étaient concentrés dans la région africaine, en particulier chez les enfants de moins de cinq ans. Alors que le taux d’incidence global du paludisme a diminué à l’échelle mondiale à partir de 2010, le déclin a plafonné ces dernières années et des stratégies de lutte supplémentaires sont nécessaires de toute urgence pour éliminer la maladie.
Les stades sanguins asexués cycliques des parasites du paludisme provoquent une pathogenèse de la maladie et un petit sous-ensemble de ceux-ci se différencient en gamétocytes femelles et mâles. Les gamétocytes de Plasmodium falciparum sont uniques par nature car ils prennent de 7 à 10 jours à se développer à travers cinq stades morphologiquement distincts. Les gamétocytes immatures du stade I à IV sont séquestrés dans le parenchyme de la moelle osseuse et restent largement absents de la circulation périphérique2,3,4,5. Les érythrocytes infectés par des gamétocytes matures de stade V sont libérés dans la circulation sanguine et circulent librement pour être pris par les moustiques. Une fois à l’intérieur de l’intestin moyen du moustique, les gamétocytes sont activés, par un changement de température et une exposition à l’environnement de l’intestin moyen, se transforment en gamètes femelles et mâles et commencent le développement des stades de moustique, qui culmine avec les stades infectieux des sporozoïtes dans les glandes salivaires des moustiques6,7.
Depuis que Trager et Jenson8 ont décrit une méthode standardisée de culture de P. falciparum,les études sur les stades sanguins asexués ont considérablement progressé. Cependant, l’absence d’un système de culture fiable pour les stades sexuels a rendu difficile l’étude des gamétocytes de P. falciparum, de la biologie de la transmission et des stades des moustiques. Ces dernières années, plusieurs méthodes ont été publiées qui ont aidé les laboratoires à établir des cultures de gamétocytes9,10,11,12. Ce manuscrit décrit un protocole normalisé et fiable pour la culture des gamétocytes de P. falciparum qui peut représenter une ressource précieuse pour la communauté de recherche sur le paludisme. Cette méthode permet la production robuste de gamétocytes matures et infectieux qui, avec un protocole d’alimentation normalisé des moustiques, se traduit par une infectiosité très fiable des moustiques. Ces méthodes ont été établies pour maintenir un approvisionnement ininterrompu en gamétocytes et en parasites au stade des moustiques. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole complet de culture de gamétocytes (Figure 1), la préparation de mangeoires à membrane de verre et l’infection des moustiques à l’aide de ces mangeoires membranaires (Figure 2), la dissection de l’intestin moyen (Figure 3) et de la glande salivaire des moustiques (Figure 4), et la quantification de l’infection chez les moustiques après la dissection de l’intestin moyen et des glandes salivaires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les prélèvements sanguins décrits ci-dessous ont été approuvés par le Comité d’examen institutionnel de l’Université Johns Hopkins. P. falciparum est cultivé dans des globules biologiques frais dans des conditions stériles dans une installation de niveau de biosécurité 2 (BSL2) et la prudence est utilisée pour manipuler le matériel biologique. Après chaque étape impliquant du sang ou des produits sanguins, chaque plastique ou verrerie est rincée avec 10% d’eau de Javel dans la hotte avant d’être éliminée correctement.
1. Réactifs et préparation
- On a utilisé un isolat de parasite P. falciparum NF54 (voir tableau des matériaux),qui peut produire des gamétocytes infectieux jusqu’à deux mois en culture continue.
REMARQUE: Toutes les lignées de parasites adaptées à la culture ne produisent pas de gamétocytes, et les isolats nf54 à faible passage sont les plus cohérents. - O+ Érythrocytes: Diluer le sang total en ajoutant un volume égal de milieu RPMI 1640 et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à température ambiante dans un rotor oscillant avec désacettelation réglée à 0. Retirez soigneusement le manteau surnageant et bouffant (une bande blanche entre le plasma et les érythrocytes emballés, qui contient la plupart des globules blancs et des plaquettes) et ajoutez un volume égal de RPMI. Répétez l’étape de lavage deux fois et après le lavage final, ajoutez un volume de granulés de RPMI pour obtenir 50% d’hématocrite pour le stockage à 4 ° C.
REMARQUE: Les gamétocytes mûrissent sur une période de deux semaines, ce qui rend essentiel de commencer les cultures avec des érythrocytes frais, généralement des érythrocytes prélevés en une semaine. - O+ Sérum humain: Regrouper au moins 6 unités de sérum ensemble pour minimiser l’effet de la variation normale du sérum de différents individus. Stériliser le sérum humain regroupé à l’aide de flacons filtrants de 0,2 μm. Aliquote en portions de 50 mL ou moins selon les besoins et conserver à -20 °C.
