Summary
엑소솜 응용 프로그램은 신약 개발 및 재생 의학을위한 새로운 도구입니다. 우리는 기계학 연구를 위해 CB-SC에게 불린 새로운 확인된 줄기 세포에서 엑소좀을 격리하기 위하여 고순도와 엑소솜 격리 프로토콜을 설치합니다. 우리는 또한 인간의 단핵구와 CB-SC 유래 엑소좀을 결합하여 표현성 고유 의 대식세포로 분화합니다.
Abstract
줄기세포 교육자(SCE) 치료는 제1형 당뇨병 및 기타 자가면역 질환의 치료를 위한 새로운 임상 접근법이다. SCE 요법은 격리된 환자의 혈액 단핵세포(예를 들어, 림프구 및 단핵구)를 체온기계를 통해 순환시키고, 환자의 혈액 단핵세포를 SCE 장치에서 부착된 코드 혈액 유래 줄기세포(CB-SC)와 공동 배양한 다음, 이러한 "교육받은" 면역 세포를 환자의 혈액에 반환합니다. 엑소좀은 모든 생물유체 및 세포 배양 매체에 존재하는 30\u2012150 nm 사이의 나노 크기의 세포외 소포이다. SCE 치료의 근본적인 분자 메커니즘을 더 탐구하고 CB-SC에서 풀어 놓인 엑소좀의 행동을 결정하기 위하여, 우리는 CB-SC를 가진 처리 도중 이 엑소좀을 phagocytize 하는 세포를 조사합니다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 디오 라벨CB-SC 유래 엑소좀을 공동 배양함으로써, CB-SC 유래 엑소좀이 주로 인간 CD14 양성 단세포에 의해 채택되어, 단일세포의 분화로 이어지는 것을 발견하여, 스핀들-유사 모폴로지및 M2 의 분자 표면의 발현과 함께 단일세포의 분화로 이어진다. 여기서, 우리는 CB-SC 유래 엑소좀의 격리 및 특성화와 인간의 단핵구와 CB-SC 유래 엑소좀의 공동 배양을 위한 프로토콜및 M2 분화의 모니터링을 위한 프로토콜을 제시한다.
Introduction
적혈구(CB-SC)는 인간 적인 코드 혈액으로부터 확인된 줄기 세포의 독특한 유형이며, 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 조혈줄기 세포(HSC)1과같은 다른 알려진 유형의 줄기 세포와 구별된다. 면역 변조의 독특한 특성과 페트리 접시의 표면에 단단히 부착 할 수있는 능력에 기초하여, 우리는 임상 시험2,3에서줄기 세포 교육자 (SCE) 치료로 지정된 새로운 기술을 개발했다. SCE 치료 중 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 세포 분리기를 통해 수집 및 순환되고 체외에서 부착된 CB-SC와 공동 배양됩니다. 이러한 "교육된" 세포(CB-SC 처리 PBMC)는 닫힌 루프 시스템에서 환자의 순환으로 반환됩니다. 임상시험은 이미 제1형 당뇨병(T1D)2,4 및탈모증 아레아타(AA)5를포함한 자가면역 질환의 치료를 위한 SCE 치료의 임상 안전성 및 효능을 입증하였다.
엑소좀은 직경 이 30\u2012150 nm에 이르는 나노입자의 가족이며 모든 생물유체 및 세포 배양 배지6에존재한다. 엑소좀은 지질, mRNA, 단백질 및 microRNA(miRNA)를 포함한 많은 생리활성 분자로 풍부하며 세포 간 통신에서 중요한 역할을 합니다. 늦게, 엑소좀은클리닉7,8,9에서그들의 치료 잠재력 때문에 연구원과 제약 회사에 대한 더 매력적되고있다. 최근, 우리의 기계론 연구는 CB-SC 방출 엑소좀SCE 치료의 면역 변조에 기여한다는 것을입증10.
