Summary
Indagini dettagliate sugli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria sono fondamentali per progettare efficaci strategie di blocco della trasmissione. Questo protocollo dimostra come coltura efficacemente gametociti infettivi e quindi nutrire questi gametociti alle zanzare per generare stadi di zanzara di P. falciparum.
Abstract
La malaria rimane uno dei più importanti problemi di salute pubblica, causando morbilità e mortalità significative. La malaria è una malattia trasmessa dalle zanzare trasmessa attraverso un morso infettivo dalla zanzara femmina Anopheles. Il controllo della malaria alla fine si baserà su una moltitudine di approcci, che includono modi per bloccare la trasmissione da, attraverso e dalle zanzare. Per studiare in laboratorio gli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria, abbiamo ottimizzato un protocollo per la coltura di gametociti di Plasmodium falciparum altamente infettivi, uno stadio parassitario necessario per la trasmissione dall'ospite umano al vettore della zanzara. I gametociti di P. falciparum maturano attraverso cinque fasi morfologicamente distinte, che richiedono circa 1-2 settimane. La coltura dei gametociti descritta in questo protocollo viene completata in 15 giorni e sono infettive per le zanzare dai giorni 15-18. Questi protocolli sono stati sviluppati per mantenere un ciclo continuo di infezione dei gametociti competenti e per mantenere l'apporto ininterrotto degli stadi di zanzara del parassita. Qui, descriviamo la metodologia della coltura dei gametociti e come infettare le zanzare con questi parassiti usando alimentatori a membrana di vetro.
Introduction
La malaria è causata dai parassiti Plasmodium e viene trasmessa ai loro ospiti vertebrati attraverso il morso infettivo delle zanzare Anopheles femminili. Secondo il rapporto 2019 dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), ci sono stati circa 405.000 decessi, su un totale di 228 milioni di casi di malaria1. La maggior parte dei decessi correlati alla malaria sono stati concentrati nella regione africana, specialmente tra i bambini sotto i cinque anni di età. Mentre il tasso di incidenza complessivo della malaria è diminuito a livello globale dal 2010, negli ultimi anni il declino si è stabilizzato e sono urgentemente necessarie ulteriori strategie di controllo per eliminare la malattia.
Gli stadi ciclici del sangue asessuato dei parassiti della malaria causano patogenesi della malattia e un piccolo sottoinsieme di questi si differenzia in gametociti femminili e maschili. I gametociti del Plasmodium falciparum sono unici in natura in quanto impiegano 7-10 giorni per svilupparsi attraverso cinque stadi morfologicamente distinti. I gametociti immaturi dallo stadio I al IV sono sequestrati nel parenchima del midollo osseo e rimangono in gran parte assenti dalla circolazione periferica2,3,4,5. Gli eritrociti infettati da gametociti maturi allo stadio V vengono rilasciati nel flusso sanguigno e circolano liberamente per essere assorbiti dalle zanzare. Una volta all'interno del midgut della zanzara, i gametociti vengono attivati, attraverso un cambiamento di temperatura e l'esposizione all'ambiente midgut, si trasformano in gameti femminili e maschili e iniziano lo sviluppo degli stadi di zanzara, che culmina con gli stadi infettivi degli sporozoiti nelle ghiandole salivari della zanzara6,7.
Da quando Trager e Jenson8 hanno descritto un metodo standardizzato per la coltura di P. falciparum, gli studi sugli stadi del sangue asessuato sono notevolmente progrediti. Tuttavia, la mancanza di un sistema di coltura affidabile per le fasi sessuali ha reso difficile lo studio dei gametociti di P. falciparum, della biologia della trasmissione e degli stadi delle zanzare. Negli ultimi anni sono stati pubblicati diversi metodi che hanno aiutato i laboratori a stabilire colture di gametociti9,10,11,12. Questo manoscritto descrive un protocollo standardizzato e affidabile per la coltura di gametociti di P. falciparum che può rappresentare una risorsa preziosa per la comunità di ricerca sulla malaria. Questo metodo consente la robusta produzione di gametociti maturi e infettivi che, insieme a un protocollo standardizzato di alimentazione delle zanzare, si traduce in un'infettività delle zanzare altamente affidabile. Questi metodi sono stati stabiliti per mantenere la fornitura ininterrotta di gametociti e parassiti dello stadio di zanzara. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo di coltura dei gametociti approfondito (Figura 1), la preparazione di alimentatori a membrana di vetro e l'infezione delle zanzare usando questi alimentatori a membrana (Figura 2), la dissezione del midgut (Figura 3) e la ghiandola salivare delle zanzare (Figura 4) e la quantificazione dell'infezione nella zanzara dopo la dissezione del midgut e della ghiandola salivare.
