Summary
L'applicazione esosoma è uno strumento emergente per lo sviluppo di farmaci e la medicina rigenerativa. Stabiliamo un protocollo di isolamento esosoma ad alta purezza per isolare gli esosomi dalle nuove cellule staminali identificate chiamate CB-SC per studi meccanicistici. Cocoliamo anche esosomi derivati dal CB-SC con monociti umani, portando alla loro differenziazione in macrofagi fenotipicamente distinti.
Abstract
La terapia con educatore di cellule staminali (SCE) è un nuovo approccio clinico per il trattamento del diabete di tipo 1 e di altre malattie autoimmuni. La terapia SCE fa circolare le cellule mononucleari del sangue del paziente isolato (ad esempio linfociti e monociti) attraverso una macchina di aferesi, co-coltura le cellule mononucleari del sangue del paziente con cellule staminali derivate dal sangue del cordone ombelicale aderenti (CB-SC) nel dispositivo SCE, quindi restituisce queste cellule immunitarie "istruite" al sangue del paziente. Gli esosomi sono vescicole extracellulari di dimensioni nanometriche tra 30\u2012150 nm esistenti in tutti i mezzi di coltura biofluida e cellulare. Per esplorare ulteriormente i meccanismi molecolari alla base della terapia SCE e determinare le azioni degli esosomi rilasciati da CB-SC, studiamo quali cellule fagocitizzano questi esosomi durante il trattamento con CB-SC. Co-coltivando esosomi derivati dal CB-SC con cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMC), abbiamo scoperto che gli esosomi derivati dal CB-SC sono stati prevalentemente ripresi da monociti positivi al CD14 umano, portando alla differenziazione dei monociti nei macrofagi di tipo 2 (M2), con morfologia simile al mandrino ed espressione dei marcatori molecolari superficiali associati all'M2. Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione degli esosomi derivati da CB-SC e il protocollo per la co-coltura di esosomi derivati da CB-SC con monociti umani e il monitoraggio della differenziazione M2.
Introduction
Le cellule staminali del sangue del cordone ombelicale (CB-SC) sono un tipo unico di cellule staminali identificate dal sangue del cordone ombelicale umano e si distinguono da altri tipi noti di cellule staminali come le cellule staminali mesenchimali (MSC) e le cellule staminali ematopoietiche (HSC)1. Sulla base delle loro proprietà uniche di modulazione immunitaria e della loro capacità di aderire strettamente alla superficie delle piastre di Petri, abbiamo sviluppato una nuova tecnologia designata come terapia di educatore delle cellule staminali (SCE) negli studiclinici 2,3. Durante la terapia SCE, le cellule mononucleari del sangue periferico di un paziente (PBMC) vengono raccolte e circolate attraverso un separatore cellulare e co-coltivate con CB-SC aderente in vitro. Queste cellule "istruite" (PBMC trattato con CB-SC) vengono quindi restituite alla circolazione del paziente in un sistema a circuito chiuso. Studi clinici hanno già dimostrato la sicurezza clinica e l'efficacia della terapia SCE per il trattamento di malattie autoimmuni tra cui diabete di tipo 1 (T1D)2,4 e alopecia areata (AA)5.
Gli esosomi sono una famiglia di nanoparticelle con diametri che vanno da 30\u2012150 nm ed esistono in tutti i mezzi di coltura biofluida ecellulare 6. Gli esosomi sono arricchiti con molte molecole bioattive tra cui lipidi, mRNA, proteine e microRNA (miRNA) e svolgono un ruolo importante nelle comunicazioni da cellula a cellula. Negli ultimi tempi, gli esosomi sono diventati più attraenti per i ricercatori e le aziende farmaceutiche a causa delle loro potenzialità terapeutiche nellecliniche 7,8,9. Recentemente, i nostri studi meccanicistici hanno dimostrato che gli esosomi rilasciati da CB-SC contribuiscono alla modulazione immunitaria della terapia SCE10.