여기서, 우리는 CB-SC 방출 엑소좀에 의하여 단핵구를 표적으로 하는 SCE 치료의 기계장치를 탐구하기 위하여 프로토콜을 기술합니다. 첫째, CB-SC 방출 엑소솜은 초원심분리 방법을 사용하여 CB-SC 유래 컨디셔닝 된 미디어로부터 격리되고 유동 세포측정법, 서부 블롯 (WB) 및 동적 광 산란 (DLS)에 의해 검증되었습니다. 둘째, CB-SC 유래 엑소좀은 녹색 형광성 리포필리오닉 염료인 디오로 표지되었다. 셋째, PBMC와 공동 배양하여 유동 세포측정에 의한 PBMC의 다양한 하위 집단에서 디오 라벨 CB-SC 유래 엑소좀의 양수를 검사했습니다. 이 프로토콜은 줄기 세포의 면역 변조의 기초가 되는 엑소좀의 작용을 연구하기 위한 지침을 제공합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 발견 및 혁신 센터, Hackensack 자오선 건강 센터의 기관 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 인간의 버피 코트 혈액 단위는 뉴욕 혈액 센터에서 구입 (뉴욕, 뉴욕). 인간 탯줄 혈액 단위는 건강한 기증자에게서 집합되고 Cryo 세포 국제 혈액 은행 (올즈마르, 플로리다)에서 구입했습니다. 뉴욕 혈액 센터와 Cryo-Cell은 IRB 승인및 기증자로부터 동의 서를 서명하여 혈액 수집 및 분포에 대한 모든 인증을 받았습니다.
1. CB-SC 유래 조건제 배지의 세포 배양 및 준비
- 25mL의코드블러드(재료표)를밀도 그라데이션 배지(γ = 1.077)를 50mL 원문 튜브로 옮기다.
- 1,690 x g의 원심분리기는 브레이크없이 스윙 버킷 로터에서 20 °C에서 20 분 동안.
- 모노핵세포층(버피 코트)을 새로운 50mL 원문튜브로 조심스럽게 이송한다. 포산염 완충식식염(PBS)을 40mL로 채우십시오. 20°C에서 10분 동안 751 x g의 펠릿 셀에 혼합 및 원심분리기를 혼합합니다.
- 상체를 버리고 세포 펠릿에 ACK 리시스버퍼(재료 표)의15mL을 추가합니다. 파이펫팅을 통해 셀을 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
참고: 이 단계는 적혈구를 제거합니다. - PBS의 25mL로 원물 튜브를 채웁니다. 원심분리기는 751 x g에서 5분 동안, 펠릿 단핵 세포를 얻기 위해 상류제를 폐기한다.
- PBS40mL로 2x를 세척하여 남은 리시스 버퍼를 제거합니다.
- 751 x g의 원심분리기에서 5분 동안 세포를 펠릿합니다.
- 상체를 폐기하고 튜브 당 화학적 정의 세럼이없는 매체(재료 표)의10 mL로 장혈 단핵 세포를 다시 중단하십시오.
- 코드 혈액 단핵 세포를 하나의 튜브에 결합합니다.
- 20 μL 셀 서스펜션을 복용하고 1.5mL 튜브에 0.4 % 트라이판 블루 용액(재료 테이블)의20 μL과 혼합하십시오.
- 챔버 슬라이드에 로드하고 자동화 된 셀 카운터로 셀 수와 셀 생존 가능성을 정량화합니다.
참고: 세포 농도가 1 x 107 세포/mL 이상인 경우 세포 현탁액은 1:10에 희석됩니다. - 150mm x 15mm 페트리 접시의 종자 단핵 세포는 화학적으로 정의된 혈청 없는 세포 배양 배지에서 1 x 106 세포/mL, 25mL/접시에 첨가한다.
- CB-SC가 80% 이상 에 도달할 때까지 10\u201214 일 동안 8 % CO2 조건 하에서 37 °C에서 배양하십시오.
- 페트리 접시 당 15mL의 PBS로 슈퍼 상체를 버리고 씻으십시오. 그런 다음 PBS를 제거합니다.
참고: CB-SC는 페트리 요리에 단단히 부착되어 있습니다. - 반복 단계 1.14 두 번.
- 페트리 접시당 화학적으로 정의된 세럼 프리 배지 25mL를 추가합니다.
- 3\u20124 일 동안 8 % CO2 조건 하에서 37 °C에서 배양하십시오.
- CB-SC 유래 조건부 배지를 50mL 원문 튜브로 수집합니다.
2. CB-SC의 특성화
- PBS 기반 셀 해리 버퍼의 10mL를 5mL 파이펫 팁(재료 표)으로 위아래로 피펫팅하여 CB-SC를분리한다.
- 원심분리기는 1,690 x g에서 5분 동안 펠릿 세포에 대해 다시 중단하고 PBS의 200 μL에서 다시 중단한다.