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Protocol
Le raccolte di sangue descritte di seguito sono state approvate dall'Institutional Review Board della Johns Hopkins University. P. falciparum viene coltivato in globuli rossi freschi in condizioni sterili in un impianto di livello di biosicurezza 2 (BSL2) e si usa cautela per maneggiare materiali biologici. Dopo ogni passaggio che coinvolge sangue o prodotti sanguigni, ogni stoviglie o bicchieri viene risciacquato con candeggina al 10% all'interno del cappuccio prima del corretto smaltimento.
1. Reagenti e preparazione
- È stato utilizzato l'isolato di parassiti P. falciparum NF54 (vedi Tabella dei materiali),che può produrre gametociti infettivi per un massimo di due mesi mentre è in coltura continua.
NOTA: Non tutte le linee di parassiti adattate alla coltura producono gametociti e gli isolati NF54 a basso passaggio sono i più coerenti. - O+ Eritrociti: diluire il sangue intero aggiungendo lo stesso volume di mezzi RPMI 1640 e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente in un rotore di oscillazione con deaccelerazione impostata a 0. Rimuovere con attenzione il mantello surnatante e buffy (una banda bianca tra il plasma e gli eritrociti impacchettati, che contiene la maggior parte dei globuli bianchi e delle piastrine) e aggiungere lo stesso volume di RPMI. Ripetere la fase di lavaggio due volte e dopo il lavaggio finale aggiungere un volume di pellet di RPMI per ottenere il 50% di ematocrito per la conservazione a 4 °C.
NOTA: i gametociti maturano per un periodo di due settimane, il che rende fondamentale iniziare le colture con eritrociti freschi, in genere gli eritrociti disegnati entro una settimana funzionano bene. - O+ Siero umano: raggruppare almeno 6 unità di siero insieme per ridurre al minimo l'effetto della normale variazione del siero da parte di individui diversi. Sterilizzare il siero umano in pool utilizzando palloni di filtrazione da 0,2 μm. Aliquota in porzioni di almeno 50 ml in base al fabbisogno e conservazione a -20 °C.
NOTA: Gli eritrociti e il siero devono essere di un gruppo sanguigno compatibile per le colture di P. falciparum. - 500x Soluzione di ipoxantina (100 mL): sciogliere 0,5 g di ipoxantina in 100 mL di 1 M NaOH. Filtrare sterilizzare e fare aliquote da 5-10 ml per la conservazione. Le scorte possono essere immagazzinate fino a un anno a -20 °C e fino a 2 settimane a 4 °C.
- Bicarbonato di sodio (opzionale): Sciogliere 7,5 g di bicarbonato di sodio in 100 ml di acqua deionizzata per coltura tissutale e sterilizzare con filtro da 0,2 μm.
NOTA: Questo protocollo utilizza il metodo del barattolo di candela per fornire condizioni microaerofile per la coltura in vitro di P. falciparum e non richiede bicarbonato di sodio. Tuttavia, se i parassiti vengono coltivati utilizzando una miscela di gas della malaria (5% O2, 5% CO2 e 90% N 2 ), è importante integrare i mezzi dicolturacon lo 0,2% di bicarbonato di sodio. - Supporto completo: per preparare 500 mL di media completi, aggiungere 1 mL di soluzione di ipoxantina e 50 mL di siero umano in pool a 500 mL di RPMI 1640. Aggiungere 15 ml di bicarbonato di sodio al 7,5% se si utilizza una miscela di gas della malaria. Conservare i supporti completi a 4 °C ed eliminare se il colore del supporto completo cambia da arancione a rosa. Per evitare sprechi, creare abbastanza supporti completi da utilizzare entro tre giorni.
- Mezzi di esflagellazione (opzionale): Effettuare l'esflagellazione o il mezzo ookinete sciogliendo 200 mg di NaHCO3,5 mg di ipoxantina e 100 μL di acido xanthurenico (da 100 mM di stock in acqua) a 100 ml di mezzi incompleti (RPMI 1640 con glutammina e HEPES).
NOTA: L'esflagellazione è il processo di formazione di gameti maschili all'interno dell'intestino medio della zanzara Anopheles femminile pochi minuti dopo che prende farina di sangue infettata da gametociti. I gametociti maschili di Plasmodium danno origine a 8 gameti maschili dopo un evento di esflagellazione. In vitro, questo processo avviene spontaneamente quando la temperatura di coltura viene abbassata a temperatura ambiente (RT) e può essere osservato in gametociti maturi in coltura. - N-acetilglucosamina (opzionale): Produrre 500 mM di soluzione stock di N-acetilglucosamina in acqua o mezzi incompleti, aliquota e conservare a -20 °C.
