Summary
エキソソームアプリケーションは、医薬品開発と再生医療のための新たなツールです。我々は、高純度のエキソソーム分離プロトコルを確立し、機械学的研究のためにCB-SCと呼ばれる新しい同定された幹細胞からエキソソームを分離する。また、CB-SC由来エキソソームをヒト単球と共培養し、その分化を、定型的に区別するマクロファージに導いた。
Abstract
幹細胞教育者(SCE)療法は、1型糖尿病および他の自己免疫疾患の治療のための新しい臨床アプローチである。SCE療法は、単離された患者の血液単核細胞(例えば、リンパ球および単球)をアフェレシス機を介して循環し、SCE装置中の接着性臍帯血由来幹細胞(CB-SC)を有する患者の血液単核細胞を共培養し、これらの「教育された」免疫細胞を患者の血液に戻す。エキソソームは、すべての生体流体および細胞培養媒体に存在する30\u2012150 nmの間のナノサイズの細胞外小胞である。SCE療法の基礎となる分子メカニズムをさらに探求し、CB-SCから放出されるエキソソームの作用を調べるため、CB-SCによる治療中にこれらのエキソソームを食作用させる細胞を調べる。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)と共に標識されたCB-SC由来エキソソームを共培養することにより、CB-SC由来エキソソームはヒトCD14陽性単球によって主に取り込まれ、スピンドル様形態とM2関連表面マーカーの発現を伴う単球の分化(M2)につながることがわかった。ここでは、CB-SC由来エキソソームの分離と特徴付けのためのプロトコルと、ヒト単球とCB-SC由来エキソソームの共培養とM2分化のモニタリングのためのプロトコルを提示する。
Introduction
臍帯血幹細胞(CB-SC)は、ヒト臍帯血から同定された独自のタイプの幹細胞であり、間葉系幹細胞(MSC)および造血幹細胞(HSC)1などの他の既知のタイプの幹細胞と区別される。免疫変調の特性とペトリ皿の表面にしっかりと付着する能力に基づいて、我々は臨床試験2、3で幹細胞教育者(SCE)療法として指定された新しい技術を開発しました。SCE療法の間に、患者の末梢血単核細胞(PBMC)は細胞分離器を介して集め、循環し、インビトロの付着CB-SCと共培養される。これらの「教育された」細胞(CB-SC処理PBMC)は、閉ループシステムで患者の循環に戻されます。臨床試験は、1型糖尿病(T1D)2、4および脱毛症(AA)5を含む自己免疫疾患の治療に対するSCE療法の臨床的安全性および有効性を既に実証している。
エキソソームは、直径30\u2012150 nmのナノ粒子ファミリーであり、すべての生体流体および細胞培養培地6に存在する。エキソソームは、脂質、mRNA、タンパク質、マイクロRNA(miRNA)を含む多くの生理活性分子で富化され、細胞間通信において重要な役割を果たします。最近では、エキソソームは、診療所7、8、9の治療の可能性のために、研究者や製薬会社にとってより魅力的になっています。最近、我々の機械学的研究はCB-SC放出エキソソームがSCE療法10の免疫調節に寄与することを実証した。
ここでは、CB-SC放出エキソソームによる単球を標的とするSCE療法のメカニズムを探るプロトコルについて述べる。まず、CB-SC放出エキソソームを超遠心分離法を用いてCB-SC由来のコンディション培地から分離し、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット(WB)および動的光散乱(DLS)によって検証した。第2に、CB-SC由来エキソソームは、緑色蛍光性親油性色素であるディオで標識した。第三に、彼らは、フローサイトメトリーによるPBMCの異なる亜集団におけるディオ標識CB-SC由来エキソソームの正の割合を調べるためにPBMCと共培養した。このプロトコルは、幹細胞の免疫調節の基礎となるエキソソームの作用を研究するためのガイダンスを提供する。
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Protocol
このプロトコルは、ハッッケンサック・メリディアン・ヘルスの発見・イノベーションセンターの制度的人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。ヒトバフィーコート血液ユニットは、ニューヨーク血液センター(ニューヨーク、ニューヨーク)から購入されました。ヒト臍帯血ユニットは健康なドナーから採取され、クライオセル・インターナショナル血液銀行(フロリダ州オールズマー)から購入した。ニューヨーク血液センターとクライオセルの両方が、IRBの承認を得て、ドナーから同意書に署名し、採血と分布のすべての認定を受けています。
