Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בידול של מונוציטים לתוך מקרופאגים שונים Phenotypically לאחר טיפול עם תאי גזע דם חוט אנושי (CB-SC)נגזר אקסוזומים

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61562
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2, 1
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health Center, 2Department of Chemistry and Chemistry Biology, Stevens Institute of Technology

Summary

יישום Exosome הוא כלי מתפתח לפיתוח תרופות ורפואה רגנרטיבית. אנו מקימים פרוטוקול בידוד אקסו-זמני עם טוהר גבוה כדי לבודד אקסוזומים מתאי גזע שזוהו על ידי רומן הנקראים CB-SC למחקרים מכניים. אנחנו גם coculture CB-SC נגזר אקסוזומים עם מונוציטים אנושיים, המוביל ההבדל שלהם לתוך מקרופאגים שונים phenotypically.

Abstract

טיפול במחנך תאי גזע (SCE) הוא גישה קלינית חדשנית לטיפול בסוכרת מסוג 1 ובמחלות אוטואימוניות אחרות. טיפול SCE מפיץ את תאי הדם החד-גרעיניים של המטופל המבודד (למשל, לימפוציטים ומונוציטים) באמצעות מכונת אפיה, תרבויות ותרביות תרבית הדם של המטופל mononuclear תאים עם תאי גזע טבור דבקים (CB-SC) במכשיר SCE, ולאחר מכן מחזיר תאים חיסוניים "משכילים" אלה לדם של המטופל. Exosomes הם שלל חוץ תאי בגודל ננו בין 30\u2012150 ננומטר קיים בכל מדיה ביו-נוזלים ותרבות תא. כדי להמשיך לחקור מנגנונים מולקולריים הבסיסיים טיפול SCE ולקבוע את הפעולות של exosomes שוחרר CB-SC, אנו חוקרים אילו תאים phagocytize אלה exosomes במהלך הטיפול עם CB-SC. על-ידי שיתוף culturing CB-SC-נגזר אקסוזומים עם תאים חד גרעיניים דם היקפיים אנושיים (PBMC), מצאנו כי exosomes נגזר CB-SC נלקחו בעיקר על ידי מונוציטים אנושיים CD14 חיובי, המוביל הבידול של מונוציטים לתוך סוג 2 מקרופאגים (M2), עם מורפולוגיה דמויי ציר וביטוי של סמנים מולקולריים משטח M2 הקשורים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ואפיון של אקסוזומים הנגזרים מ-CB-SC ולפרוטוקול לתרבות ההפוכחה של אקסוזומים שמקורם ב-CB-SC עם מונוציטים אנושיים וניטור בידול M2.

Introduction

תאי גזע דם טבורים (CB-SC) הם סוג ייחודי של תאי גזע המזוהים מדם טבור אנושי ומובדלים מסוגים ידועים אחרים של תאי גזע כגון תאי גזע mesenchymal (MSC) ותאי גזע hematopoietic (HSC)1. בהתבסס על המאפיינים הייחודיים שלהם של אפנון חיסוני והיכולת שלהם לדבוק בחוזקה על פני השטח של צחות פטרי, פיתחנו טכנולוגיה חדשה המוגדרת כטיפול מחנך תאי גזע (SCE) בניסוייםקליניים 2,3. במהלך טיפול SCE, תאים חד-גרעיניים בדם היקפי של המטופל (PBMC) נאספים ומופצים דרך מפריד תאים ויתורות בהתרבות עם CB-SC דבק במבחנה. תאים "משכילים" אלה (PBMC שטופלו ב-CB-SC) מוחזרים לאחר מכן למחזור הדם של המטופל במערכת סגורה. ניסויים קליניים כבר הוכיחו את הבטיחות הקלינית ואת היעילות של טיפול SCE לטיפול במחלות אוטואימוניות כולל סוכרת סוג 1 (T1D)2,4 והתקרחות areata (AA)5.

