Summary
חקירות מפורטות על שלבי יתושים של טפילי מלריה הם קריטיים לתכנון אסטרטגיות חסימת שידור יעילות. פרוטוקול זה מדגים כיצד לתרבות ביעילות gametocytes זיהומיות ולאחר מכן להאכיל את המשחקים האלה יתושים כדי ליצור שלבי יתושים של P. falciparum.
Abstract
מלריה נותרה אחת הבעיות החשובות ביותר לבריאות הציבור, הגורמת לתחלואה ותמותה משמעותיות. מלריה היא מחלה המועברת על ידי יתושים המועברת באמצעות עקיצה מדבקת מיתוש אנופלס הנקבה. בקרת מלריה בסופו של דבר תיסתמך על מספר רב של גישות, הכוללות דרכים לחסום את ההעברה אל יתושים, דרך וממנה. כדי לחקור את שלבי היתושים של טפילי מלריה במעבדה, מיטבנו פרוטוקול לתרבות פלסמודיום פאלציפרום גמטוציטים מדבקים מאוד, שלב טפיל הנדרש להעברת הפונדקאי האנושי לווקטור היתושים. P. falciparum gametocytes בוגרים באמצעות חמישה שלבים שונים מבחינה מורפולוגית, אשר לוקח בערך 1-2 שבועות. תרבות Gametocyte המתוארת בפרוטוקול זה הושלמה ב 15 ימים והם זיהומיות יתושים מימים 15-18. פרוטוקולים אלה פותחו כדי לשמור על מחזור מתמשך של gametocytes מוסמך זיהום ולשמור על אספקה רציפה של שלבי יתושים של הטפיל. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה של תרבות gametocyte וכיצד להדביק יתושים עם טפילים אלה באמצעות מזינים קרום זכוכית.
Introduction
מלריה נגרמת על ידי טפילים פלסמודיום והוא מועבר המארחים החולייתיים שלהם באמצעות נשיכה זיהומית של יתושים אנופלס נקבה. על פי דו"ח ארגון הבריאות העולמי לשנת 2019( WHO), היו כ -405,000 מקרי מוות, מתוך סך של 228 מיליון מקרים של מלריה1. רוב מקרי המוות הקשורים למלריה התרכזו באזור אפריקה, במיוחד בקרב ילדים מתחת לגיל חמש. בעוד ששיעור השכיחות הכולל של מלריה ירד ברחבי העולם משנת 2010, בשנים האחרונות חלה ירידה ואסטרטגיות בקרה נוספות נחוצות בדחיפות כדי לחסל את המחלה.
שלבי דם א-מיניים מחזוריים של טפילים מלריה גורמים לפתוגנזה של מחלות ותת-קבוצה קטנה של אלה מתבדלים לגמטוציטים נשיים וזכריים. פלסמודיום פאלציפרום gametocytes הם ייחודיים בטבע כפי שהם לוקחים 7-10 ימים לפתח דרך חמישה שלבים שונים מבחינה מורפולוגית. גמטוציטים לא בוגרים משלב I ועד IV מופרדים בפרנצ'ימה של מח עצם ונשארים ברובם נעדרים מהמחזור ההיקפי2,3,4,5. אריתרוציטים נגועים ב gametocytes שלב בוגרים משתחררים במחזור הדם ומסתובבים בחופשיות כדי להילקח על ידי יתושים. ברגע שבתוך היתושים, הגמטוציטים מופעלים, באמצעות שינוי בטמפרטורה ובחשיפה לסביבת midgut, הופכים לגמטים נקביים וזכרים ומתחילים בפיתוח שלבי היתושים, אשר מגיע לשיאו עם השלבים ההדבקים של ספורוזויטים בבלוטות הרוק של היתושים6,7.
מאז טרייגרוג'נסון 8 תיאר שיטה סטנדרטית לתרבות P. falciparum, מחקרים על שלבי הדם הא-מיניים התקדמו מאוד. עם זאת, היעדר מערכת תרבות אמינה לשלבים מיניים הקשה על לימוד משחקי P. falciparum, ביולוגיה של שידור ושלבי יתושים. בשנים האחרונות פורסמו מספר שיטות אשר סייעו למעבדות בהקמת תרבויות gametocyte9,10,11,12. כתב יד זה מתאר פרוטוקול סטנדרטי ואמין לתרבות P. falciparum gametocytes שיכולים לייצג משאב בעל ערך לקהילת המחקר במלריה. שיטה זו מאפשרת ייצור חזק של gametocytes בוגר ומדבק אשר יחד עם פרוטוקול האכלת יתושים סטנדרטי, תוצאות זיהום יתושים אמין מאוד. שיטות אלה הוקמו כדי לשמור על אספקה רציפה של gametocytes, וטפילים בשלב יתושים. בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול תרבות gametocyte יסודי (איור 1),הכנת מאכילי קרום זכוכית וזיהום של יתושים באמצעות מאכילי ממברנות אלה (איור 2),ניתוח של midgut (איור 3) ובלוטת הרוק של יתושים (איור 4), וכימות זיהום יתושים לאחר אמצע וניתוח בלוטת הבריח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אוספי הדם המתוארים להלן אושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. P. falciparum הוא תרביתות RBCs טרי בתנאים סטריליים במתקן ברמה בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) וזהירות משמשת לטיפול בחומרים ביולוגיים. לאחר כל שלב הכולל דם או מוצרי דם, כל כלי פלסטיק או כלי זכוכית נשטפים עם 10% אקונומיקה בתוך מכסה המנוע לפני סילוק נאות.