1. CB-SC由来のコンディション培地の細胞培養および調製
- 20 mL の帯状グラデーション媒体(γ = 1.077)を20 mL以上の臍帯血(材料表)を50 mL円錐形チューブに移します。
- ブレーキなしのスイングバケットローターで20°Cで20分間1,690 x g の遠心分離機。
- 単核細胞層(バフィーコート)を新しい50 mL円錐形チューブに慎重に移します。円錐管にリン酸緩衝生理食塩分(PBS)を40 mLに充填します。ペレット細胞に混合し、751 x g で20°Cで10分間混合します。
- 上清を捨て、細胞ペレットにACKのライシスバッファー(材料表)の15 mLを加えます。ピペット処理を通して細胞を再中断する。その後、室温で10分間インキュベートします。
注:この手順は、赤血球を削除します。 - 25 mLのPBSで円錐管を充填します。751 x g で5分間遠心分離し、上清を捨ててペレット化した単核細胞を得た。
- 2xを40mLのPBSで洗浄し、残りのリシスバッファーを除去します。
- 遠心分離機を751xgで5分間細胞にペレットする。
- 上清を捨て、1管あたり10mLの化学的に定義された無血清培地(材料表)で臍帯血単核細胞を再中断します。
- 臍帯血単核細胞を1つのチューブに結合する。
- 20 μLのセル懸濁液を取り、20 μLの0.4%トリパンブルー溶液(材料表)を1.5 mLチューブに混ぜます。
- チャンバースライドにロードし、自動化されたセルカウンターで細胞数と細胞生存率を定量化します。
注:細胞の濃度が1 x 107 細胞/mLを超える場合、細胞懸濁液は1:10で希釈されます。 - 150 mm x 15 mm のペトリ皿に 1x 106 細胞/mL、25 mL/dish の化学定義無血清細胞培地で単核細胞をシードします。
- CB-SCが80%以上の合流点に達するまで、10\u201214日間の8%CO2条件下で37°Cでインキュベートします。
- 上清を捨て、ペトリ皿あたり15mLのPBSで洗います。次に、PBS を削除します。
注意:CB-SCはペトリ料理にしっかりと取り付けられています。 - ステップ 1.14 を 2 回繰り返します。
- ペトリ皿あたり25mLの化学的に定義された血清フリー培地を加えます。
- 3\u20124日間、8%CO2条件下で37°Cでインキュベートします。
- CB-SC由来のコンディション培地を50 mL円錐形チューブに回収します。
2. CB-SCの特徴付け
- 5 mL ピペットチップ(材料表)でPBSベースの細胞解離バッファーを上下にピペット処理してCB-SCを取り外す。
- 遠心分離機はペレット細胞に5分間1,690 x g で、PBSの200 μLで再中断します。
- 染色調製キットを介して細胞内染色用の細胞を固定および透過させる(材料表)。
- サンプルごとにFcブロッカー(材料表)5 μLを加え、室温で15分間インキュベートします。
注:Fcブロッカーは、抗体で染色する場合に非特異的結合を阻害します。 - CD34、CD45、SOX2、OCT3/4、CD270、ガレクチン9を25μg/mL(材料表)を含む蛍光共役マウス抗ヒトモノクローナル抗体を100μLの細胞に加える。軽い保護と室温で30分間インキュベート。
- 染色後、1 mLのPBSで細胞を洗浄し、遠心分離機を751 x g で10分間ペレット細胞に洗浄します。
- 200 μL の PBS で細胞を再中断し、5 mL チューブに移します。
- フローサイトメトリーを行い、上記の特定のマーカーに関連するCB-SCの発現を検証する。
3. CB-SC由来エキソソームの分離
- 4°Cで10分間300xgでステップ1.18から採取したコンディション培地を遠心分離する。 上清を新しい50 mL円錐形チューブに移します。
- 遠心分離剤は、ステップ3.1から集めた上清を2,000xgで4°Cで20分間回収した。 上清を新しい50 mL円錐形チューブに移します。
- 遠心分離剤は、ステップ3.2から集めた上清を10,000xgで4°Cで30分間回収した。 上清を新しい50 mL円錐形チューブに移します。