Exosomes הם משפחה של חלקיקים עם קטרים הנעים 30\u2012150 nm והם קיימים בכל biofluid ומדיה תרבות תא6. אקסוזומים מועשרים מולקולות ביואקטיביות רבות כולל שומנים, mRNAs, חלבונים, microRNAs (miRNA), ולשחק תפקיד חשוב בתקשורת תא לתא. לאחרונה, exosomes הפכו אטרקטיביים יותר עבור חוקרים וחברות תרופות בשל הפוטנציאל הטיפולי שלהםבמרפאות 7,8,9. לאחרונה, המחקרים המכניים שלנו הראו כי exosomes CB-SC שפורסמו לתרום אפנון חיסוני של טיפול SCE10.

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לחקור את המנגנון של טיפול SCE מיקוד מונוציטים על ידי exosomes CB-SC שפורסמו. ראשית, exosomes CB-SC שוחררו היו מבודדים מ CB-SC נגזר מדיה מותנית באמצעות שיטות ultracentrifugation ואומתו על ידי ציטומטריה זרימה, כתם מערבי (WB) ופיזור אור דינמי (DLS). שנית, אקסוזומים נגזר CB-SC סומנו עם צבע ליפופילי פלורסנט ירוק: דיו. שלישית, הם היו שיתוף תרבות עם PBMC כדי לבחון את האחוזים החיוביים של exosomes CB-SC-מתויג בתת-אוכלוסיות שונות של PBMC על ידי ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה מספק הדרכה ללמוד את הפעולה של exosomes הבסיסית אפנון חיסוני של תאי גזע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של המחקר האנושי המוסדי במרכז לגילוי וחדשנות, Hackensack Meridian Health. יחידות דם של מעיל באפי אנושי נרכשו ממרכז הדם של ניו יורק (ניו יורק, ניו יורק). יחידות דם טבור אנושי נאספו מתורמים בריאים ונרכשו מבנק הדם הבינלאומי Cryo-Cell (Oldsmar, FL). הן מרכז הדם של ניו יורק והן קריו-תא קיבלו את כל ההסמכה לאוספים והפצות דם, באישור IRB וטפסי הסכמה חתומים מתורמים.

1. תרבות תאים והכנת CB-SC נגזר בינוני מותן

  1. להעביר 25 מ"ל של דם טבור (טבלת חומרים) מעל 20 מ"ל של צפיפות הדרגתי בינוני (γ = 1.077) לתוך צינור חסין 50 מ"ל.
  2. צנטריפוגה ב 1,690 x g עבור 20 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד ללא בלם.
  3. מעבירים בזהירות את שכבת התא המונו-נו-נו-קלר (מעיל באפי) לצינור חרסי חדש של 50 מ"ל. מלא את הצינור החמור עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) עד 40 מ"ל. מערבבים וצנטריפוגה לתאי כדוריות ב-751 x g למשך 10 דקות ב-20°C.
  4. השליכו את הסופרנט והוספו 15 מ"ל שלמאגר ACK lysis ( טבלת חומרים ) לתא. להשעות מחדש תאים באמצעות צנרת. לאחר מכן דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: שלב זה מסיר את תאי הדם האדומים.
  5. מלא את הצינור חסני עם 25 מ"ל של PBS. צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant כדי להשיג תאים מונו-קלריים כדוריים.
  6. לשטוף 2x עם 40 מ"ל של PBS כדי להסיר את מאגר lysis הנותרים.
  7. צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דקות כדי גלולות התאים.
  8. השליכו את תאי הדם המונו-גרעיניים של הדם המותאם-גרעיני עם 10 מ"ל של מדיום ללא סרום המוגדר כימי(טבלת חומרים)לכל שפופרת.
  9. שלב תאים חד-קוטביים בדם טבור לצינור אחד.
  10. קח 20 μL התא מתלה ולערבב עם 20 μL של 0.4% פתרון כחול trypan(טבלת חומרים)בצינור 1.5 מ"ל.
  11. טען לתוך שקופית התא וכמת את מספר התא ואת הכדאיות בתא באמצעות מונה תא אוטומטי.
    הערה: מתלי התא מדוללים בשעה 1:10 אם ריכוז התאים הוא מעל 1 x10 7 תאים/מ"ל.
  12. זרעים חד-נשקיים בתאים חד-נשקיים ב-150 מ"מ x 15 מ"מ צ'נרי ב-1 x10 6 תאים/מ"ל, 25 מ"ל/צלחת במדיום תרבות תאים ללא סרום המוגדר כימית.
  13. דגירה ב 37 °C תחת 8% CO2 תנאים עבור 10\u201214 ימים עד CB-SC להגיע יותר מ 80% confluence.
  14. השליכו את הסופרנטנט ושטפו 15 מ"ל PBS לכל צלחת פטרי; לאחר מכן, הסר את PBS.
    הערה: CB-SC מחוברים לצלי פטרי בחוזקה.
  15. חזור על שלב 1.14 פעמיים.
  16. מוסיפים 25 מ"ל של סרום כימי ללא מדיום לכל צלחת פטרי.
  17. דגירה ב 37 °C תחת 8% CO2 תנאים עבור 3\u20124 ימים.
  18. לאסוף את CB-SC נגזר בינוני מותנה לתוך צינורות חרליים 50 מ"ל.

