Summary
Экзосомное применение является новым инструментом для разработки лекарственных средств и регенеративной медицины. Мы устанавливаем протокол экзосомной изоляции с высокой чистотой, чтобы изолировать экзосомы от новых выявленных стволовых клеток под названием CB-SC для механистических исследований. Мы также совместно культуры CB-SC полученных экзосом с человека моноцитов, что приводит к их дифференциации в фенотипически различных макрофагов.
Abstract
Терапия стволовыми клетками (SCE) является новым клиническим подходом для лечения диабета типа 1 и других аутоиммунных заболеваний. SCE терапия циркулирует изолированных моноядерных клеток крови пациента (например, лимфоцитов и моноцитов) через афереза машины, совместно культур крови пациента моноядерных клеток с адептом пуповинной крови стволовых клеток (CB-SC) в устройстве SCE, а затем возвращает эти "образованные" иммунные клетки в кровь пациента. Экзосомы являются наноразмерными внеклеточными пузырьками между 30-2012150 нм, существующими во всех биофлюидных и клеточных культурных средствах массовой информации. Для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе терапии SCE и определить действия экзосом, выпущенных из CB-SC, мы исследуем, какие клетки фагоцитизируют эти экзосомы во время лечения CB-SC. По совместной культивирования Дио помечены CB-SC полученных экзосом с человеческой периферической крови моноядерных клеток (PBMC), мы обнаружили, что CB-SC полученных экзосом были преимущественно приняты человека CD14-положительных моноцитов, что приводит к дифференциации моноцитов в тип 2 макрофаги (M2), с шпиндель-как морфология и выражение M2-ассоциированных молекулярных маркеров. Здесь мы представляем протокол для изоляции и характеристики экзосом, полученных CB-SC, и протокол для совместной культуры экзосом, полученных CB-SC, с моноцитами человека и мониторинга дифференциации M2.
Introduction
Стволовые клетки пуповинной крови (CB-SC) являются уникальным типом стволовых клеток, идентифицированных из пуповинной крови человека и отличаются от других известных типов стволовых клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и гематопоэтические стволовые клетки (HSC)1. Основываясь на их уникальных свойствах иммунной модуляции и их способности плотно прилипать к поверхности чашек Петри, мы разработали новую технологию, обозначенную как терапия стволовыми клетками (SCE) в клиническихиспытаниях 2,3. Во время терапии SCE, периферические моноядерные клетки крови пациента (PBMC) собираются и циркулируют через клеточный сепаратор и совместно культурируются с приверженцем CB-SC in vitro. Эти "образованные" клетки (CB-SC-обработанные PBMC) затем возвращаются в кровообращение пациента в замкнутой системе. Клинические испытания уже продемонстрировали клиническую безопасность и эффективность терапии SCE для лечения аутоиммунных заболеваний, включая диабет типа 1 (T1D)2,4 и алопеция areata (AA)5.
Экзосомы являются семейство наночастиц диаметром от 30 до 2012150 нм и существуют во всех биофлюидных и клеточных культурСМИ 6. Экзосомы обогащаются многими биологически неактивными молекулами, включая липиды, мРНК, белки и микроРНК (миРНК), и играют важную роль в связи между клетками. В последнее время экзосомы стали более привлекательными для исследователей и фармацевтических компаний из-за их терапевтическогопотенциала в клиниках 7,8,9. Недавно наши механистические исследования показали, что CB-SC-выпущенные экзосомы способствуют иммунной модуляции SCE терапии10.
