Summary
Detaillierte Untersuchungen an Mückenstadien von Malariaparasiten sind entscheidend, um wirksame Strategien zur Blockierung der Übertragung zu entwickeln. Dieses Protokoll zeigt, wie man infektiöse Gametozyten effektiv kultiviert und diese Gametozyten dann an Moskitos verfüttert, um Mückenstadien von P. falciparumzu erzeugen.
Abstract
Malaria ist nach wie vor eines der wichtigsten Probleme der öffentlichen Gesundheit und verursacht eine erhebliche Morbidität und Mortalität. Malaria ist eine durch Mücken übertragene Krankheit, die durch einen infektiösen Stich von der weiblichen Anopheles-Mücke übertragen wird. Die Malariabekämpfung wird sich schließlich auf eine Vielzahl von Ansätzen stützen, darunter Möglichkeiten, die Übertragung zu, durch und von Moskitos zu blockieren. Um Mückenstadien von Malariaparasiten im Labor zu untersuchen, haben wir ein Protokoll zur Kultivierung hochinfektiöser Plasmodium falciparum-Gametozyten optimiert, einem Parasitenstadium, das für die Übertragung vom menschlichen Wirt auf den Mückenvektor erforderlich ist. P. falciparum Gametozyten reifen durch fünf morphologisch unterschiedliche Schritte, was etwa 1-2 Wochen dauert. Die in diesem Protokoll beschriebene Gametozytenkultur wird in 15 Tagen abgeschlossen und ist ab den Tagen 15-18 für Moskitos infektiös. Diese Protokolle wurden entwickelt, um einen kontinuierlichen Zyklus von infektionskompetenten Gametozyten aufrechtzuerhalten und eine ununterbrochene Versorgung mit Mückenstadien des Parasiten aufrechtzuerhalten. Hier beschreiben wir die Methodik der Gametozytenkultur und wie man Moskitos mit diesen Parasiten mit Glasmembran-Feedern infiziert.
Introduction
Malaria wird durch Plasmodium-Parasiten verursacht und durch infektiösen Stich weiblicher Anopheles-Mücken auf ihre Wirbeltierwirte übertragen. Laut dem Bericht der Weltgesundheitsorganisation (WHO) von 2019 gab es schätzungsweise 405.000 Todesfälle von insgesamt 228 Millionen Malariafällen1. Die meisten Todesfälle im Zusammenhang mit Malaria konzentrierten sich auf die afrikanische Region, insbesondere auf Kinder unter fünf Jahren. Während die Gesamtinzidenzrate von Malaria seit 2010 weltweit zurückgegangen ist, hat sich der Rückgang in den letzten Jahren stabilisiert und zusätzliche Bekämpfungsstrategien sind dringend erforderlich, um die Krankheit zu eliminieren.
Zyklische asexuelle Blutstadien von Malariaparasiten verursachen Krankheitspathogenese und eine kleine Untergruppe davon differenziert sich in weibliche und männliche Gametozyten. Plasmodium falciparum Gametozyten sind einzigartig in der Natur, da sie 7-10 Tage brauchen, um sich durch fünf morphologisch unterschiedliche Stadien zu entwickeln. Unreife Gametozyten vom Stadium I bis IV werden im Knochenmarkparenchym sequestriert und bleiben im peripheren Kreislauf weitgehend abwesend2,3,4,5. Erythrozyten, die mit Gametozyten im reifen Stadium V infiziert sind, werden im Blutkreislauf freigesetzt und zirkulieren frei, um von Moskitos aufgenommen zu werden. Sobald sie sich im Mückenmitteldarm befinden, werden Gametozyten durch eine Temperaturänderung und Exposition gegenüber der Mitteldarmumgebung aktiviert, verwandeln sich in weibliche und männliche Gameten und beginnen mit der Entwicklung der Mückenstadien, die mit den infektiösen Stadien der Sporozoiten in den Mückenspeicheldrüsen6,7gipfelt .
Da Trager und Jenson8 eine standardisierte Methode zur Kultivierung von P. falciparumbeschrieben haben, sind Studien zu den asexuellen Blutstadien stark fortgeschritten. Das Fehlen eines zuverlässigen Kultursystems für sexuelle Stadien hat es jedoch schwierig gemacht, P. falciparum Gametozyten, Übertragungsbiologie und Mückenstadien zu untersuchen. In den letzten Jahren wurden mehrere Methoden veröffentlicht, die Laboratorien bei der Etablierung von Gametozytenkulturen geholfen haben9,10,11,12. Dieses Manuskript beschreibt ein standardisiertes und zuverlässiges Protokoll zur Kultivierung von P. falciparum-Gametozyten, das eine wertvolle Ressource für die Malaria-Forschungsgemeinschaft darstellen kann. Diese Methode ermöglicht die robuste Produktion von reifen und infektiösen Gametozyten, was zusammen mit einem standardisierten Mückenfütterungsprotokoll zu einer hochzuverlässigen Mückeninfektiosität führt. Diese Methoden wurden etabliert, um eine ununterbrochene Versorgung mit Gametozyten und Parasiten im Mückenstadium aufrechtzuerhalten. In diesem Manuskript beschreiben wir ein gründliches Gametozytenkulturprotokoll (Abbildung 1), die Vorbereitung von Glasmembranfütterern und die Infektion von Moskitos mit diesen Membranfressern (Abbildung 2), die Dissektion des Mitteldarms (Abbildung 3) und der Speicheldrüse von Moskitos (Abbildung 4) und die Quantifizierung der Infektion bei Mücken nach Mitteldarm- und Speicheldrüsendissektion.