2. אפיון CB-SC

  1. ניתוק CB-SC על ידי pipetting 10 מ"ל של מאגר דיסוציאציה תא מבוסס PBS למעלה ומטה עם קצה פיפטה 5 מ"ל(טבלת חומרים).
  2. צנטריפוגה ב 1,690 x g עבור 5 דקות לתאי כדוריות ולהשעות מחדש ב 200 μL של PBS.
  3. לתקן ולחלחל תאים עבור כתמים תאיים באמצעות ערכת הכנתהכתמה (טבלת חומרים).
  4. להוסיף 5 μL של בלוק FC (טבלת חומרים) לכל דגימה דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: חוסם Fc מעכב איגוד לא ספציפי בעת הכתמה בנוגדנים.
  5. הוסף נוגדנים חד-אנושיים נגד עכבר פלואורסצינטי, כולל CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 ו- Galectin 9ב- 25 μg/mL (טבלת חומרים) לנפח של 100 μL של תאים. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הגנה קלה.
  6. לאחר הכתמה, לשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 751 x g עבור 10 דקות לתאי גלולה.
  7. להשעות מחדש תאים עם 200 μL של PBS ולהעביר לתוך צינור 5 מ"ל.
  8. בצע ציתום זרימה כדי לאמת את הביטוי של CB-SC המשויך מעל סמנים ספציפיים.

3. בידוד אקסוזומים הנגזרים מ-CB-SC

  1. צנטריפוגה המדיום מותן שנאסף מ שלב 1.18 ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C. העבר את הסופרנטנט לצינור חורט חדש של 50 מ"ל.
  2. צנטריפוגה supernatant שנאסף מ שלב 3.1 ב 2,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° C. העבר את הסופרנטנט לצינור חורט חדש של 50 מ"ל.
  3. צנטריפוגה supernatant שנאסף מ שלב 3.2 ב 10,000 x g עבור 30 דקות ב 4 ° C. העבר את הסופרנטנט לצינור חורט חדש של 50 מ"ל.
    הערה: הרוטור זווית קבועה משמש כך כדורי התא מואצים לצד של הצינור. סמן את צד המכסה וצייר עיגול בצד הצינור שבו צפויה הגלולה.
  4. מסנן supernatants שנאספו מ שלב 3.3 עם מסנן 0.22 μm(טבלת חומרים).
  5. העברת 15 מ"ל מדיה לכל יחידת סינון צנטריפוגלית של 10 kDa(טבלת חומרים).
  6. צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 30 דקות כדי לבודד את התקשורת אקסוזום מרוכז.
  7. מעבירים את האקסוזומים המרוכזים לצינור אולטרה-צנטריפוגה. לאחר מכן, exosomes גלולה ב 100,000 x g עבור 80 דקות ב 4 ° C.
  8. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדורי האקסוזומים ב-10 מ"ל של PBS.
  9. צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 80 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את כדורי exosomes.
  10. להשעות מחדש את כדורי exosomes ב 200 μL של PBS על ידי pipetting למעלה למטה.