注: 固定角度ローターは、細胞ペレットがチューブの側面に沈殿するように使用されます。キャップの側面をマークし、ペレットが予想されるチューブの側面に円を描きます。 - ステップ 3.3 から収集したフィルター上清を 0.22 μm フィルターで使用します (材料表)。
- 各10 kDa遠心フィルターユニット(材料表)に15mLのメディアを転送します。
- 4,000 x g で遠心分離し、30分間、濃縮エキソソーム培地を分離する。
- 濃縮エキソソームを超遠心チューブに移します。その後、ペレットエキソソームを100,000xgで80分間4°Cで行う。
- 上清を捨て、PBSの10mLでペレットエキソソームを再懸濁します。
- 遠心分離機は、エキソソームペレットを集めるために4°Cで80分間100,000xgで。
- エキソソームペレットを200 μLのPBSで上下にピペット処理して再懸濁します。
4. CB-SC由来エキソソームの特徴
- ビチンコニン酸アッセイ(BCA)キットによるエキソソーム製剤の総タンパク質濃度の定量化
- ステップ3.10で調製した各アルブミン標準および単離エキソソームサンプルのピペット10μLを、重複した96ウェルプレートに作製した。
- BCAキットから各ウェルに200μLの試薬を加えます。プレートの内容物を10sのプレートシェーカーに十分に混ぜます。
注意:作動試薬(WR):1部試薬Bを用いた50個の試薬A。 - プレートをホイルで覆い、37°Cで30分間インキュベートします。
- プレートを室温(RT)まで冷却します。
- プレートリーダーを介して562 nmでサンプル吸光度を測定します。
- フローサイトメトリー用エキソソームの調製と染色
- 20 μL の抗ヒト CD63 磁気ビーズ (4.5 μm サイズ) (材料表) を、ステップ 3.10 で作成した CB-SC 由来エキソソームの 25 μg に PBS の合計 100 μL 体積で 25 μg に添加してエキソソームを捕捉します。
- 800 rpm でシェーカー上の 4 °C でチューブを一晩 (18\u201222 h) インキュベートします。
- チューブの下部にサンプルを集めるために300xgでチューブを30sで遠心します。
- 300 μLの分離バッファー (PBS で 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) を加え、ピペットで軽く混ぜます。
注: このステップは、ビーズに結合したエキソソームを打ち出します。 - チューブをマグネットスタンドに1分間置き(材料表)、上清を捨てます。
- 手順 4.2.4\u20124.2.5 を繰り返します。
- 400 μL の分離バッファーでビーズバウンドエキソソームを再中断します。
- 各チューブにビーズ結合エキソソームのアリコート100μL。
- 蛍光共役抗体(CD9-FITC、CD81-PE、およびCD63-FITCをそれぞれ25μg/mL)を、CD63ビーズ捕捉エキソソーム付きの各流管に加えます。
注: アイソタイプ一致 IgG は、負のコントロールとして機能します。 - 800 rpmでシェーカーに光保護を付けて室温で45分間インキュベートします。
- 手順 4.2.4\u20124.2.5 を繰り返します。
- 200 μL の分離バッファーでビーズ結合エキソソームを再中断し、5 mL の流れチューブに移します。
- フローサイトメーターのサンプルカルーセルにチューブを入れます。
- エキソソームテスト用のプロトコルを開きます。
- フローサイトメーターでサンプルを自動的に実行します。
- ウェスタンブロットによるエキソソーム検出
注意:ウェスタンブロットは確立された方法であり、メソッド自体の詳細には入りません。- ステップ3.10から100 μLのRIPAバッファー、ピペット20倍のペレットをライゼし、氷の上に5分間置きます。
- BCAキットによるエキソソームリゼートのタンパク質濃度を定量化し、1ウェルあたり25μgのタンパク質をロードします。
- 150Vで40分間ゲル電気泳動によりタンパク質を分離します。
- 半乾燥転写方法11を用いて、フッ化ビニリデン(PVDF)膜にタンパク質を移す。
- 5%非脂肪乳で膜を30分間ブロックします。
- 2 μg/mL抗ヒトアリックス(材料表)および1 μg/mL抗ヒトカルネキシン抗体(材料表)をインキュベートする。