- Soluzioni di NaCl: Sciogliere 0,9 g, 1,6 g e 12 g di NaCl in 100 ml di acqua deionizzata di grado di coltura tissutale per produrre soluzioni di NaCl allo 0,9%, all'1,6% e al 12%. Filtrare sterilizzare con filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.
2. P. falciparum cultura scenica asessuata
- Per iniziare la coltura del parassita, rimuovere un flaconcino congelato a basso passaggio di P. falciparum NF54, dal serbatoio di azoto liquido e scongelare rapidamente a bagnomaria impostato a 37 °C.
- Trasferire il contenuto (~1 mL) in un tubo centrifugo sterile da 50 mL e aggiungere a goccia 0,2 volumi di NaCl al 12% preriscaldato, agitando delicatamente il tubo per garantire una miscelazione uniforme. Incubare per 5 minuti a RT con agitazione intermittente delicata.
- Aggiungere 9 volumi di NaCl all'1,6% a goccia, continuando la miscelazione delicata. Centrifugare il contenuto a 500 x g per 5 minuti a RT, scartare con cura il surnatante. Aggiungere 9 volumi di NaCl allo 0,9% a goccia, assicurandosi di mescolare costantemente il pellet di parassiti. Centrifugare di nuovo a 500 x g per 5 minuti a RT. Rimuovere il surnatante e risospendare i parassiti in 5 ml di mezzo completo.
- Trasferire il contenuto in un pozzettino di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti e aggiungere 100-200 μL di globuli rossi imballati.
- Incubare la coltura parassitaria a 37 °C in un barattolo di candela o in una camera di incubatore modulare spurgata con una speciale miscela di gas del 5% O2, 5% CO2 e 90% N2.
- Sostituisci i media ogni giorno e monitora la crescita facendo un sottile striscio di sangue attingendo alcuni microlitri dallo strato di RBC stabilizzato dopo che il surnatante di coltura è stato aspirato durante il normale cambio di media.
- Utilizzare una pipetta Pasteur in vetro sterile per disegnare e quindi toccare al centro del vetrino per trasferire una goccia di coltura sulla diapositiva. Posiziona un'altra diapositiva di vetro davanti alla goccia e tirala indietro per contattare i globuli rossi, spingendola rapidamente in avanti con un solo movimento per fare una sottile macchia di monostrato RBC.
- Posizionare la diapositiva orizzontalmente su uno stendino e lasciarla asciugare all'aria. Fissare lo striscio di sangue facendo cadere metanolo assoluto sullo striscio. Lasciare asciugare completamente lo striscio fisso e quindi versare con cura il 10% di macchia di Geimsa appena diluito in acqua, fino a quando lo striscio di sangue è completamente coperto. Lasciare che le cellule si macchino per circa 15 minuti.
- Lavare via la macchia in eccesso risciacquando il vetrino sotto l'acqua del rubinetto pulita e lasciare asciugare i vetrini in posizione verticale.
- Determinare la parassitemia visualizzando lo striscio di sangue sottile su un microscopio utilizzando l'obiettivo di immersione in olio 100x. Contare il numero di eritrociti infetti su un totale di almeno 500 globuli rossi per determinare la percentuale di parassitemia.
3. Coltura di gametociti di P. falciparum
NOTA: le colture di gametociti impiegano due settimane per produrre gametociti maturi infettivi per le zanzare. I passaggi della coltura dei gametociti sono descritti nella Figura 1. Gli isolati di P. falciparum di solito perdono la capacità di produrre gametociti dopo una coltura in vitro a lungo termine13. Per garantire la qualità dei gametociti, la coltura deve essere iniziata dalla coltura di alimentazione a basso passaggio, non più vecchia di 2 mesi dallo scongelamento. Preriscaldare il mezzo a 37 °C ed eseguire tutte le procedure su un set di scaldasalviette a 38 °C. Assicurarsi che le colture di gametociti non siano fuori dall'incubatrice per un periodo prolungato per ridurre al minimo le fluttuazioni di temperatura.
- Seminare la coltura dei gametociti (giorno 0) utilizzando una coltura mista di alimentatore a stadio asessuato allo 0,3-1% di parassitemia al 4% di ematocrito.
- Per impostare una coltura di gametociti a sei pozzi, centrifugare 5 mL di coltura di alimentazione a 500 x g per 5 minuti a RT. Scartare il surnatante e risusciere il pellet in 30 mL di supporto completo.
- Aggiungere 1,2 mL di globuli rossi confezionati, mescolare ed erogare 5 ml in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti e incubare in un barattolo di candele a 37 °C.