4. אפיון אקסוזומים נגזר CB-SC

  1. כימות ריכוז החלבון הכולל של הכנה אקסוזום על ידי ערכת תסוואי חומצה bicinchoninic (BCA)
    1. פיפט 10 μL של כל תקן אלבומין ומבודד exosome מדגם מוכן בשלב 3.10 לתוך צלחת 96-באר בכפילויות.
    2. הוסף 200 μL של reagent עובד מתוך ערכת BCA לכל באר. מערבבים את תכולת הצלחת ביסודיות על שייקר הצלחת במשך 10 שניות.
      הערה: ריאגנט עבודה (WR): ריאגנט A בן 50 חלקים עם ריאגנט B של חלק אחד.
    3. מכסים את הצלחות בנייר כסף ומדגרים אותן ב-37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
    4. מצננים את הצלחות לטמפרטורת החדר (RT).
    5. מדוד ספיגה לדוגמה ב- 562 00 00 00 00:00:00,000 -
  2. הכנה והכתמה של אקסוזומים עבור ציטומטריית זרימה
    1. ללכוד exosomes על ידי הוספת 20 μL של חרוזים מגנטיים CD63 אנטי אנושי (4.5 μm גודל) (טבלת חומרים) לתוך 25 μg של exosomes נגזר CB-SC מוכן בשלב 3.10 בסך הכל 100 μL נפח של PBS.
    2. דגירה הצינור בן לילה (18\u201222 h) ב 4 ° C על שייקר ב 800 סל"ד.
    3. צנטריפוגה הצינור ב 300 x g עבור 30 s לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור.
    4. הוסף 300 μL של מאגר בידוד (0.1% אלבומין סרום של נקניק (BSA) ב- PBS) ומערבבים בעדינות על ידי pipetting.
      הערה: שלב זה שוטף את האקסוזומים המאוגדים בחרוזים.
    5. מניחים את הצינור על מעמד מגנט למשך דקה אחת (טבלת חומרים) וזורקים את הסופרנטנט.
    6. חזור על שלבים 4.2.4\u20124.2.5.
    7. להשעות מחדש את exosomes חרוזים כבול עם 400 μL של חיץ בידוד.
    8. Aliquot 100 μL של exosomes חרוזים כבולים לכל צינור.
    9. הוסף נוגדנים פלואורסצנטיים (CD9-FITC, CD81-PE ו- CD63-FITC ב- 25 μg/mL, בהתאמה) לכל צינור זרימה עם exosomes חרוז CD63 שנתפסו.
      הערה: IgGs תואמי Isotype משמשים כפקדים שליליים.
    10. דגירה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר עם הגנה קלה על שייקר ב 800 סל"ד.
    11. חזור על שלבים 4.2.4\u20124.2.5.
    12. להשעות מחדש את exosomes חרוזים כבול ב 200 μL של חיץ בידוד ולהעביר צינורות זרימה 5 מ"ל.
    13. מניחים את הצינורות בהסגלה לדוגמה של ציטומטר הזרימה.
    14. פתח את הפרוטוקול לבדיקות אקסו-אקסו-סוחפת.
    15. הפעל את הדגימה באופן אוטומטי על-ידי ציטומטר זרימה.
  3. זיהוי אקסו-זו-ום על-ידי כתם מערבי
    הערה: כתם מערבי היא שיטה מבוססת היטב ולא נלך לפרטים של השיטה עצמה.
    1. Lyse כדורי exosomes נגזר CB-SC מ שלב 3.10 עם 100 μL של מאגר RIPA, פיפטה 20x, ולאחר מכן מניחים על קרח במשך 5 דקות.
    2. לכמת את ריכוז החלבון של exosome lysate על ידי ערכת BCA ולטעון 25 μg של חלבון לכל באר.
    3. הפרדו את החלבונים באמצעות אלקטרופורזה ג'ל במשך 40 דקות ב 150 V.
    4. להעביר את החלבון קרום פלואוריד פוליוינילידן (PVDF) באמצעות העברה חצי יבשה שיטה11.
    5. חוסמים את הממברנה עם 5% חלב ללא שומן למשך 30 דקות.
    6. דגירה עם 2 μg/mL אנטי-אנושי אליקס(טבלת חומרים)ו 1 μg / מ"ל נוגדנים קלנקסין אנטי אנושי(טבלת חומרים).
    7. זהה את החלבון באמצעות כימיומינציה באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית.
  4. אימות Exosome על-ידי פיזור אור דינמי (DLS)
    1. לדלל 10 μg של דגימות exosome נגזר CB-SC ב 1 מ"ל של PBS.
    2. מעבירים את ה-1 מ"ל של מדגם מדולל למיקרו-מיקרו חד פעמי(טבלת חומרים).
    3. מניחים את ה-cuvette במכשיר DLS. הגדר את אינדקס שבירה (RI) כ- 1.39 עבור כל הצג לדוגמה.
    4. הפעל דגימות ב- 25 °C ורכוש שלוש מדידות לכל שבר כדי לקבל התפלגות גודל ממוצעת.
  5. אימות אקסו-זופי על-ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)
    1. מעיל formvar על 300 רשתות נחושת רשת12 (לוח חומרים).
    2. לחזק את formvar עם השכבה הנוספת של פחמן התאדה על רשתות נחושת12.
      הערה: גישת ציפוי כזו מצוינת לתמיכה בדגימות.
    3. טען 10 μL של דגימות אקסו-זום על רשתות ולהשאיר לאוויר יבש.
    4. דגימות כתם שליליות עם אצטט אורניל במשך 5 דקות.
    5. לשטוף שלוש פעמים עם מי DI ולהשאיר לייבוש אוויר.
    6. צפה וצלם את הדגימות תחת TEM. הגדר את מתח ההאצה על 200 kV וגודל ספוט ב 2.