- 염색 준비키트(재료표)를통해 세포 내 염색을 위한 세포를 수정하고 투과화합니다.
- 샘플 당 5 μL의 Fc 차단제(재료표)를추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
참고: Fc 차단제는 항체로 염색할 때 비특이적 결합을 억제합니다. - CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 및 Galectin 9를 포함하는 형광-컨쥬게이드 마우스 항인간 단일클론 항체를 25 μg/mL(재료표)에서100 μL 부피에 추가합니다. 실내 온도에서 30분 동안 배양하여 광을 보호합니다.
- 염색 후, 751 x g에서 751 x g에서 PBS 및 원심분리기 1mL로 셀을 세척하여 펠릿 세포에 10 분 동안 씻으십시오.
- PBS의 200 μL로 세포를 다시 중단하고 5 mL 튜브로 이송합니다.
- 특정 마커 위에 연관된 CB-SC의 발현을 검증하기 위해 유동 세포측정을 수행합니다.
3. CB-SC 유래 엑소좀의 격리
- 원심분리기는 4°C에서 10분 동안 300 x g에서 1.18 단계에서 수집된 조건된 배지를 원심분리한다. 새로운 50mL 원전 튜브로 상수체를 전송합니다.
- 원심분리기는 4°C에서 20분 동안 2,000 x g에서 3.1 단계에서 수집된 상피. 새로운 50mL 원전 튜브로 상수체를 전송합니다.
- 원심분리기는 4°C에서 30분 동안 10,000 x g에서 3.2 단계에서 수집된 상신체입니다. 새로운 50mL 원전 튜브로 상수체를 전송합니다.
참고: 고정 각도 로터가 사용되어 세포 펠릿이 튜브 측면에 침전됩니다. 캡의 측면을 표시하고 펠릿이 예상되는 튜브 측면에 원을 그립니다. - 0.22 μm필터(재료 표)로3.3단계에서 수집된 필터 슈퍼네이넌트.
- 각 10 kDa 원심 필터장치(재료표)로15mL의 미디어를 전송합니다.
- 심분리기는 4,000 x g에서 30분 동안 농축 된 외향성 미디어를 분리합니다.
- 농축 된 엑소좀을 초원심분리기 튜브로 옮기다. 이어서, 펠릿 엑소솜은 4°C에서 80분 동안 100,000 x g에서 발포하였다.
- 상체를 버리고 PBS의 10 mL에서 펠릿 엑소좀을 다시 중단하십시오.
- 4°C에서 80분 동안 100,000 x g의 원심분리기에서 엑소솜 펠릿을 수집한다.
- PBS의 200 μL에서 위아래로 파이프를 통해 엑소좀 펠릿을 다시 중단합니다.
4. CB-SC 유래 엑소좀의 특성화
- 비신천산 분석(BCA) 키트에 의한 외식 제제의 총 단백질 농도 를 정량화
- 각 알부민 표준 및 격리된 외식 샘플의 Pipette 10 μL은 3.10 단계에서 제조된 96웰 플레이트를 복제하여 제조하였다.
- BCA 키트에서 작업 시약의 200 μL을 각 우물에 추가합니다. 플레이트 쉐이커에 플레이트의 내용기를 10s로 완전히 섞습니다.
참고: 작업 시약 (WR): 1 부 시약 B와 50 부분 시약 A. - 호일로 접시를 덮고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 접시를 실온(RT)으로 식힙니다.
- 플레이트 판독기를 통해 562 nm에서 샘플 흡광도를 측정합니다.
- 유동 세포측정을 위한 외종의 제조 및 염색
- PBS의 총 100 μL 부피에서 3.10 단계로 제조된 CB-SC 유래 엑소좀의 25 μg에 20 μL의 항인간 CD63 자기 구슬(4.5 μm 크기)(재료표)을추가하여 엑소좀을 포획한다.
- 800 rpm에서 셰이커에 4 °C에서 하룻밤 튜브 (18\u20122h)를 배양합니다.
- 튜브의 바닥에 샘플을 수집하는 30 s에 대한 300 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.
- 300μL의 절연 버퍼(PBS에 0.1% 소 세럼 알부민(BSA)를 넣고 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
참고: 이 단계는 비드 바인딩 엑소좀을 낭비합니다. - 튜브를 자석 스탠드에 1분(재료 표)에 놓고 상퍼를 폐기합니다.
- 반복 단계 4.2.4\u20124.2.5.
