Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Дифференциация моноцитов в фенотипически различные макрофаги после лечения стволовыми клетками крови человека (CB-SC)-Производные экзосомы

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61562
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2, 1
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health Center, 2Department of Chemistry and Chemistry Biology, Stevens Institute of Technology

Summary

Экзосомное применение является новым инструментом для разработки лекарственных средств и регенеративной медицины. Мы устанавливаем протокол экзосомной изоляции с высокой чистотой, чтобы изолировать экзосомы от новых выявленных стволовых клеток под названием CB-SC для механистических исследований. Мы также совместно культуры CB-SC полученных экзосом с человека моноцитов, что приводит к их дифференциации в фенотипически различных макрофагов.

Abstract

Терапия стволовыми клетками (SCE) является новым клиническим подходом для лечения диабета типа 1 и других аутоиммунных заболеваний. SCE терапия циркулирует изолированных моноядерных клеток крови пациента (например, лимфоцитов и моноцитов) через афереза машины, совместно культур крови пациента моноядерных клеток с адептом пуповинной крови стволовых клеток (CB-SC) в устройстве SCE, а затем возвращает эти "образованные" иммунные клетки в кровь пациента. Экзосомы являются наноразмерными внеклеточными пузырьками между 30-2012150 нм, существующими во всех биофлюидных и клеточных культурных средствах массовой информации. Для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе терапии SCE и определить действия экзосом, выпущенных из CB-SC, мы исследуем, какие клетки фагоцитизируют эти экзосомы во время лечения CB-SC. По совместной культивирования Дио помечены CB-SC полученных экзосом с человеческой периферической крови моноядерных клеток (PBMC), мы обнаружили, что CB-SC полученных экзосом были преимущественно приняты человека CD14-положительных моноцитов, что приводит к дифференциации моноцитов в тип 2 макрофаги (M2), с шпиндель-как морфология и выражение M2-ассоциированных молекулярных маркеров. Здесь мы представляем протокол для изоляции и характеристики экзосом, полученных CB-SC, и протокол для совместной культуры экзосом, полученных CB-SC, с моноцитами человека и мониторинга дифференциации M2.

Introduction

Стволовые клетки пуповинной крови (CB-SC) являются уникальным типом стволовых клеток, идентифицированных из пуповинной крови человека и отличаются от других известных типов стволовых клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и гематопоэтические стволовые клетки (HSC)1. Основываясь на их уникальных свойствах иммунной модуляции и их способности плотно прилипать к поверхности чашек Петри, мы разработали новую технологию, обозначенную как терапия стволовыми клетками (SCE) в клиническихиспытаниях 2,3. Во время терапии SCE, периферические моноядерные клетки крови пациента (PBMC) собираются и циркулируют через клеточный сепаратор и совместно культурируются с приверженцем CB-SC in vitro. Эти "образованные" клетки (CB-SC-обработанные PBMC) затем возвращаются в кровообращение пациента в замкнутой системе. Клинические испытания уже продемонстрировали клиническую безопасность и эффективность терапии SCE для лечения аутоиммунных заболеваний, включая диабет типа 1 (T1D)2,4 и алопеция areata (AA)5.

Экзосомы являются семейство наночастиц диаметром от 30 до 2012150 нм и существуют во всех биофлюидных и клеточных культурСМИ 6. Экзосомы обогащаются многими биологически неактивными молекулами, включая липиды, мРНК, белки и микроРНК (миРНК), и играют важную роль в связи между клетками. В последнее время экзосомы стали более привлекательными для исследователей и фармацевтических компаний из-за их терапевтическогопотенциала в клиниках 7,8,9. Недавно наши механистические исследования показали, что CB-SC-выпущенные экзосомы способствуют иммунной модуляции SCE терапии10.

Здесь мы описываем протокол для изучения механизма SCE терапии ориентации моноцитов CB-SC-выпущенных экзосом. Во-первых, выпущенные CB-SC экзосомы были изолированы от кондиционированных средств массовой информации CB-SC с использованием методов ультрацентрифугации и проверены цитометрией потока, западной помаркой (WB) и динамическим рассеянием света (DLS). Во-вторых, экзосомы, полученные из CB-SC, были помечены зеленым флуоресцентным липофильным красителем: Dio. В-третьих, они были совместно культурированы с PBMC для изучения положительных процентов дио помечены CB-SC полученных экзосом на различных субпопуляций ПБМК по цитометрии потока. Этот протокол содержит рекомендации по изучению действия экзосом, лежащих в основе иммунной модуляции стволовых клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол следует руководящим принципам институционального комитета по этике исследований человека в Центре открытий и инноваций, Hackensack Meridian Health. Человеческие баффи пальто единиц крови были приобретены в Нью-йоркском центре крови (Нью-йорк, Штат Ny). Единицы пуповинной крови человека были собраны у здоровых доноров и приобретены в Международном банке крови Cryo-Cell (Олдсмар, Флорида). Как Нью-йоркский центр крови, так и Cryo-Cell получили все аккредитации для сбора и распределения крови, с одобрения IRB и подписанных форм согласия от доноров.