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Protocol
Die unten beschriebenen Blutentnahmen wurden vom Institutional Review Board der Johns Hopkins University genehmigt. P. falciparum wird in frischen Erythrozyten unter sterilen Bedingungen in einer Anlage der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) kultiviert, und beim Umgang mit biologischen Materialien wird Vorsicht walten gelassen. Nach jedem Schritt mit Blut oder Blutprodukten wird jedes Plastik- oder Glasgeschirr vor der ordnungsgemäßen Entsorgung mit 10% Bleichmittel in der Haube gespült.
1. Reagenzien und Zubereitung
- Es wurde das Parasitenisolat P. falciparum NF54 (siehe Materialtabelle)verwendet, das in der kontinuierlichen Kultur bis zu zwei Monate lang infektiöse Gametozyten produzieren kann.
HINWEIS: Nicht alle kulturangepassten Parasitenlinien produzieren Gametozyten, und NF54-Isolate mit geringer Passage sind am konsistentesten. - O+ Erythrozyten: Verdünnen Sie Vollblut durch Zugabe des gleichen Volumens von RPMI 1640-Medien und zentrifugieren Sie es bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur in einem ausschwenkbaren Rotor mit Derentschleunigung auf 0 eingestellt. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und das Buffy-Fell (ein weißes Band zwischen Plasma und gepackten Erythrozyten, das die meisten weißen Blutkörperchen und Blutplättchen enthält) und fügen Sie das gleiche Volumen an RPMI hinzu. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal und fügen Sie nach der letzten Wäsche ein Pelletvolumen RPMI hinzu, um 50% Hämatokrit für die Lagerung bei 4 ° C zu erhalten.
HINWEIS: Gametozyten reifen über einen Zeitraum von zwei Wochen, was es wichtig macht, Kulturen mit frischen Erythrozyten zu beginnen, typischerweise Erythrozyten, die innerhalb einer Woche gezogen werden, funktioniert gut. - O+ Human Serum: Poolen Sie mindestens 6 Serumeinheiten zusammen, um die Wirkung normaler Variationen im Serum von verschiedenen Personen zu minimieren. Sterilisieren Sie gepooltes humanes Serum mit 0,2 μm Filtrationskolben. Aliquot in Portionen von 50 ml oder weniger je nach Bedarf und bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Erythrozyten und Serum müssen aus einer kompatiblen Blutgruppe für P. falciparum-Kulturen stammen. - 500x Hypoxanthin (100 ml) Lösung: 0,5 g Hypoxanthin in 100 ml 1 M NaOH auflösen. Filter sterilisieren und 5-10 ml Aliquots für die Lagerung herstellen. Bestände können bis zu einem Jahr bei -20 °C und bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
- Natriumbicarbonat (optional): 7,5 g Natriumbicarbonat in 100 ml entionisiertem Wasser in Gewebekulturqualität auflösen und mit einem 0,2 μm-Filter filtern.
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die Kerzenglasmethode, um mikroaerophile Bedingungen für die In-vitro-Kultur von P. falciparum bereitzustellen, und benötigt kein Natriumbicarbonat. Werden Parasiten jedoch mit einem Malariagasgemisch (5%O2, 5%CO2 und 90%N2)kultiviert, ist es wichtig, Kulturmedien mit 0,2% Natriumbicarbonat zu ergänzen. - Komplettes Medium: Um 500 ml vollständiges Medium herzustellen, fügen Sie 1 ml Hypoxanthinlösung und 50 ml gepooltes humanes Serum zu 500 ml RPMI 1640 hinzu. Fügen Sie 15 ml 7,5% Natriumbicarbonat hinzu, wenn Sie ein Malaria-Gasgemisch verwenden. Lagern Sie die vollständigen Medien bei 4 °C und verwerfen Sie sie, wenn sich die Farbe der gesamten Medien von Orange zu Rosa ändert. Um Abfall zu vermeiden, stellen Sie innerhalb von drei Tagen genügend vollständige Medien her, die verwendet werden können.
- Exflagelierungsmedien (optional): Herstellung von Exflagellations- oder Ookinetmedien durch Lösen von 200 mg NaHCO3, 5 mg Hypoxanthin und 100 μL Xanthurensäure (ab 100 mM Vorrat in Wasser) auf 100 ml unvollständiger Medien (RPMI 1640 mit Glutamin und HEPES).
HINWEIS: Exflagellation ist der Prozess der männlichen Gametenbildung im Mitteldarm der weiblichen Anopheles-Mücke wenige Minuten nach der Einnahme von Blutmahlzeiten, die mit Gametozyten infiziert sind. Männliche Gametozyten von Plasmodium führen nach einem Exflagellationsereignis zu 8 männlichen Gameten. In vitro tritt dieser Prozess spontan auf, wenn die Kulturtemperatur auf Raumtemperatur (RT) gesenkt wird und kann in kultivierten reifen Gametozyten beobachtet werden. - N-Acetylglucosamin (optional): 500 mM Stammlösung von N-Acetylglucosamin in Wasser oder unvollständigen Medien herstellen, aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- NaCl-Lösungen: Lösen Sie 0,9 g, 1,6 g und 12 g NaCl in 100 ml deionisiertem Gewebekulturwasser auf, um 0,9%, 1,6% und 12% NaCl-Lösungen herzustellen. Mit 0,22 μm Filter filtrieren und bei 4 °C lagern.