NOTA: La coltura di gametociti impostata sopra descritta si basa su una coltura mista di alimentatore a stadio asessuato al 5% di parassitemia. - Cambiare i mezzi ogni giorno per 15-18 giorni, senza l'aggiunta di sangue fresco, aspirando attentamente circa il 70-80% di coltura surnatante per evitare di rimuovere le cellule del sangue.
- Aggiungere 5 ml di supporti freschi e completi a ciascun pozzo. Mentre si cambia il supporto, aggiungere lentamente il supporto utilizzando una pipetta sierologica contro la parete del pozzo per evitare di disturbare lo strato RBC stabilizzato.
NOTA: Poiché 1-2 ml del terreno di coltura saranno lasciati durante il cambio dei media, il volume totale della coltura sarà compreso tra 6-7 ml, dopo il giorno 1 della coltura dei gametociti. Mentre si adatta questo protocollo, è consigliabile fare strisci di sangue ogni giorno alterno per assicurarsi che i parassiti siano sani. Fare uno striscio di sangue può spesso esaurire il numero di cellule in coltura. Per evitare questo, disegna un volume molto piccolo. - Per quantificare la gametocitemia matura, fare striscio di sangue tra i giorni 15-18 e contare il numero di gametociti maturi tra il numero totale di cellule.
NOTA: I gametociti maturi possono essere facilmente identificati con la loro classica forma a mezzaluna con estremità arrotondate lisce (Figura 5B). - Contare un minimo di 1.000 globuli rossi e calcolare la percentuale di globuli rossi infettati da gametociti maturi.
- Per quantificare gli eventi di esflagellazione, prendere 200 μL di coltura di gametociti e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a RT in un tubo preriscaldato. Risuscimere il pellet in 20 μL di mezzo di esflagellazione e trasferirlo in un vetrino con coperchio.
- Dopo 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente, iniziare a contare i centri di esflagellazione in modalità di contrasto di fase utilizzando l'obiettivo 10x. Contare i centri di esflagellazione in almeno quattro campi per calcolare gli eventi di esflagellazione.
NOTA: Una metodologia dettagliata del test di esflagellazione è stata descritta in precedenza da Delves et al10. Più di 20 eventi di esflagellazione per campo sono considerati adatti per il test di alimentazione a membrana. - Le colture di gametociti hanno tipicamente bassi livelli di stadi asessuati residui. Se l'esperimento richiede gametociti puri, trattare la coltura con 50 mM di N-acetilglucosamina.
- Aggiungere 0,5 mL di N-acetilglucosamina da 10x soluzione stock per pozzetti (5 mL) per un minimo di 3 giorni mentre si cambia il mezzo per eliminare gli stadi asessuali residui.
NOTA: N-acetilglucosamina può bloccare l'invasione di merozoiti sessualmente impegnati troppo, il trattamento deve essere iniziato solo dopo il giorno 7 di coltura dei gametociti.
4. Infezione da zanzare utilizzando il test standard di alimentazione a membrana (SMFA)
NOTA: i gametociti coltivati in vitro possono essere somministrati alle zanzare utilizzando alimentatori a membrana di vetro. La configurazione dell'apparato di alimentazione del sangue è illustrata nella Figura 2. Come descritto sopra, mantenere sempre i gametociti a 37 °C per evitare l'attivazione prima che vengano ingeriti dalle zanzare. Materie plastiche prebelliche, reagenti e attrezzature utilizzate con la coltura di gametociti a 37 °C.
- Affama le zanzare Anopheles femmina di 3-7 giorni rimuovendo la loro acqua zuccherata per 6,5 ore o durante la notte prima dell'alimentazione a membrana.
- Trasferirli utilizzando aspiratori motorizzati o a bocca in bicchieri di carta ricoperti da doppio strato di tessuto a maglie fini. In alternativa, abbattere le zanzare in una cella frigorifera o in frigorifero per trasferirle nei bicchieri di carta.
NOTA: la tazza delle dimensioni di una pinta può essere utilizzata per nutrire fino a 100 zanzare. - Centrifuga lavato il sangue a 500 x g per 5 minuti a RT e scartare il surnatante. Aggiungere un volume uguale di siero umano appena scongelato per ricostituire il sangue intero. Trasferire la miscela di sangue e siero a bagnomaria impostato a 37 °C per 30 minuti.
- Trasferire la coltura dei gametociti in tubo di plastica preriscaldato da 15 mL e centrifugare a 600 x g per 5 minuti a 37 °C. Aspirare accuratamente il surnatante di coltura e fare striscio di sangue sottile per determinare la gametocitemia matura come descritto sopra.
- Per fare l'alimentazione finale del sangue, diluire il pellet di gametociti alla concentrazione desiderata usando sangue intero ricostituito. Mantenere l'alimentazione del sangue a 37 °C fino a quando le zanzare e gli alimentatori di vetro sono pronti.