Qui descriviamo il protocollo per esplorare il meccanismo della terapia SCE che prende di mira i monociti da esosomi rilasciati da CB-SC. In primo luogo, gli esosomi rilasciati dal CB-SC sono stati isolati dai supporti condizionati derivati da CB-SC utilizzando metodi di ultracentrifugazione e convalidati dalla citometria del flusso, dalla western blot (WB) e dalla diffusione dinamica della luce (DLS). In secondo luogo, gli esosomi derivati dal CB-SC sono stati etichettati con un colorante lipofilo fluorescente verde: Dio. In terzo luogo, sono stati co-coltivati con PBMC per esaminare le percentuali positive di esosomi derivati da CB-SC con etichetta Dio alle diverse sottopopolazioni di PBMC per citometria a flusso. Questo protocollo fornisce indicazioni per studiare l'azione degli esosomi alla base della modulazione immunitaria delle cellule staminali.
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Protocol
Il protocollo segue le linee guida del comitato etico istituzionale per la ricerca umana presso Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Le unità di sangue del mantello buffy umano sono state acquistate dal New York Blood Center (New York, NY). Le unità di sangue del cordone ombelicale umano sono state raccolte da donatori sani e acquistate dalla banca del sangue Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Sia il New York Blood Center che Cryo-Cell hanno ricevuto tutti gli accreditamenti per le raccolte e le distribuzioni di sangue, con l'approvazione dell'IRB e i moduli di consenso firmati dai donatori.
1. Coltura cellulare e preparazione del mezzo condizionato derivato da CB-SC
- Trasferire 25 ml di sangue del cordone ombelicale(tabella dei materiali)su 20 ml di mezzo gradiente di densità (γ = 1,077) in un tubo conico da 50 ml.
- Centrifuga a 1.690 x g per 20 min a 20 °C in un rotore a benna oscillante senza freno.
- Trasferire con cura lo strato di cellule mononucleari (strato di buffy) in un nuovo tubo conico da 50 ml. Riempire il tubo conico con soluzione salina tamponata dal fosfato (PBS) a 40 mL. Mescolare e centrifugare a celle a pellet a 751 x g per 10 min a 20 °C.
- Scartare il supernatante e aggiungere 15 mL di tampone di lisi ACK (Tabella dei materiali) al pellet cellulare. Sospendere di nuovo le celle tramite pipettazione. Quindi incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Questo passaggio rimuove i globuli rossi. - Riempire il tubo conico con 25 ml di PBS. Centrifuga a 751 x g per 5 min e scarta il supernatante per ottenere cellule mononucleari a pellet.
- Lavare 2x con 40 mL di PBS per rimuovere il buffer di lysis rimanente.
- Centrifuga a 751 x g per 5 minuti per pellettizzare le cellule.
- Scartare le cellule mononucleari del sangue del cordone ombelicale supernatanti e ri-sospendere con 10 ml di mezzo privo di siero definito chimicamente (tabella deimateriali)per tubo.
- Unire le cellule mononucleari del sangue del cordone ombelicale a un unico tubo.
- Prendere 20 μL di sospensione cellulare e mescolare con 20 μL di soluzione blu trypan 0,4%(tabella dei materiali)in un tubo da 1,5 ml.
- Caricare nello scivolo della camera e quantificare il numero di cella e la vitalità della cella con un contatore di celle automatizzato.
NOTA: La sospensione cellulare viene diluita a 1:10 se la concentrazione cellulare è superiore a 1 x 107 celle/mL. - Semina cellule mononucleari in 150 mm x 15 mm Piastre di Petri a 1 x 106 cellule/mL, 25 mL/piatto in mezzo di coltura cellulare privo di siero definito chimicamente.
- Incubare a 37 °C in condizioni di CO2 dell'8% per 10\u201214 giorni fino a quando CB-SC raggiunge più dell'80% di confluenza.
- Scartare il supernatante e lavare con 15 mL di PBS per piastra di Petri; quindi, rimuovere il PBS.
NOTA: CB-SC è attaccato saldamente alle piastre di Petri. - Ripetere il passaggio 1.14 due volte.
- Aggiungere 25 mL di mezzo privo di siero definito chimicamente per piastra di Petri.
- Incubare a 37 °C in condizioni di CO2 dell'8% per 3\u20124 giorni.
- Raccogliere il mezzo condizionato derivato da CB-SC in tubi conici da 50 ml.
2. Caratterizzazione di CB-SC
- Staccare CB-SC tubazionando 10 mL di tampone di dissociazione cellulare a base di PBS su e giù con una punta della pipetta da 5 mL(Tabella dei materiali).