1. ריאגנטים והכנה
- טפיל לבודד P. falciparum NF54 (ראה טבלה של חומרים) שימש, אשר יכול לייצר gametocytes זיהומיות עד חודשיים בזמן בתרבות רציפה.
הערה: לא כל קווי הטפיל המותאמים לתרבות מייצרים גיימטוציטים, ומבודדי NF54 במעבר נמוך הם עקביים ביותר. - O+ אריתרוציטים: לדלל דם שלם על ידי הוספת נפח שווה של מדיה RPMI 1640 וצנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ברוטור נדנדה החוצה עם deacceleration להגדיר ב 0. הסר בזהירות את מעיל supernatant ו באפי (רצועה לבנה בין פלזמה אריתרוציטים ארוזים, אשר מכיל את רוב תאי הדם הלבנים טסיות) ולהוסיף נפח שווה של RPMI. חזור על שלב הכביסה פעמיים ולאחר הכביסה הסופית להוסיף נפח גלולה אחת של RPMI כדי לקבל 50% המטוקריט לאחסון ב 4 °C (70 °F).
הערה: Gametocytes בוגרים על פני תקופה של שבועיים מה שהופך את זה קריטי להתחיל תרבויות עם אריתרוציטים טריים, בדרך כלל אריתרוציטים שצוירו בתוך שבוע עובד טוב. - O+ סרום אנושי: יש לאסוף לפחות 6 יחידות של סרום יחד כדי למזער את ההשפעה של שונות נורמלית בסרום מאנשים שונים. לחטא סרום אנושי מאוחסן באמצעות צלוחיות סינון 0.2 מיקרומטר. Aliquot בחלקים של 50 מ"ל או פחות בהתבסס על הצורך ולאחסן ב -20 °C (70 °F).
הערה: אריתרוציטים וסרום צריכים להיות מסוג דם תואם לתרבויות P. falciparum. - 500x היפוקסנתין (100 מ"ל) פתרון: להמיס 0.5 גרם של היפוקסנתין ב 100 מ"ל של 1 M NaOH. מסנן לעקר ולעשות 5-10 מ"ל aliquots לאחסון. ניתן לאחסן מניות עד שנה ב-20 °C (50 °F) ועד שבועיים ב-4 °C (70 °F).
- סודיום ביקרבונט (אופציונלי): יש להמיס 7.5 גרם נתרן ביקרבונט ב-100 מ"ל של מים ציוניים של תרבית רקמות ומסנן לחטא עם מסנן 0.2 מיקרומטר.
הערה: פרוטוקול זה משתמש בשיטת צנצנת הנרות כדי לספק תנאים מיקרואורופיליים עבור P. falciparum בתרבות הפריה ויטרו ואינו דורש סודיום ביקרבונט. עם זאת, אם טפילים מתורבתים באמצעות תערובת גז מלריה (5% O2, 5% CO2 ו 90% N2), חשוב להשלים מדיה תרבות עם 0.2% סודיום ביקרבונט. - מדיה מלאה: כדי להכין 500 מ"ל של מדיה מלאה, להוסיף 1 מ"ל של פתרון היפוקסנתין ו 50 מ"ל של סרום אנושי במאגר ל 500 מ"ל של RPMI 1640. יש להוסיף 15 מ"ל של 7.5% נתרן ביקרבונט אם משתמשים בתערובת גז מלריה. יש לאחסן מדיה מלאה ב- 4 °C (7%), ולהשליך אם צבע המדיה המלאה משתנה לכתום לוורוד. כדי למנוע בזבוז, הפוך מספיק מדיה מלאה לשימוש בתוך שלושה ימים.
- מדיית Exflagellation (אופציונלי): להפוך exflagellation או ookinete מדיה על ידי המסת 200 מ"ג NaHCO3, 5 מ"ג היפוקסנתין ו 100 μL של חומצה קסנתורינית (מ 100 mM מלאי במים) ל 100 מ"ל של מדיה לא שלמה (RPMI 1640 עם גלוטמין ו HEPES).
הערה: Exflagellation הוא התהליך של היווצרות gamete זכר בתוך midgut של יתוש אנופלס נקבה כמה דקות לאחר שהוא לוקח ארוחת דם נגוע gametocytes. גיימטוציטים זכרים של פלסמודיום מעוררים 8 גיימטים זכרים לאחר אירוע התרוממותמות. במבחנה, תהליך זה מתרחש באופן ספונטני כאשר טמפרטורת התרבות יורדת לטמפרטורת החדר (RT) וניתן לראות ב gametocytes בוגרים תרבותית. - N-אצטילגלוקוסאמין (אופציונלי): הפוך פתרון מלאי 500 mM של N-אצטילגלוקוסאמין במים או מדיה לא שלמה, aliquot ולאחסן ב -20 °C (20 °F).
