Summary
マラリア原虫の蚊の段階に関する詳細な調査は、効果的な伝染遮断戦略を設計するために重要です。このプロトコルは、感染性のタテキを効果的に培養し、これらのタテライトを蚊に供給して P.熱帯熱砂の蚊の段階を生成する方法を示しています。
Abstract
マラリアは依然として最も重要な公衆衛生上の問題の1つであり、重大な罹患率と死亡率を引き起こしている。マラリアは、雌の アノフェレス 蚊からの感染性咬傷を介して伝染する蚊媒介性疾患である。マラリア対策は、最終的には蚊との間の感染を遮断する方法を含む多数のアプローチに依存します。マラリア原虫の蚊の段階を実験室で研究するために、ヒト宿主から蚊ベクターへの感染に必要な寄生虫ステージである感染性の高い熱帯 熱マラリア 原虫の宿虫細胞を培養するプロトコルを最適化しました。 P. 熱帯熱透析 細胞は、5つの形態学的に異なるステップを経て成熟し、およそ1〜2週間かかる。このプロトコルに記載されているガテサイト培養は15日で完了し、15〜18日目から蚊に感染する。これらのプロトコルは、感染有能なタテライトの連続的なサイクルを維持し、寄生虫の蚊の段階の途切れない供給を維持するために開発されました。ここでは、食細胞培養の方法論と、ガラス膜フィーダーを用いてこれらの寄生虫に感染する方法について述べる。
Introduction
マラリアは マラリア原 虫寄生虫によって引き起こされ、雌 のアノフェレス 蚊の感染性咬傷を介して脊椎動物の宿主に伝染する。2019年の世界保健機関(WHO)の報告書によると、マラリアの合計2億2,800万例から推定405,000人の死亡がありました。マラリア関連死のほとんどはアフリカ地域、特に5歳未満の小児に集中していた。マラリアの全体的な発生率は2010年から世界的に低下していますが、近年は減少が高まっており、この病気を排除するために追加の制御戦略が緊急に必要とされています。
マラリア原虫の周期性無性血液段階は病因を引き起こし、これらの小さなサブセットは女性と男性の解血細胞に分化する。熱帯熱マラリア原虫のテジカルは、5つの形態学的に異なる段階を経て開発するのに7〜10日かかるため、本質的にユニークです。第1段階からIV期までの未熟な食細胞は骨髄小板に隔離され、末梢循環2、3、4、5にはほとんど欠けている。成熟期Vのゲームサイトに感染した赤血球は、血流中に放出され、蚊によって取り込まれるように自由に循環する。蚊の中に入ると、タレトサイトは、温度の変化と中腸環境への暴露を通じて活性化され、メスとオスの配偶体に変身し、蚊の唾液腺6、7のスポロゾアテの感染段階で最高潮に達する蚊の段階の開発を開始する。
TragerとJenson8はP.熱帯熱化を培養するための標準化された方法を説明したので、無性血液段階に関する研究は大幅に進歩している。しかし、性的段階のための信頼性の高い文化システムの欠如は、P.熱帯熱マラリア類、伝染生物学および蚊の段階を研究することを困難にしている。近年、数種類の方法が発表され、その中で、9、10、11、12の培養を確立する研究所が発表されている。本稿は、マラリア研究コミュニティにとって貴重な資源を表すことができるP.熱帯熱マラリア原虫を培養するための標準化された信頼性の高いプロトコルを記述する。この方法は、標準化された蚊の供給プロトコルと共に、信頼性の高い蚊の感染性をもたらす成熟した、感染性のタメサイトの堅牢な生産を可能にする。これらの方法は、ゲームトサイト、および蚊の段階寄生虫の途切れない供給を維持するために確立された。本稿では、完全な食塩基細胞培養プロトコル(図1)、ガラス膜フィーダーの調製、これらの膜フィーダーを用いた蚊の感染(図2)、蚊の中腸(図3)の解剖および唾液腺の解剖(図4)、中腸および唾液腺切断後の蚊の感染の定量について述べる。
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Protocol