- Centrifugare a 1.690 x g per 5 min per le celle a pellet e sospendere di nuovo in 200 μL di PBS.
- Fissare e permeabilizzare le cellule per la colorazione intracellulare tramite kit di preparazione della colorazione(Tabella dei materiali).
- Aggiungere 5 μL di fc blocker(Tabella dei materiali)per campione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Il bloccante Fc inibisce il legame non specifico quando si macchia con gli anticorpi. - Aggiungere anticorpi monoclonali anti-umano del topo coniugati a fluorescenza tra cui CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 e Galectina 9 a 25 μg/mL(Tabella dei materiali)a 100 μL volume di cellule. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con protezione dalla luce.
- Dopo la colorazione, lavare le celle con 1 mL di PBS e centrifugare a 751 x g per 10 min per le celle a pellet.
- Sospendere di nuovo le celle con 200 μL di PBS e trasferirsi in un tubo da 5 ml.
- Eseguire la citometria del flusso per convalidare l'espressione dei marcatori specifici associati a CB-SC sopra.
3. Isolamento degli esosomi derivati dal CB-SC
- Centrifugare il mezzo condizionato raccolto dal passo 1.18 a 300 x g per 10 min a 4 °C. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo conico da 50 ml.
- Centrifugare il supernatante raccolto dal passo 3.1 a 2.000 x g per 20 min a 4 °C. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo conico da 50 ml.
- Centrifugare il supernatante raccolto dal passo 3.2 a 10.000 x g per 30 min a 4 °C. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo conico da 50 ml.
NOTA: Il rotore ad angolo fisso viene utilizzato in modo che i pellet cellulari siano precipitati sul lato del tubo. Contrassegnare il lato del cappuccio e disegnare un cerchio sul lato del tubo in cui è previsto il pellet. - Supernaganti filtranti raccolti dal passo 3.3 con un filtro da 0,22 μm(Tabella dei materiali).
- Trasferire 15 mL di supporti in ogni unità filtrante centrifuga da 10 kDa(Tabella dei materiali).
- Centrifuga a 4.000 x g per 30 min per isolare i mezzi esosomi concentrati.
- Trasferire gli esosomi concentrati in un tubo ultracentrifugo. Quindi, il pellet esosomi a 100.000 x g per 80 min a 4 °C.
- Scartare il supernatante e sospendere di nuovo gli esosomi del pellet in 10 mL di PBS.
- Centrifuga a 100.000 x g per 80 min a 4 °C per raccogliere il pellet di esosomi.
- Sospendere di nuovo il pellet di esosomi in 200 μL di PBS tubazioni su e giù.
4. Caratterizzazione di esosomi derivati da CB-SC
- Quantificazione della concentrazione proteica totale della preparazione esosoma mediante kit di dosaggio dell'acido bicinchoninico (BCA)
- Pipetta 10 μL di ogni campione di albumina standard e isolato esosoma isolato preparato nel passaggio 3.10 in una piastra da 96 porci in duplicato.
- Aggiungere 200 μL del reagente di lavoro dal kit BCA ad ogni pozzo. Mescolare accuratamente il contenuto della piastra sullo shaker della piastra per 10 s.
NOTA: Reagente di lavoro (WR): reagente a 50 parti A con reagente in 1 parte B. - Coprire le piastre con un foglio e incubarle a 37 °C per 30 minuti.
- Raffreddare le piastre a temperatura ambiente (RT).
- Misurare l'assorbanza del campione a 562 nm tramite un lettore di piastre.
- Preparazione e colorazione di esosomi per citometria a flusso
- Catturare gli esosomi aggiungendo 20 μL di perline magnetiche CD63 anti-umane (dimensioni 4,5 μm)(tabella dei materiali)in 25 μg di esosomi derivati dal CB-SC preparati nella fase 3.10 in totale 100 μL volume di PBS.
- Incubare il tubo durante la notte (18\u201222 h) a 4 °C sullo shaker a 800 giri/min.
- Centrifugare il tubo a 300 x g per 30 s per raccogliere il campione nella parte inferiore del tubo.
- Aggiungere 300 μL di tampone di isolamento (0,1% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS) e mescolare delicatamente mediante pipettazione.