REMARQUE: Les érythrocytes et le sérum doivent provenir d’un groupe sanguin compatible pour les cultures de P. falciparum. - 500x Hypoxanthine (100 mL) solution : Dissoudre 0,5 g d’hypoxanthine dans 100 mL de 1 M NaOH. Filtrer stériliser et faire 5-10 mL aliquotes pour le stockage. Les stocks peuvent être stockés jusqu’à un an à -20 °C et jusqu’à 2 semaines à 4 °C.
- Bicarbonate de sodium (facultatif) : Dissoudre 7,5 g de bicarbonate de sodium dans 100 mL d’eau désionisée de qualité de culture tissulaire et filtrer avec un filtre de 0,2 μm.
REMARQUE: Ce protocole utilise la méthode du pot à bougie pour fournir des conditions microaérophiles pour la culture in vitro de P. falciparum et ne nécessite pas de bicarbonate de sodium. Cependant, si les parasites sont cultivés à l’aide d’un mélange de gaz antipaludique (5% O2,5% CO2 et 90% N2),il est important de compléter les milieux de culture avec 0,2% de bicarbonate de sodium. - Milieu complet : Pour préparer 500 mL de milieu complet, ajouter 1 mL de solution d’hypoxanthine et 50 mL de sérum humain regroupé à 500 mL de RPMI 1640. Ajouter 15 mL de bicarbonate de sodium à 7,5 % si vous utilisez un mélange de gaz antipaludique. Conservez les supports complets à 4 °C et jetez-les si la couleur des supports complets passe de l’orange au rose. Pour éviter le gaspillage, fabriquez suffisamment de supports complets à utiliser dans les trois jours.
- Milieux d’exflagellation (facultatif) : Faire des milieux d’exflagellation ou d’ookinete en dissolvant 200 mg deNaHCO3,5 mg d’hypoxanthine et 100 μL d’acide xanthurénique (à partir de 100 mM de stock dans l’eau) à 100 mL de milieu incomplet (RPMI 1640 avec glutamine et HEPES).
REMARQUE: L’exflagellation est le processus de formation de gamètes mâles à l’intérieur de l’intestin moyen du moustique anophèle femelle quelques minutes après qu’il a pris un repas de sang infecté par des gamétocytes. Les gamétocytes mâles de Plasmodium donnent naissance à 8 gamètes mâles après un événement d’exflagellation. In vitro, ce processus se produit spontanément lorsque la température de culture est abaissée à la température ambiante (RT) et peut être observé dans des gamétocytes matures en culture. - N-acétylglucosamine (facultatif) : Conserver une solution mère de N-acétylglucosamine de 500 mM dans de l’eau ou un milieu incomplet, aliquote et conserver à -20 °C.
- Solutions de NaCl : Dissoudre 0,9 g, 1,6 g et 12 g de NaCl dans 100 mL d’eau désionisée de qualité culture tissulaire pour faire des solutions de NaCl à 0,9 %, 1,6 % et 12 %. Filtrer stériliser avec un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C.
2. Culture du stade asexué de P. falciparum
- Pour commencer la culture parasitaire, retirez un flacon congelé à faible passage de P. falciparum NF54 du réservoir d’azote liquide et décongelez rapidement au bain-marie à 37 ° C.
- Transférer le contenu (~1 mL) dans un tube de centrifugeuse stérile de 50 mL et ajouter goutte à goutte 0,2 volume de NaCl pré-averti à 12%, tout en secouant doucement le tube pour assurer un mélange uniforme. Incuber pendant 5 min à TA avec des secousses douces intermittentes.
- Ajouter 9 volumes de NaCl à 1,6 % goutte à goutte, tout en continuant à mélanger doucement. Centrifuger le contenu à 500 x g pendant 5 min à RT, jeter soigneusement le surnageant. Ajouter 9 volumes de NaCl à 0,9% goutte à goutte, tout en veillant à mélanger systématiquement la pastille de parasite. Centrifuger à nouveau à 500 x g pendant 5 min à RT. Retirer le surnageant et remettre en service les parasites dans 5 mL de milieu complet.
- Transférer le contenu dans un puits d’une plaque de culture tissulaire de 6 puits et ajouter 100 à 200 μL de globules rbés emballés.
- Incuber la culture parasitaire à 37 °C dans un pot à bougie ou dans une chambre d’incubateur modulaire purgée avec un mélange spécial de gaz de 5% O2,5% CO2 et 90% N2.
- Remplacez le milieu tous les jours et surveillez la croissance en faisant un frottis sanguin mince en prélissant quelques microlitres de la couche de globules rouges décantée après que le surnageant de culture a été aspiré lors d’un changement régulier du milieu.