1. Культура клеток и подготовка среднего состояния, полученного из CB-SC

  1. Перенесите 25 мл пуповинной крови(таблица материалов)более 20 мл градиентной среды плотности (γ и 1,077) в коническую трубку 50 мл.
  2. Центрифуга при 1690 х г в течение 20 мин при 20 градусов по Цельсию в качающихся ведро ротора без тормоза.
  3. Тщательно перенесите моноядерный клеточный слой (буффи пальто) в новую коническую трубку 50 мл. Заполните коническую трубку фосфатным буферным солевым раствором (PBS) до 40 мл. Смешайте и центрифугу с гранулами при 751 х г в течение 10 мин при 20 градусов по Цельсию.
  4. Отбросьте супернатант и добавьте 15 мл буфера лиза ACK(Таблица материалов)к грануле клетки. Повторное приостановление ячеек через пипетки. Затем инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг удаляет красные кровяные тельца.
  5. Заполните коническую трубку 25 мл PBS. Центрифуга на 751 х г в течение 5 мин и отказаться от супернатанта для получения гранулированных моноядерных клеток.
  6. Вымойте 2x с 40 мл PBS, чтобы удалить оставшийся буфер лиза.
  7. Центрифуга при 751 х г в течение 5 мин, чтобы гранулировать клетки.
  8. Отбросьте супернатант и повторно приостановьте моноядерные клетки пуповинной крови с 10 мл химически определенной среды, свободной от сыворотки(таблица материалов)на трубку.
  9. Объедините моноядерные клетки пуповинной крови в одну трубку.
  10. Возьмите 20 йл клеточной подвески и смешать с 20 йл 0,4% трипан синий раствор (Таблица материалов) в 1,5 мл трубки.
  11. Загрузите в слайд камеры и количественно номер ячейки и жизнеспособность ячейки с помощью автоматизированного счетчика ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подвеска клетки разбавляется в 1:10, если концентрация клеток выше 1 х 107 клеток/мл.
  12. Семена моноядерных клеток в 150 мм х 15 мм Петри блюда на 1 х 106 клеток / мл, 25 мл / блюдо в химически определенных сыворотки свободной клеточной культуры среды.
  13. Инкубация при 37 градусах по Цельсию при условиях CO2 8% в течение 10-201214 дней до достижения CB-SC более 80% слияния.
  14. Откажитесь от супернатанта и вымойте 15 мл PBS на чашку Петри; затем удалите PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CB-SC плотно прикреплены к чашкам Петри.
  15. Повторите шаг 1.14 два раза.
  16. Добавьте 25 мл химической сыворотки свободной среды на чашку Петри.
  17. Инкубация при 37 градусах по Цельсию при условиях CO2 8% в течение 3-20124 дней.
  18. Соберите CB-SC-производных кондиционированных средних в 50 мл конических труб.

2. Характеристика CB-SC

  1. Отсоедините CB-SC путем пипетки 10 мл PBS основе ячейки диссоциации буфера вверх и вниз с 5 мл пипетки отзыв (Таблица материалов).
  2. Центрифуга при 1690 х г в течение 5 мин до гранулированных клеток и повторно приостановить в 200 йл PBS.
  3. Исправить и проницаемые клетки для внутриклеточного окрашивания с помощью окрашивания комплект подготовки(Таблица материалов).
  4. Добавьте 5 мкл блокатора Fc(Таблица материалов) наобразец и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блокатор Fc ингибирует неспецифическую привязку при окрашивание антителами.
  5. Добавьте флуоресценции конъюгированных мыши анти-человеческих моноклональных антител, включая CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270, и Галектин 9 на 25 мкг / мл (Таблица материалов) до 100 МКЛ объем клеток. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре с защитой света.
  6. После окрашивания, мыть клетки с 1 мл PBS и центрифуги на 751 х г в течение 10 мин гранул клеток.
  7. Повторно приостанавливать клетки с 200 МКЛ PBS и передачи в 5 мл трубки.
  8. Выполняйте цитометрию потока для проверки экспрессии связанных с CB-SC вышеуказанных конкретных маркеров.