5. למדוד Dio-תווית CB-SC נגזר exosomes נלקח על ידי תת אוכלוסיות שונות של PBMC

  1. תווית CB-SC נגזר אקסוזומים עם צבע ליפופילי פלורסנט ירוק Dio
    1. להעביר 100 μg של exosomes CB-SC נגזר (מוכן בשלב 3.10) לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
    2. לדלל דגימה עם PBS ל 5 מ"ל.
    3. מוסיפים צבע ליפופילי פלואורסצנטי ירוק(טבלת חומרים)עד שריכוז העבודה מגיע ל-5 μM.
    4. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור.
    5. מעבירים את הדגימה לצינור אולטרה-צנטריפוגה.
    6. צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 80 דקות כדי כדורי CB-SC נגזר exosomes.
    7. להשעות מחדש את exosomes מתויג ב 200 μL של PBS.
  2. הכנת PBMC אנושי
    1. להעביר 25 מ"ל של מעיל באפי אנושי(טבלת חומרים)מעל 20 מ"ל של צפיפות הדרגתית בינונית (γ = 1.077) לתוך צינור חסוני 50 מ"ל.
    2. חזור על שלבים 1.2 עד 1.11.
    3. מעבירים 1 x 106 PBMC לצלחת הידרופובית 24 באר שאינה מטופלת ברקמות (1 מ"ל/באר).
      הערה: צלחת שאינה מטופלת ברקמות שימשה כדי למנוע דבקות במונוציטים.
  3. אקסוזומים בעלי תווית של דיו עם PBMC
    1. להעביר 40 μL Dio-תווית CB-SC נגזר exosomes מוכן בשלב 5.1.7 לכל PBMC המכיל היטב בצלחת 24-באר באמצעות פיפטה 200 μL. הוסף את אותו אמצעי אחסון של PBS כדי לשלוט בארות.
    2. מערבבים על ידי התפתלות 10x. דגירה ל-4 שעות.
    3. לאסוף 200 μL exosome-מטופל PBMC ותווית עם Hoechst 33342 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. זרוק את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 100 μL של PBS.
    5. הר תאים על שקופיות מיקרוסקופ.
    6. צפה וצלם את האינטראקציה של exosomes CB-SC-מתויג DIO עם Hoechst 33342 תווית PBMC באמצעות מיקרוסקופ.
    7. העבר את התאים הנותרים מ- 5.3.3 לצינור 1.5 מ"ל.
    8. צנטריפוגה ב-300 x g ל-10 דקות ב-4°C. זרוק את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 200 μL של PBS.
    9. הוסף 5 μL של חוסם Fc לכל דוגמה. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    10. הוסף נוגדנים (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 ו- CD56 ב- 25 μg/mL) (טבלת חומרים) כדי להכתים PBMC.
      הערה: IgGs תואמי Isotype משמשים כפקדים שליליים.
    11. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הגנה קלה.
    12. הוסף 1 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי גלולות התאים.
    13. להשעות מחדש את התאים עם 200 μL PBS. הוסף 5 μL של פרודיד פרופידיום.
    14. השתמש ציטומטריית זרימה כדי להעריך את רמת ספיגת exosome מתויג Dio באוכלוסיית משנה שונה של PBMC.