2. P. falciparum asexuelle Bühnenkultur
- Um mit der Parasitenkultur zu beginnen, entfernen Sie eine gefrorene Durchstechflasche mit P. falciparum NF54 aus dem Flüssigstickstofftank und tauen Sie schnell im Wasserbad bei 37 °C auf.
- Geben Sie den Inhalt (~ 1 ml) in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen und geben Sie tropfenweise 0,2 Volumen vorgewärmtes 12% NaCl hinzu, während Sie das Röhrchen vorsichtig schütteln, um ein gleichmäßiges Mischen zu gewährleisten. Inkubieren Sie für 5 min bei RT mit intermittierendem sanftem Schütteln.
- Fügen Sie 9 Volumen von 1,6% NaCl tropfenweise hinzu, während Sie das sanfte Mischen fortsetzen. Zentrifugieren Sie den Inhalt bei 500 x g für 5 min bei RT, verwerfen Sie vorsichtig den Überstand. Fügen Sie 9 Volumina von 0,9% NaCl tropfenweise hinzu, während Sie sicherstellen, dass das Parasitenpellet konsistent gemischt wird. Zentrifugieren Sie erneut bei 500 x g für 5 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie Parasiten in 5 mL vollständiges Medium.
- Übertragen Sie den Inhalt in eine Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte und fügen Sie 100-200 μL verpackte Erythrozyten hinzu.
- Parasitenkultur bei 37 °C in einem Kerzenglas oder in einer modularen Inkubatorkammer mit speziellem Gasgemisch aus 5%O2, 5%CO2 und 90% N2gespült.
- Ersetzen Sie die Medien jeden Tag und überwachen Sie das Wachstum, indem Sie einen dünnen Blutausstrich machen, indem Sie ein paar Mikroliter aus der abgesetzten RBC-Schicht ziehen, nachdem der Kulturüberstand während des regelmäßigen Medienwechsels abgesaugt wurde.
- Verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette aus Glas, um zu zeichnen, und tippen Sie dann in die Mitte des Glasobjektträgers, um einen Tropfen Kultur auf den Objektträger zu übertragen. Legen Sie einen weiteren Glasschieber vor den Tropfen und ziehen Sie ihn zurück, um die Erythrozyten zu kontaktieren, und schieben Sie ihn schnell in einer Bewegung nach vorne, um einen dünnen Abstrich der RBC-Monoschicht zu machen.
- Legen Sie den Schieber horizontal auf einen Wäscheständer und lassen Sie ihn an der Luft trocknen. Fixieren Sie den Blutausstrich, indem Sie absolutes Methanol auf den Abstrich fallen lassen. Lassen Sie den festen Abstrich vollständig trocknen und gießen Sie dann vorsichtig 10% Geimsa-Fleck frisch verdünnt in Wasser, bis der Blutausstrich vollständig bedeckt ist. Lassen Sie die Zellen ca. 15 Min färben.
- Waschen Sie den überschüssigen Fleck ab, indem Sie den Objektträger unter sauberem Leitungswasser abspülen und die Objektträger in vertikaler Position trocknen lassen.
- Bestimmen Sie Parasitemie, indem Sie einen dünnen Blutausstrich auf einem Mikroskop mit Ölimmersion 100x Objektiv betrachten. Zählen Sie die Anzahl der infizierten Erythrozyten unter insgesamt mindestens 500 Erythrozyten, um den Prozentsatz der Parasitemie zu bestimmen.
3. P. falciparum Gametozytenkultur
HINWEIS: Gametozytenkulturen benötigen zwei Wochen, um reife Gametozyten zu produzieren, die für Moskitos infektiös sind. Die Schritte der Gametozytenkultur sind in Abbildung 1 dargestellt. P. falciparum-Isolate verlieren in der Regel die Fähigkeit, Gametozyten zu produzieren, nach einer langfristigen In-vitro-Kultur13. Um die Qualität der Gametozyten zu gewährleisten, sollte die Kultur aus einer Feederkultur mit niedriger Passage begonnen werden, die seit dem Auftauen nicht älter als 2 Monate ist. Medien auf 37 °C vorwärmen und alle Eingriffe an einem auf 38 °C eingestellten Gleitwärmer durchführen. Stellen Sie sicher, dass Gametozytenkulturen nicht für längere Zeit aus dem Inkubator sind, um Temperaturschwankungen zu minimieren.
- Säen Sie die Gametozytenkultur (Tag 0) mit gemischter asexueller Feederkultur bei 0,3-1% Parasitemie bei 4% Hämatokrit.
- Um eine Sechs-Well-Gametozytenkultur aufzubauen, zentrifugieren Sie 5 ml Feederkultur bei 500 x g für 5 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Pellet in 30 ml vollständigem Medium.
- 1,2 ml verpackte Erythrozyten hinzufügen, mischen und 5 ml in jede Vertiefung der 6-Well-Platte geben und in einem Kerzenglas bei 37 ° C inkubieren.