- פתרונות NaCl: להמיס 0.9 גרם, 1.6 גרם ו 12 גרם NaCl ב 100 מ"ל של תרבות רקמות ציון deionized מים כדי להפוך 0.9%, 1.6% ו 12% NaCl פתרונות. מסנן לחטא עם מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 °C (50 °F).
2. תרבות במה א-מינית P. falciparum
- כדי להתחיל תרבות טפילים, להסיר מספוא קפוא מעבר נמוך של P. falciparum NF54, ממיכל החנקן הנוזלי ולהפשיר במהירות באמבט מים להגדיר ב 37 °C (50 °F).
- העבר את התכולה (~1 מ"ל) לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל והוסף 0.2 נפח של 12% NaCl מחמם מראש, תוך ניעור עדין של הצינור כדי להבטיח ערבוב אחיד. דגירה במשך 5 דקות ב RT עם רועד עדין לסירוגין.
- הוסיפו 9 כרכים של 1.6% NaCl, תוך המשך ערבוב עדין. צנטריפוגות את התוכן ב 500 x g במשך 5 דקות ב RT, בזהירות להשליך את supernatant. הוסף 9 כרכים של 0.9% NaCl dropwise, תוך הקפדה לערבב באופן עקבי את כדורי הטפיל. צנטריפוגה שוב ב 500 x g במשך 5 דקות ב RT. הסר את טפילים supernatant ו resuspend לתוך 5 מ"ל של מדיה מלאה.
- להעביר את התוכן לבאר אחת של צלחת תרבית רקמות 6 היטב ולהוסיף 100-200 μL של RBCs ארוז.
- תרבית טפילי דגירה ב 37 °C (5 °F) בצנצנת נרות או בתא אינקובטור מודולרי מטוהר עם תערובת גז מיוחדת של 5% O2, 5% CO2 ו 90% N2.
- החלף מדיה מדי יום ונטר את הצמיחה על ידי ביצוע מריחת דם דקה על ידי ציור כמה microliters משכבת RBC התיישבה לאחר תרבות supernatant כבר שאף במהלך שינוי מדיה רגיל.
- השתמש זכוכית סטרילית פסטר pipette לצייר ולאחר מכן הקש במרכז שקופית הזכוכית כדי להעביר טיפה של תרבות לשקופית. הנח שקופית זכוכית נוספת מול הטיפה ומשוך אותה בחזרה כדי ליצור קשר עם RBCs, דוחף אותה במהירות קדימה בתנועה אחת כדי להפוך את ההכפשה דקה של RBC monolayer.
- הנח את השקופית אופקית על מתלה ייבוש והיתר לה להתייבש באוויר. תקן את מריחת הדם על ידי הטלת מתנול מוחלט על הכתם. אפשרו למרוחה הקבועה להתייבש לחלוטין ואז יוצקים בזהירות 10% כתמי גימסה מדוללים טריים במים, עד שכתמי דם מכוסים לחלוטין. אפשר לתאים להכתים במשך כ -15 דקות.
- לשטוף את הכתם עודף על ידי שטיפה של השקופית תחת מי ברז נקיים ולאפשר למגלשות להתייבש במצב אנכי.
- לקבוע טפילים על ידי צפייה כתמי דם דק על מיקרוסקופ באמצעות שמן טבילה 100x המטרה. לספור את מספר אריתרוציטים נגועים בין סך של לפחות 500 RBCs כדי לקבוע אחוז טפילים.
3. תרבות הגמטוציטים P. falciparum
הערה: תרבויות Gametocyte לקחת שבועיים כדי לייצר gametocytes בוגר מדבק יתושים. השלבים של תרבות הגמטוציטים מפורטים באיור 1. P. falciparum מבודד בדרך כלל לאבד את היכולת לייצר gametocyte לאחר לטווח ארוך בתרבות במבחנה13. כדי להבטיח את איכות הגמטוציטים, יש ליזום את התרבות מתרבות מאכיל המעבר הנמוכה, לא יותר מחודשיים מאז ההפשרה. מדיה חמה מראש ל 37 °C (50 °F) ולבצע את כל ההליכים על מחמם שקופיות להגדיר ב 38 °C (50 °F). ודא שתרביות gametocyte אינן מחוץ לאינקובטור לתקופה ממושכת כדי למזער את תנודות הטמפרטורה.
- זרע את תרבות הגמטוציטים (יום 0) באמצעות תרבות מאכיל במה א-מינית מעורבת ב 0.3-1% טפילים ב 4% המטוקריט.
- כדי להגדיר תרבות של שש טוב gametocyte, צנטריפוגה 5 מ"ל של תרבות מאכיל ב 500 x g במשך 5 דקות ב RT. להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 30 מ"ל של מדיה מלאה.
- מוסיפים 1.2 מ"ל של RBCs ארוזים, מערבבים ומחלקים 5 מ"ל לכל באר של צלחת 6 באר ודגרה בצנצנת נרות ב 37 °C (5 °F).