- 400 μL의 절연 버퍼로 비드 바인딩 엑소좀을 다시 일시 중단합니다.
- 각 튜브에 비드 바운드 엑소좀의 알리쿼트 100 μL.
- CD63 비드 포획 외경을 가진 각 유동 관에 형광 컨쥬게이트 항체(CD9-FITC, CD81-PE 및 CD63-FITC)를 각각 25 μg/mL에 추가합니다.
참고: 동형 일치 IgGs는 부정적인 컨트롤 역할을 합니다. - 800 rpm에서 셰이커에 빛을 보호하여 실온에서 45 분 동안 배양하십시오.
- 반복 단계 4.2.4\u20124.2.5.
- 절연 버퍼의 200 μL에서 비드 바인딩 엑소좀을 다시 중단하고 5mL 유동 튜브로 이송합니다.
- 유동 세포계의 샘플 회전 목마에 튜브를 놓습니다.
- 외성 테스트를 위한 프로토콜을 엽니다.
- 흐름 사이토미터로 샘플을 자동으로 실행합니다.
- 서쪽 얼룩에 의한 엑소솜 검출
참고 : 서양 얼룩은 잘 설립 된 방법이며 우리는 방법 자체의 세부 사항으로 이동하지 않습니다.- RIPA 버퍼, 파이펫 20x의 100 μL을 가진 단계 3.10에서 CB-SC 유래 엑소좀의 펠릿을 lyse한 다음 5 분 동안 얼음위에 놓습니다.
- BCA 키트에 의해 외성 용액의 단백질 농도를 정량화하고 잘 당 단백질 25 μg를 적재합니다.
- 150 V에서 40 분 동안 젤 전기 전광에 의해 단백질을 분리하십시오.
- 반건조전달법(11)을이용하여 폴리비닐리덴 불소(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 전달한다.
- 30 분 동안 5 % 비 지방 우유로 멤브레인을 차단하십시오.
- 2 μg/mL 항인간알릭스(재료표)및 1 μg/mL 항인간 칼넥신항체(재료표)로배양한다.
- 디지털 이미징 시스템으로 화학 발광으로 단백질을 감지합니다.
- 동적 광 산란(DLS)에 의한 엑소솜 유효성 검사
- PBS의 1mL에서 CB-SC 유래 엑소솜 샘플의 10 μg를 희석시.
- 희석된 시료 1mL을 일회용 반마이크로큐벳(재료표)으로 옮기다.
- 큐벳을 DLS 기기에 배치합니다. 모든 샘플 모니터에 대해 굴절률(RI)을 1.39로 설정합니다.
- 25°C에서 샘플을 실행하고 분수당 세 가지 측정값을 획득하여 평균 크기 분포를 얻습니다.
- 전송 전자 현미경 검사법 (TEM)에 의한 외성 유효성 검사
- 300 메쉬 구리그리드(12)에 코트 폼바(12).
- 구리그리드(12)에증발된 탄소의 추가 층으로 폼바를 강화한다.
참고 : 이러한 코팅 접근 방식은 시편 지원에 탁월합니다. - 외식 시료 10μL을 그리드에 적재하고 공기 건조시로 둡니다.
- 5 분 동안 우라인 아세테이트와 음의 얼룩 샘플.
- DI 물로 세 번 씻고 공기 건조로 둡니다.
- TEM 하에서 샘플을 관찰하고 촬영합니다. 가속 전압을 200 kV로 설정하고 스팟 크기를 2로 설정합니다.
5. PBMC의 다른 하위 인구에 의해 촬영 디오 라벨 CB-SC 파생 엑소좀 측정
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녹색 형광성 리포필리포닉 염료 Dio를 곁들인 라벨 CB-SC 유래 엑소좀
- CB-SC 유래 엑소좀 100μg(3.10단계에서 제조)를 15mL 원심분리기 튜브로 옮긴다.
- PBS로 샘플을 5mL로 희석합니다.
- 작업 농도가 5 μM에 도달할 때까지 녹색 형광 성 립소성 염료 디오(재료의 표)를추가합니다.
- 빛으로부터 보호받는 실온에서 15분 동안 배양하십시오.
- 샘플을 초원심분리기 튜브로 옮는다.
- 원심분리기는 100,000 x g에서 80분 동안 디오 라벨이 부착된 CB-SC 유래 엑소좀에 대해 볼렛합니다.
- PBS의 200 μL에서 표지된 엑소좀을 다시 일시 중단합니다.