- Utilisez une pipette Pasteur en verre stérile pour dessiner, puis tapotez au centre de la lame de verre pour transférer une goutte de culture sur la lame. Placez une autre glissière de verre devant la goutte et tirez-la vers l’arrière pour entrer en contact avec les globules rouges, en la poussant rapidement vers l’avant en un seul mouvement pour faire un mince frottis de monocouche de globules rouges.
- Placez la glissière horizontalement sur un séchoir et laissez-la sécher à l’air. Fixez le frottis sanguin en déposant du méthanol absolu sur le frottis. Laissez le frottis fixe sécher complètement, puis versez soigneusement 10% de tache de Geimsa fraîchement diluée dans de l’eau, jusqu’à ce que le frottis sanguin soit complètement recouvert. Laissez les cellules se tacher pendant environ 15 min.
- Lavez l’excès de tache en rinçant la glissière sous l’eau du robinet propre et laissez les lames sécher en position verticale.
- Déterminer la parasitémie en observant un frottis sanguin mince sur un microscope à l’aide de l’objectif d’immersion dans l’huile 100x. Comptez le nombre d’érythrocytes infectés parmi un total d’au moins 500 globules complets pour déterminer le pourcentage de parasitémie.
3. Culture de gamétocytes de P. falciparum
REMARQUE: Les cultures de gamétocytes prennent deux semaines pour produire des gamétocytes matures infectieux pour les moustiques. Les étapes de la culture de gamétocytes sont décrites à la figure 1. Les isolats de P. falciparum perdent généralement la capacité de produire des gamétocytes après une culture in vitro à long terme13. Pour assurer la qualité des gamétocytes, la culture doit être initiée à partir d’une culture nourricière à faible passage, âgée de moins de 2 mois depuis la décongélation. Préchauffer le média à 37 °C et effectuer toutes les procédures sur un chauffe-glissière réglé à 38 °C. Assurez-vous que les cultures de gamétocytes ne sont pas hors de l’incubateur pendant une période prolongée afin de minimiser les fluctuations de température.
- Ensemencez la culture de gamétocytes (jour 0) en utilisant une culture nourricière mixte au stade asexué à 0,3-1% de parasitémie à 4% d’hématocrite.
- Pour mettre en place une culture de gamétocytes à six puits, centrifuger 5 mL de culture nourricière à 500 x g pendant 5 min à RT. Jeter le surnageant et ressuspender la pastille dans 30 mL de milieu complet.
- Ajouter 1,2 mL de globules rouges emballés, mélanger et distribuer 5 mL à chaque puits de la plaque de 6 puits et incuber dans un pot à bougie à 37 °C.
REMARQUE: La culture de gamétocytes décrite ci-dessus est basée sur une culture d’alimentation mixte au stade asexué à 5% de parasitémie. - Changez de média tous les jours pendant 15 à 18 jours, sans ajout de sang frais, en aspirant soigneusement environ 70 à 80% de surnageant de culture pour éviter d’éliminer les cellules sanguines.
- Ajouter 5 mL de milieux frais complets à chaque puits. Lors du changement de média, ajoutez lentement le média à l’aide d’une pipette sérologique contre la paroi du puits pour éviter de perturber la couche de globules bouclés décantée.
REMARQUE: Étant donné qu’il restera 1 à 2 mL du milieu de culture pendant le changement de milieu, le volume total de culture sera compris entre 6 et 7 mL, après le jour 1 de la culture de gamétocytes. Tout en adaptant ce protocole, il est conseillé de faire des frottis sanguins tous les deux jours pour s’assurer que les parasites sont en bonne santé. Faire un frottis sanguin peut souvent épuiser le nombre de cellules en culture. Pour éviter cela, dessinez un très petit volume. - Pour quantifier la gamétocytemie mature, faites un frottis sanguin entre les jours 15-18 et comptez le nombre de gamétocytes matures parmi le nombre total de cellules.
REMARQUE: Les gamétocytes matures peuvent facilement être identifiés avec leur forme classique en croissant avec des extrémités arrondies lisses (Figure 5B). - Comptez au moins 1 000 globulesraux et calculez le pourcentage de globulesraux infectés par des gamétocytes matures.
- Pour quantifier les événements d’exflagellation, prendre 200 μL de culture de gamétocytes et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à RT dans un tube préchauffé. Resuspendez la pastille dans 20 μL de support d’exflagellation et transférez-la sur une lame de verre avec couvercle.