הערה: תרבות Gametocyte שהוקמה לעיל מבוססת על תרבות מזינה במה א-מינית מעורבת ב 5% טפילים. - לשנות מדיה מדי יום במשך 15-18 ימים, ללא תוספת של דם טרי, על ידי שאיפה בזהירות על 70-80% תרבית supernatant כדי למנוע הסרת תאי דם.
- הוסף 5 מ"ל של מדיה מלאה טרייה לכל באר. בעת שינוי מדיה, הוסף לאט מדיה באמצעות פיפטה סרולוגית על קיר הבאר כדי למנוע הפרעה לשכבת RBC המיושב.
הערה: מכיוון ש- 1-2 מ"ל של מדיום התרבות יישאר במהלך שינוי מדיה, נפח התרבות הכולל יהיה בין 6-7 מ"ל, לאחר היום הראשון של תרבות המשחק. תוך התאמת פרוטוקול זה, מומלץ לעשות כתמי דם כל יום חלופי כדי לוודא טפילים בריאים. ביצוע מריחת דם יכול לעתים קרובות לרוקן את מספר התאים בתרבית. כדי למנוע זאת, לצייר נפח קטן מאוד. - כדי לכמת gametocytemia בוגר, להפוך את כתמי הדם בין ימים 15-18 ולספור את מספר gametocytes בוגר בין המספר הכולל של תאים.
הערה: ניתן לזהות בקלות גיימטוציטים בוגרים עם צורת הסהר הקלאסית שלהם עם קצוות מעוגלים חלקים(איור 5B). - לספור מינימום של 1,000 RBCs ולחשב את אחוז RBCs נגועים gametocytes בוגר.
- כדי לכמת אירועי exflagellation, לקחת 200 μL של תרבות gametocyte וצנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב RT בצינור התחמם מראש. resuspend הכדור ב 20 μL של מדיה exflagellation ולהעביר שקופית זכוכית עם פתק כיסוי.
- לאחר 15 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, להתחיל לספור מרכזי exflagellation במצב ניגוד שלב באמצעות המטרה 10x. ספירת מרכזי נשיפה בארבעה שדות לפחות כדי לחשב אירועי התלקחות.
הערה: מתודולוגיה מפורטת של בדיקת exflagellation תוארה קודם לכן על ידי Delves et al10. יותר מ-20 אירועי נשיפה לכל שדה נחשבים מתאימים לבדיקת האכלה ממברנה. - תרבויות Gametocyte בדרך כלל יש רמות נמוכות של שלבים א-מיניים שיורית. אם הניסוי דורש gametocytes טהור, לטפל בתרבות עם 50 mM N-אצטילגלוקוסמין.
- הוסף 0.5 מ"ל של N-אצטילגלוקוסאמין מפתרון מלאי 10x לבאר (5 מ"ל) למשך 3 ימים לפחות תוך שינוי מדיה כדי לנקות שלבים א-מיניים שיורית.
הערה: N-אצטילגלוקוסאמין יכול לחסום פלישה של מרוזויטים מחויבים מינית מדי, הטיפול צריך להיות יזם רק לאחר היום 7 של תרבות gametocyte.
4. זיהום יתושים באמצעות בדיקת האכלה סטנדרטית של ממברנה (SMFA)
הערה: Gametocytes גדל במבחנה ניתן להאכיל יתושים באמצעות מאכילי קרום זכוכית. הגדרת מנגנון האכלת הדם מוצגת באיור 2. כפי שתואר לעיל, תמיד לשמור gametocytes ב 37 °C (50 °F) כדי למנוע הפעלה לפני שהם נבלעים על ידי יתושים. כלי פלסטיק לפני המלחמה, ריאגנטים וציוד משמשים עם תרבות gametocyte עד 37 °C (50 °F).
- להרעיב 3-7 ימים נקבות אנופלס יתושים על ידי הסרת מי הסוכר שלהם במשך 6.5 שעות או לילה לפני האכלת הממברנה.
- מעבירים אותם באמצעות שאיפות ממונעות או מופעלות בפה לכוסות נייר מכוסות בשכבה כפולה של בד רשת עדין. לחלופין, להפיל יתושים בחדר קר או במקרר כדי להעביר אותם לכוסות נייר.
הערה: ניתן להשתמש בכוס בגודל ליטר אחד כדי להאכיל עד 100 יתושים. - צנטריפוגה שטפה דם ב 500 x g במשך 5 דקות ב RT ולהשליך supernatant. הוסף נפח שווה של סרום אנושי שהופשר טרי כדי לשחזר את כל הדם. מעבירים את תערובת הדם והסרום לאמבט המים שנקבע על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- העבר את תרבות gametocyte לצינור פלסטיק 15 מ"ל מחומם מראש צנטריפוגה ב 600 x g במשך 5 דקות ב 37 °C (7 °F). בזהירות לשאוף את התרבות supernatant ולעשות כתמי דם דקים כדי לקבוע gametocytemia בוגר כמתואר לעיל.
- כדי להפוך את ההזנה הסופית בדם, לדלל את כדורי gametocyte לריכוז הרצוי באמצעות דם שלם reconsuted. שמור על הזנת הדם ב 37 °C (50 °F) עד יתושים מאכילי זכוכית מוכנים.