3. Изоляция экзосом, полученных из CB-SC

  1. Центрифуга кондиционированной среды, собранной из шага 1.18 при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую коническую трубку 50 мл.
  2. Центрифуга супернатанта собрана из шага 3.1 при 2000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую коническую трубку 50 мл.
  3. Центрифуга супернатанта собрана из шага 3.2 при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую коническую трубку 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ротор с фиксированным углом используется так, что гранулы клетки осаждаются в сторону трубки. Отметйте сторону крышки и нарисуйте круг на стороне трубки, где гранулы, как ожидается.
  4. Фильтр supernatants собраны из шага 3.3 с фильтром 0,22 мкм(Таблица материалов).
  5. Передача 15 мл мультимедиа на каждый центробежный фильтр 10 кДа(Таблица материалов).
  6. Центрифуга на 4000 х г в течение 30 минут, чтобы изолировать концентрированные экзосомы.
  7. Перенесите концентрированные экзосомы в ультрацентрифугную трубку. Затем, гранулы экзосомы при 100000 х г в течение 80 мин при 4 градусов по Цельсию.
  8. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте экзосомы гранул в 10 мл PBS.
  9. Центрифуга при 100 000 х г в течение 80 мин при 4 градусов по Цельсию для сбора гранул экзосомы.
  10. Повторно приостанавливайте гранулы экзосом в 200 МКЛ PBS, трубя вверх и вниз.

4. Характеристика экзосом, полученных из CB-SC

  1. Количественная оценка общей концентрации белка экзосомного препарата с помощью набора анализа бицинхониновой кислоты (BCA)
    1. Pipette 10 L каждого стандарта альбумин и изолированный образец экзосомы подготовлен в шаге 3.10 в пластину 96-хорошо в дубликате.
    2. Добавьте 200 мкл работающего реагента из комплекта BCA к каждой колодец. Смешайте содержимое пластины тщательно на шейкере пластины в течение 10 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий реагент (WR): 50-часть реагента А с 1-частью реагента B.
    3. Обложка пластины с фольгой и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
    4. Охладить пластины до комнатной температуры (RT).
    5. Измерьте абсорбт образца на 562 nm через считыватель плиты.
  2. Подготовка и окрашивание экзосом для цитометрии потока
    1. Захват экзосомы, добавив 20 йл анти-человеческого CD63 магнитных бусин (размер 4,5 мкм)(Таблица материалов ) в 25 МКГ CB-SC полученных экзосом, подготовленных в шаге 3,10 в общей сложности 100 йл объем PBS.
    2. Инкубировать трубку на ночь (18-u201222 ч) при 4 градусов по Цельсию на шейкере при 800 об/мин.
    3. Центрифуга трубки на 300 х г на 30 с, чтобы собрать образец в нижней части трубки.
    4. Добавьте 300 МКЛ буфера изоляции (0,1% бычьего альбумин сыворотки (BSA) в PBS) и аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг моет бисером связаны экзосомы.
    5. Поместите трубку на магнитную подстоять в течение 1 мин (Таблица материалов) и отбросить супернатант.
    6. Повторите шаги 4.2.4-u20124.2.5.
    7. Повторно приостанавливать экзосомы, связанные с бисером, с 400 йл буфера изоляции.
    8. Aliquot 100 йл бисера связаны экзосомы к каждой трубке.
    9. Добавить флуоресценции конъюгированных антител (CD9-FITC, CD81-PE, и CD63-FITC на 25 мкг / мл, соответственно) для каждого потока трубки с CD63 шарик захваченных экзосом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Isotype-соответствует IgGs служить в качестве отрицательного контроля.
    10. Инкубировать в течение 45 минут при комнатной температуре с защитой света на шейкере при 800 об/мин.
    11. Повторите шаги 4.2.4-u20124.2.5.
    12. Повторно приостанавливать экзосомы, связанные с бисером, в 200 мкл буфера изоляции и передавать в трубы потока 5 мл.
    13. Поместите трубки в образец карусели потока цитометра.
    14. Откройте протокол для экзосомного тестирования.
    15. Вы запустите образец автоматически с помощью цитометра потока.
  3. Обнаружение экзосомы западным пятном
    ПРИМЕЧАНИЕ: Западная помарка устоявшийся метод, и мы не будем входить в подробности самого метода.
    1. Lyse гранулы CB-SC полученных экзосом из шага 3.10 с 100 йл буфера RIPA, пипетка 20x, а затем место на льду в течение 5 мин.
    2. Количественная оценка концентрации белка экзосомы лизата комплектом BCA и нагрузка 25 мкг белка на колодец.
    3. Отделить белки гель электрофорезом в течение 40 мин при 150 В.
    4. Передача белка в мембрану поливинилидена фтора (PVDF) с помощью полусухого метода передачи11.
    5. Заблокив мембрану 5% нежирным молоком в течение 30 мин.
    6. Инкубировать с 2 мкг / мл анти-человеческой Аликс (Таблица материалов) и 1 мкг / мл анти-человеческих антител Calnexin (Таблица материалов).
    7. Обнаружить белок по химилюминесценции с помощью цифровой системы визуализации.
  4. Экзосомная проверка путем динамического рассеяния света (DLS)
    1. Разбавить 10 мкг образцов экзосомы, полученных CB-SC, в 1 мл PBS.
    2. Перенесите 1 мл разбавленного образца в одноразовый полуми микро cuvette(Таблица материалов).
    3. Поместите кюветт в инструмент DLS. Установите рефракционный индекс (RI) как 1.39 для всего монитора выборки.
    4. Вы запустите образцы при 25 градусов по Цельсию и приобретите три измерения на фракцию, чтобы получить среднее распределение размера.
  5. Экзосомная проверка путем передачи электронной микроскопии (TEM)
    1. Пальто formvar на 300 сетки медныхсеток 12 ( Таблица материалов).
    2. Укрепите формвар дополнительным слоем выпаривания углерода на медных сетках12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Такой подход покрытия отлично подходит для поддержки образцов.
    3. Загрузите 10 МКЛ образцов экзосомы на сетки и оставьте высохнуть.
    4. Отрицательно пятна образцов с уранил ацетат в течение 5 мин.
    5. Вымойте три раза водой DI и оставьте в воздухе сухой.
    6. Наблюдайте и фотографуйте образцы под TEM. Установите ускоряющееся напряжение на уровне 200 кВ и размер пятна на уровне 2.