NOTA: concentrazioni di gametociti maturi tra lo 0,02 e lo 0,3% forniranno un'infettività costante delle zanzare. Tuttavia, è consigliabile ottimizzare la gametocitemia alimentando varie concentrazioni a diverse tazze di zanzare. - Assicurarsi che gli alimentatori a membrana di vetro abbiano due aperture, un'apertura superiore stretta per pipettare il sangue infetto e un'apertura inferiore per il fissaggio della membrana. Tagliare un film di paraffina in quadrati, allungare a uno spessore uniforme e attenersi all'apertura dell'alimentatore per creare un compartimento sigillato per l'alimentazione del sangue.
- Collegare gli alimentatori a membrana a un bagno d'acqua circolatorio collegando i tubi su ciascun lato per consentire il passaggio di acqua calda attraverso la camicia attorno agli alimentatori a membrana.
NOTA: diversi alimentatori di vetro possono essere collegati in serie per adattarsi a più condizioni di alimentazione. - Dopo che tutti gli alimentatori sono collegati al bagno d'acqua, accenderlo e ispezionare eventuali perdite.
- Posizionare gli alimentatori al centro della rete su tazze per zanzare con membrana verso il basso e fissare gli alimentatori usando morsetti o nastro. Assicurarsi che gli alimentatori a membrana non siano inclinati su alcun lato per consentire una distribuzione uniforme dell'alimentazione del sangue e uno stretto contatto dell'intero alimentatore con la rete sulle tazze, per consentire alle zanzare l'accesso dall'interno della tazza.
- Pipettare circa 200-1000 μL di sangue in alimentatori a membrana.
NOTA: il volume dell'alimentazione del sangue varierà in base al numero di zanzare e alle dimensioni dell'alimentatore a membrana. Per l'alimentatore di vetro da 14 mm e 50 zanzare utilizzare 200 μL di mangime per sangue. - Assicurarsi che il caricamento sia stato eseguito correttamente e che l'alimentazione del sangue sia stata sovrapposta al film di paraffina.
- Consentire alle zanzare di nutrirsi per circa 30 minuti con un monitoraggio intermittente.
NOTA: soffiare delicatamente le zanzare con la bocca per fornire CO2 che indurrà una migliore alimentazione del sangue. - Rimuovi le zanzare non allettate abbattendole in una stanza fredda. Ispezionare visibilmente le zanzare per rigonfiamento e arrossamento nell'addome come segno di pasto di sangue fresco. In alternativa, utilizzare un aspiratore azionato dalla bocca per rimuovere selettivamente le zanzare non allettate.
- Scartare le zanzare non nutrite, dopo averle immerse nel 70% di etanolo e rimettere le zanzare nutrite nella tazza delle zanzare.
- Tazze per zanzare a doppia gabbia e trasferirle in un incubatore ad alto contenimento specificato per le zanzare infette dal parassita della malaria umana P. falciparum.
- Metti i tamponi di cotone imbevuti di saccarosio al 10% sulle tazze di zanzara per fornire loro farina di zucchero. Sostituisci i tamponi di cotone a giorni alterni, fino a quando le zanzare non vengono sezionate.
5. Dissezione dell'intestino medio della zanzara e quantificazione del carico di oocisti
NOTA: uno schema della dissezione del midgut è mostrato nella Figura 3.
- 7-8 giorni dopo l'alimentazione del sangue, trasferire le tazze di zanzara a 4 ° C per 10 minuti per abbattere le zanzare.
- Trasferire le zanzare da sezionare in una capsula di Petri su ghiaccio usando una pinza a punta fine.
- Immergere le zanzare in etanolo al 70% per 1-2 minuti per eutanasizzare. Aggiungi PBS alla capsula di Petri per lavare via l'etanolo dopo che tutte le zanzare sono state eutanasizzate.
NOTA: Prima di aggiungere PBS assicurati che tutte le zanzare siano morte. - Montare un vetrino sul microscopio di dissezione e una pipetta da 100 μL di PBS al centro. Trasferire con cura una zanzara usando una pinza nel PBS e lasciare il resto delle zanzare nella capsula di Petri sul ghiaccio.
- Usando una pinza a punta fine, tenere il terzo segmento dell'addome dall'estremità posteriore della zanzara e con la seconda pinza tenere la giunzione tra il torace e l'addome. Tirare delicatamente l'addome fino a quando il midgut è completamente esposto.
- Scartare il resto del tessuto di zanzara e trasferire il midgut in un vetrino pulito contenente alcune gocce di PBS.
- Quando il numero desiderato di zanzare è stato sezionato, rimuovere con cura il PBS usando una pipetta e macchiare il midgut con lo 0,2% di mercurocromo per 2-5 minuti.