- デジタルイメージングシステムを用いて化学発光によりタンパク質を検出します。
- 動的光散乱(DLS)によるエキソソーム検証
- PBS 1 mL でCB-SC由来エキソソームサンプルの 10 μg を希釈します。
- 希釈サンプル1mLを使い捨てセミマイクロキュベット(材料表)に移します。
- DLSの器械にキュヴェットを置く。すべてのサンプル モニタに対して、屈折率 (RI) を 1.39 に設定します。
- サンプルを25°Cで実行し、1分の3の測定値を取得して平均サイズ分布を取得します。
- 透過電子顕微鏡(TEM)によるエキソソーム検証
- 300メッシュ銅格子12(材料表)上のコートフォームバー。
- 銅格子12上の蒸発炭素の追加層でフォームバーを強化する。
注:このようなコーティングアプローチは、試料のサポートに優れています。 - エキソソームサンプル10 μLをグリッドに積み込み、エアドライのままにします。
- 酢酸ウラニルでサンプルを5分間負の染色。
- DI水で3回洗い、空気乾燥にしておきます。
- TEMの下でサンプルを観察し、撮影してください。加速電圧を200kV、スポットサイズを2に設定します。
5. PBMCの異なる亜集団によって取られたディオ標識CB-SC由来エキソソームを測定する
-
緑色蛍光性親油性色素のダイオによるラベルCB-SC由来エキソソーム
- CB-SC由来エキソソーム(ステップ3.10で作成)の100 μgを15 mL遠心分離管に移します。
- PBSでサンプルを5mLに希釈します。
- 緑色蛍光性の親油性色素Dio(材料表)を加える。
- 光から保護された室温で15分間インキュベートします。
- サンプルを超遠心チューブに移します。
- 遠心分離機は80分間100,000 x g で、ダイオ標識されたCB-SC由来エキソソームをペレットにする。
- PBSの200 μLでラベル付けされたエキソソームを再中断します。
-
ヒトPBMCの準備
- 20 mL の密度勾配媒体(γ = 1.077)を超えるヒトバフィーコート(材料表)を50 mL円錐形チューブに移します。
- ステップ 1.2 ~ 1.11 を繰り返します。
- 1 x 106 PBMCを非組織処理疎水性24ウェルプレート(1 mL/well)に移します。
注:非組織処理プレートは、単球の付着を避けるために使用されました。
-
PBMCとの共同培養ディオラベルエキソソーム
- ステップ5.1.7で調製した40 μL Dio-ラベルCB-SC由来エキソソームを、200 μL ピペットを使用して、24 ウェルプレート内の各 PBMC 含有ウェルに移します。同じ量のPBSを追加して井戸を制御します。
- 10倍のピペットで混ぜます。4時間インキュベートする。
- 200 μL エキソソーム処理PBMCを収集し、室温で10分間、Hoechst 33342でラベルを収集します。
- 室温で10分間300×gで遠心分離機。 上清を捨て、細胞ペレットをPBSの100 μLで再び懸濁します。
- 顕微鏡のスライドに細胞を取り付けます。
- ディオ標識CB-SC由来エキソソームとHOEchst 33342標識PBMCとの相互作用を顕微鏡で観察し、撮影します。
- 残りの細胞をステップ 5.3.3 から 1.5 mL チューブに移します。
- 遠心分離機 300 x g で 4 °C で 10 分間 上清を捨て、200μLのPBSで細胞ペレットを再び懸濁します。
- サンプルごとにFcブロッカーを5μL追加します。室温で15分間インキュベートします。
- PBMCを染色する抗体(CD3、CD4、CD8、CD11c、CD14、CD19、CD56を25μg/mL)に添加します。
注: アイソタイプ一致 IgG は、負のコントロールとして機能します。 - 軽い保護と室温で30分間インキュベート。
- 4°Cで10分間300xgでPBSと遠心分離機を1 mL加え、細胞をペレット化する。
- 200 μL PBS で細胞を再懸濁します。ヨウ化プロピジウム5μLを加えます。
- フローサイトメトリーを使用して、PBMCの異なるサブ人口におけるディオ標識エキソソーム取り込みのレベルを評価します。
6. 単球に対するCB-SC由来エキソソームの作用を調べる
- ヒトCD14陽性単球の単球の分離
- 3 x 107 人体 PBMC を 15 mL チューブに移します。
- 遠心分離機 300 x g で 4 °C で 10 分間