הערה: ריכוזי gametocyte בוגרים בין 0.02 ל -0.3% יספקו הדבקה עקבית של יתושים. עם זאת, מומלץ לייעל gametocytemia על ידי הזנת ריכוזים שונים כוסות שונות של יתושים. - ודא כי מאכילי קרום זכוכית יש שני פתחים, פתח עליון צר כדי pipette את הדם הנגוע ופתח תחתון עבור התקשרות ממברנה. חותכים סרט פרפין לריבועים, נמתחים לעובי אחיד ונצמדים לפתיחת המאכיל כדי ליצור תא אטום להזנת הדם.
- חבר מאכילי ממברנה לאמבט מים במחזור הדם על ידי חיבור צינורות מכל צד כדי לאפשר מעבר של מים חמים דרך הז'קט סביב מאכילי ממברנה.
הערה: ניתן לחבר מספר מאכילי זכוכית בסדרה כדי להתאים לתנאי הזנה מרובים. - לאחר שכל המאכילים מחוברים לאמבט המים, הפעל אותו ובדוק אם יש דליפות.
- מניחים מאכילים במרכז הרשת על כוסות יתושים עם בצד הממברנה כלפי מטה ומזינים מאובטחים באמצעות מלחציים או סרט הדבקה. ודא שמאכילי הממברנה אינם מוטים לאף צד כדי לאפשר אפילו הפצה של הזנת הדם ומגע קרוב של המאכיל כולו עם הרשת על כוסות, כדי לאפשר ליתושים גישה מתוך הכוס.
- פיפטה על 200-1000 μL של הזנת דם לתוך מאכילי ממברנות.
הערה: נפח המזון בדם ישתנה בהתאם למספר היתושים ולגודל מאכיל הממברנה. עבור מאכיל זכוכית 14 מ"מ ו 50 יתושים להשתמש 200 μL של הזנת דם. - ודא ההעמסה נעשתה כראוי והזנת דם היה overlaid על סרט פרפין.
- אפשר ליתושים לאכול כ -30 דקות עם ניטור לסירוגין.
הערה: לפוצץ בעדינות יתושים עם הפה כדי לספק CO2 אשר יגרום האכלה משופרת בדם. - הסר יתושים לא מנודים על ידי הפלתם בחדר קר. בדוק באופן ניכר יתושים עבור בליטה ואדמומיות בבטן כסימן לארוחת דם טרי. לחלופין, השתמש בשאיפה המופעלת בפה כדי להסיר באופן סלקטיבי יתושים לא מנומקים.
- יש להשליך יתושים לא מנודים, לאחר השרייתם ב-70% אתנול והחזירו את היתושים לכוס היתושים.
- כוסות יתושים בכלוב כפול ולהעביר אותם אינקובטור בלימה גבוהה שצוין עבור יתושים נגועים טפיל מלריה אנושי P. falciparum.
- מניחים רפידות כותנה ספוגות ב-10% סוכרוז על כוסות היתושים כדי לספק להם ארוחת סוכר. החלף רפידות כותנה כל יומיים, עד יתושים ניתחו.
5. ניתוח יתושים באמצע המעי וכימות עומס הביצה
הערה: תרשים של ניתוח אמצע-קטגוריה מוצג באיור 3.
- 7-8 ימים לאחר האכלת דם, להעביר כוסות יתושים ל 4 °C (50 °F) במשך 10 דקות כדי להפיל יתושים.
- מעבירים יתושים למנתח של פטרי על קרח באמצעות מלקחיים עדינים.
- להשרות יתושים ב 70% אתנול במשך 1-2 דקות כדי להרדים אותם. מוסיפים PBS לצלחת הפטרי כדי לשטוף את האתנול לאחר כל היתושים מורדמים.
הערה: לפני הוספת PBS ודא שכל היתושים מתים. - הרכב שקופית זכוכית על מיקרוסקופ ניתוח ופיפטה 100 μL של PBS במרכז. מעבירים בזהירות יתוש אחד באמצעות מלקחיים לתוך ה- PBS ומשאירים את שאר היתושים בצלחת הפטרי על הקרח.
- באמצעות מלקחיים עדינים, להחזיק את החלק השלישי של הבטן מן הקצה האחורי של היתוש ועם מלקחיים שני להחזיק את הצומת בין בית החזה והבטן. משכו בעדינות את הבטן עד שהמידגוט נחשף במלואו.
- להשליך את שאר רקמת היתוש ולהעביר את midgut למגלשה נקייה המכילה כמה טיפות של PBS.
- כאשר מספר היתושים הרצוי נותח, הסר בזהירות את ה- PBS באמצעות פיפטה והכתים את מידגוט עם 0.2% מרקורוכרום למשך 2-5 דקות.
- הסר עודף mercurochrome ו midguts בשורה על השקופית, כך שהם יכולים להיות חזותיים בקלות תחת מיקרוסקופ האור.
- מניחים פתק כיסוי וסופרים ביציות על כל אמצע מטרה מתחת ליעד של פי 10. כתמי אוציטים ורודים והם עגולים בצורתם(איור 6C).
6. ניתוח בלוטת הרוק של יתושים וכימות עומס ספורוזויט
הערה: תרשים של ניתוח בלוטת הרוק מוצג באיור 4.