- Rimuovere l'eccesso di mercurocromo e allineare i midgut sul vetrino in modo che possano essere facilmente visualizzati al microscopio ottico.
- Posizionare una scivolata di copertura e contare le oocisti su ciascun midgut sotto l'obiettivo 10x. Le oocisti si macchiano di rosa e sono di forma circolare (Figura 6C).
6. Dissezione della ghiandola salivare della zanzara e quantificazione del carico di sporozoiti
NOTA: Uno schema della dissezione delle ghiandole salivari è mostrato nella Figura 4.
- 14-18 giorni dopo l'alimentazione del sangue, posizionare le tazze di zanzara a 4 ° C per 10 minuti.
NOTA: è importante attendere che le zanzare smettano di muoversi. - Mentre aspetti che le zanzare smettano di muoversi, prepara gli strumenti per la dissezione.
- Posizionare una lastra di vetro su uno stadio di microscopio di dissezione. Preparare 2 set di aghi da 25 G su siringhe da 1 mL e una pipetta Pasteur da 9" e una lampadina in gomma. Posizionare il 70% di EtOH e il mezzo di dissezione (HBSS, L-15 o PBS) in una piastra a 6 pozzetti.
- Nella cella frigorifera, trasferire le zanzare anestetizzate in una piastra a 6 pozzetti contenente il 70% di EtOH. Spostare delicatamente le zanzare con una pinza per assicurarsi che tutte le zanzare siano inzuppate, quindi trasferire le zanzare nel mezzo di dissezione usando una pinza per lavare via il 70% di EtOH.
- Spostati nella stanza di dissezione e posiziona le zanzare su uno stadio di microscopio di dissezione.
- Rimuovere il mezzo in eccesso dalle zanzare, aggiungere nuovo mezzo se necessario durante la dissezione. Evitare che le zanzare si secchino, ma troppo liquido rende più difficile la dissezione.
- Usando 2 siringhe con aghi da 25 G, tenere il torace e la testa della zanzara e tirare delicatamente la testa verso l'alto per estrarre le ghiandole salivari dal torace.
- Scollegare le ghiandole salivari dalla testa e dal torace con un ago.
- Posizionare temporaneamente le ghiandole salivari in una goccia separata di mezzo sulla lastra di vetro.
- Dopo aver sezionato 15-20 ghiandole salivari, raccoglierle in un tubo a bassa ritenzione usando la pipetta Pasteur.
NOTA: Una volta che le ghiandole salivari entrano nella parte larga della pipetta Pasteur, si attaccheranno al vetro ed è difficile esesaurirle. - Ghiandole salivari a pellet mediante breve rotazione a impulsi in una centrifuga da tavolo. Rimuovere il mezzo di dissezione senza interrompere il pellet e aggiungere 100 μL di nuovo mezzo di dissezione.
- Macinare le ghiandole salivari con un piccolo omogeneizzatore per 1 minuto per ottenere sporozoiti.
- Posizionare 10 μL di mezzo di dissezione contenente sporozoiti su un emocitometro.
NOTA: A seconda del numero di ghiandole salivari, potrebbe essere necessario diluire la soluzione di sporozoite a 1:10 a 1:50 con mezzo prima di contare. - Conta il numero di sporozoiti in due dei quattro quadranti e calcola il numero di sporozoiti / zanzare:
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Representative Results
Qui presentiamo i risultati di una serie di alimentazioni a membrana utilizzando colture di gametociti P. falciparum NF54 generate utilizzando il protocollo sopra (vedi (Figura 5). La coltura dei gametociti è stata iniziata con circa lo 0,5% di coltura asessuata a stadio misto il giorno 0, che è cresciuta fino a un picco di parassitemia di circa il 15% entro il giorno 4 e il giorno 5. Come mostrato nella Figura 5A a questa alta parassitemia, i parassiti sono stressati e la cultura dello stadio asessuato si blocca. Tuttavia, questo stress provoca contemporaneamente l'induzione della gametocitogenesi. I primi gametociti sono comparsi dopo il giorno 6 e il giorno 7 e la parassitemia asessuata è lentamente diminuita ma è rimasta a un livello basso. La presenza di parassiti dello stadio asessuato non ha influenzato gli esperimenti di alimentazione delle zanzare. Tuttavia, se i gametociti devono essere utilizzati in esperimenti che richiedono colture pure, come saggi di sensibilità ai farmaci e studi proteomici o trascrittomici, gli stadi asessuali residui possono essere rimossi mediante trattamento con 50 mM di N-acetilglucosamina. La maggior parte dei gametociti matura allo stadio V entro il giorno 15, momento in cui diventano infettivi per le zanzare ed erano pronti per essere nutriti. Immagini rappresentative di strisci di sangue macchiati di Giemsa in diversi punti temporali dopo l'inizio della coltura di gametociti sono mostrate nella Figura 5B.