- Après 15 minutes d’incubation à température ambiante, commencez à compter les centres d’exflagellation en mode contraste de phase à l’aide d’un objectif 10x. Comptez les centres d’exflagellation dans au moins quatre champs pour calculer les événements d’exflagellation.
REMARQUE: Une méthodologie détaillée de dosage d’exflagellation a été décrite précédemment par Delves et al10. Plus de 20 événements d’exflagellation par champ sont considérés comme appropriés pour le test d’alimentation membranaire. - Les cultures de gamétocytes ont généralement de faibles niveaux de stades asexués résiduels. Si l’expérience nécessite des gamétocytes purs, traiter la culture avec 50 mM de N-acétylglucosamine.
- Ajouter 0,5 mL de N-acétylglucosamine à partir de 10x solution stock par puits (5 mL) pendant au moins 3 jours tout en changeant de milieu pour éliminer les stades asexués résiduels.
REMARQUE: La N-acétylglucosamine peut également bloquer l’invasion des mérozoïtes sexuellement engagés, le traitement ne doit être initié qu’après le jour 7 de la culture de gamétocytes.
4. Infection par les moustiques à l’aide d’un test d’alimentation membranaire standard (SMFA)
REMARQUE: Les gamétocytes cultivés in vitro peuvent être donnés aux moustiques à l’aide de mangeoires à membrane de verre. La mise en place de l’appareil d’alimentation en sang est illustrée à la figure 2. Comme décrit ci-dessus, maintenez toujours les gamétocytes à 37 °C pour éviter l’activation avant qu’ils ne soient ingérés par les moustiques. Les articles en plastique préwarm, les réactifs et les équipements utilisés avec la culture de gamétocytes jusqu’à 37 °C.
- Affamer les moustiques anophèles femelles de 3 à 7 jours en retirant leur eau sucrée pendant 6,5 h ou pendant la nuit avant de se nourrir par membrane.
- Transférez-les à l’aide d’aspirateurs motorisés ou à bouche dans des gobelets en papier recouverts d’une double couche de tissu à mailles fines. Alternativement, faites tomber les moustiques dans une chambre froide ou un réfrigérateur pour les transférer dans les gobelets en papier.
REMARQUE: Une tasse de taille pinte peut être utilisée pour nourrir jusqu’à 100 moustiques. - Centrifuger le sang lavé à 500 x g pendant 5 min à RT et jeter le surnageant. Ajouter un volume égal de sérum humain fraîchement décongelé pour reconstituer le sang total. Transférer le mélange de sang et de sérum au bain-marie fixé à 37 °C pendant 30 min.
- Transférer la culture de gamétocytes dans un tube en plastique préchauffé de 15 mL et centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 37 °C. Aspirez soigneusement le surnageant de culture et faites un frottis sanguin mince pour déterminer la gamétocytemie mature comme décrit ci-dessus.
- Pour faire l’alimentation sanguine finale, diluer la pastille de gamétocytes à la concentration souhaitée en utilisant du sang total reconstitué. Gardez l’alimentation sanguine à 37 °C jusqu’à ce que les moustiques et les mangeoires en verre soient prêts.
REMARQUE: Des concentrations de gamétocytes matures comprises entre 0,02 et 0,3% fourniront une infectiosité constante des moustiques. Cependant, il est conseillé d’optimiser la gamétocytemie en nourrissant différentes concentrations à différentes tasses de moustiques. - Assurez-vous que les mangeoires à membrane en verre ont deux ouvertures, une ouverture supérieure étroite pour pipeter le sang infecté et une ouverture inférieure pour la fixation de la membrane. Coupez un film de paraffine en carrés, étirez-le à une épaisseur uniforme et collez-le à l’ouverture du chargeur pour créer un compartiment scellé pour l’alimentation en sang.
- Fixez les mangeoires à membrane à un bain-marie circulatoire en connectant des tubes de chaque côté pour permettre le passage de l’eau chaude à travers la gaine autour des mangeoires à membrane.
REMARQUE: Plusieurs mangeoires en verre peuvent être connectées en série pour s’adapter à plusieurs conditions d’alimentation. - Une fois que toutes les mangeoires sont connectées au bain-marie, allumez-le et inspectez les fuites.
- Placez les mangeoires au centre du filet sur les gobelets anti-moustiques avec membrane vers le bas et fixez les mangeoires à l’aide de pinces ou de ruban adhésif. Assurez-vous que les mangeoires à membrane ne sont inclinées d’aucun côté pour permettre une distribution uniforme de l’alimentation sanguine et un contact étroit de l’ensemble de la mangeoire avec le filet sur les tasses, afin de permettre aux moustiques d’accéder de l’intérieur de la tasse.
- Pipette environ 200–1000 μL de sang alimentent les mangeoires à membrane.