5. Мера Дио помечены CB-SC полученных экзосом вверх принятых различных субпопуляций PBMC

  1. Этикетка CB-SC полученных экзосом с зеленым флуоресцентным липофильным красителем Dio
    1. Передача 100 мкг экзосом, полученных из CB-SC (подготовленных в шаге 3.10) в 15 мл центрифуги трубки.
    2. Разбавить образец с PBS до 5 мл.
    3. Добавьте зеленый флуоресцентный липофилиновый краситель Dio(таблицаматериалов) до тех пор, пока рабочая концентрация не достигнет 5 МКМ.
    4. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре, защищенной от света.
    5. Перенесите образец в ультрацентрифугную трубку.
    6. Центрифуга на 100000 х г в течение 80 мин гранулы Дио помечены CB-SC полученных экзосом.
    7. Повторно приостанавливать помеченные экзосомы в 200 МКЛ PBS.
  2. Подготовка человека PBMC
    1. Передача 25 мл человеческого баффи пальто (Таблица материалов) более 20 мл плотности градиента среды (γ и 1,077) в 50 мл конической трубки.
    2. Повторите шаги от 1,2 до 1,11.
    3. Передача 1 х 106 PBMC в не-ткани обработанных гидрофобных 24-хорошо пластины (1 мл / хорошо).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не-ткани обработанные пластины был использован, чтобы избежать соблюдения моноцитов.
  3. Со-культура Дио помечены экзосомы с PBMC
    1. Передача 40 йл Дио помечены CB-SC полученных экзосом, подготовленных в шаге 5,1,7 к каждому PBMC-содержащих хорошо в 24-хорошо пластины с использованием 200 йл пипетки. Добавьте тот же объем PBS для управления скважинами.
    2. Смешайте с помощью пипетки 10x. Инкубация в течение 4 ч.
    3. Соберите 200 мкл экзосомы обработанных PBMC и этикетки с Hoechst 33342 в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Центрифуга при температуре 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы клетки в 100 МКЛ PBS.
    5. Маунт-клетки на микроскоп слайды.
    6. Наблюдайте и фотографуйте взаимодействие экзосом, полученных из CB-SC под маркировкой Dio, с помощью микроскопа с маркировкой Hoechst 33342.
    7. Перенесите оставшиеся ячейки из шага 5.3.3 в трубку 1,5 мл.
    8. Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы клетки в 200 МКЛ PBS.
    9. Добавьте 5 мкл блокатора Fc на образец. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
    10. Добавьте антитела (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 и CD56 при 25 мкг/мл) (Таблица материалов) для окрашивания PBMC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Isotype-соответствует IgGs служить в качестве отрицательного контроля.
    11. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре с защитой света.
    12. Добавьте 1 мл PBS и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах по Цельсию, чтобы гранулировать клетки.
    13. Повторно приостанавливать клетки с 200 хл PBS. Добавьте 5 мкл йодида пропидия.
    14. Используйте цитометрию потока для оценки уровня поглощения экзосомы под маркировкой Дио в различных субпопуляциях PBMC.