Tra 8 e 10 giorni dopo l'alimentazione del sangue, le zanzare sono state sezionate per determinare la prevalenza e l'intensità dell'infezione. La prevalenza è la percentuale di zanzare nutrite che hanno oocisti mentre l'intensità è il numero di oocisti presenti in ogni zanzara. Entrambi sono indicatori importanti del successo del feed. I dati di 5 mangimi indipendenti per zanzare sono mostrati nella Figura 6. I mangimi sono stati scelti per mostrare la normale variazione dei livelli di infettività dopo l'alimentazione con gametociti maturi allo 0,3% dalla coltura del giorno 16 di P. falciparum NF54. L'intensità dell'oocisti fornisce dati quantitativi per determinare l'infettività delle zanzare dei gametociti e la prevalenza mostra la percentuale di zanzare nutrite che si sono infettate. Questi dati possono essere utilizzati per valutare gli agenti bloccanti la trasmissione e per identificare e caratterizzare gli obiettivi per i vaccini e i farmaci che bloccano la trasmissione. Il numero di oocisti variava sia all'interno che tra gli esperimenti e richiedeva 25-50 zanzare per coorte per determinare l'effetto di varie condizioni sperimentali.
Le intensità dell'oocisti sono considerate come punto finale della maggior parte dei saggi e delle strategie di blocco della trasmissione, tuttavia il numero di sporozoiti è solitamente importante per la biologia degli sporozoiti e per gli studi sullo stadio epatico. La tabella 1 mostra il numero medio di sporozoiti ottenuti per zanzara da 12 mangimi di sangue indipendenti. Come mostrato nella tabella, il numero medio di sporozoiti era coerente, tuttavia, c'è stato un esperimento in cui abbiamo ottenuto zero sporozoiti, che rappresentano un fallimento occasionale del test.
Figura 1: Flusso di lavoro della coltura di gametociti di P. falciparum e protocollo di alimentazione a membrana. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Configurazione dell'alimentazione del sangue di zanzara. (A) Alimentatore di vetro e pezzo rettangolare di pellicola di paraffina (B) Due alimentatori di vetro visualizzati prima e dopo l'attacco della membrana del parafilm (C) Alimentatore di vetro sopra la tazza di zanzara e collegato con il bagno d'acqua di circolazione. (D,E) Pipettaggio del sangue nell'alimentatore di vetro (F) Vista inferiore dell'alimentatore di vetro che mostra una distribuzione omogenea dell'alimentazione del sangue (G) Diverse zanzare che si nutrono attraverso la membrana del parafilm. (H) Vista dall'alto delle tazze di zanzara dopo l'alimentazione, che mostra gocce di sangue escrete dalle zanzare che si nutrono sul fondo della tazza. Barra della scala = 10 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentazione grafica che mostra i passaggi della dissezione del midgut della zanzara. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rappresentazione grafica che mostra i passaggi della dissezione della ghiandola salivare della zanzara. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Coltura di gametociti di P. falciparum e visualizzazione dell'oocisti sul midgut di zanzara infetta. (A) Decorso temporale della coltura di gametociti di 15 giorni, che mostra una forte moltiplicazione degli stadi asessuati al picco di parassitemia entro i primi 4 giorni, seguito da gametocitogenesi e maturazione nel tempo. (B) Striscio di sangue sottile macchiato di Geimsa che mostra varie fasi della coltura dei gametociti, il giorno 1 fase asessuale precoce, il giorno 4 picco di parassite asessuale, il giorno 6 cultura stressata a causa dell'alto carico di parassiti, i giorni 9 e 12 i gametociti precoci e il giorno 15 che mostrano gametociti maschi e femmine maturi. Morfologicamente i gametociti allo stadio iniziale erano indistinguibili dagli stadi asessuati, ma lo stadio II tardivo mostrava la forma a mezzaluna con estremità appuntite e allungate mentre il parassita si sviluppava nello stadio III e IV. I gametociti maturi di stadio V, tuttavia, erano caratterizzati dalla classica forma a mezzaluna con estremità arrotondate e visibilità minima della cellula ospite14. Barra della scala = 10 mm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: P. falciparum oocysts conta per zanzara midgut. (A) Il grafico mostra la conta delle oocisti nel corso degli anni, per ogni esperimento, le zanzare sono state alimentate con lo 0,3% di gametociti e le viscere medie sono state sezionate il giorno 8 dopo l'alimentazione del sangue. Ogni punto rappresenta il numero di oocisti dai singoli midgut e la linea orizzontale rappresenta il valore mediano. (B) La tabella mostra la conta media delle oocisti, la prevalenza delle zanzare infette e la gamma di infezioni. (C) Immagini che mostrano oocisti sul midgut di zanzara da due esperimenti separati di alimentazione del sangue a diversi ingrandimenti. Barra della scala = 150 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Rsperimento | Giorno della dissezione (post alimentazione del sangue) | Sporozoite/zanzara media |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
Tabella 1: Numero medio di ghiandole salivari sporozoiti per zanzara per 12 cicli indipendenti in un periodo di 2 anni. Le zanzare A. stephensi sono state alimentate con lo 0,3% di gametociti P. falciparum e 15-20 zanzare sono state sezionate tra i giorni 14-17 dopo l'alimentazione del sangue. Vengono mostrati i conteggi medi di sporozoiti per zanzara.