REMARQUE: Le volume de l’alimentation sanguine varie en fonction du nombre de moustiques et de la taille du chargeur à membrane. Pour les mangeoires en verre de 14 mm et 50 moustiques, utilisez 200 μL d’alimentation sanguine. - Assurez-vous que le chargement a été effectué correctement et que l’alimentation en sang a été superposée sur le film de paraffine.
- Laissez les moustiques se nourrir pendant environ 30 minutes avec une surveillance intermittente.
REMARQUE: Soufflez doucement les moustiques avec la bouche pour fournir du CO2 qui induira une meilleure alimentation sanguine. - Éliminez les moustiques non allaités en les faisant tomber dans une chambre froide. Inspectez visiblement les moustiques pour le renflement et la rougeur dans l’abdomen comme signe de repas de sang frais. Alternativement, utilisez un aspirateur à commande buccale pour éliminer sélectivement les moustiques non alimentés.
- Jetez les moustiques non nourris, après les avoir trempés dans de l’éthanol à 70% et remettez les moustiques nourris dans la tasse à moustiques.
- Double-cage de tasses anti-moustiques et les transférer dans un incubateur à haut confinement spécifié pour les moustiques infectés par le parasite du paludisme humain P. falciparum.
- Placez des cotons imbibés de saccharose à 10% sur les tasses à moustiques pour leur fournir de la farine de sucre. Remplacez les cotons tous les deux jours, jusqu’à ce que les moustiques soient disséqués.
5. Dissection métentaire de l’intestin et quantification de la charge d’oocyste
REMARQUE: Un schéma de dissection de l’intestin moyen est illustré à la figure 3.
- 7-8 jours après l’alimentation sanguine, transférer les tasses de moustiques à 4 ° C pendant 10 minutes pour abattre les moustiques.
- Transférez les moustiques à disséquer dans une boîte de Petri sur de la glace à l’aide de pinces à pointe fine.
- Faire tremper les moustiques dans de l’éthanol à 70% pendant 1-2 min pour les euthanasier. Ajoutez du PBS à la boîte de Petri pour laver l’éthanol après l’euthanasie de tous les moustiques.
REMARQUE: Avant d’ajouter PBS, assurez-vous que tous les moustiques sont morts. - Montez une lame de verre sur un microscope à dissection et pipette 100 μL de PBS au centre. Transférez soigneusement un moustique à l’aide d’une pince dans le PBS et laissez le reste des moustiques dans la boîte de Pétri sur de la glace.
- À l’aide d’une pince à pointe fine, maintenez le troisième segment de l’abdomen de l’extrémité postérieure du moustique et, avec la deuxième pince, maintenez la jonction entre le thorax et l’abdomen. Tirez doucement l’abdomen jusqu’à ce que l’intestin moyen soit complètement exposé.
- Jetez le reste du tissu anti-moustique et transférez l’intestin moyen sur une lame propre contenant quelques gouttes de PBS.
- Lorsque le nombre souhaité de moustiques a été disséqué, retirez soigneusement le PBS à l’aide d’une pipette et tachez l’intestin moyen avec 0,2% de mercurochrome pendant 2 à 5 minutes.
- Enlevez l’excès de mercurochrome et d’alignement des intestins moyens sur la lame afin qu’ils puissent être facilement visualisés au microscope optique.
- Placez un bordereau de couverture et comptez les oocystes sur chaque intestin moyen sous l’objectif 10x. Les oocystes sont roses et de forme circulaire (Figure 6C).
6. Dissection des glandes salivaires des moustiques et quantification de la charge en sporozoïtes
REMARQUE: Un schéma de dissection des glandes salivaires est montré à la figure 4.
- 14-18 jours après l’alimentation sanguine, placez les tasses à moustiques à 4 ° C pendant 10 min.
REMARQUE: Il est important d’attendre que les moustiques cessent de bouger. - En attendant que les moustiques cessent de bouger, préparez des outils pour la dissection.
- Placez une plaque de verre sur une scène de microscope à dissection. Préparez 2 ensembles d’aiguilles de 25 G sur des seringues de 1 mL et une pipette Pasteur de 9 po et une ampoule en caoutchouc. Placer 70% d’EtOH et de milieu de dissection (HBSS, L-15 ou PBS) dans une plaque à 6 puits.
- Dans la chambre froide, transférer les moustiques anesthésisés dans une plaque de 6 puits contenant 70% d’EtOH. Déplacez doucement les moustiques avec une pince pour vous assurer que tous les moustiques sont trempés, puis transférez les moustiques au milieu de dissection en utilisant une pince pour laver 70% EtOH.