NOTA: Questo passaggio lava gli esosomi legati alle perline. - Posizionare il tubo su un supporto magnetico per 1 minuto (Tavolo dei materiali) e scartare il supernatante.
- Ripetere i passaggi 4.2.4\u20124.2.5.
- Sospendere di nuovo gli esosomi legati al tallone con 400 μL di tampone di isolamento.
- Aliquota 100 μL di esosomi legati al tallone ad ogni tubo.
- Aggiungere anticorpi coniugati a fluorescenza (CD9-FITC, CD81-PE e CD63-FITC rispettivamente a 25 μg/mL) a ciascun tubo di flusso con esosomi catturati con perline CD63.
NOTA: gli IgG abbinati all'isotipo fungono da controlli negativi. - Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente con protezione dalla luce sullo shaker a 800 giri/min.
- Ripetere i passaggi 4.2.4\u20124.2.5.
- Sospendere di nuovo gli esosomi legati al tallone in 200 μL di tampone di isolamento e trasferirli a tubi di flusso da 5 ml.
- Posizionare i tubi nel carosello campione del citometro a flusso.
- Aprire il protocollo per i test esosomi.
- Eseguire automaticamente il campione in base al citometro di flusso.
- Rilevamento esosoma da parte della macchia occidentale
NOTA: Western blot è un metodo consolidato e non andremo nei dettagli del metodo stesso.- Lisciviare i pellet di esosomi derivati da CB-SC dal passo 3.10 con 100 μL di tampone RIPA, pipetta 20x, quindi mettere sul ghiaccio per 5 min.
- Quantificare la concentrazione proteica di glisato esosoma con il kit BCA e caricare 25 μg di proteine per pozzo.
- Separare le proteine per elettroforesi gel per 40 min a 150 V.
- Trasferire la proteina alla membrana in fluoruro di polivinilidene (PVDF) utilizzando il metodo di trasferimento semi-secco11.
- Bloccare la membrana con il 5% di latte non grasso per 30 minuti.
- Incubare con 2 μg/mL anti-umano Alix(Table of Materials)e 1 μg/mL anticorpi anti-umani calnexina(Tabella dei materiali).
- Rileva la proteina mediante chemiluminescenza con un sistema di imaging digitale.
- Convalida esosoma mediante diffusione dinamica della luce (DLS)
- Diluire 10 μg di campioni esosomi derivati da CB-SC in 1 mL di PBS.
- Trasferire gli 1 mL del campione diluito in cuvette semi-micro usa e getta (Tabella dei materiali).
- Posizionare la cuvetta nello strumento DLS. Impostare l'indice di rifrazione (RI) su 1,39 per tutto il monitor campione.
- Eseguire campioni a 25 °C e acquisire tre misurazioni per frazione per ottenere una distribuzione media delle dimensioni.
- Convalida esosoma mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
- Cappotto formvar su 300 griglie di rame mesh12 (Tabella dei materiali).
- Rafforzare la formvar con lo strato aggiuntivo di carbonio evaporato sulle griglie di rame12.
NOTA: Un tale approccio di rivestimento è eccellente per il supporto del campione. - Caricare 10 μL di campioni esosomi sulle griglie e lasciare asciugare all'aria.
- Macchie negative di campioni con acetato di uranile per 5 min.
- Lavare tre volte con acqua DI e lasciare asciugare all'aria.
- Osservare e fotografare i campioni sotto TEM. Impostare la tensione di accelerazione a 200 kV e la dimensione dello spot a 2.
5. Misurare gli esosomi derivati dal CB-SC con etichetta Dio utilizzati da diverse sottopopolazioni di PBMC
-
Etichetta Esosomi derivati da CB-SC con colorante lipofilo fluorescente verde Dio
- Trasferire 100 μg di esosomi derivati dal CB-SC (preparati nella fase 3.10) in un tubo di centrifuga da 15 ml.
- Diluire il campione con PBS a 5 mL.
- Aggiungere il colorante lipofilo fluorescente verde Dio(Table of Materials) finoa quando la concentrazione di lavoro raggiunge i 5 μM.
- Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce.
- Trasferire il campione in un tubo ultracentrifugo.
- Centrifuga a 100.000 x g per 80 min a pellet Esosomi derivati da CB-SC con etichetta Dio.