以下に記載の採血はジョンズ・ホプキンス大学の機関審査委員会によって承認されています。 P.熱帯熱砂 は、生体安全レベル2(BSL2)施設で無菌状態で新鮮なRBCで培養され、生体材料を扱う際に注意が必要です。血液または血液製剤を含む各ステップの後、すべてのプラスチック製品またはガラス製品は、適切な処分の前にフード内の10%漂白剤ですすがされます。
1. 試薬および調製
- 寄生虫分離 P.熱帯熱膜NF54( 材料表を参照)を使用し、連続培養中に最大2ヶ月間感染性のタテク細胞を産生することができる。
注:すべての文化適応寄生虫ラインがガテサイトを生成するものではなく、低通路NF54分離株が最も一貫しています。 - O+ 赤血球: 回転速度が 0 に設定されたスイングアウトローターで、室温で 500 x g の RPMI 1640 培地と遠心分離機の等量を加えて全血を希釈します。上清とバフィーコート(白血球と血小板の大部分を含む血漿とパック赤血球の間の白いバンド)を慎重に取り除き、RPMIの等しい量を追加します。洗浄工程を2回繰り返し、最終洗浄後にRPMIのペレット体積を1個加え、4°Cで保存するための50%ヘマトクリットを得る。
注:タメトサイトは2週間にわたって成熟し、新鮮な赤血球で培養を始めることが重要であり、典型的には1週間以内に描かれた赤血球がうまくいきます。 - O+ ヒト血清:異なる個体からの血清中の正常な変動の影響を最小限に抑えるために、少なくとも6単位の血清を一緒にプールする。0.2 μmろ過フラスコを使用して、プールされたヒト血清を殺菌します。必要に応じて50mL以下の部分でアリコートを使用し、-20°Cで保存します。
注:赤血球と血清は 、P.熱帯熱化液化 培養に適合する血液型の血液である必要があります。 - 500xのヒポキサンチン(100 mL)溶液:1M NaOHの100mLに0.5gの低酸素量を溶解する。フィルターは殺菌し、貯蔵のための5-10 mLアリコートを作る。在庫は-20°Cで1年、4°Cで2週間まで保管することができます。
- 重炭酸ナトリウム(任意):脱イオン化、組織培養グレードの水の100 mLに7.5gの重炭酸ナトリウムを溶解し、0.2 μmフィルターでフィルター滅菌します。
注:このプロトコルは、体外培養中のP.熱帯熱砂に微小好気条件を提供するためにキャンドルジャー法を使用し、重炭酸ナトリウムを必要としません。しかし、マラリアガスミックス(5%O2、5%CO2、90%N2)を用いて寄生虫を培養する場合、0.2%の重炭酸ナトリウムで培養培地を補うことが重要です。 - 完全な媒体:完全な媒体の500 mLを準備するために、RPMI 1640の500 mLに50mLのヒポキサンチン溶液および50mLのプールされたヒト血清を加える。マラリアガス混合物を使用する場合は、7.5%重炭酸ナトリウムの15 mLを追加します。4 °Cで完全なメディアを保存し、完全なメディアの色がオレンジからピンクに変わったら捨てます。無駄を避けるために、3日以内に使用できる十分な完全なメディアを作ります。
- エクスフラグリングメディア(オプション):200mg NaHCO3、5mgのヒポキサンチン、100μLのキサンスレイン酸(水中100mMストックから)から不完全な培地(RPMI 1640、グルタミンおよびHEPES)を溶解して、エクスフラベレーションまたはウーキネテ培地を作ります。
注:Exflagellationは、テグサイトに感染した血液食事を取った数分後に、雌のアノフェレス蚊の中腸内で男性のホテ形成のプロセスです。マラリア原虫の男性の食前細胞は、爆発イベントの後に8つの男性配偶体を生み出します。インビトロでは、培養温度が室温(RT)に低下したときにこのプロセスが自発的に起こり、培養された成熟したゲームサイトで観察することができる。 - N-アセチルグルコサミン(任意):水中または不完全な培地中のN-アセチルグルコサミンの500 mMストック溶液を作り、アリコートを-20°Cで保存する。
- NaCl溶液:0.9g、1.6g、12gのNaClを100mLの組織培養グレード脱イオン水に溶解し、0.9%、1.6%、12%NaCl溶液を作ります。フィルターは0.22 μmフィルターで殺菌し、4 °Cで貯ます。
2. P. 熱帯熱酒場 無性ステージ文化
- 寄生虫培養を始めるには 、P.ファルシパーム NF54の低通路凍結バイアルを液体窒素タンクから取り出し、37°Cに設定した水浴で素早く解凍する。
- 50 mLの無菌遠心分離管に内容物(約1mL)を移し、落下体は、混合を確実にするためにチューブを穏やかに振りながら、0.2体積のプリウォーム12%NaClを加えます。断続的な穏やかな揺れでRTで5分間インキュベートします。
- 穏やかな混合を続けながら、1.6%NaClの9巻をドロップワイズで追加します。RTで5分間 500xg の内容物を遠心し、上清を慎重に捨てます。9ボリュームの0.9%NaClドロップワイズを加え、寄生虫ペレットを一貫して混合します。遠心分離機はRTで5分間500 x g で再び、上清を取り除き、寄生虫を5mLの完全な培地に再中断します。
- 6ウェル組織培養プレートの1つのウェルに内容物を移し、100-200 μLのパックされたRbCsを加えます。
- キャンドル瓶内または5%O2、5%CO2および90%N2の特別なガス混合でパージされたモジュラーインキュベーターチャンバーで37°Cでのインキュベート寄生虫培養。
- 毎日培地を交換し、定期的な培地交換中に培養上清が吸引された後、落ち着いたRBC層から数マイクロリットルを引き出して薄い血液スミアを作ることによって成長を監視する。
- 滅菌ガラスパスツールピペットを使用して、ガラススライドの中央をタップして、一滴の培養液をスライドに移します。ドロップの前に別のガラススライドを置き、RBCsに接触するためにそれを引き戻し、すぐにRBC単層の薄い塗りつぶしを作るために1つの動きでそれを前方に押し出します。
- スライドを乾燥ラックの上に水平に置き、空気乾燥させます。絶対メタノールを塗り薬に落として血液の汚れを固定します。固定塗抹標本を完全に乾燥させ、血の塗抹標本が完全に覆われるまで、水で希釈した10%のゲムサ染色を慎重に注ぎます。細胞を約15分間染色します。
- きれいな水道水の下でスライドをすすぎ、スライドが垂直位置で乾燥するようにして、余分な汚れを洗い流します。
- 油浸漬100x目的を用いて顕微鏡で薄い血の塗抹標本を見て寄生虫症を決定する。感染した赤血球の数を少なくとも500 RBCの中で数え、寄生虫の割合を決定します。
3. P. 熱帯熱酒乳酸塩 細胞培養
注:テマトサイトの培養は、蚊に感染する成熟した同血球を作り出すのに2週間かかります。ゲームサイトの文化の手順を 図 1に示します。 P. 熱帯熱透析 液は、通常、長期間のインビトロ培養13の後にガテサイトを産生する能力を失う。食細胞の質を保証するために、培養は解凍以来2ヶ月以上前から低い通路フィーダー培養から開始されるべきである。37°Cに予温メディアを、38°Cに設定したスライドウォーマーですべての手順を実行します。 温度変動を最小限に抑えるために、培養物が長期間インキュベーターから外れていないことを確認してください。
- 4%ヘマトクリットで0.3〜1%の寄生虫症で混合無性ステージフィーダー培養を使用して、食細胞培養(0日目)をシードします。
- 6つの良いガテサイト文化を設定するには、遠心分離5 mLのフィーダー培養500 x g で5分間RTで5分間、上清を捨て、完全な培地の30 mLでペレットを再中断します。
- 1.2 mLのパックされたRBCを加え、混合し、6ウェルプレートの各ウェルに5 mLを分配し、37°Cのキャンドル瓶にインキュベートします。
注:上述の食細胞培養は、5%の寄生虫症で混合無性ステージフィーダー培養に基づいています。 - 培地を毎日15~18日間変更し、新鮮な血液を加えることなく、血液細胞を除去しないように約70〜80%の培養上清を注意深く吸引する。
- 各井戸に5mLの新鮮な完全なメディアを加えます。メディアを変更しながら、ゆっくりと解決されたRBC層を乱さないように井戸の壁に対して血清学的ピペットを使用してメディアを追加します。
注意:培地交換時に1~2mLの培養液が残るため、培養量は、1日目のゲームトサイト培養後に6~7mLの間になります。このプロトコルを適応させながら,寄生虫が健康であることを確認するために、毎日血液の汚れを作ることをお勧めします。血液の汚れを作ることは、多くの場合、培養中の細胞の数を枯渇させることができます.これを避けるには、非常に小さなボリュームを描きます。 - 成熟したゲーム細胞血症を定量化するには、15~18日目の間に血液の汚れを作り、細胞の総数の中で成熟したゲームサイトの数を数えます。
注:成熟したゲームトサイトは、滑らかな丸みを帯びた端を持つ古典的な三日月形で簡単に識別することができます(図5B)。 - 最低 1,000 RBC をカウントし、成熟したゲームサイトに感染した RBC の割合を計算します。
- 爆発事象を定量化するには、200 μLのガメトサイト培養と遠心分離機を500 x g で500 x gで、事前に温めたチューブでRTで5分間服用します。20 μLのエクスフラグリングメディアでペレットを再懸濁し、カバースリップ付きのガラススライドに移します。
- 室温で15分のインキュベーションを行った後、10倍の目的を使用して位相コントラストモードでエクスフラメレーションセンターのカウントを開始します。exflagellation イベントを計算するために、少なくとも 4 つのフィールドにエクスフラベレーションセンターをカウントします。
注:拡張アッセイの詳細な方法論は、Delvesら10によって先に説明されています。1フィールドあたり20以上のエクスフラグイベントは、膜供給アッセイに適していると考えられています。 - テキサイト培養は、通常、残留無性段階の低レベルを有する。実験が純粋なタテライトを必要とする場合は、50 mM N-アセチルグルコサミンで培養を処理します。
- 残留無性段階をクリアするためにメディアを変更しながら、最低3日間、ウェル(5 mL)あたり10xストック溶液からN-アセチルグルコサミンの0.5 mLを追加します。
注:N-アセチルグルコサミンはあまりにも性的に犯したメロゾアイトの侵入をブロックすることができ、治療は、ゲームサイト培養の7日目の後にのみ開始されるべきです。
4. 標準的な膜供給アッセイ(SMFA)を用いた蚊の感染
注:インビトロで成長した食細胞は、ガラス膜フィーダーを使用して蚊に供給することができます。血液供給装置の設定は 図2に示す。前述のように、蚊に摂取する前に活性化を避けるために、常に37°Cでゲームトサイトを維持してください。37 °Cにゲームサイト培養で使用されるプリウォームプラスチック製品、試薬および機器。
- 3-7日齢の雌 のアノフェレス 蚊を飢えさせ、膜給餌前に6.5時間または一晩砂糖水を取り除きます。
- 細かいメッシュ生地の二重層で覆われた紙コップに電動または口操作の吸引器を使用してそれらを転送します。また、冷たい部屋や冷蔵庫で蚊を倒して紙コップに移します。
注:1パイントサイズのカップを使用して、最大100個の蚊を餌にすることができます。 - 遠心分離機は、RTで5分間 500xg で血液を洗浄し、上清を捨てる。全血を再構成するために、解凍したばかりのヒト血清の等量を追加します。37°Cのウォーターバスに血液と血清ミックスを30分間移動します。
- 15 mLプラスチックチューブと遠心分離機を600 x g で37°Cで5分間培養します。 上清培養物を慎重に吸引し、薄い血の塗抹標本を作り、上述した成熟したゲーム細胞血症を決定する。
- 最終的な血液を作るためには、全血を再構成して目的の濃度に食塩藻ペレットを希釈する。蚊とガラスフィーダーの準備ができるまで、血液供給を37°Cに保ちます。
注:成熟したガテトサイト濃度は0.02〜0.3%の間で一貫した蚊の感染性を提供します。しかし、蚊の異なるカップに様々な濃度を供給することによって、ゲームサイト血症を最適化することをお勧めします。 - ガラス膜フィーダーには、感染した血液をピペットする狭い上部開口部と膜付着のための底部の開口部の2つの開口部があることを確認してください。パラフィンフィルムを正方形にカットし、均一な厚さに伸ばし、フィーダーの開口部に貼り付けて、血液供給のための密閉されたコンパートメントを作成します。
- 各側のチューブを接続して循環式水槽に膜フィーダーを取り付け、膜フィーダーの周りのジャケットを通して暖かい水を通過させます。
注:複数の供給条件に対応するために、複数のガラスフィーダーを直列に接続できます。 - すべてのフィーダーが水浴に接続された後、それをオンにして漏れがないか検査します。
- 膜側の下に付いた蚊のカップの網の中央にフィーダーを置き、クランプまたはテープを使用して固定フィーダー。膜フィーダーが任意の側に傾かないようにして、カップの網とフィーダー全体の均等な分布とカップの網との密接な接触を可能にし、カップ内から蚊がアクセスできるようにします。
- 約200~1000μLの血液が膜フィーダーに送り込まれたピペット。
注:血液供給量は、蚊の数と膜フィーダーの大きさによって異なります。14 mmガラスフィーダーと50個の蚊の場合は、200 μLの血液供給を使用します。 - 負荷が適切に行われ、血の供給がパラフィンフィルムに重ねられていたことを確認してください。
- 断続的なモニタリングで約30分間蚊に餌を与えられるようにします。
注:蚊を口で軽く吹き飛ばしてCO2 を提供し、血液の改善を誘発します。 - 冷たい部屋で蚊を倒して取り除きます。新鮮な血液の食事の兆候として、腹部の膨らみや赤みがないか蚊を目に見えて検査します。あるいは、口で操作された吸引器を使用して、未供給の蚊を選択的に除去する。
- 70%エタノールに浸した後、餌を与えられていない蚊を捨て、餌を与えた蚊を蚊のカップに戻します。
- 二重ケージ蚊のカップとヒトマラリア原虫 P.熱帯熱マラリアに感染した蚊のために指定された高封じ込めインキュベーターにそれらを転送します。
- 10%のスクロースに浸した綿パッドを蚊のカップに置き、砂糖の食事を提供します。蚊が解剖されるまで、綿パッドを1日おきに交換してください。
5. モスキート中腸管解剖と卵胞負荷定量
注: midgut 解剖の概略を 図 3に示します。
- 7-8日の血液供給後、蚊のカップを4°Cに移して10分間、蚊を倒します。
- 細かい先端の鉗子を使用して氷の上のペトリ皿に解剖される蚊を移す。
- 蚊を70%エタノールに浸し、1〜2分間安楽死させます。すべての蚊が安楽死させた後、エタノールを洗い流すためにペトリ皿にPBSを追加します。
注:PBSを追加する前に、すべての蚊が死んでいることを確認してください。 - 顕微鏡を解剖する顕微鏡にガラススライドを取り付け、中央にPBSのピペット100 μLを取り付けます。慎重にPBSに鉗子を使用して1つの蚊を転送し、氷の上にペトリ皿に蚊の残りの部分を残します。
- 細かい先端の鉗子を使用して、蚊の後端から腹部の3番目のセグメントを保持し、第二の鉗子が胸郭と腹部の間の接合部を保持する。中腸が完全に露出するまで腹部をそっと引っ張ります。
- 蚊の組織の残りの部分を捨て、PBSの数滴を含むきれいなスライドに中腸を転送します。
- 所望の数の蚊が解剖されたら、ピペットを使用してPBSを慎重に取り除き、0.2%のメルクロクロムで0〜5分間中腸を汚します。
- スライド上の余分なメルクロクロムとラインアップのミドグを取り除き、軽顕微鏡で簡単に視覚化できるようにします。
- カバースリップを置き、10倍の目的の下で各中腸にウーストシットを数えます。オーシストはピンク色に染まり、円形である(図6C)。
6. 蚊の唾液腺解離とスポロゾアイト負荷定量
注: 唾液腺解剖の概略を 図 4に示します。
- 14-18日の血液供給後、蚊のカップを4°Cに10分間置きます。
注:蚊が動かなくなるまで待つことが重要です。 - 蚊が動かなくなるのを待っている間に、解剖のためのツールを準備してください。
- 解剖顕微鏡のステージにガラス板を置きます。1 mLの注射器に25G針の2セットと9 "パスツールピペットとゴム球根を準備します。70%のEtOHおよび解剖媒体(HBSS、L-15またはPBS)を6ウェルプレートに入れる。
- 冷たい部屋では、70%のEtOHを含む6ウェルプレートに麻酔をした蚊を移す。すべての蚊が浸されていることを確認するために鉗子で蚊を穏やかに移動し、鉗子を使用して70%EtOHを洗い流すことによって蚊を解剖媒体に移します。
- 解剖室に移動し、解剖顕微鏡の段階に蚊を置きます。
- 蚊から余分な媒体を取り除き、解剖中に必要に応じて新しい媒体を追加します。蚊が乾燥するのを避けるが、あまりにも多くの液体は解剖をより困難にする。
- 25G針の注射器を2本使用し、蚊の胸郭と頭を持ち、頭をそっと上に引っ張って胸郭から唾液腺を引っ張ります。
- 唾液腺を針で頭と胸から切り離す。
- 一時的に唾液腺をガラス板上の培地の別の液滴に入れる。
- 15-20唾液腺を解剖した後、パスツールピペットを使用して低保持チューブに集めます。
注:唾液腺がパスツールピペットの広い部分に入ると、ガラスにくっついて取り出すのは難しいです。 - テーブルトップ遠心分離機で短パルススピンによるペレット唾液腺。ペレットを破壊することなく解剖媒体を取り除き、100 μLの新しい解剖媒体を追加します。
- 唾液腺を小さなホモジナイザーで1分間粉砕し、スポロゾアイトを得る。
- スポロゾイトを含む解剖媒体を10μLのヘモサイトメーターに置きます。
注:唾液腺の数に応じて、カウントする前に、スポロゾアイト溶液を培地で1:10〜1:50に希釈する必要があります。 - 4つの象限のうちの2つのスポロゾイトの数を数え、sporozoites/蚊の数を計算します。
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Representative Results
ここでは、上記のプロトコルを使用して生成された P.ファルシカルNF54 食塩細胞培養物を用いた一連の膜供給の結果を提示します(図5参照)。テマトサイト培養は0日目に約0.5%の混合無性培養で開始され、4日目と5日目までに約15%のピーク寄生虫症に成長しました。この高寄生症で 図5A に示すように、寄生虫はストレスを受け、無性期の培養がクラッシュする。しかし、このストレスは、ゲーム細胞産生の誘導をもたらすと同時に起きます。初期の食細胞は6日目と7日目の後に現れ、無性寄生虫症はゆっくりと低下したが、低いレベルにとどまった。無性期寄生虫の存在は蚊の摂食実験に影響を与えなかった。しかし、薬物感受性アッセイやプロテオミクスや転写学などの純粋な培養を必要とする実験でゲームサイトを使用する場合、残留無性ステージは50mM N-アセチルグルコサミンによる治療によって除去することができる。ゲームトサイトの大半は、15日目までにVをステージングするために成熟し、その時点で蚊に感染し、餌を与える準備ができていました。ギムサ染色血中スミアの代表的な画像は、食細胞培養開始後の異なる時点での血中塗抹標本を 図5Bに示す。
血液を摂食してから8~10日の間に、蚊を解剖して感染の有病率と強度を決定した。有病率は、各蚊に見られるウーストの数である強度が一方で、卵胞を有する餌付蚊の割合である。どちらもフィードの成功の重要な指標です。5つの独立した蚊の餌からのデータを 図6に示す。P. 熱帯熱膜 NF54の16日目培養から0.3%成熟した食細胞を供給した後の感染レベルの正常な変動を示すために飼料が選択された。ウーシスト強度は、タメトサイトの蚊感染率を決定するための定量的データを提供し、有病率は感染した餌付蚊の割合を示す。これらのデータは、伝達遮断剤を評価し、感染遮断ワクチンおよび薬物の標的を同定し、特徴付けるために使用することができる。ウーシストの数は実験の内外で変化し、様々な実験条件の効果を決定するためにコホートあたり25〜50蚊が必要であった。
大嚢胞強度は、ほとんどの伝達遮断アッセイおよび戦略の終点と考えられているが、通常、sporozoiteの数は、sporozoite生物学および肝臓段階の研究にとって重要である。 表1 は、12の独立した血液供給から得られた蚊当たりの平均数のスポロゾイトを示す。表に示すように、平均数のスポロゾイトは一貫していましたが、試作では、アッセイの不全を表すゼロスポロゾイトを得た実験が1つありました。
図1:P.ファルシパーラム食細胞培養および膜供給プロトコルのワークフローこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:蚊の血の摂食のセットアップ。(A)ガラスフィーダーとパラフィンフィルムの長方形片(B)パラフィルム膜付着の前後に表示された2つのガラスフィーダー(C)ガラスフィーダーを蚊カップの上に、循環水浴で接続した。(D,E)ガラスフィーダーへの血液供給のピペット(F)血中飼料の均質な分布を示すガラスフィーダーの底面(G)パラフィルム膜を通して供給するいくつかの蚊。(H)餌を与えた後の蚊のカップのトップビューは、カップの底に餌を与える蚊によって排泄された血液の滴を示す。スケールバー= 10 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:蚊中腸解剖のステップを示すグラフィカル表現。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:蚊唾液腺解剖のステップを示すグラフィカル表現。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: P. 熱帯熱膜のテクトサイト培養と感染した蚊の中腸の尿腫の可視化.(A)15日間のガテトサイト培養の時間経過は、最初の4日以内に寄生虫のピークに無性段階の急激な増殖を示し、続いて、時間の経過とともに細胞細胞形成および成熟を続ける。(B)ゲムサ染色薄血性スミアは、食細胞培養の様々な段階を示し、1日目初期無性期、第4日目のピーク無性寄生虫症、6日目は高い寄生虫負荷によるストレス培養、9日目及び12日目の早期食細胞および15日目の成熟した男性および女性の同血球を示す。形態学的初期の食細胞は無性の段階と区別がつかないが、後期IIは尖った端を持つ三日月形を示し、寄生虫がステージIIIおよびIVに発達するにつれて細長い。成熟ステージVゲームサイトは、しかし、丸みを帯びた端と最小限のホスト細胞の視認性14を有する古典的な三日月形によって特徴付けられた。スケールバー= 10 mmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:P.熱帯熱膜嚢胞は蚊の中腸当たりの数を数える。(A)グラフは、長年にわたってoocyst数を示し、各実験のために、蚊は0.3%の殺血細胞を供給し、中間腸は8日目のポスト血流で解剖された。各ドットは、個々の中間腸からのウーストの数を表し、水平線は中央値を表します。(B)表は、平均オーシスト数、感染した蚊の有病率および感染範囲を示す。(C)異なる倍率で2つの別々の血液供給実験から蚊の中腸の卵胞を示す写真。スケールバー= 150 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 実験 | 解剖の日(ポスト血流) | 平均スポロゾアイト/蚊 |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
表1:2年間の12回の独立サイクルにおける蚊1人当たりの唾液腺スポロゾアイトの平均数。A. stephensi 蚊は0.3% のP.熱帯熱虫 の殺虫細胞を与えられ、15〜20個の蚊は14-17日後の血液供給の間に解剖された。蚊1人当たりの平均スポロゾアイト数が示されている。