HINWEIS: Die oben beschriebene Gametozytenkultur basiert auf einer gemischten asexuellen Feederkultur mit 5% Parasitemie. - Wechseln Sie die Medien täglich für 15-18 Tage, ohne zuzüglich frischem Blut, indem Sie vorsichtig etwa 70-80% Kulturüberstand absaugen, um die Entfernung von Blutzellen zu vermeiden.
- Fügen Sie jedem Bohrloch 5 ml frisches komplettes Medium hinzu. Fügen Sie beim Medienwechsel langsam Medien mit einer serologischen Pipette an der Wand des Brunnens hinzu, um die abgesetzte RBC-Schicht nicht zu stören.
HINWEIS: Da während des Medienwechsels 1-2 ml des Kulturmediums verbleiben, liegt das Gesamtkulturvolumen nach Tag 1 der Gametozytenkultur zwischen 6-7 ml. Bei der Anpassung dieses Protokolls ist es ratsam, jeden zweiten Tag Blutausstriche zu machen, um sicherzustellen, dass Parasiten gesund sind. Die Herstellung eines Blutausstrichs kann oft die Anzahl der Zellen in Kultur erschöpfen. Um dies zu vermeiden, zeichnen Sie ein sehr kleines Volumen. - Um die reife Gametozytämie zu quantifizieren, machen Sie den Blutabstrich zwischen den Tagen 15-18 und zählen Sie die Anzahl der reifen Gametozyten unter der Gesamtzahl der Zellen.
HINWEIS: Reife Gametozyten können leicht mit ihrer klassischen Halbmondform mit glatten abgerundeten Enden identifiziert werden (Abbildung 5B). - Zählen Sie mindestens 1.000 Erythrozyten und berechnen Sie den Prozentsatz der Erythrozyten, die mit reifen Gametozyten infiziert sind.
- Um Exflagellationsereignisse zu quantifizieren, nehmen Sie 200 μL Gametozytenkultur und zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei RT in einem vorgewärmten Röhrchen. Resuspendieren Sie das Pellet in 20 μL Exflagellationsmedien und übertragen Sie es auf einen Glasobjektträger mit Abdeckschein.
- Beginnen Sie nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur mit der Zählung der Exflagellationszentren im Phasenkontrastmodus mit dem 10-fachen Objektiv. Zählen Sie Exflagellationszentren in mindestens vier Feldern, um Exflagellationsereignisse zu berechnen.
ANMERKUNG: Eine detaillierte Methodik des Exflagellationsassays wurde zuvor von Delves et al10beschrieben. Mehr als 20 Exflagellationsereignisse pro Feld gelten als geeignet für den Membranfütterungsassay. - Gametozytenkulturen haben typischerweise ein niedriges Maß an asexuellen Reststadien. Wenn das Experiment reine Gametozyten erfordert, behandeln Sie die Kultur mit 50 mM N-Acetylglucosamin.
- Fügen Sie 0,5 ml N-Acetylglucosamin aus 10x Stammlösung pro Vertiefung (5 ml) für mindestens 3 Tage hinzu, während Sie die Medien wechseln, um die verbleibenden asexuellen Stadien zu klären.
HINWEIS: N-Acetylglucosamin kann auch die Invasion sexuell begangener Merozoiten blockieren, die Behandlung sollte erst nach Tag 7 der Gametozytenkultur eingeleitet werden.
4. Mückeninfektion mit Standard-Membranfütterungsassay (SMFA)
HINWEIS: In vitro gezüchtete Gametozyten können mit Glasmembranfütterern an Moskitos verfüttert werden. Der Aufbau des Blutfütterungsapparates ist in Abbildung 2 dargestellt. Wie oben beschrieben, halten Sie die Gametozyten immer bei 37 °C, um eine Aktivierung zu vermeiden, bevor sie von Moskitos aufgenommen werden. Vorwärmung von Kunststoffwaren, Reagenzien und Geräten mit Gametozytenkultur auf 37 °C.
- Verhungern Sie 3-7 Tage alte weibliche Anopheles-Moskitos, indem Sie ihr Zuckerwasser für 6,5 h oder über Nacht vor der Membranfütterung entfernen.
- Übertragen Sie sie mit motorisierten oder mundbetriebenen Aspiratoren auf Pappbecher, die mit einer doppelten Schicht feinmaschigen Gewebes bedeckt sind. Alternativ können Sie Moskitos in einem kalten Raum oder Kühlschrank niederschlagen, um sie in die Pappbecher zu übertragen.
HINWEIS: Ein Pint-Körbchen kann verwendet werden, um bis zu 100 Moskitos zu füttern. - Zentrifuge gewaschen Blut bei 500 x g für 5 min bei RT und entsorgt Überstand. Fügen Sie eine gleiche Menge frisch aufgetautes menschliches Serum hinzu, um das Vollblut zu rekonstituieren. Die Blut-Serum-Mischung für 30 min in das bei 37 °C eingestellte Wasserbad geben.
- Die Gametozytenkultur in ein vorgewärmtes 15-ml-Kunststoffröhrchen geben und bei 600 x g für 5 min bei 37 °C zentrifugieren. Aspirieren Sie vorsichtig den Kulturüberstand und machen Sie einen dünnen Blutausstrich, um die reife Gametozytämie wie oben beschrieben zu bestimmen.