6. Изучите действие экзосом, полученных из CB-SC, на моноциты

  1. Изоляция человека CD14-положительных моноцитов
    1. Перенесите 3 x 107 человека PBMC в трубку 15 мл.
    2. Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
    3. Поместите разделительнуюколонку (Таблица материалов)в магнитный сепаратор(Таблица материалов).
    4. Вымойте столбцы разделения три раза с 2 мл холодного буфера бега(Таблица материалов).
    5. Повторно приостанавливать клетки в 300 МКЛ холодного PBS. Добавьте 60 МКЛ микроблад CD14. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 15 минут.
    6. Добавьте 6 мл холодного PBS. Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
    7. Повторно приостанавливайте гранулированное ячейки в 500 МКЛ холодного бегущего буфера.
    8. Перенесите ячейки в разделительный столбец (подготовленный в шаге 6.14) и дайте им пройти.
    9. Вымойте разделительную колонку три раза с 2 мл бегущего буфера на стирку. Поднимите колонку из магнитного сепаратора и поместите ее в центрифугу 15 мл трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 15 мл трубки должны быть помещены на лед из-за присоединения CD14-положительных моноцитов к трубке при комнатной температуре.
    10. Перенесите 2 мл холодного бегущего буфера на верхнюю часть колонны и изолируйте CD14-положительные ячейки в 15-мл трубки.
    11. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию, чтобы гранулировать CD14-положительные клетки.
    12. Повторно приостановить клетки с 2 мл холодной химически определенной сыворотки свободной среды(Таблица материалов).
    13. Перенесите 50 МКЛ клеток в трубку 1,5 мл.
    14. Пятно с 10 йл Krome Оранжевый спряженных анти-человеческого CD14 mAb (Таблица материалов) в течение 20 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Isotype-соответствует IgGs служить в качестве отрицательного контроля.
    15. Добавьте 1 мл PBS в клетки. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин гранулированных клеток.
    16. Повторно приостанавливать клетки в 200 МКЛ PBS и передавать его в 5 мл трубки. Определите чистоту CD14-положительных моноцитов по цитометрии потока.
  2. Лечение моноцитов экзосомами, полученными из CB-SC
    1. Семя 1 х 106 очищенных моноцитов с химически определенным сыворотки свободной культуры среды(Таблица материалов) в ткани культуры обработанных 6-хорошо пластины (2 мл / хорошо).
    2. Инкубация в течение 2 ч при 37 градусах по Цельсию под 5% CO2.
    3. Откажитесь от супернатанта с 1 мл пипетки. Аккуратно добавьте 2 мл предварительно разогретой химической культуры, свободной от сыворотки(таблицаматериалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Моноциты были прилипли к пластине в течение 2 часов. Плавающие клетки были идентифицированы как мертвые или другие клеточные загрязнения.
    4. Добавьте 80 мкг экзосом, полученных CB-SC, изолированных от культур шага 3.10 к моноцитам в 6-хорошой пластине с общим объемом 2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Такой же объем PBS был добавлен к контрольных скважин.
    5. Инкубация при 37 градусах по Цельсию под 5% CO2 в течение 3'u20124 дней.
    6. Фотография морфологии клеток с помощью перевернутого микроскопа на 200× увеличение(Таблица материалов).
    7. Отсоедините клетки, засовыв вверх и вниз в 1 мл буфера диссоциации клеток на основе PBS с наконечником пипетки 1 мл.
    8. Урожай остальных прикрепленных клеток через сотовый скребок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку первичные моноциты или дифференцированные макрофаги плотно прикрепляются, некоторые клетки остаются прилипаемыми к дну после обработки буфером диссоциации. Таким образом, эти клетки собирают с помощью клеточного скребка.
    9. Соберите ячейки по 1690 х г в течение 5 мин. Повторное приостановление ячеек в 200 МКЛ PBS.
    10. Добавьте 5 мкл блокатора Fc (25 мкг/мл), чтобы заблокировать неспецифическую привязку.
    11. Добавьте антитела (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 и CD209 при 25 мкг/мл, таблица материалов)к клеткам. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Isotype-соответствует IgGs служить в качестве отрицательного контроля
    12. Добавьте 1 мл PBS в клетки и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин. Откажитесь от супернатанта и повторно приостанавливайте с 200 хл PBS.
    13. Добавьте 5 мкл йодида пропидия на образец (200 МКЛ) и перенесите клетки в новую трубку потока 5 мл.
    14. Выполните цитометрию потока и оцените уровни выражений CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 и CD209.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Первоначально фенотип и чистота CB-SC были изучены цитометрией потока с маркерами, связанными с CB-SC, такими как лейкоцит общий антиген CD45, специфические факторы транскрипции ES OCT3/4 и SOX2. CB-SC отображает высокие уровни выражения CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 и galectin 9, но без выражения CD34(рисунок 1A). Анализ цитометрии потока подтвердил экспрессию экзосом-специфических маркеров, включая CD9, CD81 и CD63, на экзосомах, полученных CB-SC(рисунок 1B). Морфология и распределение размеров экзосом характеризовались TEM и DLS(рисунок 1C,D), с размером 79,38 ± 20,07 нм. Западная помарка более далее доказала выражение exosome-associated маркера Alix, без выражения ER-связанного маркера Calnexin (Рисунок 1E).