- Sospendere di nuovo gli esosomi etichettati in 200 μL di PBS.
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Preparazione del PBMC umano
- Trasferire 25 ml di strato di buffy umana(Tabella dei materiali)oltre 20 ml di mezzo gradiente di densità (γ = 1,077) in un tubo conico da 50 ml.
- Ripetere i passaggi da 1.2 a 1.11.
- Trasferire 1 x 106 PBMC in una piastra idrofobica a 24 porsi non trattata con tessuti (1 mL/pozzo).
NOTA: Una piastra non trattata con tessuti è stata utilizzata per evitare l'adesione di monociti.
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Esosomi co-culturali con etichetta Dio con PBMC
- Trasferire 40 μL Esosomi derivati da CB-SC con etichetta Dio preparati al passaggio 5.1.7 a ciascun pozzo contenente PBMC in una piastra da 24 pozza utilizzando una pipetta da 200 μL. Aggiungere lo stesso volume di PBS per controllare i pozzi.
- Mescolare pipettando 10x. Incubare per 4 ore.
- Raccogliere PBMC trattato con esosoma da 200 μL ed etichettare con Hoechst 33342 per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifuga a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 100 μL di PBS.
- Montare le celle su vetrini al microscopio.
- Osservare e fotografare l'interazione di esosomi derivati da CB-SC con PBMC con etichetta Hoechst 33342 utilizzando un microscopio.
- Trasferire le celle rimanenti dal passo 5.3.3 in un tubo da 1,5 ml.
- Centrifuga a 300 x g per 10 min a 4 °C. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 200 μL di PBS.
- Aggiungere 5 μL di blocco Fc per campione. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere anticorpi (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 e CD56 a 25 μg/mL) (Table of Materials) per macchiare PBMC.
NOTA: gli IgG abbinati all'isotipo fungono da controlli negativi. - Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con protezione dalla luce.
- Aggiungere 1 mL di PBS e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C per pellettizzare le cellule.
- Sospendere di nuovo le cellule con PBS da 200 μL. Aggiungere 5 μL di ioduro di propidio.
- Utilizzare la citometria del flusso per valutare il livello di assorbimento esosoma con etichetta Dio in diverse sottopopolazioni di PBMC.
6. Esaminare l'azione degli esosomi derivati dal CB-SC sui monociti
- Isolamento monociti positivi al CD14 umano
- Trasferire 3 x 107 PBMC umano in un tubo da 15 ml.
- Centrifuga a 300 x g per 10 min a 4 °C.
- Posizionare la colonna diseparazione ( Tabella dei materiali) nel separatore di magneti ( Tabella deimateriali).
- Lavare le colonne di separazione tre volte con 2 mL di tampone di funzionamento a freddo(Tabella dei materiali).
- Sospendere di nuovo le cellule in 300 μL di PBS freddo. Aggiungere 60 μL di microperline CD14. Mescolare bene e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.
- Aggiungere 6 mL di PBS freddo. Centrifuga a 300 x g per 10 min a 4 °C.
- Sospendere di nuovo le celle a pellet in 500 μL di tampone di funzionamento a freddo.
- Trasferire le celle nella colonna di separazione (preparata nel passaggio 6.14) e lasciarle passare.
- Lavare la colonna di separazione tre volte con 2 mL di tampone di corsa per lavaggio. Sollevare la colonna dal separatore del magnete e posizionarla in un tubo di centrifuga da 15 ml.
NOTA: Il tubo da 15 ml deve essere posizionato sul ghiaccio a causa dell'aderenza dei monociti positivi al CD14 al tubo a temperatura ambiente. - Trasferire 2 ml di tampone di funzionamento a freddo nella parte superiore della colonna e isolare le celle positive cd14 nel tubo da 15 ml.
- Centrifuga a 300 x g per 10 min a 4 °C per pellettizzare le cellule positive cd14.
- Sospendere di nuovo le cellule con 2 mL di mezzo privo di siero definito chimicamente freddo(Tabella dei materiali).
- Trasferire 50 μL di cellule in un tubo da 1,5 ml.
- Macchia con 10 μL di CD14 mAb anti-umano coniugato con krome arancione(Tavolo dei materiali)per 20 min.