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인간 PBMC의 준비
- 25mL의 인간 버피코트(재료표)를20mL 이상의 밀도 그라데이션 배지(γ = 1.077)를 50mL 원문 튜브로 옮기다.
- 1.2에서 1.11단계를 반복합니다.
- 1 x 106 PBMC를 비조직 처리 소수성 24웰 플레이트(1 mL/well)로 옮기습니다.
참고: 단핵구의 접기를 피하기 위해 비조직 처리 플레이트가 사용되었습니다.
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PBMC와 공동 문화 디오 라벨 엑소섬
- 200 μL 파이펫을 사용하여 24웰 플레이트에서 각 PBMC 함유웰 플레이트에 5.1.7 단계로 제조된 40 μL Dio-DC-유래 엑소좀을 전송한다. 동일한 양의 PBS를 추가하여 우물을 제어합니다.
- 10x를 파이프로 섞는다. 4 시간 동안 인큐베이션하십시오.
- 실온에서 10분 동안 200 μL 엑소좀 처리된 PBMC와 호흐트스트 33342라벨을 수집합니다.
- 실온에서 10 분 동안 300 x g의 원심 분리기. 상체를 버리고 PBS의 100 μL에서 셀 펠릿을 다시 중단하십시오.
- 현미경 슬라이드에 세포를 마운트합니다.
- 현미경을 사용하여 Hoechst 33342 표지 PBMC와 디오 라벨 CB-SC 유래 엑소좀의 상호 작용을 관찰하고 촬영합니다.
- 나머지 셀을 5.3.3 단계에서 1.5 mL 튜브로 옮킨다.
- 4°C에서 10분 동안 300 x g의 원심분리기. 상체를 버리고 PBS의 200 μL에서 셀 펠릿을 다시 중단하십시오.
- 샘플당 5μL의 Fc 차단기를 추가합니다. 실온에서 15분 동안 배양하십시오.
- 항체(CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 및 CD56를 25 μg/mL에서)(재료표)에 추가하여 PBMC를 염색합니다.
참고: 동형 일치 IgGs는 부정적인 컨트롤 역할을 합니다. - 실내 온도에서 30분 동안 배양하여 광을 보호합니다.
- PBS와 원심분리기 1mL을 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 첨가하여 세포를 펠릿합니다.
- 200 μL PBS로 세포를 다시 일시 중단합니다. 프로피듐 요오드 5 μL을 추가합니다.
- 유동 세포측정을 사용하여 PBMC의 다른 하위 집단에서 Dio 라벨이 부착된 외종 섭취량의 수준을 평가합니다.
6. 단핵구에 CB-SC 유래 엑소좀의 동작을 검사
- 절연 인간 CD14 양성 단핵구
- 3 x 107 인간의 PBMC를 15mL 튜브로 옮기십시오.
- 4°C에서 10분 동안 300 x g의 원심분리기.
- 분리열(재료 표)을자석 분리기(재료표)에놓습니다.
- 차가운 실행 버퍼(재료의 표)의2 mL로 세 번 분리 열을 세척합니다.
- 감기 PBS의 300 μL에서 세포를 다시 중단합니다. CD14 마이크로비드의 60 μL을 추가합니다. 잘 섞어서 얼음에 15분 동안 배양합니다.
- 차가운 PBS 의 6 mL을 추가합니다. 4°C에서 10분 동안 300 x g의 원심분리기.
- 냉간 실행 버퍼의 500 μL에서 펠릿 세포를 다시 중단합니다.
- 분리 열로 세포를 옮기고(6.14 단계에서 준비)하고 통과하게 합니다.
- 분리 컬럼을 세척당 2mL의 러닝 버퍼로 세 번 세척합니다. 자석 분리기에서 컬럼을 들어 올려 15mL 원심분리기 튜브에 놓습니다.
참고: 15mL 튜브는 실온에서 튜브에 CD14 양성 단색세포의 준수로 인해 얼음 위에 두어야 합니다. - 콜드 러닝 버퍼2mL을 컬럼 의 맨 위로 옮기고 CD14 양성 셀을 15mL 튜브로 분리합니다.
- CD14 양성 세포를 펠릿하기 위해 4°C에서 10분 동안 300 x g의 원심분리기.
- 감기 화학적 정의 혈청 프리배지(재료표)의2mL로 세포를 다시 중단한다.