- Um die endgültige Blutfütterung herzustellen, verdünnen Sie das Gametozytenpellet auf eine gewünschte Konzentration unter Verwendung von rekonstituiertem Vollblut. Halten Sie die Blutfütterung bei 37 ° C, bis Moskitos und Glasfütterer bereit sind.
HINWEIS: Reife Gametozytenkonzentrationen zwischen 0,02 und 0,3% sorgen für eine konsistente Mückeninfektiosität. Es ist jedoch ratsam, die Gametozytämie zu optimieren, indem verschiedene Konzentrationen an verschiedene Becher von Moskitos verfüttert werden. - Stellen Sie sicher, dass die Glasmembrandosierer zwei Öffnungen haben, eine schmale obere Öffnung, um das infizierte Blut zu pipettieren, und eine untere Öffnung für die Membranbefestigung. Schneiden Sie einen Paraffinfilm in Quadrate, dehnen Sie ihn auf eine gleichmäßige Dicke und kleben Sie ihn an die Öffnung des Feeders, um ein versiegeltes Fach für die Blutzufuhr zu schaffen.
- Befestigen Sie Membrandosierer an einem zirkulierenden Wasserbad, indem Sie auf jeder Seite Schläuche anschließen, um den Durchgang von warmem Wasser durch den Mantel um die Membranzuführungen zu ermöglichen.
HINWEIS: Mehrere Glasdosierer können in Reihe geschaltet werden, um mehreren Fütterungsbedingungen gerecht zu werden. - Nachdem alle Feeder an das Wasserbad angeschlossen sind, schalten Sie es ein und untersuchen Sie es auf Lecks.
- Platzieren Sie Feeder in der Mitte des Netzes auf Mückenbechern mit Membranseite nach unten und sichern Sie Feeder mit Klemmen oder Klebeband. Stellen Sie sicher, dass die Membrandosierer nicht zur Seite geneigt sind, um eine gleichmäßige Verteilung des Blutfutters und einen engen Kontakt des gesamten Futters mit dem Netz an den Bechern zu ermöglichen, damit Moskitos aus dem Inneren des Bechers gelangen können.
- Etwa 200–1000 μL Blutzufuhr werden in Membrandosierer pipettiert.
HINWEIS: Das Volumen des Blutfutters variiert je nach Anzahl der Moskitos und Größe des Membranfutters. Für 14 mm Glasfutter und 50 Mücken verwenden Sie 200 μL Blutfutter. - Stellen Sie sicher, dass das Laden ordnungsgemäß durchgeführt wurde und die Blutzufuhr auf die Paraffinfolie gelegt wurde.
- Lassen Sie Moskitos etwa 30 Minuten lang mit intermittierender Überwachung füttern.
HINWEIS: Blasen Sie Moskitos vorsichtig mit dem Mund, um CO2 bereitzustellen, das eine verbesserte Bluternährung induziert. - Entfernen Sie nicht gefütterte Moskitos, indem Sie sie in einem kalten Raum niederschlagen. Untersuchen Sie Moskitos sichtbar auf Ausbuchtung und Rötung im Bauch als Zeichen für frische Blutmahlzeit. Alternativ können Sie einen mundbetriebenen Sauger verwenden, um ungefütterte Moskitos selektiv zu entfernen.
- Entsorgen Sie nicht gefütterte Moskitos, nachdem Sie sie in 70% Ethanol eingeweicht haben, und legen Sie gefütterte Moskitos zurück in den Mückenbecher.
- Doppelkäfig-Mückenbecher und übertragen Sie sie in einen Inkubator mit hohem Containment, der für Moskitos bestimmt ist, die mit dem menschlichen Malariaparasiten P. falciparuminfiziert sind.
- Legen Sie Wattepads, die mit 10% Saccharose getränkt sind, auf die Moskitobecher, um sie mit Zuckermehl zu versorgen. Ersetzen Sie die Wattepads jeden zweiten Tag, bis die Moskitos seziert sind.
5. Mücken-Mitteldarmdissektion und Oozystenlastquantifizierung
HINWEIS: Ein Schema der Mitteldarmdissektion ist in Abbildung 3 dargestellt.
- 7-8 Tage nach der Blutfütterung Mückenbecher für 10 min auf 4 ° C übertragen, um Moskitos niederzuschlagen.
- Übertragen Sie Moskitos, die mit einer feinen Pinzette seziert werden sollen, in eine Petrischale auf Eis.
- Weichen Sie Moskitos in 70% Ethanol für 1-2 min ein, um sie einzuschläfern. Fügen Sie PBS in die Petrischale hinzu, um das Ethanol abzuwaschen, nachdem alle Moskitos eingeschläfert wurden.
HINWEIS: Stellen Sie vor dem Hinzufügen von PBS sicher, dass alle Moskitos tot sind. - Montieren Sie einen Glasobjektträger auf dem Seziermikroskop und pipettieren Sie 100 μL PBS in der Mitte. Übertragen Sie vorsichtig eine Mücke mit einer Pinzette in das PBS und lassen Sie den Rest der Mücken in der Petrischale auf Eis.
- Halten Sie mit einer feinspitzigen Pinzette das dritte Segment des Abdomens vom hinteren Ende der Mücke und halten Sie mit der zweiten Pinzette die Verbindung zwischen Thorax und Abdomen. Ziehen Sie den Bauch vorsichtig, bis der Mitteldarm vollständig freigelegt ist.