- Déplacez-vous dans la salle de dissection et placez les moustiques sur une scène de microscope à dissection.
- Enlever l’excès de milieu des moustiques, ajouter un nouveau milieu si nécessaire pendant la dissection. Évitez que les moustiques ne se dessèchent, mais trop de liquide rend la dissection plus difficile.
- À l’aide de 2 seringues avec des aiguilles de 25 G, tenez le thorax et la tête des moustiques et tirez doucement la tête vers le haut pour tirer les glandes salivaires du thorax.
- Déconnectez les glandes salivaires de la tête et du thorax avec une aiguille.
- Placez temporairement les glandes salivaires dans une gouttelette séparée de milieu sur la plaque de verre.
- Après avoir disséqué 15 à 20 glandes salivaires, collectez-les dans un tube à faible rétention à l’aide de la pipette Pasteur.
REMARQUE: Une fois que les glandes salivaires pénètrent dans la partie large de la pipette Pasteur, elles collent au verre et il est difficile de les faire sortir. - Glandes salivaires à granulés par spin d’impulsion courte dans une centrifugeuse de table. Retirer le milieu de dissection sans perturber la pastille et ajouter 100 μL de nouveau milieu de dissection.
- Broyer les glandes salivaires avec un petit homogénéisateur pendant 1 min pour obtenir des sporozoïtes.
- Placer 10 μL de milieu de dissection contenant des sporozoïtes sur un hémocytomètre.
REMARQUE: Selon le nombre de glandes salivaires, il peut être nécessaire de diluer la solution de sporozoïte à 1:10 à 1:50 avec un milieu avant de compter. - Comptez le nombre de sporozoïtes dans deux des quatre quadrants et calculez le nombre de sporozoïtes/moustiques :
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous présentons ici les résultats d’une série d’alimentations membranaires utilisant des cultures de gamétocytes P. falciparum NF54 générées à l’aide du protocole ci-dessus (voir (Figure 5). La culture de gamétocytes a été initiée avec environ 0,5% de culture asexuée au stade mixte le jour 0, qui a atteint un pic de parasitémie d’environ 15% au jour 4 et au jour 5. Comme le montre la figure 5A à cette parasitémie élevée, les parasites sont stressés et la culture au stade asexué s’effondre. Cependant, ce stress entraîne concomitamment l’induction de la gamétocytogenèse. Les premiers gamétocytes sont apparus après les jours 6 et 7 et la parasitémie asexuée a lentement diminué mais est restée à un faible niveau. La présence de parasites au stade asexué n’a pas affecté les expériences d’alimentation des moustiques. Cependant, si les gamétocytes doivent être utilisés dans des expériences nécessitant des cultures pures, telles que des tests de sensibilité aux médicaments et des études protéomiques ou transcriptomiques, les stades asexués résiduels peuvent être éliminés par un traitement avec 50 mM de N-acétylglucosamine. La majorité des gamétocytes mûrissent au stade V au jour 15, moment auquel ils deviennent infectieux pour les moustiques et étaient prêts à être nourris. Des images représentatives de frottis sanguins colorés par Giemsa à différents moments après l’initiation de la culture de gamétocytes sont montrées à la figure 5B.
Entre 8 et 10 jours après l’alimentation sanguine, les moustiques ont été disséqués pour déterminer la prévalence et l’intensité de l’infection. La prévalence est le pourcentage de moustiques nourris qui ont des oocystes tandis que l’intensité est le nombre d’oocystes trouvés dans chaque moustique. Les deux sont des indicateurs importants du succès de l’aliment. Les données de 5 aliments indépendants pour moustiques sont présentées à la figure 6. Les aliments ont été choisis pour montrer la variation normale des niveaux d’infectiosité après une alimentation avec 0,3% de gamétocytes matures à partir de la culture au jour 16 de P. falciparum NF54. L’intensité des oocystes fournit des données quantitatives pour déterminer l’infectiosité des gamétocytes par les moustiques et la prévalence montre le pourcentage de moustiques nourris qui ont été infectés. Ces données peuvent être utilisées pour évaluer les agents bloquant la transmission et pour identifier et caractériser les cibles des vaccins et des médicaments bloquant la transmission. Le nombre d’oocystes variait à la fois à l’intérieur et entre les expériences et nécessitait 25 à 50 moustiques par cohorte pour déterminer l’effet de diverses conditions expérimentales.
Les intensités d’oocyste sont considérées comme le point final de la plupart des essais et des stratégies de blocage de la transmission, mais le nombre de sporozoïtes est généralement important pour la biologie des sporozoïtes et pour les études au stade hépatique. Le tableau 1 montre le nombre moyen de sporozoïtes obtenus par moustique à partir de 12 apports sanguins indépendants. Comme le montre le tableau, le nombre moyen de sporozoïtes était constant, cependant, il y a eu une expérience où nous avons obtenu zéro sporozoïte, ce qui représente un échec occasionnel du test.