- 세포의 50 μL을 1.5 mL 튜브로 옮기십시오.
- 20 분 동안 Krome 오렌지 컨쥬게이드 안티 - 인간 CD14 mAb(재료의 표)의10 μL와 얼룩.
참고: 동형 일치 IgGs는 부정적인 컨트롤 역할을 합니다. - 셀에 1mL PBS를 추가합니다. 펠릿 세포에 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기.
- PBS의 200 μL에서 세포를 다시 중단하고 5 mL 튜브로 전송합니다. 유동 세포측정에 의한 CD14 양성 단핵구의 순도를 결정합니다.
- CB-SC 유래 엑소좀을 가진 단핵구의 처리
- 종자 1 x 106 정수 된 단세포는 화학적 정의 세럼없는 배양 배지(재료의 표)조직 배양 처리 6 웰 플레이트 (2 mL / 웰).
- 5 %CO2 에서 37 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
- 1mL 파이펫으로 상체를 폐기하십시오. 37°C의 2mL를 미리 따뜻하게 한 화학적 정의 세럼 없는 배양배지(재료표)를부드럽게 넣습니다.
참고: 모노사이클은 2시간 이내에 플레이트에 부착되었다. 부동 세포는 죽은 또는 다른 세포 오염으로 확인되었다. - 3.10 단계에서 단핵배양에 분리된 80μg CB-SC 유래 엑소좀을 총 부피가 2mL인 6웰 플레이트에 추가합니다.
참고: 동일한 양의 PBS가 우물을 제어하기 위해 추가되었습니다. - 3\u20124 일 동안 5 % CO2 미만의 37 ° C에서 배양하십시오.
- 200× 배율(재료표)에서 반전된 현미경을 사용하여 세포형태학을 촬영합니다.
- 1mL 파이펫 팁으로 PBS 기반 셀 해리 버퍼의 1mL에서 위아래로 피펫팅하여 세포를 분리합니다.
- 셀 스크레이퍼를 통해 나머지 부착된 세포를 수확합니다.
참고: 1차 단핵구 또는 분화된 대식세포가 단단히 부착되기 때문에 일부 세포는 해리 버퍼로 치료 한 후 바닥에 부착 된 상태로 유지됩니다. 따라서 이러한 세포는 세포 스크레이퍼로 수확됩니다. - 5 분 동안 1,690 x g에서 세포를 수집합니다. PBS의 200 μL에서 세포를 다시 일시 중단합니다.
- Fc 차단제(25 μg/mL)의 5μL을 추가하여 비특이적 결합을 차단합니다.
- 항체(CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 및 CD209를 25 μg/mL, 재료 표)에추가합니다. 실온에서 30분 동안 배양하십시오.
참고: 동형 일치 IgGs 는 부정적인 제어 역할을 - 세포에 PBS 1mL을 추가하고 원심분리기는 300 x g에서 10분 동안 추가합니다. 200 μL의 PBS로 상체를 버리고 다시 중단하십시오.
- 시료 당 5 μL의 요오드(200 μL)를 추가하고 세포를 새로운 5mL 유량 튜브로 이송합니다.
- 유동 세포측정을 수행하고 CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 및 CD209 식의 수준을 평가합니다.
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Representative Results
처음에 CB-SC의 표현형 및 순도는 백혈구 공통 항원 CD45, ES 세포 특이적 전사 인자 OCT3/4 및 SOX2와 같은 CB-SC 관련 마커를 사용하여 혈중 세포측정에 의해 검사되었다. CB-SC는 CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 및 galectin 9 발현의 높은 수준을 표시하지만 CD34의 발현은없습니다(도 1A). 유동 세포측정 분석은 CD9, CD81 및 CD63을 포함한 엑소좀 특이적 마커의 발현을 CB-SC 유래 엑소좀(도1B)에확인하였다. 엑소좀의 형태및 크기 분포는 TEM 및 DLS(도1C,D)를특징으로 하며, 크기는 79.38± 20.07nm였다. 웨스턴 블롯은 ER-관련 마커 칼넥신(도1E)의발현 없이 엑소솜 관련 마커 알릭스의 발현을 더욱 입증하였다.