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Discussion
I metodi qui descritti sono stati utilizzati con successo presso il Johns Hopkins Malaria Research Institute per più di 10 anni15,16,17,18,19,20,21,22. I gametociti prodotti utilizzando questo protocollo sono stati utilizzati per saggi gametocitocidi ad alto rendimento22, per proteomica15, nonché per studi trascrittomici23. Tuttavia, uno dei motivi principali per sviluppare questi metodi è quello di utilizzare i gametociti maturi per infettare le zanzare per studi sugli stadi delle zanzare e sugli sporozoiti23,24,25,26. Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per generare gametociti maturi di P. falciparum e l'infezione delle zanzare usando alimentatori a membrana di vetro. Questi metodi sono fondamentali per qualsiasi laboratorio che lavora su strategie di blocco della trasmissione, stadi di sporozoite e stadi epatici pre-eritrocitici di P. falciparum.
Ifediba e Vanderberg nel 1981 descrissero la coltura a lungo termine di P. falciparum,in presenza di 50 μg/mL di ipoxantina che produceva gametociti maturi altamente infettivi27. Da allora ci sono state numerose pubblicazioni che descrivono i metodi per produrre gametociti per diverse applicazioni9,10,11,12. La maggior parte di queste pubblicazioni utilizza condizioni che inducono la gametocitogenesi precedentemente descritte per aumentare i rendimenti. L'uso di mezzi condizionati, sottolineando la coltura con un improvviso aumento della parassitemia, un calo dell'ematocrito per imitare l'anemia, la lisi dei globuli rossi e la repressione della fase di log per massa, possono essere utilizzati per indurre la gametocitogenesi. Il metodo qui descritto è semplice e testato nel tempo. Iniziare la coltura dei gametociti con lo 0,3-1% di parassitemia in stadio asessuato al 4% di ematocrito e cambiare i mezzi ogni giorno fino al giorno 15-18. Per ottenere risultati coerenti, è fondamentale iniziare la coltura di gametociti con parassiti dello stadio asessuato a basso passaggio, utilizzare globuli rossi freschi (<1 settimana) e assicurarsi che la temperatura di coltura non fluttui durante il cambiamento dei media. Poiché il processo di sviluppo dei gametociti falciparum avviene sequestrato in condizioni statiche di spazi extravascolari nel midollo osseo4,5, è importante non disturbare gli strati RBC depositati durante il periodo di coltura.
Coltivare i gametociti di P. falciparum con coerenza è impegnativo, ma farli infettare le zanzare presenta un altro livello di complessità. L'alimentazione a membrana è soggetta a diverse variabili diverse dai gametociti, come l'età e la forma fisica della zanzara, il microbiota dell'intestino medio e il comportamento alimentare28,29. Di solito i dati SMFA mostrano un alto grado di variabilità e richiedono un gran numero di zanzare per identificare gli effetti di diverse condizioni sperimentali11,28. L'utilizzo di una coltura a basso passaggio per i gametociti, zanzare sane di 3 -6 giorni e un protocollo di alimentazione a membrana ottimizzato possono aiutare con le variazioni nella conta delle oocisti.
Il protocollo qui descritto sia per la coltivazione dei gametociti che per l'alimentazione a membrana, è stato ottimizzato nel corso di molti anni. Questi metodi forniscono una descrizione dettagliata per ottenere gametociti maturi competenti per la trasmissione, test standard di alimentazione a membrana, dissezione del midgut della zanzara e quantificazione dell'oocisti, nonché dissezione della ghiandola salivare e quantificazione dello sporozoite. Questi protocolli sono coerenti in termini di numero di gametociti necessari per fornire un'infettività affidabile delle zanzare e un robusto numero di oocisti e rese di sporozoite.
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Disclosures
Gli Autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Bloomberg Philanthropies per il sostegno finanziario al Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Questo lavoro non sarebbe stato possibile senza l'esperienza fornita dalle strutture di base per insetti e parassitologia JHMRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
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