Figure 1 : Flux de travail de la culture de gamétocytes de P. falciparum et protocole d’alimentation membranaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Configuration de l’alimentation en sang des moustiques. (A) Mangeoire en verre et morceau rectangulaire de film de paraffine (B) Deux mangeoires en verre exposées avant et après fixation de la membrane du parafilm (C) Mangeoire en verre sur le dessus de la tasse anti-moustique et reliée au bain-marie de circulation. (D,E) Pipetage de l’alimentation en sang dans le chargeur en verre (F) Vue du bas du chargeur en verre montrant une distribution homogène de l’alimentation sanguine (G) Plusieurs moustiques se nourrissant à travers la membrane du parafilm. (H) Vue de dessus des tasses à moustiques après l’alimentation, montrant des gouttes de sang excrétées par les moustiques qui se nourrissent au fond de la tasse. Barre d’échelle = 10 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Représentation graphique montrant les étapes de la dissection de l’intestin moyen des moustiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Représentation graphique montrant les étapes de la dissection des glandes salivaires des moustiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Culture de gamétocytes de P. falciparum et visualisation d’oocystes sur l’intestin moyen des moustiques infectés. (A) Cours temporel de la culture de gamétocytes de 15 jours, montrant une forte multiplication des stades asexués jusqu’au pic de la parasitémie dans les 4 premiers jours, suivie de la gamétocytogenèse et de la maturation au fil du temps. (B) Frottis sanguin mince coloré par Geimsa montrant divers stades de la culture de gamétocytes, jour 1 stade asexué précoce, jour 4 pic de parasitémie asexuée, jour 6 culture stressée en raison de la charge parasitaire élevée, jours 9 et 12 gamétocytes précoces et jour 15 montrant des gamétocytes mâles et femelles matures. Morphologiquement, les gamétocytes à un stade précoce étaient impossibles à distinguer des stades asexués, mais le stade II tardif a montré la forme du croissant avec des extrémités pointues et allongées à mesure que le parasite se développait aux stades III et IV. Les gamétocytes matures de stade V, cependant, étaient caractérisés par une forme de croissant classique avec des extrémités arrondies et une visibilité minimale des cellules hôtes14. Barre d’échelle = 10 mm Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Nombre d’oocystes de P. falciparum par moustique de l’intestin moyen. (A) Le graphique montre le nombre d’oocystes au fil des ans, pour chaque expérience, les moustiques ont été nourris avec 0,3% de gamétocytes et les intestins moyens ont été disséqués le jour 8 après l’alimentation sanguine. Chaque point représente le nombre d’oocystes de l’intestin moyen individuel et la ligne horizontale représente la valeur médiane. (B) Le tableau indique le nombre moyen d’oocystes, la prévalence des moustiques infectés et l’étendue de l’infection. (C) Images montrant des oocystes sur l’intestin moyen des moustiques provenant de deux expériences distinctes d’alimentation sanguine à des grossissements différents. Barre d’échelle = 150 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Expérience | Jour de dissection (après l’alimentation sanguine) | Sporozoïte/moustique moyen |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
Tableau 1 : Nombre moyen de sporozoïtes des glandes salivaires par moustique pendant 12 cycles indépendants sur une période de 2 ans. Les moustiques A. stephensi ont été nourris avec 0,3% de gamétocytes de P. falciparum et 15 à 20 moustiques ont été disséqués entre les jours 14 à 17 après l’alimentation sanguine. Le nombre moyen de sporozoïtes par moustique est indiqué.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les méthodes décrites ici ont été utilisées avec succès à l’Institut de recherche sur le paludisme Johns Hopkins depuis plus de10ans15,16,17,18,19,20,21,22. Les gamétocytes produits à l’aide de ce protocole ont été utilisés pour des tests gamétocytocidaires à haut débit22, pour la protéomique15, ainsi que pour des études transcriptomiques23. Cependant, une raison majeure de développer ces méthodes est d’utiliser les gamétocytes matures pour infecter les moustiques pour des études sur les stades des moustiques et les sporozoïtes23,24,25,26. Ce manuscrit décrit un protocole détaillé de génération de gamétocytes matures de P. falciparum et d’infection des moustiques à l’aide de mangeoires à membrane en verre. Ces méthodes sont essentielles pour tout laboratoire travaillant sur les stratégies de blocage de la transmission, les stades sporozoïtes et les stades hépatiques pré-érythrocytaires de P. falciparum.