6. לבחון את הפעולה של exosomes נגזר CB-SC על מונוציטים

  1. בידוד מונוציטים אנושיים CD14 חיוביים
    1. להעביר 3 x 107 PBMC אנושי לתוך צינור 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ב-300 x g ל-10 דקות ב-4°C.
    3. מקם את עמודתההפרדה (טבלת חומרים)במפריד המגנט (טבלת חומרים).
    4. לשטוף עמודות ההפרדה שלוש פעמים עם 2 מ"ל של מאגר ריצה קר (טבלת חומרים).
    5. להשעות מחדש את התאים ב 300 μL של PBS קר. הוסף 60 μL של MICROBeads CD14. מערבבים היטב ותדנוד על קרח במשך 15 דקות.
    6. להוסיף 6 מ"ל של PBS קר. צנטריפוגה ב-300 x g ל-10 דקות ב-4°C.
    7. להשעות מחדש את התאים כדוריים ב 500 μL של מאגר ריצה קרה.
    8. העבר תאים לעמודת ההפרדה (שהוכן בשלב 6.14) ותן להם לעבור.
    9. שטוף את עמודת ההפרדה שלוש פעמים עם 2 מ"ל של מאגר ריצה לכל שטיפה. הרם את העמודה ממפריד המגנט והמקם אותו בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
      הערה: צינור 15 מ"ל צריך להיות ממוקם על קרח בשל הדבקות של CD14 חיובי מונוציטים לצינור בטמפרטורת החדר.
    10. העבר 2 מ"ל של מאגר ריצה קר לראש העמודה ולבודד את התאים CD14 חיובי לתוך צינור 15 מ"ל.
    11. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי גלולות CD14 תאים חיוביים.
    12. להשעות מחדש את התאים עם 2 מ"ל של סרום קר מוגדר כימית חינם בינוני(טבלת חומרים).
    13. להעביר 50 μL של תאים לתוך צינור 1.5 מ"ל.
    14. כתם עם 10 μL של Krome כתום-התקהלות אנטי-אדם CD14 mAb(שולחן של חומרים)במשך 20 דקות.
      הערה: IgGs תואמי Isotype משמשים כפקדים שליליים.
    15. הוסף PBS 1 מ"ל לתאים. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות לתאי כדורי.
    16. להשעות מחדש תאים ב 200 μL של PBS ולהעביר אותו צינור 5 מ"ל. לקבוע את הטוהר של מונוציטים CD14 חיובי על ידי ציתום זרימה.
  2. טיפול במונוציטים עם אקסוזומים מ-CB-SC
    1. זרע 1 x 106 מונוציטים מטוהרים עם אמצעי תרבות ללא סרום המוגדר כימית (טבלתחומרים)בצלחת 6-well שטופלה בתרבות הרקמות (2 מ"ל/באר).
    2. דגירה ל2 שעות ב 37 ° C תחת 5% CO2.
    3. השליכו את הסופרנטנט עם 1 מ"ל פיפטה. הוסף 2 מ"ל של 37 °C חימום מראש כימי מוגדר סרום חינם תרבות בינונית(טבלת חומרים)בעדינות.
      הערה: מונוציטים היו דבוקים לצלחת בתוך 2 שעות. תאים צפים זוהו כמתים או מזהמים תאים אחרים.
    4. הוסף 80 μg CB-SC נגזר exosomes מבודד לשלב 3.10 לתרביות monocyte בצלחת 6-באר עם נפח כולל של 2 מ"ל.
      הערה: אותו אמצעי אחסון של PBS נוסף כדי לשלוט בארות.
    5. דגירה ב 37 °C תחת 5% CO2 עבור 3\u20124 ימים.
    6. צלם את המורפולוגיה של התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך ב- 200× הגדלה(טבלת חומרים).
    7. ניתוק תאים על-ידי התנתקות למעלה ולמעלה ב- 1 מ"ל של מאגר דיסוציאציה תא מבוסס PBS עם קצה פיפטה 1 מ"ל.
    8. לקצור את התאים המצורפים הנותרים באמצעות מגרד תאים.
      הערה: מאז מונוציטים ראשיים או מקרופאגים מובדילים לצרף בחוזקה, תאים מסוימים נשארים דבודים לתחתית לאחר הטיפול עם מאגר דיסוציאציה. לכן, תאים אלה נקטפים עם מגרד תאים.
    9. לאסוף תאים ב 1,690 x g במשך 5 דקות. להשעות מחדש תאים ב 200 μL של PBS.
    10. הוסף 5 μL של חוסם Fc (25 μg/mL) כדי לחסום איגוד לא ספציפי.
    11. הוסף נוגדנים (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 ו- CD209 ב- 25 μg/mL, טבלת חומרים)לתאים. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: IgGs תואמי Isotype משמשים כשליטה שלילית
    12. הוסף 1 מ"ל של PBS לתאים וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות. היפטר מהסופרנט והשעה מחדש עם 200 μL של PBS.
    13. להוסיף 5 μL של פרודיד פרופידיום לכל מדגם (200 μL) ולהעביר תאים לצינור זרימה חדש 5 מ"ל.
    14. בצע את ציתום הזרימה והערך את רמות ביטויי CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 ו- CD209.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בתחילה, הפנוטיפ והטוהר של CB-SC נבדקו על ידי ציטומיה זרימה עם סמנים הקשורים CB-SC כגון leukocyte נפוץ אנטיגן CD45, ES תא ספציפי תמלול גורמי OCT3/4, ו SOX2. CB-SC להציג רמות גבוהות של CD45, OCT3/4, SOX2, CD270, ו ביטוי galectin 9, אבל אין ביטוי של CD34 (איור 1A). ניתוח ציטומטריית זרימה אישר את הביטוי של סמנים אקסוזום ספציפיים כולל CD9, CD81, ו CD63 היו על exosomes נגזר CB-SC(איור 1B). מורפולוגיה והתפלגות גודל של אקסוזומים התאפיינו ב- TEM ו- DLS (איור 1C,D),עם גודל של 79.38 ± 20.07 נק'. כתם מערבי הוכיח עוד יותר את הביטוי של אליקס הסמן המשויך אקסוזום, ללא ביטוי של הסמן המשויך ER קלנקסין (איור 1E).