- 14-18 ימים לאחר האכלת דם, מניחים כוסות יתושים ב 4 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
הערה: חשוב לחכות עד יתושים להפסיק לנוע. - בזמן ההמתנה ליתושים יפסיקו לזוז, הכינו כלים לפירוק.
- מניחים צלחת זכוכית על במת מיקרוסקופ ניתוח. הכן 2 סטים של מחטים 25 G על מזרקי 1 מ"ל ופיפטת פסטר 9 " ונורה גומי. מניחים 70% EtOH ומדיום ניתוח (HBSS, L-15 או PBS) בצלחת 6 באר.
- בחדר הקר, העבירו יתושים מרדים בצלחת 6 באר המכילה 70% EtOH. הזיזו בעדינות יתושים עם מלקחיים כדי לוודא שכל היתושים ספוגים, ואז מעבירים יתושים למדיום הניתוח באמצעות מלקחיים כדי לשטוף 70% EtOH.
- עברו לחדר הניתוח והניחו יתושים על במת מיקרוסקופ ניתוח.
- הסר מדיום עודף יתושים, להוסיף מדיום חדש לפי הצורך במהלך הניתוח. הימנע יתושים להתייבש עדיין יותר מדי נוזלים עושה ניתוח קשה יותר.
- באמצעות 2 מזרקים עם 25 G מחטים, להחזיק בית החזה יתושים וראש, בעדינות למשוך את הראש כלפי מעלה כדי למשוך בלוטות רוק מבית החזה.
- נתק את בלוטות הרוק מהראש ובית החזה עם מחט.
- מניחים בלוטות רוק זמניות בטיפת בינונית נפרדת על צלחת הזכוכית.
- לאחר לנתח 15-20 בלוטות רוק, לאסוף אותם בצינור שמירה נמוכה באמצעות פיפטת פסטר.
הערה: ברגע שבלוטות הרוק נכנסות לחלק הרחב של פיפטת פסטר, הן ידבקו לזכוכית וקשה להוציא אותן. - בלוטות הרוק של כדוריות על ידי פעימה קצרה מסתובבות בצנטריפוגה בראש השולחן. הסר את מדיום הניתוח מבלי לשבש את הכדור ולהוסיף 100 μL של מדיום ניתוח חדש.
- לטחון בלוטות הרוק עם homogenizer קטן במשך 1 דקות כדי לקבל sporozoites.
- מניחים 10 μL של מדיום ביתור המכיל ספורוזויטים על hemocytometer.
הערה: בהתאם למספר בלוטות הרוק, ייתכן שיהיה צורך לדלל את פתרון sporozoite ל 1:10 עד 1:50 עם בינוני לפני הספירה. - ספרו את מספר הספורוזויטים בשניים מארבעת הרבעים וחשבו את מספר הספורוזויטים/יתושים:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו מציגים תוצאות מסדרה של הזנות ממברנה באמצעות תרבויות P. falciparum NF54 gametocyte שנוצרו באמצעות הפרוטוקול לעיל (ראה איור5). תרבות הגמטוציטים החלה עם כ-0.5% תרבות א-מינית מעורבת ביום 0, שגדלה לשיא של כ-15% ביום 4 וביום החמישי. כפי שניתן לראות באיור 5A בטפילים הגבוהים האלה, הטפילים לחוצים ותרבות הבמה הא-מינית מתרסקת. עם זאת, מתח זה במקביל גורם אינדוקציה של gametocytogenesis. הגמטוציטים המוקדמים הופיעו לאחר היום 6 ויום 7 וטפילמיה א-מינית ירדה לאט אך נשארה ברמה נמוכה. נוכחות של טפילים בשלב א-מיני לא השפיעה על ניסויי האכלת יתושים. עם זאת, אם gametocytes לשמש בניסויים הדורשים תרבויות טהורות, כגון תביעות רגישות לסמים ומחקרים פרוטאומיים או transcriptomic, שלבים א-מיניים שיורית ניתן להסיר על ידי טיפול עם 50 mM N-אצטילגלוקוסמין. רוב הגמטוציטים בוגרים לשלב V עד יום 15 שבו הם הופכים מדבקים ליתושים והיו מוכנים לאכילה. תמונות מייצגות של כתמי דם מוכתמים בג'ימסה בנקודות זמן שונות לאחר תחילת תרבות הגמטוציטים מוצגות באיור 5B.
בין 8 ל 10 ימים לאחר האכלת דם, יתושים נותחו כדי לקבוע את השכיחות ואת עוצמת הזיהום. השכיחות היא אחוז היתושים המוזנים שיש להם ביציות בעוד שעוצמה היא מספר הקיציות שנמצאו בכל יתוש. שניהם אינדיקטורים חשובים להצלחת ההזנה. נתונים מ-5 הזנות יתושים עצמאיות מוצגים באיור 6. הזנות נבחרו כדי להראות את השונות הרגילה ברמות ההדבקה לאחר האכלה עם 0.3% gametocytes בוגרים מיום 16 תרבות של P. falciparum NF54. עוצמות Oocyst מספק נתונים כמותיים כדי לקבוע הדבקת יתושים של gametocytes ושכיחות מראה את אחוז יתושים המוזנים שנדבקו. נתונים אלה יכולים לשמש להערכת גורמי חסימת שידור ולזיהוי ואפיון מטרות להעברת חיסונים ותרופות. מספר היוציות השתנה בתוך ובין ניסויים ודרשו 25-50 יתושים לכל קבוצה כדי לקבוע את ההשפעה של תנאי ניסוי שונים.