Ifediba et Vanderberg en 1981 ont décrit la culture à long terme de P. falciparum,en présence de 50 μg/mL d’hypoxanthine qui produisait des gamétocytes matures hautement infectieux27. Depuis lors, il y a eu de nombreuses publications décrivant les méthodes de production de gamétocytes pour différentes applications9,10,11,12. La plupart de ces publications utilisent des conditions induisant la gamétocytogenèse décrites précédemment pour augmenter les rendements. L’utilisation de milieux conditionnés, en stressant la culture par une augmentation soudaine de la parasitémie, une baisse de l’hématocrite pour imiter l’anémie, la lyse des globules rouges et la répression de la phase logarithmique en masse, peuvent être utilisées pour induire la gamétocytogenèse. La méthode décrite ici est simple et éprouvée. Initier la culture de gamétocytes avec 0,3-1% de parasites au stade asexué à 4% d’hématocrite et changer de média tous les jours jusqu’au jour 15-18. Pour obtenir des résultats constants, il est essentiel de commencer la culture de gamétocytes avec des parasites au stade asexué à faible passage, d’utiliser des globules rboc frais (<1 semaine) et de s’assurer que la température de culture ne fluctue pas lors du changement de milieu. Étant donné que le processus de développement des gamétocytes de falciparum se produit séquestré dans des conditions statiques d’espaces extravasculaires dans la moelle osseuse4,5, il est important de ne pas perturber les couches de globules rouges installées tout au long de la période de culture.
Cultiver des gamétocytes de P. falciparum avec cohérence est exigeant, mais les amener à infecter les moustiques présente un autre niveau de complexité. L’alimentation membranaire est soumise à plusieurs variables autres que les gamétocytes, telles que l’âge et la forme physique des moustiques, le microbiote de l’intestin moyen et le comportement alimentaire28,29. Habituellement, les données SMFA montrent un degré élevé de variabilité et nécessitent un grand nombre de moustiques pour identifier les effets de différentes conditions expérimentales11,28. En utilisant la culture à faible passage pour les gamétocytes, des moustiques sains âgés de 3 à 6 jours et un protocole d’alimentation membranaire optimisé peuvent aider à compenser les variations du nombre d’oocystes.
Le protocole décrit ici pour la culture de gamétocytes et l’alimentation membranaire a été optimisé pendant de nombreuses années. Ces méthodes fournissent une description détaillée pour l’obtention de gamétocytes compétents en matière de transmission mature, d’un test d’alimentation membranaire standard, d’une dissection de l’intestin moyen des moustiques et d’une quantification des oocystes, ainsi que d’une dissection des glandes salivaires et d’une quantification des sporozoïtes. Ces protocoles sont cohérents en termes de nombre de gamétocytes nécessaires pour fournir une infectiosité fiable des moustiques et un nombre robuste d’oocystes et de rendements en sporozoïtes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Bloomberg Philanthropies pour son soutien financier au Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Ce travail n’aurait pas été possible sans l’expertise fournie par les installations de base d’insectes et de parasitologie de JHMRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
- World Health Organization.
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E.
- Joice, R., et al. Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow. Science Translational Medicine. 6 (244), 5 (2014).
- Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. American Journal of Hematology. 85 (12), 943 (2010).
- Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland. Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).
- Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. The development of malaria parasites in the mosquito midgut. Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).
- Trager, W., Jenson, J. B.
- Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery. Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).
- Delves, M. J., et al. Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions. Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).
- Habtewold, T., et al. Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity. Malaria Journal. 18 (1), 24 (2019).
- Demanga, C. G., et al. The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor. Parasites and Vectors. 10 (1), 216 (2017).
- Brockelman, C. R. Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum. Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).
- Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 7, (2017).
- Essuman, E., et al. A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs. Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).
- Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent. mBio. 8 (5), 01631 (2017).
- Oakley, M. S., et al. Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes. Scientific Reports. 8, 11568 (2018).
- Saraiva, R. G., et al. Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin. Scientific Reports. 8, 6176 (2018).
- Tao, D., et al. Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).
- Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes. Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).
- Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).
- Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity. PLoS One. 9 (8), 105817 (2014).
- Lindner, S. E., et al. Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites. Nature Communications. 10, 4964 (2019).
- McLean, K. J., et al. Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters. Scientific Reports. 9, 13131 (2019).
- Espinosa, D. A., et al. Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).
- Swearingen, K. E., et al. Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606 (2016).
- Ifediba, T., Vanderberg, J. P. Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes. Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).
- Miura, K., et al. An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines. Malaria Journal. 15, 463 (2016).
- Miura, K., et al. Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays. PLoS One. 8 (3), 57909 (2013).