- 磁石セパレータ (表) に分離カラム(材料表) を配置します。
- 2 mLのコールドランニングバッファ(材料表)で分離カラムを3回洗浄します。
- 300 μL のコールド PBS で細胞を再懸濁します。60 μL の CD14 マイクロビーズを加えます。よく混ぜて氷の上で15分間インキュベートします。
- 6 mLの冷たいPBSを加えます。遠心分離機 300 x g で 4 °C で 10 分間
- ペレット化された細胞を500 μLのコールドランニングバッファに再懸濁します。
- 細胞を分離カラムに移し(ステップ6.14で準備)、それらを通過させます。
- 分離カラムを洗浄ごとに2mLのランニングバッファで3回洗浄します。マグネットセパレータから柱を持ち上げ、15 mL遠心分離管に入れます。
注:15 mLチューブは、室温でチューブにCD14陽性単球が付着するため、氷の上に置く必要があります。 - 2 mLのコールドランニングバッファーをカラムの上部に移し、CD14陽性細胞を15 mLチューブに分離します。
- 遠心分離機を4°Cで10分間300xgでCD14陽性細胞にペレット化した。
- 2 mLの冷た化学定義血清フリー培地(材料表)で細胞を再中断する。
- 50 μLの細胞を1.5 mLチューブに移します。
- 10 μLのクロームオレンジ共役抗ヒト CD14 mAb (材料表) を 20 分間染色。
注: アイソタイプ一致 IgG は、負のコントロールとして機能します。 - 細胞に1 mL PBSを加えます。遠心分離機を300xgで10分間ペレット細胞にする。
- 200 μL の PBS で細胞を再中断し、5 mL チューブに移します。フローサイトメトリーによりCD14陽性単球の純度を測定する。
- CB-SC由来エキソソームによる単球の治療
- 種子1 x106 は、培養処理した6ウェルプレート(2mL/well)の化学的に定義された無血清培地(材料表)を用いて単球を精製した。
- 37°Cで2時間インキュベートして5%CO2の下で。
- 上清を1 mLピペットで捨てます。37°Cの2mLを加え、あらかじめ温められた化学的に定義された無血清培地(材料表)を穏やかに加えます。
注:単球は2時間以内にプレートに接着した。浮遊細胞は死んだかまたは他の細胞汚染として同定された。 - ステップ3.10から分離された80 μgのCB-SC由来エキソソームを、総体積2 mLの6ウェルプレートに単球培養物に加えます。
注: 同じ PBS のボリュームが、井戸を制御するために追加されました。 - 3\u20124日間、5%CO2以下で37°Cでインキュベートします。
- 反転顕微鏡を用いて細胞形態を200×倍率で撮影する(材料表)。
- 1 mL ピペットチップを用いたPBSベースの細胞解離バッファーの 1 mL で上下にピペットを使用して細胞を取り外します。
- 残りの付着セルをセルスクレーパーで収穫します。
注:一次単球または分化されたマクロファージはしっかりと付着するので、一部の細胞は解離緩衝液で処理した後も底部に付着したままです。したがって、これらの細胞は細胞スクレーパーで収穫される。 - 5分間1,690 x g で細胞を収集します。200 μL の PBS で細胞を再中断します。
- Fcブロッカー(25 μg/mL)を5 μL追加して、非特異的な結合をブロックします。
- 抗体(CD14、CD80、CD86、CD163、CD206、CD209、25μg/mL、 材料表)を細胞に加えます。室温で30分間インキュベートします。
注: アイソタイプ一致 IgG は負のコントロールとして機能します - 細胞にPBSの1 mLを加え、遠心分離機を300xgで10分間加えます。 上清を捨て、200 μLのPBSで再中断します。
- サンプル当たり5μLのヨウ化プロピジウム(200μL)を加え、新しい5mLのフローチューブに細胞を移します。
- フローサイトメトリーを実行し、CD14、CD80、CD86、CD163、CD206、およびCD209の各表現のレベルを評価します。
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Representative Results