PBMC были обработаны с Дио помечены CB-SC-Exo. Наблюдение микроскопии продемонстрировало прямое взаимодействие Дио с маркировкой CB-SC-Exo с PBMC(рисунок 2A). Чтобы лучше определить, какая популяция клеток взаимодействовала с дио-помеченным CB-SC-Exo, различные клеточные отсеки были закрыты клеточными маркерами, такими как CD3 для Т-клеток, CD11c для миелоидных дендритных клеток (DC), CD14 для моноцитов, CD19 для В-клеток и CD56 дляНК-клеток (рисунок 2B). После инкубации в течение 4 часов, цитометрия потока продемонстрировала, что различные отсеки клеток крови отображаются при различной средней интенсивности флуоресценции (МФО) дио-положительных экзосом(рисунок 2C). Примечательно, что моноциты продемонстрировали более высокую медианную интенсивность флуоресценции Дио-положительного CB-SC-Exo, чем у другихиммунных клеток (рисунок 2C),подчеркивая, что моноциты были в первую очередь направлены на CB-SC полученных экзосом.

Для изучения прямого воздействия экзосом, полученных из CB-SC, на моноциты, очищенные CD14и моноциты были совместно культурированы с экзосомами, полученными CB-SC, в течение 3 дней. Обработанный экзосомой моноцит успешно дифференцирован в шпиндель-как морфологии(рисунок 3A). Далее, фенотипы CB-SC-Exo обработанных или необработанных моноцитов были протестированы, выявление выражений M2-ассоциированных маркеров, включая CD163, CD206, CD209 были заметно увеличены среди экзосомы обработанной группы (Рисунок 3B, красная гистограмма). По сравнению с обычными макрофагами M2, генерируемыми M-CSF и IL-4, обработанные CB-SC-Exo моноциты выразили аналогичные уровни связанных с M2 маркеров, таких как CD163, CD206, CD209, без существенных различий(рисунок 3C). Таким образом, данные показывают, что моноциты дифференцируются в макрофаги с фенотипом M2 после лечения экзосомами, полученными CB-SC.

Figure 1
Рисунок 1: Характеристика экзосом, полученных из CB-SC. (A) Фенотипическая характеристика CB-SC, высокое выражение CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 и Galectin-9, без выражения CD34. (B) Выражения экзосомы связанных маркеров (CD63, CD9, CD81) на CB-SC полученных экзосом. Isotype-соответствует IgGs служил в качестве элементов управления для цитометрии потока (серая гистограмма). (C)Передача электронной микроскопии (TEM) изображение CB-SC полученных экзосом. (D)Распределение размеров экзосом, полученных CB-SC, с использованием динамитического рассеяния света (DLS). (E) Западные помарки показывают, что CB-SC полученных экзосомы отображения экзосомы конкретных маркер Аликс, но отрицательный для эндоплазмической стикулум (ER)-ассоциированный маркер Calnexin. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Взаимодействие экзосом, полученных CB-SC, с различными популяциями PBMC. (A)Взаимодействие Дио помечены CB-SC-Exo (зеленый) с PBMC (синий, ядерное окрашивание с Hoechst 33342) был сфотографирован с nikon Eclipse Ti2 микроскоп с NIS-Elements программной версии 5.11.02, с высоким увеличением, показывающим распределение Дио помечены экзосомы (зеленый) в клетках PBMC после совместного инкубации для 4 ч 5% CO2 в не-ткани культуры обработанных 24-хорошо пластины. n No 2. (B) Gating стратегия для анализа цитометрии потока с клеточными маркерами поверхности для различных субпопуляций в PBMC, в том числе CD3 для Т-клеток, CD14 для моноцитов, CD19 для В-клеток, CD56 для НК-клеток и CD11c для DCs. (C) Отображение различной средней интенсивности флуоресценции (МФО) дио-обозначенной экзосомы среди различных субпопуляций PBMC (например, Т-клетки, моноциты, B клетки, НК-клетки, DCs). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Влияние экзосом, полученных из CB-SC, на моноциты. (A) Морфологическое изменение моноцитов в шпиндель-как клетки после обработки с CB-SC-производных экзосом. (B) Up-регулируется уровень M2-ассоциированных маркеров выражение после лечения CB-SC полученных экзосом, таких как CD163, CD206, и CD209 (красная линия). Необработанные моноциты (зеленая линия) служили контролем. Isotype-соответствует IgGs служил в качестве отрицательного контроля (серая линия). (C)Фенотипическое сравнение между обычными макрофагами M2 и макрофагами М2, вызванными CB-SC-Exo. Для генерации обычных макрофагов M2 очищенные моноциты CD14 и monocytes обработались с помощью макрофагов 50 нг/мл(M-CSF) при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 условий в течение 7 дней, а затем ночная обработка 10 нг/мл IL-4. M2-ассоциированные маркеры, включая CD14. CD80, CD86, CD163, CD206 и CD209 оценивались по цитометрии потока. Изотип-соответствует иммуноглобулин G (IgG) служить в качестве контроля. Данные представлены как среднее ± SD; N No 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Применение экзосом является новой областью для клинической диагностики, разработки лекарств и регенеративной медицины. Здесь мы представляем подробный протокол о подготовке экзосом, полученных из CB-SC, и функциональное исследование экзосом на дифференциацию моноцитов человека. Текущий протокол показал, что функциональные экзосомы, полученные из CB-SC, изолированы последовательной центрифугой и ультрацентрифугированием с высокой чистотой и обладают иммунной модуляцией моноцитов.