PBMC는 디오 라벨CB-SC-엑소로 처리되었다. 현미경 관찰은 PBMC(그림2A)와디오 라벨 CB-SC-엑소의 직접적인 상호 작용을 보여 주었다. Dio-labeled CB-SC-Exo와 상호 작용하는 세포 집단을 더 잘 정의하기 위해, 상이한 세포 구획은 T 세포를 위한 CD3, 골수성 수지상 세포CD11c(DC), 단화세포CD14, B 세포CD56(그림2B)와같은 세포별 마커로 계각하였다. 4시간 동안 의배복 후, 유동 세포측정은 다이오 양성 엑소좀(도2C)의상이한 형광 강도(MFI)에 표시되는 상이한 혈액세포 구획을 입증하였다. 특히, 단핵구는 다른 면역세포(그림 2C)의것보다 디오 양성 CB-SC-엑소의 더 높은 중간 형광 강도를 나타내었으며, 이는 단핵구가 주로 CB-SC 유래 엑소좀에 의해 표적으로 삼았다는 것을 강조했다.
단세포에 대한 CB-SC 유래 엑소좀의 직접적인 효과를 탐구하기 위해 정제된CD14+ 단핵구는 3일 동안 CB-SC 유래 엑소좀과 공동 배양되었다. 외성 처리 단핵구는 스핀들 과 같은 형태로 성공적으로 분화하였다(그림3A). 다음으로, CB-SC-엑소처리 또는 처리되지 않은 단핵구의 표현형이 시험되었고, CD163, CD206, CD209를 포함한 M2 관련 마커의 발현이 엑소좀 처리군(도3B,적색 히스토그램)에서 현저하게 증가하였다. M-CSF + IL-4에 의해 생성된 종래의 M2 대식세포와 비교하여, CB-SC-엑소 처리 단세포는 CD163, CD206, CD209와 같은 M2 관련 마커의 유사한 수준을 현저한 차이 없이 표현하였다(도3C). 따라서, 데이터는 단핵구가 CB-SC 유래 엑소좀을 가진 처리 후에 M2 표현형을 가진 대식세포로 분화한다는 것을 나타낸다.
그림 1: CB-SC 유래 엑소좀의 특성화. (A)CB-SC의 표현성, CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 및 Galectin-9의 높은 발현, CD34의 발현 없음. (B)CB-SC 유래 엑소좀에 대한 엑소솜 관련 마커(CD63, CD9, CD81)의 발현. 동형 일치 IgGs는 유동 세포측정법(회색 히스토그램)에 대한 제어 역할을 했습니다. (C)CB-SC 유래 엑소좀의 전송 전자 현미경 검사법(TEM) 이미지. (D)다이나미스틱 광 산란(DLS)을 이용한 CB-SC 유래 엑소좀의 크기 분포. (E)웨스턴 블롯은 CB-SC 유래 엑소좀이 엑소좀 특이적 마커 알릭스를 표시하지만, 내피 성 망상(ER)에 대한 부정적(ER)-관련 마커 칼넥신을 표시하고 있음을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PBMC의 다른 인구와 CB-SC 유래 엑소좀의 상호 작용. (A)디오 라벨CB-SC-엑소(녹색)와 PBMC(블루, Hoechst 33342)와 핵 염색은 NIS-Elements 소프트웨어 버전 5.11.02와 함께 니콘 이클립스 Ti2 현미경으로 촬영되었으며, 비조직 배양에서 4 시간 5 % CO2의 공동 인큐베이션 후 PBMC 세포에서 디오 라벨 엑소좀 (녹색)의 분포를 나타내는 높은 배율로 촬영되었습니다. n = 2. (b)PBMC의 상이한 하위 집단에 대한 세포별 표면 마커를 가진 유동 세포측정 분석을 위한 게이팅 전략, T 세포용 CD3, 단핵구CD14, B 세포의 CD19, CD56용 CD56, CD11c 를 DC용(C) 다른 PBMC 하위 집단(예를 들어, T 세포, 모노사이클, B세포, NK 세포, DC)의 다이코 라벨외종의 상이한 중앙형광 강도(MFI)를 표시한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 단핵구에 CB-SC 유래 엑소좀의 효과. (A)CB-SC 유래 엑소좀을 치료한 후 스핀들 과 같은 세포로 단핵구의 형태학적 변화. (B)CD163, CD206 및 CD209(red line)와 같은 CB-SC 유래 엑소좀을 치료한 후 M2-어소시에이트 마커의 발현 수준을 최대 조절하였다. 처리되지 않은 단핵구(녹색 선)가 제어역할을 합니다. 동형 일치 IgGs는 음의 컨트롤 (회색 선)역할을했다. (C)종래의 M2 대식세포와 CB-SC-엑소 유도 M2 대식세포 간의 표형 비교. 종래의 M2 대식세포를 생성하기 위해, 정제된 CD14+단세포는 37°C에서 50 ng/mL 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF)로 처리되었고, 7일 동안 5%CO2 조건, 10 ng/mL IL-4를 가진 야간 처리에 선행되었다. CD14를 포함하는 M2 관련 마커. CD80, CD86, CD163, CD206 및 CD209는 유동 세포측정에 의해 평가되었다. 이소타입-일치 면역글로불린 G(IgG)는 대조군 역할을 한다. 데이터는 SD에 ± 의미로 표시됩니다. N = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
엑소좀의 응용 은 임상 진단, 약물 개발 및 재생 의학을위한 신흥 분야입니다. 여기서는 CB-SC 유래 엑소좀의 제조와 인간 단핵구의 분화에 대한 엑소좀의 기능적 연구에 관한 상세한 프로토콜을 제시한다. 현재 프로토콜은 기능성 CB-SC 유래 엑소좀이 순도가 높은 순도및 모노사이클에 면역 변조를 나타내는 순차적 원심분리 및 초원심분리에 의해 격리된다는 것을 입증하였다.