当初、CB-SCの表現型と純度を、白血球共通抗原CD45、ES細胞特異的転写因子OCT3/4、およびSOX2などのCB-SC関連マーカーを用いてフローサイトメトリーにより調べた。CB-SCはCD45、OCT3/4、SOX2、CD270、およびガレクチン9の発現を高レベルで表示するが、CD34の発現は一切ない(図1A)。フローサイトメトリー解析では、CD9、CD81、およびCD63を含むエキソソーム特異的マーカーの発現がCB-SC由来エキソソーム上にあったことを確認した(図1B)。エキソソームの形態およびサイズ分布は、TEMおよびDLS(図1C,D)によって特徴付けられており、サイズは79.38±20.07 nmであった。ウェスタンブロットは、さらに、エキソソーム関連マーカーアリックスの発現を証明し、ER関連マーカーカルネキシンの発現を伴わない(図1E)。
PBMCは、ディオラベルCB-SC-Exoで治療された。顕微鏡観察では、ディオ標識CB-SC-ExoとPBMCとの直接的な相互作用が実証された(図2A)。どの細胞集団がどのジオ標識CB-SC-Exoと相互作用するかをより良く定義するために、異なる細胞区画は、T細胞用CD3、骨髄樹状細胞(DC)のCD11c、単球用CD14、B細胞用CD19、NK細胞用CD56などの細胞特異的マーカーでゲート付けされた(図2B)。4時間のインキュベーション後、フローサイトメトリーは、ディオ陽性エキソソームの異なる中央値蛍光強度(MFI)に異なる血液細胞コンパートメントが表示されることを実証した(図2C)。特に、単球は、他の免疫細胞の蛍光よりも高い蛍光濃度の蛍光の中央値を示した(図2C)、単球が主にCB-SC由来エキソソームによって標的とされたことを強調した。
単球に対するCB-SC由来エキソソームの直接的な影響を探るために、精製されたCD14+ 単球を3日間CB-SC由来エキソソームと共培養した。エキソソーム処理された単球は、スピンドル様形態に分化に成功した(図3A)。次に、CB-SC-Exo処置または未処理単球の表現型を試験し、CD163、CD206、CD209を含むM2関連マーカーの式を明らかにし、エキソソーム処理群の中で顕著に増加した(図3B、赤色ヒストグラム)。M-CSF+ IL-4によって生成された従来のM2マクロファージと比較すると、CB-SC-Exo処理単球は、CD163、CD206、CD209などの類似したレベルのM2関連マーカーを発現し、有意な差はなかった(図3C)。したがって、データは、単球がCB-SC由来エキソソームでの治療後にM2表現型を有するマクロファージに分化することを示している。
図1:CB-SC由来エキソソームの特性(A)CB-SCの表現型特徴、CD45、OCT3/4、SOX2、CD270、ガレクチン-9の高発現、CD34の発現なし。(B) CB-SC由来エキソソーム上のエキソソーム関連マーカー(CD63、CD9、CD81)の式。アイソタイプに一致したIgGは、フローサイトメトリー(グレーヒストグラム)の制御として機能しました。(C)CB-SC由来エキソソームの透過電子顕微鏡(TEM)画像。(D) ダイナミティック光散乱(DLS)を用いたCB-SC由来エキソソームのサイズ分布。(E)ウェスタンブロットは、CB-SC由来エキソソームがエキソソーム特異的マーカーAlixを表示するが、小胞体(ER)関連マーカーカルネキシンに対して陰性であることを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PBMCの異なる集団とのCB-SC由来エキソソームの相互作用。(A) ディオラベルのCB-SC-エキソ(緑)とPBMC(青、 Hoechst 33342)を用いた核染色)は、ニコンエクリプスTi2顕微鏡をNIS-Elementsソフトウェアバージョン5.11.02で撮影し、非組織培養処理24ウェルプレートで4h5%CO2の共培養後のPBMC細胞におけるディオ標識エキソソーム(緑色)の分布を示す高倍率で撮影した。n = 2。(B) PBMCにおける異なるサブ集団に対する細胞特異的表面マーカーによるフローサイトメトリー解析のための地格化戦略 T細胞用CD3、単球用CD14、B細胞用CD19、NK細胞用CD56、およびCD11c(C)異なるPBMC亜集団間のディオ標識エキソソームの異なる中央値蛍光強度(MFI)を表示する(例えば、T細胞、単球、B細胞、NK細胞、DCs)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:単球に対するCB-SC由来エキソソームの影響(A) CB-SC由来エキソソームによる処理後のスピンドル様細胞への単球の形態学的変化(B) CD163、CD206、CD209(レッドライン)などのCB-SC由来エキソソームによる治療後のM2関連マーカーの発現レベルをアップレギュレートする。