По сравнению с другими обычными протоколами, ультрафильтрация является установленным подходом к изоляции и очистке экзосом из различных клеток или средств массовой информации, основанным на молекулярном весе и размерах исключения, которые отличаются от других внеклеточных пузырьков (EVs). В то время как изоляция ультрафильтрации является более экономией времени, чем разделение на основе ультрацентрифугации, это может привести к структурным повреждениям пузырьков в больших размерах. Экзосомы также могут быть собраны полиэтиленгликоль (PEG)-опосредованное количество осадков по низкой цене, хотя этот метод рискует экзосомы чистоты из-зазагрязнения белка 13,14. Таким образом, текущий протокол был экономически эффективным для производства экзосом при высокой чистоте. Основываясь на иммунной модуляции CB-SC полученных экзосом10, характеристика CB-SC полученных экзосом может предложить ценный биомаркер для оценки потенции стволовых клеток Педагог с CB-SC до клинического применения.

Макрофаги являются профессиональными антигеносигментающих клеток против вирусных и бактериальных инфекций, с различными биологическими функциями и неоднородности. Основываясь на их различиях в поверхностных маркерах и иммунной функции, макрофаги классифицируются с двумя поднаселениями: макрофаги типа 1 (M1, обычные макрофаги, вызывающие воспаление) и макрофаги типа 2 (M2, отображение анти-воспаления)15. Это исследование установило, что очищенные моноциты человека были дифференцированы в макрофаги типа 2 после лечения экзосомами, полученными CB-SC, показывая противовоспалительный фенотип10. Обработанные ДОБ-СК моноциты, обработанные экзосомой, продемонстрировали удлиненную морфологию и выразили связанные с М2 поверхностные маркеры (например, CD163, CD206 и CD209), с аналогичным фенотипом, как и обычные макрофаги M2, генерируемые с использованием цитокинов M-CSF и IL-4. Такие фенотипические изменения моноцитов подчеркивают новый механизм, лежащий в основе иммунной модуляции CB-SC для лечения диабета типа 1 и других аутоиммунных заболеваний. Во время терапии SCE иммунные клетки пациентов были совместно с CB-SC в течение примерно 8-20129 ч. Обработанные SCE моноциты несли экзосомы CB-SC обратно в организм, что способствовало дифференциации M2 и расширению индукции иммунной толерантности, что привело к улучшению клинических исходов после лечения SCE терапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Д-р Чжао является основателем Тяньхэ стволовых клеток биотехнологии инк д-р Чжао является изобретателем технологии стволовых клеток педагога. Все остальные авторы не имеют финансовых интересов, которые могут иметь отношение к представленной работе.