NOTA: gli IgG abbinati all'isotipo fungono da controlli negativi. - Aggiungere 1 PBS mL alle celle. Centrifuga a 300 x g per 10 min a celle a pellet.
- Sospendere di nuovo le celle in 200 μL di PBS e trasferirla in un tubo da 5 ml. Determinare la purezza dei monociti positivi al CD14 in base alla citometria del flusso.
- Trattamento di monociti con esosomi derivati da CB-SC
- Semi 1 x 106 monociti purificati con mezzo di coltura privo di siero definito chimicamente(Tabella dei materiali)in lamiera a 6 pozzi trattata con coltura tissutale (2 mL/pozzo).
- Incubare per 2 ore a 37 °C sotto il 5% di CO2.
- Scartare il supernatante con pipetta da 1 mL. Aggiungere delicatamente 2 mL di 37 °C di mezzo di coltura senza siero definito chimicamente pre-riscaldato(Tabelladei materiali).
NOTA: I monociti sono stati aderenti alla piastra entro 2 ore. Le cellule galleggianti sono state identificate come contaminazioni morte o di altre cellule. - Aggiungere esosomi derivati da CB-SC da 80 μg isolati dal passo 3.10 alle colture di monociti in una piastra da 6 pomeri e con un volume totale di 2 mL.
NOTA: Lo stesso volume di PBS è stato aggiunto ai pozzi di controllo. - Incubare a 37 °C sotto il 5% di CO2 per 3\u20124 giorni.
- Fotografare la morfologia cellulare utilizzando un microscopio invertito al 200× ingrandimento(Tabella dei materiali).
- Staccare le celle tubazioni su e giù in 1 mL di un buffer di dissociazione cellulare a base pbs con punta di pipetta da 1 mL.
- Raccogliere le restanti cellule attaccate tramite un raschietto cellulare.
NOTA: Poiché i monociti primari o i macrofagi differenziati si attaccano strettamente, alcune cellule rimangono aderenti al fondo dopo il trattamento con tampone di dissociazione. Pertanto, queste cellule vengono raccolte con un raschietto cellulare. - Raccogliere celle a 1.690 x g per 5 min. Sospendere di nuovo le cellule in 200 μL di PBS.
- Aggiungere 5 μL di blocco Fc (25 μg/mL) per bloccare l'associazione non specifica.
- Aggiungere anticorpi (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 e CD209 a 25 μg/mL, Table of Materials) alle cellule. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: gli IgG abbinati all'isotipo fungono da controllo negativo - Aggiungere 1 mL di PBS alle cellule e centrifugare a 300 x g per 10 min. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo con 200 μL di PBS.
- Aggiungere 5 μL di ioduro di propidio per campione (200 μL) e trasferire le celle in un nuovo tubo di flusso da 5 ml.
- Eseguire la citometria del flusso e valutare i livelli delle espressioni CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 e CD209.
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Representative Results
Inizialmente, il fenotipo e la purezza del CB-SC sono stati esaminati dalla citometria del flusso con marcatori associati al CB-SC come il leucocitario comune antigene CD45, i fattori di trascrizione specifici delle cellule ES OCT3/4 e SOX2. CB-SC visualizza alti livelli di espressione CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 e galectin 9, ma nessuna espressione di CD34 (Figura 1A). L'analisi della citometria a flusso ha confermato l'espressione di marcatori specifici dell'esosoma, inclusi CD9, CD81 e CD63, su esosomi derivati da CB-SC (Figura 1B). La morfologia e la distribuzione delle dimensioni degli esosomi sono state caratterizzate da TEM e DLS (Figura 1C,D), con una dimensione di 79,38 ± 20,07 nm. Western blot dimostrò ulteriormente l'espressione del marcatore associato all'esosoma Alix, senza espressione del marcatore associato al ER Calnexin (Figura 1E).
I PBMC sono stati trattati con CB-SC-Exo con etichetta Dio. L'osservazione della microscopia ha dimostrato l'interazione diretta del CB-SC-Exo con etichetta Dio con PBMC (Figura 2A). Per definire meglio quale popolazione cellulare interagiva con il CB-SC-Exo con etichetta Dio, sono stati gated diversi compartimenti cellulari con marcatori specifici delle celle come CD3 per le celle T, CD11c per le cellule dendritiche mieloidi (DC), CD14 per i monociti, CD19 per le celle B e CD56 per le celle NK (Figura 2B). Dopo un'incubazione per 4 ore, la citometria del flusso ha dimostrato che diversi compartimenti delle cellule del sangue visualizzati a diversa intensità di fluorescenza mediana (IFM) di esosomi dio-positivi (Figura 2C). In particolare, i monociti mostravano una maggiore intensità mediana di fluorescenza del CB-SC-Exo dio-positivo rispetto a quelli di altre cellule immunitarie (Figura 2C), evidenziando che i monociti erano principalmente presi di mira dagli esosomi derivati dal CB-SC.
Per esplorare gli effetti diretti degli esosomi derivati dal CB-SC sui monociti, i monociti CD14+ purificati sono stati co-coltivati con esosomi derivati da CB-SC per 3 giorni. Il monocita trattato con esosoma si è differenziato con successo in morfologie simili a mandrino (Figura 3A). Successivamente, sono stati testati fenotipi dei monociti trattati o non trattati CB-SC-Exo, rivelando che le espressioni dei marcatori associati a M2 tra cui CD163, CD206, CD209 sono state notevolmente aumentate tra il gruppo trattato con esosomi(Figura 3B,istogramma rosso). Confrontando con i macrofagi M2 convenzionali generati da M-CSF + IL-4, i monociti trattati con CB-SC-Exo hanno espresso livelli simili di marcatori associati all'M2 come CD163, CD206, CD209, senza differenzesignificative (Figura 3C). Pertanto, i dati indicano che i monociti si differenziano in macrofagi con fenotipo M2 dopo il trattamento con esosomi derivati da CB-SC.
Figura 1: Caratterizzazione degli esosomi derivati da CB-SC. (A) Caratterizzazione fenotipica di CB-SC, alta espressione di CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 e Galectin-9, nessuna espressione di CD34. (B) Espressioni di marcatori associati all'esosoma (CD63, CD9, CD81) su esosomi derivati da CB-SC. Gli IgG abbinati agli isotipi fungevano da controlli per la citometria a flusso (istogramma grigio). (C) Immagine della microscopia elettronica a trasmissione (TEM) degli esosomi derivati dal CB-SC. (D) Distribuzione delle dimensioni degli esosomi derivati da CB-SC mediante DLS (DYnamitic Light Scattering). (E) Le macchie occidentali mostrano che gli esosomi derivati dal CB-SC mostrano il marcatore specifico dell'esosoma Alix, ma negativo per il marcatore calnexin associato al reticolo endoplasmatico (ER). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Interazione di esosomi derivati dal CB-SC con diverse popolazioni di PBMC. (A) L'interazione di CB-SC-Exo (verde) con PBMC (blu, colorazione nucleare con Hoechst 33342) è stata fotografata con il microscopio Nikon Eclipse Ti2 con software NIS-Elements versione 5.11.02, con un alto ingrandimento che mostra la distribuzione di esosomi dio-etichettati (verdi) nelle cellule PBMC dopo la co-incubazione per 4 h 5% di CO2 nella piastra 24-well trattata con coltura non tissutale. n = 2. (B) Strategia di Gating per l'analisi della citometria del flusso con marcatori superficiali specifici per cellule per diverse sottopopolazioni in PBMC, tra cui CD3 per cellule T, CD14 per monociti, CD19 per cellule B, CD56 per celle NK e CD11c per CD. (C) Visualizza diverse intensità di fluorescenza mediana (IFM) di esosoma con etichetta Dio tra diverse sottopopolazioni PBMC (ad esempio, cellule T, monociti, cellule B, celle NK, CONTROLLER). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti degli esosomi derivati dal CB-SC sui monociti. (A) Cambiamento morfologico dei monociti nelle cellule simili al mandrino dopo il trattamento con esosomi derivati dal CB-SC. (B) Up-regulated il livello di espressione dei marcatori associati all'M2 dopo il trattamento con esosomi derivati da CB-SC, come CD163, CD206 e CD209 (linea rossa). I monociti non trattati (linea verde) servivano da controllo. Gli IgG abbinati all'isotipo fungevano da controlli negativi (linea grigia). (C) Confronto fenotipico tra i macrofagi M2 convenzionali e i macrofagi M2 indotta da CB-SC-Exo. Per generare i macrofagi M2 convenzionali, i monociti CD14+ purificati sono stati trattati con fattore stimolante della colonia di macrofagi da 50 ng/mL (M-CSF) a 37 °C, 5% di CO2 per 7 giorni e seguiti dal trattamento notturno con 10 ng/mL IL-4. Marcatori associati all'M2 tra cui CD14. CD80, CD86, CD163, CD206 e CD209 sono stati valutati dalla citometria a flusso. L'immunoglobulina G (IgG) abbinata all'isotipo funge da controllo. I dati sono presentati come media ± SD; N = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'applicazione di esosomi è un campo emergente per la diagnosi clinica, lo sviluppo di farmaci e la medicina rigenerativa. Qui presentiamo un protocollo dettagliato riguardante la preparazione di esosomi derivati dal CB-SC e lo studio funzionale degli esosomi sulla differenziazione dei monociti umani. L'attuale protocollo ha dimostrato che gli esosomi funzionali derivati da CB-SC sono isolati dalla centrifugazione sequenziale e dall'ultracentrifugazione con elevata purezza ed espongono la modulazione immunitaria sui monociti.