다른 종래의 프로토콜과 비교하여, 울트라 여과는 다른 세포 또는 매체로부터 외종의 격리 및 정화를 위한 확립된 접근법이며, 다른 세포외 소포(EV)와 다른 분자량 및 배제 크기에 기초한다. 초응성 분리는 초원심분리 기반 분리보다 더 많은 시간 절약이지만, 큰 크기로 소포에 구조적 손상을 일으킬 수 있습니다. 엑소좀은 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-매개 강수량에 의해 저비용으로 수집될 수 있지만, 이 방법은 단백질 오염으로 인한 엑소좀 순도의 위험을감수하지만(13,14). 따라서, 현재 프로토콜은 고순도에서 엑소좀을 생산하는 데 비용 효율적이었다. CB-SC 유래엑소좀(10)의면역 변조에 기초하여, CB-SC 유래 엑소좀의 특성화는 임상 적용 전에 CB-SC를 가진 줄기 세포 교육자의 효능을 평가하는 귀중한 바이오마커를 제공할 수 있다.
대식세포는 다양한 생물학적 기능과 이질성을 가진 바이러스 성 및 세균 감염에 대한 전문 항원 제시 세포입니다. 표면 마커및 면역 기능의 차이에 기초하여, 대식세포는 두 개의 하위 집단으로 분류됩니다: 타입-1 대식세포 (M1, 염증을 일으키는 종래의 대식세포) 및 타입-2 대식세포 (M2, 항 염증 표시)15. 이 연구는 정제된 인간 단핵구가 CB-SC 유래 엑소좀을 가진 처리 후에 타입-2 대식세포로 분화되었다는 것을, 항염증 표현형을 표시한다는 것을설치했습니다. CB-SC 유래 엑소좀 처리 단핵구는 길쭉한 형태를 나타내고 M2 관련 표면 마커(예를 들어, CD163, CD206 및 CD209)를 발현하고, 종래의 M2 대식세포와 유사한 표현형을 사이토카인 M-CSF + IL-4를 사용하여 생성된 것과 유사한 표현형을 표현하였다. 단핵구의 이러한 표현성 변화는 타입-1 당뇨병 및 그밖 자기 면역 질병의 처리를 위한 CB-SC의 면역 변조의 근본적인 새로운 기계장치를 강조합니다. SCE 치료 중 환자의 면역 세포는 약 8\u20129 h를 위해 CB-SC와 공동 배양되었습니다. SCE 처리된 단핵구는 CB-SC 유래 엑소좀을 다시 신체로 운반하여 M2 분화 및 면역 내성의 유도의 확대에 기여하여 SCE 치료로 치료 후 임상 결과의 개선을 이끌어 냈습니다.
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Disclosures
Zhao 박사는 천헤 줄기 세포 생명 공학 Inc.의 설립자입니다 Zhao 박사는 줄기 세포 교육자 기술의 발명가입니다. 다른 모든 저자는 제출 된 작업과 관련이있을 수있는 재정적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 해켄색 UMC 재단을 통해 관대 한 자금 지원을 포드 다르 씨와 루드비히 씨에게 감사드립니다. 우리는 영어 편집에 대한 로라 자오 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
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