Acknowledgments

Мы признательны г-ну Поддару и г-ну Людвигу за щедрую финансовую поддержку через Фонд UMC Хакенсака. Мы ценим Лауру Чжао за редактирование английского языка.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-129
15 ml conical tube Falcon 352196
24-well plate Falcon 351147 Non-tissue culture
plate
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) Millipore sigma D4292-20MG Store at 4 °C
300 Mesh Grids Ted Pella 1GC300
50 mL conical tube Falcon 352070
6-well plate Falcon 353046 Tissue culture plate
96-well plate Falcon 353072 Tissue culture plate
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E 100 ml
Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit Millipore sigma UFC901024
Anti-Human Alix Biolegend 634501 store at 4 °C, RRID: AB_2268110
Anti-Human Calnexin Biolegend 699401 store at 4 °C, RRID: AB_2728519
Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 BD Bioscience 561356 store at 4 °C, RRID: AB_10611859
Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange Beckman Coulter B36294 store at 4 °C, RRID: AB_2728099
Anti-Human CD163 antibody, PE BD Bioscience 556018 store at 4 °C, RRID: AB_396296
Anti-Human CD19 antibody, PC5 Beckman Coulter IM2643U store at 4 °C, RRID: AB_131160
Anti-Human CD206 antibody, FITC BD Bioscience 551135 store at 4 °C, RRID: AB_394065
Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 BD Bioscience 564127 store at 4 °C, RRID: AB_2738610
Anti-Human CD270 antibody, PE Biolegend 318806 store at 4 °C, RRID: AB_2203703
Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue Biolegend 300431 store at 4 °C, RRID: AB_1595437
Anti-Human CD34 antibody, APC Beckman Coulter IM2427U store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD4 antibody, APC BD Bioscience 555349 store at 4 °C, RRID: AB_398593
Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 Beckman Coulter IM3548U store at 4 °C, RRID: AB_1575969
Anti-Human CD56 antibody, PE Beckman Coulter IM2073U store at 4 °C, RRID: AB_131195
Anti-Human CD63 antibody,PE BD Bioscience 561925 store at 4 °C, RRID: AB_10896821
Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 Beckman Coulter A94686 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD80 antibody, APC Beckman Coulter B30642 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD81 antibody, FITC BD Bioscience 561956 store at 4 °C, RRID: AB_394049
Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 Beckman Coulter B30646 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD9 antibody, FITC ThermoScientic MA5-16860 store at 4 °C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 Biolegend 348919 store at 4 °C, RRID: AB_2716134
Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 ThermoScientic 50-5841-82 store at 4 °C, RRID: AB_11218882
Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 ThermoScientic 53-9811-82 store at 4 °C, RRID: AB_2574479
BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A1933
Buffy coat New York Blood Center 40-60 ml/unit
Cell scraper Falcon 353085
Disposable semi-micro cuvette VWR 97000590
Dissociation buffer Gibco 131510014 100 ml
Dual-Chanber cell counting slides Bio-Rad 1450015
Exosome-Human CD63 Detection reagent ThermoFisher Scientific 10606D store at 4 °C
Ficoll-Paque PLUS density grandient media GE Health 17-1440-03 500 ml
Fixed-Angle Rotor(25°) Thermo Scientifc 75003698 Maxium 24,700 x g
Gallios flow cytometer Beckman Coulter 3 lasers
10 Color Max
Human cord blood Cryo-Cell International 40-100 ml/unit
Human Fc Block BD Bioscience 564220 store at 4 °C
Immun-Blot PVDF membrane Bio-Rad 1620177
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore Sigma SLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentriguge Beckman Coulter
Orbital Shaker MP4 BioExpress S-3500-1
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 500 ml
Propidium Iodide BD Bioscience 56-66211E store at 4 °C
Nikon Eclipse Ti2 microscope Nikon instruments Inc Eclipse Ti2 NIS-Elements software version 5.11.02
Hochest 33342 Thermo Scientifc 62249 5 ml
Revert microsopy Fisher scientific 12563518
Rotor 41 Ti Beckman Coulter 331362 Maxium 41,000 rpm
Sorvall St 16R Centrifuge Thermo Scientifc 75004381
Swinging Bucket Rotor Thermo Scientifc 75003655
TC-20 cell counter Bio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific
Transmission electron microscopy JEOL JEM-2100 PLUS
Ultracentrifuge tube Beckman Coulter 331372
X'VIVO 15 Serum-free medium Lonza BEBP04-744Q 1000 ml Culture medium, store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
  2. Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
  3. Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
  4. Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
  5. Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
  6. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  7. Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
  8. Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
  9. Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
  10. Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
  11. Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
  12. Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
  13. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  15. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 165 CB-SC Терапия стволовых клеток (SCE) экзосомы моноциты макрофаг типа 2 дифференциация иммунная модуляция
Дифференциация моноцитов в фенотипически различные макрофаги после лечения стволовыми клетками крови человека (CB-SC)-Производные экзосомы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J.,… More

Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes. J. Vis. Exp. (165), e61562, doi:10.3791/61562 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter