Summary
Детальные исследования стадий малярийных паразитов комаров имеют решающее значение для разработки эффективных стратегий блокирования передачи. Этот протокол демонстрирует, как эффективно культивировать инфекционные гаметоциты, а затем скармливать эти гаметоциты комарам для генерации стадий комаров P. falciparum.
Abstract
Малярия остается одной из наиболее важных проблем общественного здравоохранения, вызывающей значительную заболеваемость и смертность. Малярия является заболеванием, передаваемым комарами, передаваемым через инфекционный укус от самки комара Anopheles. Борьба с малярией в конечном итоге будет опираться на множество подходов, которые включают способы блокирования передачи комарам, через них и от них. Для изучения стадий малярийных паразитов комаров в лаборатории мы оптимизировали протокол культивирования высокоинфекционных гаметоцитов Plasmodium falciparum, стадии паразита, необходимой для передачи от человека-хозяина комару-переносчику. Гаметоциты P. falciparum созревают через пять морфологически различных этапов, что занимает примерно 1-2 недели. Культура гаметоцитов, описанная в этом протоколе, завершается за 15 дней и заразна для комаров с 15-18 дней. Эти протоколы были разработаны для поддержания непрерывного цикла заражения компетентными гаметоцитами и для поддержания бесперебойного снабжения комаров стадиями паразита. Здесь мы описываем методологию культивированию гаметоцитов и то, как заразить комаров этими паразитами с помощью стеклянных мембранных кормушек.
Introduction
Малярия вызывается паразитами Plasmodium и передается их позвоночным хозяевам через инфекционный укус самок комаров Anopheles. Согласно докладу Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) за 2019 год, было зарегистрировано 405 000 смертей из 228 миллионов случаевмалярии1. Большинство случаев смерти от малярии было сосредоточено в африканском регионе, особенно среди детей в возрасте до пяти лет. В то время как общий уровень заболеваемости малярией снизился во всем мире с 2010 года, в последние годы спад стабилизировался, и для ликвидации этого заболевания срочно необходимы дополнительные стратегии борьбы.
Циклические стадии бесполой крови малярийных паразитов вызывают патогенез заболевания, и небольшое подмножество из них дифференцируется на женские и мужские гаметоциты. Гаметоциты Plasmodium falciparum уникальны по своей природе, так как им занимает 7-10 дней для развития через пять морфологически различных стадий. Незрелые гаметоциты от I до IV стадии секвестрируются в паренхиме костного мозга и в значительной степени остаются отсутствующими в периферическом кровообращении2,3,4,5. Эритроциты, инфицированные зрелыми гаметоцитами V стадии, высвобождаются в кровотоке и свободно циркулируют, чтобы быть захваченными комарами. Попав внутрь москитовой средней кишки, гаметоциты активируются, посредством изменения температуры и воздействия среды средней кишки, трансформируются в женские и мужские гаметы и начинают развитие стадий комара, которое завершается инфекционными стадиями спорозоитов в слюнных железах комара6,7.
С тех пор, как Трагер и Дженсон8 описали стандартизированный метод культивирования P. falciparum,исследования стадий беспологий крови значительно продвинулись. Однако отсутствие надежной системы культивовки половых стадий затруднило изучение гаметоцитов P. falciparum, биологии передачи и стадий комаров. В последние годы было опубликовано несколько методов, которые помогли лабораториям в создании культур гаметоцитов9,10,11,12. Эта рукопись описывает стандартизированный и надежный протокол к культуре гаметоцитов P. falciparum, который может представлять собой ценный ресурс для сообщества исследователей малярии. Этот метод обеспечивает надежную выработку зрелых и инфекционных гаметоцитов, что наряду со стандартизированным протоколом кормления комаров приводит к высоконадежной инфекционности комаров. Эти методы были установлены для поддержания бесперебойного снабжения гаметоцитами и паразитами стадии комаров. В этой рукописи мы описываем тщательный протокол посева гаметоцитов(Рисунок 1),приготовление кормушек со стеклянной мембраной и заражение комаров с помощью этих мембранных кормушек(Рисунок 2),рассечение средней кишки(Рисунок 3)и слюнных желез комаров(Рисунок 4),а также количественную оценку инфекции у комаров после рассечения средней кишки и слюнных желез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Анализы крови, описанные ниже, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Джона Хопкинса. P. falciparum культивируется в свежих эритроцитах в стерильных условиях на объекте уровня биобезопасности 2 (BSL2), и осторожность используется для обработки биологических материалов. После каждого этапа, связанного с кровью или продуктами крови, каждая пластиковая или стеклянная посуда промывается 10% отбеливателем в капоте перед надлежащей утилизацией.
1. Реагенты и препарат
- Был использован паразитический изолят P. falciparum NF54 (см. Таблицу материалов),который может продуцировать инфекционные гаметоциты в течение двух месяцев, находясь в непрерывной культуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не все адаптированные к культуре линии паразитов производят гаметоциты, и изоляты NF54 с низким проходом являются наиболее последовательными. - O+ Эритроциты: Разбавляют цельной кровью путем добавления равного объема среды RPMI 1640 и центрифуги при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре в откидной ротор с деакслерантом, установленным на 0. Осторожно удалите надпозитарную и пышную оболочку (белую полосу между плазмой и упакованными эритроцитами, которая содержит большую часть лейкоцитов и тромбоцитов) и добавьте равный объем RPMI. Повторите этап промывки дважды и после окончательной промывки добавьте один гранулированный объем RPMI, чтобы получить 50% гематокрита для хранения при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гаметоциты созревают в течение двух недель, что делает критически важным начинать культуру со свежими эритроцитами, обычно эритроциты, взятые в течение недели, работают хорошо. - O+ Human Serum: Объедините не менее 6 единиц сыворотки вместе, чтобы свести к минимуму эффект нормальных изменений в сыворотке крови у разных людей. Стерилизуйте объединенную человеческую сыворотку с помощью 0,2 мкм фильтрационных колбы. Аликвот порциями по 50 мл или менее в зависимости от необходимости и хранить при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эритроциты и сыворотка должны быть из совместимой группы крови для культур P. falciparum. - 500x Раствор гипоксантина (100 мл): Растворить 0,5 г гипоксантина в 100 мл 1 М NaOH. Фильтр стерилизуют и делают 5-10 мл аликвот для хранения. Запасы могут храниться до года при -20 °C и до 2 недель при 4 °C.
- Бикарбонат натрия (необязательно): Растворите 7,5 г бикарбоната натрия в 100 мл деионизированной воды для культуры тканей и стерилизуйте фильтром с фильтром 0,2 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует метод свечной банки для обеспечения микроаэрофильных условий для культуры P. falciparum in vitro и не требует бикарбоната натрия. Однако, если паразиты культивируются с использованием смеси малярийных газов (5% O2,5% CO2 и 90%N2),важно дополнить культуральная среда 0,2% бикарбоната натрия. - Полная среда: Чтобы приготовить 500 мл полной среды, добавьте 1 мл раствора гипоксантина и 50 мл объединенной сыворотки крови человека к 500 мл RPMI 1640. Добавьте 15 мл 7,5% бикарбоната натрия при использовании смеси малярийного газа. Храните полные носители при 4 °C и выбрасывайте, если цвет полных носителей меняется с оранжевого на розовый. Чтобы избежать отходов, сделайте достаточно полных носителей для использования в течение трех дней.
- Эксфлагелляционные среды (необязательно): Производят эксфлагелляционную или оокинетную жижу путем растворения 200 мг NaHCO3,5 мг гипоксантина и 100 мкл ксантуреновой кислоты (от 100 мМ запаса в воде) до 100 мл неполной среды (RPMI 1640 с глутамином и HEPES).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксфлагелляция - это процесс образования мужских гамет внутри средней кишки самки комара Anopheles через несколько минут после того, как он принимает кровяную муку, инфицированную гаметоцитами. Мужские гаметоциты Plasmodium дают начало 8 мужским гаметам после события эксфлагелляции. In vitro этот процесс происходит спонтанно, когда температура культуры понижается до комнатной температуры (RT) и может наблюдаться в культивируемых зрелых гаметоцитах. - N-ацетилглюкозамин (необязательно): Сделать 500 мМ запасного раствора N-ацетилглюкозамин в воде или неполной среде, аликвоте и хранить при -20 °C.
- Растворы NaCl: Растворить 0,9 г, 1,6 г и 12 г NaCl в 100 мл деионизированной воды для культуры тканей с 0,9%, 1,6% и 12% растворами NaCl. Фильтр стерилизуют фильтром 0,22 мкм и хранят при 4 °C.
2. P. falciparum асексуальная сценическая культура
- Чтобы начать культивировать паразитов, извлеките из резервуара с жидким азотом замороженный флакон P. falciparum NF54 и быстро разморозите на водяной бане при 37 °C.
- Перенесите содержимое (~1 мл) в стерильную центрифужную трубку объемом 50 мл и по каплям добавьте 0,2 объема предварительно выгремленного 12% NaCl, осторожно встряхнув трубку, чтобы обеспечить равномерное перемешивание. Инкубировать в течение 5 мин на РТ с прерывистым мягким встряхиванием.
- Добавьте 9 объемов по 1,6% NaCl по каплям, продолжая при этом мягкое перемешивание. Центрифугировать содержимое в 500 х г в течение 5 мин при РТ, осторожно выбросить супернатант. Добавьте 9 объемов по 0,9% NaCl по каплям, при этом убедитесь, что гранулы паразита последовательно смешиваются. Центрифуг снова при 500 х г в течение 5 мин при RT. Удалите супернатант и повторно суспендировать паразитов в 5 мл полной среды.
- Переложите содержимое в одну скважину 6-й колодекной ткани и добавьте 100-200 мкл упакованных эритроцитов.
- Инкубировать культуру паразитов при 37 °C в свечной банке или в модульной камере инкубатора, продуваемой специальной газовой смесью 5% O2,5% CO2 и 90% N2.
- Заменяйте жижи каждый день и контролируйте рост, делая тонкий мазок крови, извлекая несколько микролитров из осегуляемого слоя эритроцитов после того, как супернатант культуры был аспирирован во время регулярной смены среды.
- Используйте стерильную стеклянную пипетку Пастера, чтобы нарисовать, а затем постучите по центру стеклянной горки, чтобы перенести каплю культуры на слайд. Поместите еще один стеклянный слайд перед каплей и потяните его назад, чтобы связаться с эритроцитами, быстро толкая его вперед одним движением, чтобы сделать тонкий мазок монослоя RBC.
- Поместите горку горизонтально на сушилку и дайте ей высохнуть на воздухе. Зафиксируйте мазок крови, опустив на мазок абсолютный метанол. Дайте неподвижным мазку полностью высохнуть, а затем аккуратно вылейте 10% geimsa-пятно, свежее разбавленный в воде, пока мазок крови не будет полностью покрыт. Дайте клеткам окрашиваться в течение примерно 15 минут.
- Смойте лишнее пятно, промыв горку под чистой водопроводной водой и дайте горкам высохнуть в вертикальном положении.
- Определить паразитемию можно путем просмотра тонкого мазка крови на микроскоп с помощью масляного погружения 100x объектива. Подсчитайте количество инфицированных эритроцитов среди в общей сложности не менее 500 эритроцитов, чтобы определить процент паразитемии.
3. Культура гаметоцитов P. falciparum
ПРИМЕЧАНИЕ: Культурам гаметоцитов для производства зрелых гаметоцитов, инфекционных для комаров, занимает две недели. Этапы культуры гаметоцитов описаны на рисунке 1. Изоляты P. falciparum обычно теряют способность продуцировать гаметоциты после длительной культивируемости in vitro13. Для обеспечения качества гаметоцитов культуру следует начинать с низкопрошедежной питающей культуры, не старше 2 месяцев с момента оттаивания. Предварительно прогрейте среду до 37 °C и выполните все процедуры на скользящем грелке, установленном при 38 °C. Убедитесь, что культуры гаметоцитов не находятся вне инкубатора в течение длительного периода времени, чтобы свести к минимуму колебания температуры.
- Засейте культуру гаметоцитов (день 0) с использованием смешанной бесполой стадии питательной культуры при 0,3-1% паразитемии при 4% гематокрите.
- Чтобы создать культуру гаметоцитов в шести лунках, центрифугируют 5 мл культуры питателя при 500 х г в течение 5 мин при RT. Выбросьте супернатант и повторно суспендировать гранулу в 30 мл полной среды.
- Добавьте 1,2 мл упакованных эритроцитов, перемешайте и дозируете по 5 мл в каждую скважину из 6-й пластины и инкубируют в банке для свечей при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культура гаметоцитов, описанная выше, основана на смешанной культуре кормушки бесполой стадии при 5% паразитемии. - Меняйте млады ежедневно в течение 15-18 дней, без добавления свежей крови, тщательно аспирируя около 70-80% культурального супернатанта, чтобы избежать удаления клеток крови.
- Добавьте 5 мл свежих полных сред в каждую скважину. При смене носителя медленно добавляйте носители с помощью серологической пипетки к стенке колодца, чтобы не нарушить устоявшийся слой RBC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку 1-2 мл питательной среды останется во время смены среды, общий объем культуры составит 6-7 мл после 1-го дня культуры гаметоцитов. При адаптации этого протокола желательно делать мазки крови каждый последующий день, чтобы убедиться, что паразиты здоровы. Создание мазка крови часто может истощить количество клеток в культуре. Чтобы этого избежать, нарисуйте очень маленький объем. - Чтобы количественно оценить зрелую гаметоцитамию, сделайте мазок крови между днями 15-18 и подсчитайте количество зрелых гаметоцитов среди общего числа клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зрелые гаметоциты можно легко идентифицировать по их классической форме полумесяца с гладкими округлыми концами(рисунок 5B). - Подсчитайте минимум 1000 эритроцитов и рассчитайте процент эритроцитов, инфицированных зрелыми гаметоцитами.
- Для количественной оценки событий эксфлагелляции возьмите 200 мкл культуры гаметоцитов и центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при РТ в предварительно нагретой пробирке. Повторно суспендировать гранулу в 20 мкл эксфлагелляции и переложить на стеклянную горку с крышкой.
- После 15 мин инкубации при комнатной температуре начинают подсчет эксфлагелляционных центров в режиме фазового контраста с помощью 10-кратного объектива. Подсчитайте центры эксфлагелляции по крайней мере в четырех полях для расчета событий эксфлагелляции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная методология эксфлагелляционного анализа была описана ранее Delves et al10. Более 20 эксфлагелляций на поле считаются пригодными для анализа мембранной подачи. - Культуры гаметоцитов обычно имеют низкий уровень остаточных бесполых стадий. Если для эксперимента требуются чистые гаметоциты, обработать культуру N-ацетилглюкозамином 50 мМ.
- Добавьте 0,5 мл N-ацетилглюкозамин из 10-кратного запасного раствора на скважину (5 мл) в течение как минимум 3 дней, меняя мочную муля для очистки остаточных бесполых стадий.
ПРИМЕЧАНИЕ: N-ацетилглюкозамин также может блокировать инвазию мерозоитов, совершаемых половым образом, лечение следует начинать только после 7-го дня культуры гаметоцитов.
4. Заражение комарами с использованием стандартного мембранного анализа (SMFA)
ПРИМЕЧАНИЕ: Гаметоциты, выращенные in vitro, можно скармливать комарам с помощью стеклянных мембранных кормушек. Настройка аппарата для кормления крови показана на рисунке 2. Как описано выше, всегда поддерживайте гаметоциты при 37 ° C, чтобы избежать активации до того, как они будут проглочены комарами. Доатмная пластика, реагенты и оборудование используются с культурой гаметоцитов до 37 °C.
- Голодайте 3-7-дневных самок комаров Anopheles, удаляя их сахарную воду в течение 6,5 ч или на ночь перед кормлением на мембране.
- Перенесите их с помощью моторизованных или управляемых ртом аспираторов в бумажные стаканчики, покрытые двойным слоем тонкой сетчатой ткани. Кроме того, сбивайте комаров в холодной комнате или холодильнике, чтобы перенести их в бумажные стаканчики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чашка размером с одну пинту может быть использована для кормления до 100 комаров. - Центрифугу промывают кровью по 500 х г в течение 5 мин при РТ и выбрасывают супернатант. Добавьте равный объем свежеотмороженой человеческой сыворотки, чтобы восстановить цельную кровь. Переложите смесь крови и сыворотки на водяную баню при 37 °C в течение 30 мин.
- Перенесите культуру гаметоцитов в предварительно нагретую пластиковую трубку 15 мл и центрифугу при 600 х г в течение 5 мин при 37 °C. Тщательно аспирируйте культуру супернатантом и сделайте тонкий мазок крови, чтобы определить зрелую гаметоцитамию, как описано выше.
- Чтобы сделать окончательный корм крови, разбавьте гранулы гаметоцитов до нужной концентрации, используя восстановленную цельную кровь. Держите кровь при 37 °C до тех пор, пока комары и стеклянные кормушки не будут готовы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация зрелых гаметоцитов от 0,02 до 0,3% обеспечит постоянную инфекционность комаров. Тем не менее, желательно оптимизировать гаметоцитамию, скармливая различные концентрации разным чашкам комаров. - Убедитесь, что стеклянные мембранные кормушки имеют два отверстия: узкое верхнее отверстие для пипетки зараженной крови и нижнее отверстие для прикрепления мембраны. Разрежьте парафиновую пленку на квадраты, растяните до ровной толщины и приклейте к отверстию кормушки, чтобы создать герметичный отсек для подачи крови.
- Прикрепите мембранные питатели к циркуляционной водяной бане, соединив трубки с каждой стороны, чтобы обеспечить прохождение теплой воды через рубашку вокруг мембранных питателей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько стеклянных питателей могут быть соединены последовательно для размещения в нескольких условиях кормления. - После того, как все кормушки подключены к водяной бане, включите ее и осмотрите на наличие утечек.
- Поместите кормушки в центр сетки на москитные чашки с мембранной стороной вниз и закрепите кормушки с помощью зажимов или ленты. Убедитесь, что мембранные кормушки не наклоняются в любую сторону, чтобы обеспечить равномерное распределение корма для крови и тесный контакт всей кормушки с сеткой на чашках, чтобы позволить комарам получить доступ изнутри чашки.
- Пипетка около 200–1000 мкл крови подается в мембранные кормушки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем корма крови будет варьироваться в зависимости от количества комаров и размера мембранной кормушки. Для 14 мм стеклянной кормушки и 50 комаров используют 200 мкл кровяного корма. - Убедитесь, что загрузка была выполнена правильно, а кровь была наложена на парафиновую пленку.
- Дайте комарам кормиться около 30 минут с прерывистым мониторингом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно дуйте комаров ртом, чтобы обеспечить CO2, который будет стимулировать улучшение кормления кровью. - Удалите несыплаваемых комаров, сбив их в холодном помещении. Заметно осмотрите комаров на наличие выпуклости и покраснения в брюшной полости как признак свежей кровяной муки. В качестве альтернативы, используйте аспиратор, управляемый ртом, чтобы выборочно удалять неочиваемых комаров.
- Выбросьте некормленных комаров, замочив их в 70% этаноле, и поместите скармливаемых комаров обратно в чашку для комаров.
- Двойные клетки комаров-чашек и перенос их в инкубатор с высоким содержанием, предназначенного для комаров, инфицированных человеческим малярийным паразитом P. falciparum.
- Поместите ватные диски, пропитанные 10% сахарозой, на чашки комаров, чтобы обеспечить их сахарной мукой. Заменяйте ватные диски через день, пока комары не будут рассечены.
5. Рассечение средней кишки комаров и количественная оценка нагрузки ооцисты
ПРИМЕЧАНИЕ: Схема рассечения средней кишки показана на рисунке 3.
- Через 7-8 дней после кормления кровью перенесите чашки комаров до 4 °C в течение 10 мин, чтобы сбить комаров.
- Перенесите комаров для рассечения в чашку Петри на льду с помощью мелкоконечных щипцов.
- Замочите комаров в 70% этаноле в течение 1-2 мин, чтобы усыпить их. Добавьте PBS в чашку Петри, чтобы смыть этанол после того, как все комары усыплены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед добавлением PBS убедитесь, что все комары мертвы. - Установите стеклянную горку на рассекающий микроскоп и пипетку 100 мкл PBS в центре. Осторожно перенесите одного комара с помощью щипцов в PBS и оставьте остальных комаров в чашке Петри на льду.
- Используя мелкоконечивые щипцы, удерживайте третий сегмент брюшка от заднего конца комара и вторыми щипцами удерживайте соединение между грудной клеткой и брюшком. Осторожно потяните брюшко до тех пор, пока средняя кишка не будет полностью обнажена.
- Выбросьте остальную часть ткани комара и перенесите среднюю ковку на чистую горку, содержащую несколько капель PBS.
- Когда нужное количество комаров будет рассечено, аккуратно удалите PBS с помощью пипетки и окрашивайте среднюю ковшку 0,2% меркурохромом в течение 2-5 мин.
- Удалите излишки меркурохрома и выровняйте средние области на слайде, чтобы их можно было легко визуализировать под световым микроскопом.
- Поместите крышку и подсчитайте ооцисты на каждой средней китре под 10-кратным объективом. Ооцисты окрашены в розовый цвет и имеют круглую форму(рисунок 6C).
6. Рассечение слюнных желез комаров и количественная оценка спорозоитовой нагрузки
ПРИМЕЧАНИЕ: Схема рассечения слюнных желез показана на рисунке 4.
- Через 14-18 дней после кормления кровью поместите чашки комаров при 4 °C в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно подождать, пока комары не перестанут двигаться. - Ожидая, пока комары перестанут двигаться, подготовьте инструменты для рассечения.
- Поместите стеклянную пластину на ступень рассеченного микроскопа. Подготовьте 2 комплекта игл по 25 г на шприцах по 1 мл и 9-дюймовой пипетке Пастера и резиновой колбе. Поместите 70% EtOH и среду для рассечения (HBSS, L-15 или PBS) в пластину с 6 лунками.
- В холодном помещении перенесите обезболенные комары в 6-хорошую пластину, содержащую 70% EtOH. Осторожно перемещайте комаров щипцами, чтобы убедиться, что все комары пропитаны, а затем перенесите комаров в среду рассечения, используя щипцы, чтобы смыть 70% EtOH.
- Переместитесь в комнату для вскрытия и поместите комаров на сцену микроскопа вскрытия.
- Удалите лишнюю среду с комаров, добавьте новую среду по мере необходимости во время вскрытия. Избегайте высыхания комаров, но слишком много жидкости затрудняет рассечение.
- Используя 2 шприца с иглами 25 г, удерживайте грудную клетку комара и голову и осторожно потяните голову вверх, чтобы вытянуть слюнные железы из грудной клетки.
- Отсоедините слюнные железы от головы и грудной клетки иглой.
- Временно поместите слюнные железы в отдельную каплю среды на стеклянную пластину.
- После рассечения 15-20 слюнных желез соберите их в трубку с низкой ретенционной задержкой с помощью пипетки Пастера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только слюнные железы войдут в широкую часть пипетки Пастера, они прилипнут к стеклу, и их трудно вытащить. - Пеллетные слюнные железы коротким импульсом вращаются в настольной центрифуге. Удалите среду для рассечения, не разрушая гранулу, и добавьте 100 мкл новой среды для рассечения.
- Слюнные железы измельчают небольшим гомогенизатором в течение 1 мин с получением спорозоитов.
- Поместите на гемоцитометр 10 мкл диссекционной среды, содержащей спорозоиты.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества слюнных желез перед подсчетом может потребоваться разбавить раствор спорозоита до 1:10 до 1:50 средой. - Подсчитайте количество спорозоитов в двух из четырех квадрантов и рассчитайте количество спорозоитов/комаров:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы представляем результаты серии мембранных кормов с использованием культур гаметоцитов P. falciparum NF54, полученных с использованием протокола выше (см.рисунок 5). Культура гаметоцитов была начата примерно с 0,5% смешанной стадии бесполой культуры на 0-й день, которая выросла до пика паразитемии примерно на 15% к 4-му и 5-му дню. Как показано на рисунке 5А при этой высокой паразитемии, паразиты подвергаются стрессу, и культура бесполой стадии падает. Однако этот стресс одновременно приводит к индукции гаматоцитогенеза. Ранние гаметоциты появились после 6-го и 7-го дня, а бесполая паразитемия медленно снижалась, но оставалась на низком уровне. Наличие бесполых паразитов не повлияло на эксперименты по кормлению комаров. Однако, если гаметоциты должны использоваться в экспериментах, которые требуют чистых культур, таких как анализы чувствительности к лекарственным средствам и протеомные или транскриптомные исследования, остаточные бесполые стадии могут быть удалены путем лечения 50 мМ N-ацетилглюкозамином. Большинство гаметоцитов созревают до стадии V к 15-му дню, когда они становятся заразными для комаров и были готовы к кормлению. Репрезентативные изображения окрашенных Гиемсой мазков крови в разные моменты времени после начала культивации гаметоцитов показаны на рисунке 5B.
В период от 8 до 10 дней после кормления кровью комаров рассекли, чтобы определить распространенность и интенсивность инфекции. Распространенность - это процент кормимых комаров, которые имеют ооцисты, в то время как интенсивность - это количество ооцист, обнаруженных у каждого комара. Оба являются важными показателями успеха корма. Данные с 5 независимых кормов для комаров показаны на рисунке 6. Корма были выбраны, чтобы показать нормальное изменение уровней инфекционности после кормления 0,3% зрелых гаметоцитов с 16-го дня культуры P. falciparum NF54. Интенсивность ооцисты предоставляет количественные данные для определения инфекционности комаров гаметоцитов, а распространенность показывает процент откормленных комаров, которые заразились. Эти данные могут быть использованы для оценки агентов, блокирующих передачу, а также для выявления и характеристики мишеней для вакцин и лекарств, блокирующих передачу. Количество ооцист варьировалось как внутри, так и между экспериментами и требовало 25-50 комаров на когорту для определения влияния различных экспериментальных условий.
Интенсивность ооцисты рассматривается как конечная точка большинства анализов и стратегий блокировки передачи, однако количество спорозоитов обычно важно для биологии спорозоита и для исследований на стадии печени. В таблице 1 показано среднее количество спорозоитов, полученных на одного комара из 12 независимых кормов кровью. Как показано в таблице, среднее количество спорозоитов было последовательным, однако был один эксперимент, где мы получили ноль спорозоитов, представляющих случайный провал анализа.
Рисунок 1: Рабочий процесс культуры гаметоцитов P. falciparum и протокол питания мембран. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Настройка кормления крови комаров. (A) Стеклянная кормушка и прямоугольный кусок парафиновой пленки (B) Два стеклянных питателя, отображаемые до и после крепления мембраны парапленки(C)Стеклянная кормушка поверх чашки комара и соединена с циркуляционной водяной баней. (D,E) Пипетка подачи крови в стеклянную кормушку(F)Вид снизу стеклянной кормушки, показывающий однородное распределение кровяного корма(G)Несколько комаров, питающихся через парапленочную мембрану. (H) Вид сверху на чашки комаров после кормления, показывающий капли крови, выделяемой кормящимися комарами на дне чашки. Шкала = 10 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Графическое представление, показывающее этапы рассечения москитной средней кишки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Графическое представление, показывающее этапы рассечения слюнных желез комаров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: P. falciparum гаметоцитарная культура и визуализация ооцисты на инфицированной комариной средней киточку. (A) Временной курс 15-дневной культуры гаметоцитов, показывающий резкое размножение бесполых стадий до пика паразитемии в течение первых 4 дней с последующим гаметоцитогенезом и созреванием с течением времени. (B)Окрашенный Геймсой тонкий мазок крови, показывающий различные стадии культуры гаметоцитов, день 1 ранняя бесполая стадия, день 4 пик бесполой паразитемии, день 6 стресс культуры из-за высокой паразитарной нагрузки, дни 9 и 12 ранние гаметоциты и день 15, показывающий зрелые мужские и женские гаметоциты. Морфологически гаметоциты ранней стадии были неотличимы от бесполых стадий, но поздняя стадия II показала форму полумесяца с заостренными концами и удлинялась, когда паразит развился в стадию III и IV. Зрелые гаметоциты V стадии, однако, характеризовались классической формой полумесяца с закругленными концами и минимальной видимостью клеток-хозяев14. Шкала = 10 мм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Количество ооцист P. falciparum на одну москитную москетку. Графикпоказывает количество ооцист за эти годы, для каждого эксперимента комаров кормили 0,3% гаметоцитов, а средние мяки были рассечены на 8-й день после кормления кровью. Каждая точка представляет количество ооцист из отдельных средних полос, а горизонтальная линия представляет медианное значение. (B)В таблице показано среднее количество ооцист, распространенность инфицированных комаров и диапазон инфекции. (C) Фотографии, показывающие ооцисты на москитвой киточке из двух отдельных экспериментов по питанию кровью при разных увеличениях. Шкала = 150 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Эксперимент | День рассечения (после кормления кровью) | Средний спорозоит/комар |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
Таблица 1: Среднее количество спорозоитов слюнных желез на комара за 12 независимых циклов в течение 2-летнего периода. Комаров A. stephensi кормили 0,3% гаметоцитов P. falciparum и 15-20 комаров рассекли между 14-17 днями после кормления кровью. Показано среднее количество спорозоита на комара.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, описанные здесь, успешно используются в Научно-исследовательском институте малярии Джона Хопкинса более 10 лет15,16,17,18,19,20,21,22. Гаметоциты, полученные с использованием этого протокола, были использованы для высокопроизводительных гаметоцитоцидных анализов22,для протеомных15,а также для транскриптомных23 исследований. Однако основной причиной разработки этих методов является использование зрелых гаметоцитов для заражения комаров для исследований на стадиях комаров и спорозоитов23,24,25,26. В этой рукописи описан подробный протокол генерации зрелых гаметоцитов P. falciparum и заражения комаров с помощью стеклянных мембранных кормушек. Эти методы имеют решающее значение для любой лаборатории, работающей над стратегиями блокировки передачи, спорозоитными стадиями и предэритроцитарными стадиями печени P. falciparum.
Ифедиба и Вандерберг в 1981 году описали долгосрочную культуру P. falciparum,в присутствии 50 мкг/мл гипоксантина, который продуцировал высокоинфекционные зрелые гаметоциты27. С тех пор появились многочисленные публикации, описывающие способы получения гаметоцитов для различных применений9,10,11,12. Большинство из этих публикаций используют ранее описанные условия, вызывающие гаматоцитогенез, для повышения урожайности. Использование условных сред, стресс для культуры внезапным увеличением паразитемии, падение гематокрита для имитации анемии, лизис эритроцитов и подавление фазы log путем увеличения, может быть использовано для индуцирования гаматоцитогенеза. Метод, описанный здесь, прост и проверен временем. Инициируют культивированию гаметоцитов с 0,3-1% беспечной стадии паразитемии при 4% гематокрите и меняют медиа каждый день до 15-18 дня. Для достижения стабильных результатов крайне важно начать культивировать гаметоциты с паразитами бесполой стадии с низким проходом, использовать свежие эритроциты (<1 неделя) и убедиться, что температура культуры не колеблется во время смены среды. Поскольку процесс развития falciparum гаметоцитов происходит секвестрированно в статических условиях внесосудистых пространств в костном мозге4,5,важно не нарушать устоявшиеся эритроцитарные слои на протяжении всего периода культивации.
Культивирование гаметоцитов P. falciparum с консистенцией является сложным, но заставить их заражать комаров представляет собой еще один уровень сложности. Мембранное питание зависит от нескольких переменных, отличных от гаметоцитов, таких как возраст и приспособленность комаров, микробиота средней кишки и пищевое поведение28,29. Обычно данные SMFA показывают высокую степень изменчивости и требуют большого количества комаров для выявления эффектов различных экспериментальных условий11,28. Использование культуры с низким проходом для гаметоцитов, здоровых комаров 3-6-дневных детей и оптимизированного протокола мембранного питания может помочь с изменениями в количестве ооцист.
Протокол, описанный здесь как для культивирования гаметоцитов, так и для мембранного питания, был оптимизирован в течение многих лет. Эти методы обеспечивают подробное описание для получения грамотных гаметоцитов зрелой передачи, стандартного анализа мембранного питания, рассечения средней кишки комара и количественной оценки ооцисты, а также рассечения слюнных желез и количественной оценки спорозоита. Эти протоколы последовательны с точки зрения количества гаметоцитов, необходимых для обеспечения надежной инфекционности комаров и надежного количества ооцист и выходов спорозоита.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Bloomberg Philanthropies за финансовую поддержку Научно-исследовательского института малярии Джона Хопкинса (JHMRI). Эта работа была бы невозможна без экспертных знаний, предоставленных основными учреждениями JHMRI по насекомым и паразитологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
- World Health Organization.
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E.
- Joice, R., et al. Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow. Science Translational Medicine. 6 (244), 5 (2014).
- Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. American Journal of Hematology. 85 (12), 943 (2010).
- Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland. Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).
- Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. The development of malaria parasites in the mosquito midgut. Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).
- Trager, W., Jenson, J. B.
- Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery. Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).
- Delves, M. J., et al. Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions. Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).
- Habtewold, T., et al. Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity. Malaria Journal. 18 (1), 24 (2019).
- Demanga, C. G., et al. The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor. Parasites and Vectors. 10 (1), 216 (2017).
- Brockelman, C. R. Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum. Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).
- Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 7, (2017).
- Essuman, E., et al. A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs. Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).
- Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent. mBio. 8 (5), 01631 (2017).
- Oakley, M. S., et al. Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes. Scientific Reports. 8, 11568 (2018).
- Saraiva, R. G., et al. Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin. Scientific Reports. 8, 6176 (2018).
- Tao, D., et al. Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).
- Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes. Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).
- Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).
- Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity. PLoS One. 9 (8), 105817 (2014).
- Lindner, S. E., et al. Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites. Nature Communications. 10, 4964 (2019).
- McLean, K. J., et al. Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters. Scientific Reports. 9, 13131 (2019).
- Espinosa, D. A., et al. Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).
- Swearingen, K. E., et al. Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606 (2016).
- Ifediba, T., Vanderberg, J. P. Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes. Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).
- Miura, K., et al. An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines. Malaria Journal. 15, 463 (2016).
- Miura, K., et al. Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays. PLoS One. 8 (3), 57909 (2013).