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Discussion
ここで説明する方法は、10年以上のジョンズ・ホプキンスマラリア研究所で15年以上、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年以上にわたって使用されています。このプロトコルを用いて産生されるガテサイトは、高スループットのゲームトサイトサイクスアッセイ22、プロテオミクス15、ならびに転写23研究に使用されている。しかし、これらの方法を開発する主な理由は、蚊の段階とsporozoites23、24、25、26の研究のために蚊に感染するために成熟したタテライトを使用することです。この原稿は、成熟したP.熱帯熱膜のゲームトサイトを生成し、ガラス膜フィーダーを使用して蚊の感染の詳細なプロトコルを記述しています。これらの方法は、P.熱帯熱虫の伝達遮断戦略、sporozoiteステージおよび赤血球前肝段階に取り組んでいるあらゆる実験室にとって重要である。
1981年にイフェディバとヴァンダーベルクは、P.熱帯熱膜の長期培養を説明し、感染性の高い成熟したゲームトサイト27を産生した50μg/mLヒゴキサンチンの存在下で述べた。それ以来、さまざまなアプリケーション9、10、11、12のためのゲームサイトを生成する方法を記述する多数の出版物がありました。これらの出版物のほとんどは、収率を高めるために、以前に説明した細胞細胞産生誘導条件を利用する。コンディショニングされた培地を用いて、急激な寄生虫血症増加による培養を強調し、ヘマトクリットの低下を貧血を模倣し、赤血球のリシスおよびログ相抑制をバルクアップにより、食細胞細胞形成を誘導するために使用され得る。ここで説明する方法は、簡単で時間的にテストされています。4%ヘマトクリットで0.3-1%無性ステージ寄生虫症で食細胞培養を開始し、15-18日まで毎日メディアを変更します。一貫した結果を達成するためには、低い通路無性ステージ寄生虫でゲームサイト培養を開始し、新鮮なRBC(<1週間)を使用し、メディアの変化の間に培養温度が変動しないようにすることが重要です。熱帯熱砂の食細胞の開発過程は骨髄4,5の血管外空間の静的条件下で隔離されるため、培養期間を通じて脱着したRBC層を妨害しないことが重要である。
一貫性を持つP.熱帯熱酒乳酸塩細胞を培養することは要求ですが、蚊に感染させることは別のレベルの複雑さを提示します。膜供給は、蚊の年齢と適性、中腸微生物叢、摂食行動28、29など、食細胞以外のいくつかの変数の対象となります。通常、SMFAデータは、ばらつきの高い程度を示し、異なる実験条件11、28の効果を識別するために多数の蚊を必要とする。食細胞の低通路培養を使用して、健康な3〜6日間の古い蚊と最適化された膜供給プロトコルは、oocyst数の変動に役立ちます。
ここで説明するプロトコルは、遊食細胞培養と膜供給の両方について、長年にわたって最適化されてきた。これらの方法は、成熟した透過能力のある食塩基細胞、標準的な膜供給アッセイ、蚊中腸解剖および卵巣定量ならびに唾液腺解剖およびsporozoite定量を得るための詳細な説明を提供する。これらのプロトコルは、信頼性の高い蚊の感染性と堅牢なoocyst数およびsporozoite収量を提供するために必要な解血細胞の数の点で一貫しています。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者は、ジョンズ・ホプキンスマラリア研究所(JHMRI)への財政的支援のためにブルームバーグ・フィランソロピーに感謝します。この作業は、JHMRIの昆虫や寄生虫のコア施設が提供する専門知識がなければ不可能でした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
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