עוצמות אוציטים נחשבות לנקודת הסיום של רוב בדיקות חסימת השידור והאסטרטגיות, אולם מספר sporozoites חשובים בדרך כלל לביולוגיה ספורוזואיטית ולמחקרי שלב הכבד. טבלה 1 מציגה את המספר הממוצע של ספורוזויטים המתקבלים לכל יתוש מ-12 הזנות דם עצמאיות. כפי שניתן לראות בטבלה, המספר הממוצע של ספורוזויטים היו עקביים, עם זאת, היה ניסוי אחד שבו השגנו אפס ספורוזויטים, המייצגים כישלון מזדמן של ההסתה.
איור 1: זרימת עבודה של תרבות המשחק P. falciparum ופרוטוקול הזנת ממברנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגדרת האכלת דם יתושים. (א)מאכיל זכוכית וחתיכת סרט פרפין מלבנית(B) שני מאכילי זכוכית המוצגים לפני ואחרי התקשרות קרום parafilm (C)מאכיל זכוכית על גבי יתוש ומחוברים לאמבט מים במחזור הדם. (D,E) צנרת של הזנת דם לתוך מאכיל זכוכית (F) מבט תחתון של מאכיל זכוכית מראה הפצה הומוגנית של מזון דם (G) כמה יתושים ניזונים דרך קרום parafilm. (ח)מבט עליון על כוסות יתושים לאחר האכלה, מראה טיפות דם מופרשות על ידי יתושים האכלה בתחתית הכוס. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ייצוג גרפי המציג שלבים של ניתוח מידגוט יתושים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ייצוג גרפי המציג שלבים של ניתוח בלוטת הרוק של היתושים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: P. falciparum gametocyte תרבות והדמיה oocyst על מידגוט יתוש נגוע. (א)מסלול זמן של תרבות gametocyte 15 יום, מראה כפל תלול של שלבים א-מיניים לשיא טפילים בתוך 4 הימים הראשונים, ואחריו gametocytogenesis והתבגרות לאורך זמן. (B)כתמי דם דק מוכתמים בגימסה המציגים שלבים שונים של תרבות המשחק, יום 1 בשלב א-מיני מוקדם, יום 4 שיא טפילים א-מיניים, תרבות לחוצה ביום 6 עקב עומס טפילים גבוה, ימים 9 ו -12 gametocytes מוקדמים ויום 15 מראה גיימטוציטים בוגרים זכר ונקבה. מורפולוגית בשלב מוקדם של המשחקים לא ניתן להבחין בין שלבים א-מיניים, אך בשלב השני המאוחר הראה את צורת הסהר עם קצוות מחודדים ומוארך כמו טפיל התפתח לשלב III ו- IV. שלב בוגר V gametocytes, עם זאת, התאפיין בצורת סהר קלאסי עם קצוות מעוגלים ונראות תא מארח מינימלי14. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ביצית P. falciparum נחשבת לכל מידגוט יתושים. (A)גרף מראה ספירת ביציות לאורך השנים, עבור כל ניסוי, יתושים קיבלו 0.3% gametocytes ו midguts נותחו ביום 8 לאחר הזנת דם. כל נקודה מייצגת את מספר כדוריות מאמצע בודדות והקו האופקי מייצג ערך חציוני. (ב)הטבלה מראה ספירת נוזלים ממוצעת, שכיחות של יתושים נגועים וטווח זיהומים. (ג)תמונות המציגות ביציות על יתושים משני ניסויים נפרדים בהאכלת דם בהגדלות שונות. סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ניסוי | יום הניתוח (לאחר הזנת דם) | ממוצע ספורוזויט / יתוש |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
טבלה 1: המספר הממוצע של בלוטות הרוק sporozoites לכל יתוש במשך 12 מחזורים עצמאיים על פני תקופה של שנתיים. A. יתושי סטיבנסי קיבלו 0.3% P. falciparum gametocytes ו 15-20 יתושים נותחו בין ימים 14-17 לאחר האכלת דם. ספירת ספורוזוייט ממוצעת לכל יתוש מוצגת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות המתוארות כאן שימשו בהצלחה במכון לחקר המלריה של ג'ונס הופקינס במשך יותר מ -10 שנים15,16,17,18,19,20,21,22. Gametocytes המיוצר באמצעות פרוטוקול זה שימשו עבור תפוקה גבוהה gametocytocidal assays22, עבור proteomic15, כמו גם עבור מחקרים transcriptomic23. עם זאת, סיבה מרכזית לפתח שיטות אלה היא להשתמש gametocytes בוגר להדביק יתושים למחקרים על שלבי יתושים sporozoites23,24,25,26. כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט של יצירת גיימטוציטים בוגרים P. falciparum וזיהום של יתושים באמצעות מאכילי קרום זכוכית. שיטות אלה הן קריטיות עבור כל מעבדה עובד על אסטרטגיות חסימת שידור, שלבי ספורוזוייט ושלבי כבד טרום אריתרוציטי של P. falciparum.