未処理の単球(緑色の線)が制御役を務めた。アイソタイプマッチ IgG は、負のコントロール(灰色の線)として機能しました。(C)従来のM2マクロファージとCB-SC-Exo誘導M2マクロファージとの間のフェノミカル比較。従来のM2マクロファージを生成するために、精製されたCD14+単球を、37°Cで50ng/mLマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、5%CO2条件で7日間処理し、続いて10ng/mL IL-4で一晩処理した。CD14を含むM2関連マーカー。CD80、CD86、CD163、CD206、およびCD209をフローサイトメトリーで評価した。アイソタイプマッチ免疫グロブリンG(IgG)はコントロールとして機能します。データは SD ±平均値として表示されます。N = 3.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
エキソソームの応用は、臨床診断、医薬品開発、再生医療の新たな分野です。ここでは、CB-SC由来エキソソームの調製とヒト単球の分化に関するエキソソームの機能研究に関する詳細なプロトコルを提示する。現在のプロトコルは、機能的CB-SC由来エキソソームが高純度で逐次遠心分離と超遠心分離によって単球に免疫変調を示すことによって単一体化されることを実証した。
他の従来のプロトコルと比較して、限外濾過は、他の細胞外小胞(EV)とは異なる分子量および排除サイズに基づいて、異なる細胞または媒体からのエキソソームの単離および精製のための確立されたアプローチである。限外濾過分離は、超遠心分離よりも時間の節約が多いが、大きなサイズで小胞に構造的な損傷を引き起こす可能性がある。エキソソームはまた、ポリエチレングリコール(PEG)媒介沈殿物によって低コストで収集することができるが、この方法はタンパク質汚染13、14によるエキソソーム純度のリスクがある。したがって、現在のプロトコルは、高純度でエキソソームを製造するのに費用対効果が高かった。CB-SC由来エキソソーム10の免疫調節に基づいて、CB-SC由来エキソソームの特徴付けは、臨床応用前にCB-SCを有する幹細胞教育者の効力性を評価するための貴重なバイオマーカーを提供するかもしれない。
マクロファージは、ウイルスおよび細菌感染に対するプロの抗原提示細胞であり、様々な生物学的機能および異種性を有する。表面マーカーと免疫機能の違いに基づいて、マクロファージは2つのサブ集団で分類される:1型マクロファージ(M1、炎症を引き起こす従来のマクロファージ)および2型マクロファージ(M2、抗炎症を示す)15。本研究により、精製ヒト単球をCB-SC由来エキソソームでの治療後に2型マクロファージに分化し、抗炎症表現型10を示した。CB-SC由来エキソソーム処理単球は、細長い形態を示し、M2関連の表面マーカー(例えば、CD163、CD206、およびCD209)を発現し、サイトカインM-CSF+IL-4を用いて生成された従来のM2マクロファージと同様の表現型を有する。このような単球の表現型の変化は、1型糖尿病および他の自己免疫疾患の治療のためのCB-SCの免疫調節の基礎となる新しいメカニズムを強調する。SCE療法の間に、患者の免疫細胞をCB-SCと共培養した。SCE治療された単球は、CB-SC由来エキソソームを体内に戻し、M2分化と免疫寛容の誘導の拡大に寄与し、SCE療法による治療後の臨床結果の改善につながった。
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Disclosures
Zhao博士は、天河幹細胞バイオテクノロジー社の創設者であり、幹細胞教育者技術の発明者です。他のすべての著者は、提出された作業に関連する可能性のある金銭的利益を持っていません。
Acknowledgments
私たちは、ハッケンサックUMC財団を通じて寛大な資金援助をしてくれたポダー氏とルートヴィヒ氏に感謝しています。私たちは、英語の編集のためにローラ・ジャオに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
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