Rispetto ad altri protocolli convenzionali, l'ultrafiltrazione è un approccio consolidato per l'isolamento e la purificazione di esosomi da diverse cellule o mezzi, basato sul peso molecolare e sulle dimensioni di esclusione che sono diverse da altre vescicole extracellulari (EV). Mentre l'isolamento dell'ultrafiltrazione consente di risparmiare più tempo rispetto alla separazione basata sull'ultracentrifugazione, può causare danni strutturali alle vescicole di grandi dimensioni. Gli esosomi possono anche essere raccolti mediante precipitazione mediata da polietilene glicole (PEG) a basso costo, anche se questo metodo rischia la purezza esosoma dovuta alle contaminazioniproteiche 13,14. Pertanto, l'attuale protocollo era conveniente per produrre esosomi ad alta purezza. Sulla base delle modulazioni immunitarie degli esosomi derivati da CB-SC10, la caratterizzazione di esosomi derivati da CB-SC può offrire un prezioso biomarcatore per valutare la potenza dell'educatore delle cellule staminali con CB-SC prima delle applicazioni cliniche.
I macrofagi sono cellule professionali che presentano antigeni contro infezioni virali e batteriche, con varie funzioni biologiche ed eterogeneità. In base alle loro differenze nei marcatori superficiali e nella funzione immunitaria, i macrofagi sono classificati con due sotto-popolazioni: macrofagi di tipo 1 (M1, macrofagi convenzionali che causano infiammazione) e macrofagi di tipo 2 (M2, visualizzazione anti-infiammazione)15. Questo studio ha stabilito che i monociti umani purificati sono stati differenziati in macrofagi di tipo 2 dopo il trattamento con esosomi derivati dal CB-SC, mostrando un fenotipo anti-infiammazione10. I monociti trattati con esosomi derivati da CB-SC mostravano la morfologia allungata ed esprimevano i marcatori di superficie associati all'M2 (ad esempio CD163, CD206 e CD209), con il fenotipo simile ai macrofagi M2 convenzionali generati utilizzando citochine M-CSF + IL-4. Tali cambiamenti fenotipici dei monociti evidenziano il nuovo meccanismo alla base della modulazione immunitaria del CB-SC per il trattamento del diabete di tipo 1 e di altre malattie autoimmuni. Durante la terapia SCE, le cellule immunitarie dei pazienti sono state co-coltivate con CB-SC per circa 8\u20129 h. I monociti trattati con SCE riportavano nel corpo gli esosomi derivati dal CB-SC, il che ha contribuito alla differenziazione M2 e all'espansione dell'induzione della tolleranza immunitaria, portando al miglioramento degli esiti clinici dopo il trattamento con terapia SCE.
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Disclosures
Zhao è uno dei fondatori di Tianhe Stem Cell Biotechnology Inc. Tutti gli altri autori non hanno interessi finanziari che possano essere rilevanti per l'opera presentata.
Acknowledgments
Siamo grati a Poddar e Ludwig per il generoso sostegno finanziario tramite la Hackensack UMC Foundation. Apprezziamo Laura Zhao per l'editing in inglese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
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