- Entsorgen Sie den Rest des Mückengewebes und übertragen Sie den Mitteldarm auf einen sauberen Objektträger, der ein paar Tropfen PBS enthält.
- Wenn die gewünschte Anzahl von Moskitos seziert wurde, entfernen Sie das PBS vorsichtig mit einer Pipette und färben Sie den Mitteldarm mit 0,2% Mercurochrom für 2-5 min.
- Entfernen Sie überschüssiges Mercurochrom und richten Sie die Mitteldärme auf dem Objektträger aus, damit sie leicht unter dem Lichtmikroskop sichtbar gemacht werden können.
- Legen Sie einen Deckzettel und zählen Sie Oozysten auf jedem Mitteldarm unter 10x Objektiv. Oozysten färben sich rosa und sind kreisförmig(Abbildung 6C).
6. Mücken-Speicheldrüsen-Dissektion und Sporozoiten-Belastungsquantifizierung
ANMERKUNG: Ein Schema der Speicheldrüsendissektion ist in Abbildung 4 dargestellt.
- 14-18 Tage nach der Blutfütterung die Mückenbecher für 10 minuten bei 4 ° C platzieren.
HINWEIS: Es ist wichtig zu warten, bis sich die Moskitos nicht mehr bewegen. - Während Sie darauf warten, dass sich moskitos nicht mehr bewegen, bereiten Sie Werkzeuge für die Dissektion vor.
- Legen Sie eine Glasplatte auf einen Dissektionsmikroskoptisch. Bereiten Sie 2 Sätze 25 G Nadeln auf 1 ml Spritzen und einer 9 " Pasteur Pipette und Gummibirne vor. Legen Sie 70% EtOH und Dissektionsmedium (HBSS, L-15 oder PBS) in eine 6-Well-Platte.
- Im Kühlraum anästhesierte Moskitos in eine 6-Well-Platte mit 70% EtOH übertragen. Bewegen Sie Moskitos vorsichtig mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass alle Moskitos durchnässt sind, und übertragen Sie die Moskitos dann mit einer Pinzette auf das Seziermedium, um 70% EtOH abzuwaschen.
- Gehen Sie in den Sezierraum und legen Sie Moskitos auf eine Seziermikroskopbühne.
- Entfernen Sie überschüssiges Medium von Moskitos, fügen Sie während der Dissektion nach Bedarf neues Medium hinzu. Vermeiden Sie, dass Moskitos austrocknen, aber zu viel Flüssigkeit erschwert die Dissektion.
- Halten Sie mit 2 Spritzen mit 25 G-Nadeln den Thorax und den Kopf der Mücke und ziehen Sie den Kopf vorsichtig nach oben, um die Speicheldrüsen aus dem Thorax zu ziehen.
- Trennen Sie die Speicheldrüsen von Kopf und Thorax mit einer Nadel.
- Legen Sie vorübergehend speicheldrüsen in einem separaten Mediumtröpfchen auf der Glasplatte.
- Nachdem Sie 15-20 Speicheldrüsen seziert haben, sammeln Sie sie mit der Pasteurpipette in einem Schlauch mit niedrigem Rückhaltevermögen.
HINWEIS: Sobald die Speicheldrüsen in den breiten Teil der Pasteurpipette gelangen, haften sie am Glas und es ist schwierig, sie herauszubekommen. - Pellet-Speicheldrüsen durch kurze Pulsdrehung in einer Tischzentrifuge. Entfernen Sie das Dissektionsmedium, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie 100 μL neues Dissektionsmedium hinzu.
- Mahlen Sie Speicheldrüsen mit einem kleinen Homogenisator für 1 min, um Sporozoiten zu erhalten.
- Legen Sie 10 μL Dissektionsmedium, das Sporozoiten enthält, auf ein Hämozytometer.
HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Speicheldrüsen muss man die Sporozoitlösung vor dem Zählen möglicherweise mit Medium auf 1:10 bis 1:50 verdünnen. - Zählen Sie die Anzahl der Sporozoiten in zwei der vier Quadranten und berechnen Sie die Anzahl der Sporozoiten / Mücken:
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Representative Results
Hier präsentieren wir Ergebnisse aus einer Reihe von Membranfuttermitteln unter Verwendung von P. falciparum NF54-Gametozytenkulturen, die mit dem obigen Protokoll erzeugt wurden (siehe Abbildung5). Die Gametozytenkultur wurde mit etwa 0,5% asexueller Kultur im Mischstadium an Tag 0 begonnen, die bis Tag 4 und Tag 5 zu einer maximalen Parasitemie von etwa 15% anwuchs. Wie in Abbildung 5A bei dieser hohen Parasitämie gezeigt, werden die Parasiten gestresst und die asexuelle Stadienkultur stürzt ab. Dieser Stress führt jedoch gleichzeitig zur Induktion der Gametozytogenese. Frühe Gametozyten erschienen nach Tag 6 und Tag 7 und asexuelle Parasitemie nahm langsam ab, blieb aber auf einem niedrigen Niveau. Das Vorhandensein von Parasiten im asexuellen Stadium hatte keinen Einfluss auf Mückenfütterungsexperimente. Sollen Gametozyten jedoch in Experimenten verwendet werden, die Reinkulturen erfordern, wie z.B. Arzneimittelsensitivitätsassays und proteomische oder transkriptomische Studien, können asexuelle Reststadien durch Behandlung mit 50 mM N-Acetylglucosamin entfernt werden. Die Mehrheit der Gametozyten reift bis Zum 15. Tag auf Stadium V heran, zu welchem Zeitpunkt sie für Moskitos infektiös werden und bereit waren, gefüttert zu werden. Repräsentative Bilder von Giemsa-gefärbten Blutausstrichen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beginn der Gametozytenkultur sind in Abbildung 5B dargestellt.
Zwischen 8 und 10 Tagen nach der Blutfütterung wurden Moskitos seziert, um die Prävalenz und Intensität der Infektion zu bestimmen. Die Prävalenz ist der Prozentsatz der gefütterten Moskitos, die Oozysten haben, während die Intensität die Anzahl der Oozysten ist, die in jeder Mücke gefunden werden. Beides sind wichtige Indikatoren für den Erfolg des Feeds. Daten von 5 unabhängigen Mückenfutter sind in Abbildung 6 dargestellt. Die Futtermittel wurden ausgewählt, um die normale Variation der Infektiosität nach der Fütterung mit 0,3% reifen Gametozyten aus der Kultur von P. falciparum NF54 am Tag 16 zu zeigen. Oozystenintensitäten liefern quantitative Daten zur Bestimmung der Mückeninfektiosität von Gametozyten und die Prävalenz zeigt den Prozentsatz der gefütterten Moskitos, die infiziert wurden. Diese Daten können verwendet werden, um Transmissionsblocker zu bewerten und Ziele für transmissionsblockierende Impfstoffe und Medikamente zu identifizieren und zu charakterisieren. Die Anzahl der Oozysten variierte sowohl innerhalb als auch zwischen den Experimenten und erforderte 25-50 Moskitos pro Kohorte, um die Wirkung verschiedener experimenteller Bedingungen zu bestimmen.
Oozystenintensitäten werden als Endpunkt der meisten Transmissionsblockierungsassays und -strategien betrachtet, jedoch ist die Anzahl der Sporozoiten in der Regel wichtig für die Sporozoitenbiologie und für Leberstadienstudien. Tabelle 1 zeigt die durchschnittliche Anzahl von Sporozoiten, die pro Mücke aus 12 unabhängigen Blutfütterungen gewonnen werden. Wie in der Tabelle gezeigt, war die durchschnittliche Anzahl der Sporozoiten konsistent, jedoch gab es ein Experiment, bei dem wir keine Sporozoiten erhielten, was ein gelegentliches Versagen des Assays darstellt.
Abbildung 1: Workflow der P. falciparum-Gametozytenkultur und des Membranfütterungsprotokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Aufbau der Mückenblutfütterung. (A) Glaszufuhr und rechteckiges Stück Paraffinfolie (B) Zwei Glaszufuhren, die vor und nach der Parafilmmembranbefestigung angezeigt werden (C) Glaszufuhr auf der Oberseite des Moskitobechers und verbunden mit einem Umlaufwasserbad. (D,E) Pipettieren von Blutzufuhr in den Glasdosierer (F) Unteransicht des Glaszufuhrers zeigt homogene Verteilung der Blutzufuhr (G) Mehrere Mücken, die sich durch parafilmmembran ernähren. (H) Draufsicht auf Mückenbecher nach der Fütterung, die Blutstropfen zeigen, die von den fütternden Moskitos am Boden des Bechers ausgeschieden werden. Maßstabsleiste = 10 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Grafische Darstellung der Schritte der Mückenmitteldarmdissektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Grafische Darstellung, die die Schritte der Speicheldrüsendissektion von Mücken zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: P. falciparum Gametozytenkultur und Oozystenvisualisierung am infizierten Mückenmitteldarm. (A) Zeitverlauf der 15-tägigen Gametozytenkultur, die eine steile Vermehrung asexueller Stadien bis zum Höhepunkt der Parasitemie innerhalb der ersten 4 Tage zeigt, gefolgt von Gametozytogenese und Reifung im Laufe der Zeit. (B) Geimsa-gefärbter dünner Blutausstrich mit verschiedenen Stadien der Gametozytenkultur, Tag 1 frühes asexuelles Stadium, Tag 4 Peak asexuelle Parasitemie, Tag 6 gestresste Kultur aufgrund hoher Parasitenbelastung, Tage 9 & 12 frühe Gametozyten und Tag 15 mit reifen männlichen und weiblichen Gametozyten. Morphologisch waren Gametozyten im Frühstadium nicht von asexuellen Stadien zu unterscheiden, aber das späte Stadium II zeigte die halbmondförmige Form mit spitzen Enden und verlängerte sich, als sich der Parasit in Stadium III und IV entwickelte. Reife Gametozyten im Stadium V zeichneten sich jedoch durch eine klassische Halbmondform mit abgerundeten Enden und minimaler Sichtbarkeit der Wirtszellen aus14. Maßstabsleiste = 10 mm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: P. falciparum Oozysten zählt pro Mückenmitteldarm. (A) Grafik zeigt oozystenzahlen im Laufe der Jahre, für jedes Experiment wurden Moskitos mit 0,3% Gametozyten gefüttert und Mitteldarm wurden am Tag 8 nach der Blutfütterung seziert. Jeder Punkt stellt die Anzahl der Oozysten aus einzelnen Mitteldärmen dar und die horizontale Linie stellt den Medianwert dar. (B) Die Tabelle zeigt die mittlere Oozystenzahl, die Prävalenz infizierter Moskitos und den Infektionsbereich. (C) Bilder, die Oozysten auf Mückenmitteldarm aus zwei getrennten Blutfütterungsexperimenten mit unterschiedlichen Vergrößerungen zeigen. Maßstabsleiste = 150 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Experiment | Tag der Dissektion (nach der Blutfütterung) | Mittlere Sporozoite/Mücke |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
Tabelle 1: Durchschnittliche Anzahl der Speicheldrüsen sporozoiten pro Mücke für 12 unabhängige Zyklen über einen Zeitraum von 2 Jahren. A. stephensi Moskitos wurden mit 0,3% P. falciparum Gametozyten gefüttert und 15-20 Moskitos wurden zwischen den Tagen 14-17 nach der Blutfütterung seziert. Durchschnittliche Sporozoitenzahlen pro Mücke werden angezeigt.
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Discussion
Die hier beschriebenen Methoden werden am Johns Hopkins Malaria Research Institute seit mehr als 10 Jahren erfolgreich eingesetzt15,16,17,18,19,20,21,22. Gametozyten, die unter Verwendung dieses Protokolls hergestellt wurden, wurden für Gametozytocidal-Assays22mit hohem Durchsatz, für Proteom-15 sowie für Transkriptom-23-Studien verwendet. Ein Hauptgrund für die Entwicklung dieser Methoden ist jedoch die Verwendung der reifen Gametozyten zur Infektion von Moskitos für Studien an Mückenstadien und Sporozoiten23,24,25,26. Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll der Erzeugung reifer P. falciparum-Gametozyten und der Infektion von Moskitos mit Glasmembran-Feedern. Diese Methoden sind entscheidend für jedes Labor, das an Transmissionsblockierungsstrategien, Sporozoitenstadien und präerythrozytären Leberstadien von P. falciparum arbeitet.
Ifediba und Vanderberg beschrieben 1981 die Langzeitkultur von P. falciparumin Gegenwart von 50 μg/ml Hypoxanthin, die hochinfektiöse reife Gametozytenhervorbrachte 27. Seitdem gab es zahlreiche Publikationen, die Methoden zur Herstellung von Gametozyten für verschiedene Anwendungenbeschreiben 9,10,11,12. Die meisten dieser Publikationen verwenden zuvor beschriebene Gametozytogenese-induzierende Bedingungen, um die Erträge zu erhöhen. Unter Verwendung konditionierter Medien kann die Betonung der Kultur durch plötzliche Parasitenzunahme, Abfall des Hämatokrits zur Nachahmung von Anämie, Lyse roter Blutkörperchen und Verdrängung der Logphase durch Bulk-Up verwendet werden, um die Gametozytogenese zu induzieren. Die hier beschriebene Methode ist einfach und zeitgetestet. Initiieren Sie die Gametozytenkultur mit 0,3-1% asexueller Parasitemie bei 4% Hämatokrit und wechseln Sie täglich bis zum 15. bis zum 18. Tag das Medium. Um konsistente Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, die Gametozytenkultur mit Parasiten im asexuellen Stadium mit geringer Passage zu beginnen, frische Erythrozyten (<1 Woche) zu verwenden und sicherzustellen, dass die Kulturtemperatur während des Medienwechsels nicht schwankt. Da der Entwicklungsprozess von Falciparum-Gametozyten unter statischen Bedingungen extravaskulärer Räume im Knochenmark4,5sequestriertabläuft,ist es wichtig, die besiedelten Erythrozytenschichten während der gesamten Kulturperiode nicht zu stören.
Die Kultivierung von P. falciparum-Gametozyten mit Konsistenz ist anspruchsvoll, aber sie dazu zu bringen, Moskitos zu infizieren, stellt eine weitere Komplexitätsebene dar. Die Membranfütterung unterliegt mehreren anderen Variablen als Gametozyten, wie Alter und Fitness der Mücke, Mitteldarmmikrobiota und Fressverhalten28,29. Normalerweise zeigen SMFA-Daten ein hohes Maß an Variabilität und erfordern eine große Anzahl von Moskitos, um Die Auswirkungen verschiedener experimenteller Bedingungen zu identifizieren11,28. Die Verwendung einer Kultur mit niedriger Passage für Gametozyten, gesunde 3 - 6 Tage alte Moskitos und ein optimiertes Membranfütterungsprotokoll können bei Variationen der Oozystenzahl helfen.
Das hier beschriebene Protokoll sowohl für die Gametozytenkultivierung als auch für die Membranfütterung wurde über viele Jahre optimiert. Diese Methoden liefern eine detaillierte Beschreibung für die Gewinnung reifer übertragungskompetenter Gametozyten, einen Standard-Membranfütterungstest, eine Mückenmitteldarmdissektion und Oozystenquantifizierung sowie eine Speicheldrüsendissektion und Sporozoitenquantifizierung. Diese Protokolle sind konsistent in Bezug auf die Anzahl der Gametozyten, die benötigt werden, um eine zuverlässige Mückeninfektiosität und robuste Oozystenzahlen und Sporozoitenerträge zu gewährleisten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Bloomberg Philanthropies für die finanzielle Unterstützung des Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Diese Arbeit wäre ohne die Expertise der JHMRI-Insekten- und Parasitologie-Kerneinrichtungen nicht möglich gewesen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
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