Ifediba ו Vanderberg בשנת 1981 תיאר תרבות לטווח ארוך של P. falciparum, בנוכחות 50 מיקרוגרם / מ"ל היפוקסנתין אשר הפיק gametocytes בוגר מדבק מאוד27. מאז היו פרסומים רבים המתארים שיטות לייצר gametocytes עבור יישומים שונים9,10,11,12. רוב פרסומים אלה לנצל בעבר gametocytogenesis-גרימת תנאים כדי להגדיל את התשואות. באמצעות מדיה מותנית, הדגשת התרבות על ידי עלייה טפילית פתאומית, טיפה המטוקריט לחקות אנמיה, תמוגה של תאי דם אדומים ודיכוי שלב יומן על ידי בתפזורת למעלה, ניתן להשתמש כדי לגרום gametocytogenesis. השיטה המתוארת כאן פשוטה ונבדקה זמן. ליזום תרבות gametocyte עם 0.3-1% טפילים שלב א-מיני ב 4% המטוקריט ולשנות מדיה כל יום עד היום 15-18. כדי להשיג תוצאות עקביות, זה קריטי להתחיל תרבות gametocyte עם טמפלי במה א-מינית מעבר נמוך, להשתמש RBCs טרי (< שבוע אחד) ולוודא כי טמפרטורת התרבות אינה משתנה במהלך שינוי מדיה. מאז תהליך פיתוח falciparum gametocyte מתרחשת במצבים סטטיים של חללים חוץ וסקולריים במח העצם4,5, חשוב לא להפריע שכבות RBC התיישבו לאורך כל תקופת התרבות.
פולחן P. falciparum gametocytes עם עקביות הוא תובעני אבל מקבל אותם להדביק יתושים מציג רמה אחרת של מורכבות. האכלת ממברנה כפופה למספר משתנים שאינם gametocytes, כגון גיל וכושר של יתושים, מיקרוביוטה midgut, והתנהגות האכלה28,29. בדרך כלל נתוני SMFA מראים רמה גבוהה של שונות ודורשים מספר רב של יתושים כדי לזהות השפעות של תנאי ניסוי שונים11,28. שימוש בתרבות מעבר נמוכה לגמטוציטים, יתושים בריאים בני 3 - 6 ימים ופרוטוקול האכלת ממברנות ממוטב יכולים לעזור עם וריאציות בספירת ביציות.
הפרוטוקול המתואר כאן הן לטיפוח הגמטוציטים והן להאכלת הממברנה, עבר אופטימיזציה במשך שנים רבות. שיטות אלה מספקות תיאור מפורט להשגת gametocytes מוכשר שידור בוגר, בדיקת האכלה ממברנה סטנדרטית, ניתוח אמצע יתוש וכימות ביציקה, כמו גם ניתוח בלוטת הרוק וכימות sporozoite. פרוטוקולים אלה עקביים מבחינת מספר הגמטוציטים הדרושים כדי לספק הדבקה אמינה של יתושים וספירות ביציות חזקות ותפוקות ספורוזויט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לפילנתרופיה של בלומברג על התמיכה הכספית במכון ג'ונס הופקינס לחקר המלריה (JHMRI). עבודה זו לא הייתה מתאפשרת ללא המומחיות שמספקים מתקני הליבה של חרקים ופרזיטולוגיה של JHMRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
- World Health Organization.
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E.
- Joice, R., et al. Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow. Science Translational Medicine. 6 (244), 5 (2014).
- Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. American Journal of Hematology. 85 (12), 943 (2010).
- Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland. Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).
- Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. The development of malaria parasites in the mosquito midgut. Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).
- Trager, W., Jenson, J. B.
- Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery. Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).
- Delves, M. J., et al. Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions. Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).
- Habtewold, T., et al. Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity. Malaria Journal. 18 (1), 24 (2019).
- Demanga, C. G., et al. The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor. Parasites and Vectors. 10 (1), 216 (2017).
- Brockelman, C. R. Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum. Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).
- Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 7, (2017).
- Essuman, E., et al. A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs. Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).
- Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent. mBio. 8 (5), 01631 (2017).
- Oakley, M. S., et al. Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes. Scientific Reports. 8, 11568 (2018).
- Saraiva, R. G., et al. Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin. Scientific Reports. 8, 6176 (2018).
- Tao, D., et al. Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).
- Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes. Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).
- Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).
- Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity. PLoS One. 9 (8), 105817 (2014).
- Lindner, S. E., et al. Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites. Nature Communications. 10, 4964 (2019).
- McLean, K. J., et al. Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters. Scientific Reports. 9, 13131 (2019).
- Espinosa, D. A., et al. Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).
- Swearingen, K. E., et al. Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606 (2016).
- Ifediba, T., Vanderberg, J. P. Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes. Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).
- Miura, K., et al. An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines. Malaria Journal. 15, 463 (2016).
- Miura, K., et al. Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays. PLoS One. 8 (3), 57909 (2013).