Здесь мы описываем протокол для изучения механизма SCE терапии ориентации моноцитов CB-SC-выпущенных экзосом. Во-первых, выпущенные CB-SC экзосомы были изолированы от кондиционированных средств массовой информации CB-SC с использованием методов ультрацентрифугации и проверены цитометрией потока, западной помаркой (WB) и динамическим рассеянием света (DLS). Во-вторых, экзосомы, полученные из CB-SC, были помечены зеленым флуоресцентным липофильным красителем: Dio. В-третьих, они были совместно культурированы с PBMC для изучения положительных процентов дио помечены CB-SC полученных экзосом на различных субпопуляций ПБМК по цитометрии потока. Этот протокол содержит рекомендации по изучению действия экзосом, лежащих в основе иммунной модуляции стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол следует руководящим принципам институционального комитета по этике исследований человека в Центре открытий и инноваций, Hackensack Meridian Health. Человеческие баффи пальто единиц крови были приобретены в Нью-йоркском центре крови (Нью-йорк, Штат Ny). Единицы пуповинной крови человека были собраны у здоровых доноров и приобретены в Международном банке крови Cryo-Cell (Олдсмар, Флорида). Как Нью-йоркский центр крови, так и Cryo-Cell получили все аккредитации для сбора и распределения крови, с одобрения IRB и подписанных форм согласия от доноров.
1. Культура клеток и подготовка среднего состояния, полученного из CB-SC
- Перенесите 25 мл пуповинной крови(таблица материалов)более 20 мл градиентной среды плотности (γ и 1,077) в коническую трубку 50 мл.
- Центрифуга при 1690 х г в течение 20 мин при 20 градусов по Цельсию в качающихся ведро ротора без тормоза.
- Тщательно перенесите моноядерный клеточный слой (буффи пальто) в новую коническую трубку 50 мл. Заполните коническую трубку фосфатным буферным солевым раствором (PBS) до 40 мл. Смешайте и центрифугу с гранулами при 751 х г в течение 10 мин при 20 градусов по Цельсию.
- Отбросьте супернатант и добавьте 15 мл буфера лиза ACK(Таблица материалов)к грануле клетки. Повторное приостановление ячеек через пипетки. Затем инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг удаляет красные кровяные тельца. - Заполните коническую трубку 25 мл PBS. Центрифуга на 751 х г в течение 5 мин и отказаться от супернатанта для получения гранулированных моноядерных клеток.
- Вымойте 2x с 40 мл PBS, чтобы удалить оставшийся буфер лиза.
- Центрифуга при 751 х г в течение 5 мин, чтобы гранулировать клетки.
- Отбросьте супернатант и повторно приостановьте моноядерные клетки пуповинной крови с 10 мл химически определенной среды, свободной от сыворотки(таблица материалов)на трубку.
- Объедините моноядерные клетки пуповинной крови в одну трубку.
- Возьмите 20 йл клеточной подвески и смешать с 20 йл 0,4% трипан синий раствор (Таблица материалов) в 1,5 мл трубки.
- Загрузите в слайд камеры и количественно номер ячейки и жизнеспособность ячейки с помощью автоматизированного счетчика ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подвеска клетки разбавляется в 1:10, если концентрация клеток выше 1 х 107 клеток/мл. - Семена моноядерных клеток в 150 мм х 15 мм Петри блюда на 1 х 106 клеток / мл, 25 мл / блюдо в химически определенных сыворотки свободной клеточной культуры среды.
- Инкубация при 37 градусах по Цельсию при условиях CO2 8% в течение 10-201214 дней до достижения CB-SC более 80% слияния.
- Откажитесь от супернатанта и вымойте 15 мл PBS на чашку Петри; затем удалите PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: CB-SC плотно прикреплены к чашкам Петри. - Повторите шаг 1.14 два раза.
- Добавьте 25 мл химической сыворотки свободной среды на чашку Петри.
- Инкубация при 37 градусах по Цельсию при условиях CO2 8% в течение 3-20124 дней.
- Соберите CB-SC-производных кондиционированных средних в 50 мл конических труб.
2. Характеристика CB-SC
- Отсоедините CB-SC путем пипетки 10 мл PBS основе ячейки диссоциации буфера вверх и вниз с 5 мл пипетки отзыв (Таблица материалов).
- Центрифуга при 1690 х г в течение 5 мин до гранулированных клеток и повторно приостановить в 200 йл PBS.
- Исправить и проницаемые клетки для внутриклеточного окрашивания с помощью окрашивания комплект подготовки(Таблица материалов).
- Добавьте 5 мкл блокатора Fc(Таблица материалов) наобразец и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блокатор Fc ингибирует неспецифическую привязку при окрашивание антителами. - Добавьте флуоресценции конъюгированных мыши анти-человеческих моноклональных антител, включая CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270, и Галектин 9 на 25 мкг / мл (Таблица материалов) до 100 МКЛ объем клеток. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре с защитой света.
- После окрашивания, мыть клетки с 1 мл PBS и центрифуги на 751 х г в течение 10 мин гранул клеток.
- Повторно приостанавливать клетки с 200 МКЛ PBS и передачи в 5 мл трубки.
- Выполняйте цитометрию потока для проверки экспрессии связанных с CB-SC вышеуказанных конкретных маркеров.
3. Изоляция экзосом, полученных из CB-SC
- Центрифуга кондиционированной среды, собранной из шага 1.18 при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую коническую трубку 50 мл.
- Центрифуга супернатанта собрана из шага 3.1 при 2000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую коническую трубку 50 мл.
- Центрифуга супернатанта собрана из шага 3.2 при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую коническую трубку 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ротор с фиксированным углом используется так, что гранулы клетки осаждаются в сторону трубки. Отметйте сторону крышки и нарисуйте круг на стороне трубки, где гранулы, как ожидается. - Фильтр supernatants собраны из шага 3.3 с фильтром 0,22 мкм(Таблица материалов).
- Передача 15 мл мультимедиа на каждый центробежный фильтр 10 кДа(Таблица материалов).
- Центрифуга на 4000 х г в течение 30 минут, чтобы изолировать концентрированные экзосомы.
- Перенесите концентрированные экзосомы в ультрацентрифугную трубку. Затем, гранулы экзосомы при 100000 х г в течение 80 мин при 4 градусов по Цельсию.
- Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте экзосомы гранул в 10 мл PBS.
- Центрифуга при 100 000 х г в течение 80 мин при 4 градусов по Цельсию для сбора гранул экзосомы.
- Повторно приостанавливайте гранулы экзосом в 200 МКЛ PBS, трубя вверх и вниз.
4. Характеристика экзосом, полученных из CB-SC
- Количественная оценка общей концентрации белка экзосомного препарата с помощью набора анализа бицинхониновой кислоты (BCA)
- Pipette 10 L каждого стандарта альбумин и изолированный образец экзосомы подготовлен в шаге 3.10 в пластину 96-хорошо в дубликате.
- Добавьте 200 мкл работающего реагента из комплекта BCA к каждой колодец. Смешайте содержимое пластины тщательно на шейкере пластины в течение 10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий реагент (WR): 50-часть реагента А с 1-частью реагента B. - Обложка пластины с фольгой и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
- Охладить пластины до комнатной температуры (RT).
- Измерьте абсорбт образца на 562 nm через считыватель плиты.
- Подготовка и окрашивание экзосом для цитометрии потока
- Захват экзосомы, добавив 20 йл анти-человеческого CD63 магнитных бусин (размер 4,5 мкм)(Таблица материалов ) в 25 МКГ CB-SC полученных экзосом, подготовленных в шаге 3,10 в общей сложности 100 йл объем PBS.
- Инкубировать трубку на ночь (18-u201222 ч) при 4 градусов по Цельсию на шейкере при 800 об/мин.
- Центрифуга трубки на 300 х г на 30 с, чтобы собрать образец в нижней части трубки.
- Добавьте 300 МКЛ буфера изоляции (0,1% бычьего альбумин сыворотки (BSA) в PBS) и аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг моет бисером связаны экзосомы. - Поместите трубку на магнитную подстоять в течение 1 мин (Таблица материалов) и отбросить супернатант.
- Повторите шаги 4.2.4-u20124.2.5.
- Повторно приостанавливать экзосомы, связанные с бисером, с 400 йл буфера изоляции.
- Aliquot 100 йл бисера связаны экзосомы к каждой трубке.
- Добавить флуоресценции конъюгированных антител (CD9-FITC, CD81-PE, и CD63-FITC на 25 мкг / мл, соответственно) для каждого потока трубки с CD63 шарик захваченных экзосом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Isotype-соответствует IgGs служить в качестве отрицательного контроля. - Инкубировать в течение 45 минут при комнатной температуре с защитой света на шейкере при 800 об/мин.
- Повторите шаги 4.2.4-u20124.2.5.
- Повторно приостанавливать экзосомы, связанные с бисером, в 200 мкл буфера изоляции и передавать в трубы потока 5 мл.
- Поместите трубки в образец карусели потока цитометра.
- Откройте протокол для экзосомного тестирования.
- Вы запустите образец автоматически с помощью цитометра потока.
- Обнаружение экзосомы западным пятном
ПРИМЕЧАНИЕ: Западная помарка устоявшийся метод, и мы не будем входить в подробности самого метода.- Lyse гранулы CB-SC полученных экзосом из шага 3.10 с 100 йл буфера RIPA, пипетка 20x, а затем место на льду в течение 5 мин.
- Количественная оценка концентрации белка экзосомы лизата комплектом BCA и нагрузка 25 мкг белка на колодец.
- Отделить белки гель электрофорезом в течение 40 мин при 150 В.
- Передача белка в мембрану поливинилидена фтора (PVDF) с помощью полусухого метода передачи11.
- Заблокив мембрану 5% нежирным молоком в течение 30 мин.
- Инкубировать с 2 мкг / мл анти-человеческой Аликс (Таблица материалов) и 1 мкг / мл анти-человеческих антител Calnexin (Таблица материалов).
- Обнаружить белок по химилюминесценции с помощью цифровой системы визуализации.
- Экзосомная проверка путем динамического рассеяния света (DLS)
- Разбавить 10 мкг образцов экзосомы, полученных CB-SC, в 1 мл PBS.
- Перенесите 1 мл разбавленного образца в одноразовый полуми микро cuvette(Таблица материалов).
- Поместите кюветт в инструмент DLS. Установите рефракционный индекс (RI) как 1.39 для всего монитора выборки.
- Вы запустите образцы при 25 градусов по Цельсию и приобретите три измерения на фракцию, чтобы получить среднее распределение размера.
- Экзосомная проверка путем передачи электронной микроскопии (TEM)
- Пальто formvar на 300 сетки медныхсеток 12 ( Таблица материалов).
- Укрепите формвар дополнительным слоем выпаривания углерода на медных сетках12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Такой подход покрытия отлично подходит для поддержки образцов. - Загрузите 10 МКЛ образцов экзосомы на сетки и оставьте высохнуть.
- Отрицательно пятна образцов с уранил ацетат в течение 5 мин.
- Вымойте три раза водой DI и оставьте в воздухе сухой.
- Наблюдайте и фотографуйте образцы под TEM. Установите ускоряющееся напряжение на уровне 200 кВ и размер пятна на уровне 2.
5. Мера Дио помечены CB-SC полученных экзосом вверх принятых различных субпопуляций PBMC
-
Этикетка CB-SC полученных экзосом с зеленым флуоресцентным липофильным красителем Dio
- Передача 100 мкг экзосом, полученных из CB-SC (подготовленных в шаге 3.10) в 15 мл центрифуги трубки.
- Разбавить образец с PBS до 5 мл.
- Добавьте зеленый флуоресцентный липофилиновый краситель Dio(таблицаматериалов) до тех пор, пока рабочая концентрация не достигнет 5 МКМ.
- Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре, защищенной от света.
- Перенесите образец в ультрацентрифугную трубку.
- Центрифуга на 100000 х г в течение 80 мин гранулы Дио помечены CB-SC полученных экзосом.
- Повторно приостанавливать помеченные экзосомы в 200 МКЛ PBS.
-
Подготовка человека PBMC
- Передача 25 мл человеческого баффи пальто (Таблица материалов) более 20 мл плотности градиента среды (γ и 1,077) в 50 мл конической трубки.
- Повторите шаги от 1,2 до 1,11.
- Передача 1 х 106 PBMC в не-ткани обработанных гидрофобных 24-хорошо пластины (1 мл / хорошо).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не-ткани обработанные пластины был использован, чтобы избежать соблюдения моноцитов.
-
Со-культура Дио помечены экзосомы с PBMC
- Передача 40 йл Дио помечены CB-SC полученных экзосом, подготовленных в шаге 5,1,7 к каждому PBMC-содержащих хорошо в 24-хорошо пластины с использованием 200 йл пипетки. Добавьте тот же объем PBS для управления скважинами.
- Смешайте с помощью пипетки 10x. Инкубация в течение 4 ч.
- Соберите 200 мкл экзосомы обработанных PBMC и этикетки с Hoechst 33342 в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга при температуре 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы клетки в 100 МКЛ PBS.
- Маунт-клетки на микроскоп слайды.
- Наблюдайте и фотографуйте взаимодействие экзосом, полученных из CB-SC под маркировкой Dio, с помощью микроскопа с маркировкой Hoechst 33342.
- Перенесите оставшиеся ячейки из шага 5.3.3 в трубку 1,5 мл.
- Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы клетки в 200 МКЛ PBS.
- Добавьте 5 мкл блокатора Fc на образец. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Добавьте антитела (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 и CD56 при 25 мкг/мл) (Таблица материалов) для окрашивания PBMC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Isotype-соответствует IgGs служить в качестве отрицательного контроля. - Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре с защитой света.
- Добавьте 1 мл PBS и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах по Цельсию, чтобы гранулировать клетки.
- Повторно приостанавливать клетки с 200 хл PBS. Добавьте 5 мкл йодида пропидия.
- Используйте цитометрию потока для оценки уровня поглощения экзосомы под маркировкой Дио в различных субпопуляциях PBMC.
6. Изучите действие экзосом, полученных из CB-SC, на моноциты
- Изоляция человека CD14-положительных моноцитов
- Перенесите 3 x 107 человека PBMC в трубку 15 мл.
- Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- Поместите разделительнуюколонку (Таблица материалов)в магнитный сепаратор(Таблица материалов).
- Вымойте столбцы разделения три раза с 2 мл холодного буфера бега(Таблица материалов).
- Повторно приостанавливать клетки в 300 МКЛ холодного PBS. Добавьте 60 МКЛ микроблад CD14. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 15 минут.
- Добавьте 6 мл холодного PBS. Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- Повторно приостанавливайте гранулированное ячейки в 500 МКЛ холодного бегущего буфера.
- Перенесите ячейки в разделительный столбец (подготовленный в шаге 6.14) и дайте им пройти.
- Вымойте разделительную колонку три раза с 2 мл бегущего буфера на стирку. Поднимите колонку из магнитного сепаратора и поместите ее в центрифугу 15 мл трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: 15 мл трубки должны быть помещены на лед из-за присоединения CD14-положительных моноцитов к трубке при комнатной температуре. - Перенесите 2 мл холодного бегущего буфера на верхнюю часть колонны и изолируйте CD14-положительные ячейки в 15-мл трубки.
- Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию, чтобы гранулировать CD14-положительные клетки.
- Повторно приостановить клетки с 2 мл холодной химически определенной сыворотки свободной среды(Таблица материалов).
- Перенесите 50 МКЛ клеток в трубку 1,5 мл.
- Пятно с 10 йл Krome Оранжевый спряженных анти-человеческого CD14 mAb (Таблица материалов) в течение 20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Isotype-соответствует IgGs служить в качестве отрицательного контроля. - Добавьте 1 мл PBS в клетки. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин гранулированных клеток.
- Повторно приостанавливать клетки в 200 МКЛ PBS и передавать его в 5 мл трубки. Определите чистоту CD14-положительных моноцитов по цитометрии потока.
- Лечение моноцитов экзосомами, полученными из CB-SC
- Семя 1 х 106 очищенных моноцитов с химически определенным сыворотки свободной культуры среды(Таблица материалов) в ткани культуры обработанных 6-хорошо пластины (2 мл / хорошо).
- Инкубация в течение 2 ч при 37 градусах по Цельсию под 5% CO2.
- Откажитесь от супернатанта с 1 мл пипетки. Аккуратно добавьте 2 мл предварительно разогретой химической культуры, свободной от сыворотки(таблицаматериалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Моноциты были прилипли к пластине в течение 2 часов. Плавающие клетки были идентифицированы как мертвые или другие клеточные загрязнения. - Добавьте 80 мкг экзосом, полученных CB-SC, изолированных от культур шага 3.10 к моноцитам в 6-хорошой пластине с общим объемом 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Такой же объем PBS был добавлен к контрольных скважин. - Инкубация при 37 градусах по Цельсию под 5% CO2 в течение 3'u20124 дней.
- Фотография морфологии клеток с помощью перевернутого микроскопа на 200× увеличение(Таблица материалов).
- Отсоедините клетки, засовыв вверх и вниз в 1 мл буфера диссоциации клеток на основе PBS с наконечником пипетки 1 мл.
- Урожай остальных прикрепленных клеток через сотовый скребок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку первичные моноциты или дифференцированные макрофаги плотно прикрепляются, некоторые клетки остаются прилипаемыми к дну после обработки буфером диссоциации. Таким образом, эти клетки собирают с помощью клеточного скребка. - Соберите ячейки по 1690 х г в течение 5 мин. Повторное приостановление ячеек в 200 МКЛ PBS.
- Добавьте 5 мкл блокатора Fc (25 мкг/мл), чтобы заблокировать неспецифическую привязку.
- Добавьте антитела (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 и CD209 при 25 мкг/мл, таблица материалов)к клеткам. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Isotype-соответствует IgGs служить в качестве отрицательного контроля - Добавьте 1 мл PBS в клетки и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин. Откажитесь от супернатанта и повторно приостанавливайте с 200 хл PBS.
- Добавьте 5 мкл йодида пропидия на образец (200 МКЛ) и перенесите клетки в новую трубку потока 5 мл.
- Выполните цитометрию потока и оцените уровни выражений CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 и CD209.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первоначально фенотип и чистота CB-SC были изучены цитометрией потока с маркерами, связанными с CB-SC, такими как лейкоцит общий антиген CD45, специфические факторы транскрипции ES OCT3/4 и SOX2. CB-SC отображает высокие уровни выражения CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 и galectin 9, но без выражения CD34(рисунок 1A). Анализ цитометрии потока подтвердил экспрессию экзосом-специфических маркеров, включая CD9, CD81 и CD63, на экзосомах, полученных CB-SC(рисунок 1B). Морфология и распределение размеров экзосом характеризовались TEM и DLS(рисунок 1C,D), с размером 79,38 ± 20,07 нм. Западная помарка более далее доказала выражение exosome-associated маркера Alix, без выражения ER-связанного маркера Calnexin (Рисунок 1E).
PBMC были обработаны с Дио помечены CB-SC-Exo. Наблюдение микроскопии продемонстрировало прямое взаимодействие Дио с маркировкой CB-SC-Exo с PBMC(рисунок 2A). Чтобы лучше определить, какая популяция клеток взаимодействовала с дио-помеченным CB-SC-Exo, различные клеточные отсеки были закрыты клеточными маркерами, такими как CD3 для Т-клеток, CD11c для миелоидных дендритных клеток (DC), CD14 для моноцитов, CD19 для В-клеток и CD56 дляНК-клеток (рисунок 2B). После инкубации в течение 4 часов, цитометрия потока продемонстрировала, что различные отсеки клеток крови отображаются при различной средней интенсивности флуоресценции (МФО) дио-положительных экзосом(рисунок 2C). Примечательно, что моноциты продемонстрировали более высокую медианную интенсивность флуоресценции Дио-положительного CB-SC-Exo, чем у другихиммунных клеток (рисунок 2C),подчеркивая, что моноциты были в первую очередь направлены на CB-SC полученных экзосом.
Для изучения прямого воздействия экзосом, полученных из CB-SC, на моноциты, очищенные CD14и моноциты были совместно культурированы с экзосомами, полученными CB-SC, в течение 3 дней. Обработанный экзосомой моноцит успешно дифференцирован в шпиндель-как морфологии(рисунок 3A). Далее, фенотипы CB-SC-Exo обработанных или необработанных моноцитов были протестированы, выявление выражений M2-ассоциированных маркеров, включая CD163, CD206, CD209 были заметно увеличены среди экзосомы обработанной группы (Рисунок 3B, красная гистограмма). По сравнению с обычными макрофагами M2, генерируемыми M-CSF и IL-4, обработанные CB-SC-Exo моноциты выразили аналогичные уровни связанных с M2 маркеров, таких как CD163, CD206, CD209, без существенных различий(рисунок 3C). Таким образом, данные показывают, что моноциты дифференцируются в макрофаги с фенотипом M2 после лечения экзосомами, полученными CB-SC.
Рисунок 1: Характеристика экзосом, полученных из CB-SC. (A) Фенотипическая характеристика CB-SC, высокое выражение CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 и Galectin-9, без выражения CD34. (B) Выражения экзосомы связанных маркеров (CD63, CD9, CD81) на CB-SC полученных экзосом. Isotype-соответствует IgGs служил в качестве элементов управления для цитометрии потока (серая гистограмма). (C)Передача электронной микроскопии (TEM) изображение CB-SC полученных экзосом. (D)Распределение размеров экзосом, полученных CB-SC, с использованием динамитического рассеяния света (DLS). (E) Западные помарки показывают, что CB-SC полученных экзосомы отображения экзосомы конкретных маркер Аликс, но отрицательный для эндоплазмической стикулум (ER)-ассоциированный маркер Calnexin. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Взаимодействие экзосом, полученных CB-SC, с различными популяциями PBMC. (A)Взаимодействие Дио помечены CB-SC-Exo (зеленый) с PBMC (синий, ядерное окрашивание с Hoechst 33342) был сфотографирован с nikon Eclipse Ti2 микроскоп с NIS-Elements программной версии 5.11.02, с высоким увеличением, показывающим распределение Дио помечены экзосомы (зеленый) в клетках PBMC после совместного инкубации для 4 ч 5% CO2 в не-ткани культуры обработанных 24-хорошо пластины. n No 2. (B) Gating стратегия для анализа цитометрии потока с клеточными маркерами поверхности для различных субпопуляций в PBMC, в том числе CD3 для Т-клеток, CD14 для моноцитов, CD19 для В-клеток, CD56 для НК-клеток и CD11c для DCs. (C) Отображение различной средней интенсивности флуоресценции (МФО) дио-обозначенной экзосомы среди различных субпопуляций PBMC (например, Т-клетки, моноциты, B клетки, НК-клетки, DCs). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Влияние экзосом, полученных из CB-SC, на моноциты. (A) Морфологическое изменение моноцитов в шпиндель-как клетки после обработки с CB-SC-производных экзосом. (B) Up-регулируется уровень M2-ассоциированных маркеров выражение после лечения CB-SC полученных экзосом, таких как CD163, CD206, и CD209 (красная линия). Необработанные моноциты (зеленая линия) служили контролем. Isotype-соответствует IgGs служил в качестве отрицательного контроля (серая линия). (C)Фенотипическое сравнение между обычными макрофагами M2 и макрофагами М2, вызванными CB-SC-Exo. Для генерации обычных макрофагов M2 очищенные моноциты CD14 и monocytes обработались с помощью макрофагов 50 нг/мл(M-CSF) при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 условий в течение 7 дней, а затем ночная обработка 10 нг/мл IL-4. M2-ассоциированные маркеры, включая CD14. CD80, CD86, CD163, CD206 и CD209 оценивались по цитометрии потока. Изотип-соответствует иммуноглобулин G (IgG) служить в качестве контроля. Данные представлены как среднее ± SD; N No 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Применение экзосом является новой областью для клинической диагностики, разработки лекарств и регенеративной медицины. Здесь мы представляем подробный протокол о подготовке экзосом, полученных из CB-SC, и функциональное исследование экзосом на дифференциацию моноцитов человека. Текущий протокол показал, что функциональные экзосомы, полученные из CB-SC, изолированы последовательной центрифугой и ультрацентрифугированием с высокой чистотой и обладают иммунной модуляцией моноцитов.
По сравнению с другими обычными протоколами, ультрафильтрация является установленным подходом к изоляции и очистке экзосом из различных клеток или средств массовой информации, основанным на молекулярном весе и размерах исключения, которые отличаются от других внеклеточных пузырьков (EVs). В то время как изоляция ультрафильтрации является более экономией времени, чем разделение на основе ультрацентрифугации, это может привести к структурным повреждениям пузырьков в больших размерах. Экзосомы также могут быть собраны полиэтиленгликоль (PEG)-опосредованное количество осадков по низкой цене, хотя этот метод рискует экзосомы чистоты из-зазагрязнения белка 13,14. Таким образом, текущий протокол был экономически эффективным для производства экзосом при высокой чистоте. Основываясь на иммунной модуляции CB-SC полученных экзосом10, характеристика CB-SC полученных экзосом может предложить ценный биомаркер для оценки потенции стволовых клеток Педагог с CB-SC до клинического применения.
Макрофаги являются профессиональными антигеносигментающих клеток против вирусных и бактериальных инфекций, с различными биологическими функциями и неоднородности. Основываясь на их различиях в поверхностных маркерах и иммунной функции, макрофаги классифицируются с двумя поднаселениями: макрофаги типа 1 (M1, обычные макрофаги, вызывающие воспаление) и макрофаги типа 2 (M2, отображение анти-воспаления)15. Это исследование установило, что очищенные моноциты человека были дифференцированы в макрофаги типа 2 после лечения экзосомами, полученными CB-SC, показывая противовоспалительный фенотип10. Обработанные ДОБ-СК моноциты, обработанные экзосомой, продемонстрировали удлиненную морфологию и выразили связанные с М2 поверхностные маркеры (например, CD163, CD206 и CD209), с аналогичным фенотипом, как и обычные макрофаги M2, генерируемые с использованием цитокинов M-CSF и IL-4. Такие фенотипические изменения моноцитов подчеркивают новый механизм, лежащий в основе иммунной модуляции CB-SC для лечения диабета типа 1 и других аутоиммунных заболеваний. Во время терапии SCE иммунные клетки пациентов были совместно с CB-SC в течение примерно 8-20129 ч. Обработанные SCE моноциты несли экзосомы CB-SC обратно в организм, что способствовало дифференциации M2 и расширению индукции иммунной толерантности, что привело к улучшению клинических исходов после лечения SCE терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Д-р Чжао является основателем Тяньхэ стволовых клеток биотехнологии инк д-р Чжао является изобретателем технологии стволовых клеток педагога. Все остальные авторы не имеют финансовых интересов, которые могут иметь отношение к представленной работе.
Acknowledgments
Мы признательны г-ну Поддару и г-ну Людвигу за щедрую финансовую поддержку через Фонд UMC Хакенсака. Мы ценим Лауру Чжао за редактирование английского языка.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
Cell scraper | Falcon | 353085 | |
Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).