PBMC טופלו עם CB-SC-Exo מתויג דיו. תצפית מיקרוסקופית הדגימה את האינטראקציה הישירה של CB-SC-Exo עם PBMC (איור 2A). כדי להגדיר טוב יותר איזו אוכלוסיית תאים קיימה אינטראקציה עם CB-SC-Exo עם תווית Dio, תאי תאים שונים היו מגודרים עם סמנים ספציפיים לתא כגון CD3 עבור תאי T, CD11c עבור תאים דנדריטיים מיאלואידים (DC), CD14 עבור מונוציטים, CD19 עבור תאי B, ו CD56 עבור תאי NK (איור 2B). לאחר דגירה במשך 4 שעות, ציטומטריית זרימה הוכיחה כי תאי תאי דם שונים המוצגים בעוצמת פלואורסצנטית חציונית שונה (MFI) של exosomes Dio-חיובי(איור 2C). במיוחד, מונוציטים הפגינו עוצמה פלואורסצטית חציון גבוה יותר של CB-SC-Exo חיובי Dio מאשר אלה של תאים חיסוניים אחרים(איור 2C), הדגישכי מונוציטים היו ממוקדים בעיקר על ידי exosomes CB-SC נגזר.

כדי לחקור את ההשפעות הישירות של אקסוזומים נגזר CB-SC על מונוציטים, CD14מטוהר + מונוציטים היו שיתוף תרבות עם אקסוזומים CB-SC נגזר במשך 3 ימים. המונוציט המיוחד המפוצל בהצלחה הבדיל למורפולוגיות כמו ציר (איור 3A). לאחר מכן, נבדקו פנוטיפים של CB-SC-Exo שטופלו או לא טופלו, וחשפו את הביטויים של סמנים הקשורים ל-M2, כולל CD163, CD206, CD209, הוגדלו במידה ניכרת בקרב הקבוצה שטופלה באקסו-נו(איור 3B, היסטוגרמה אדומה). בהשוואה למקרופגים M2 הרגילים שנוצרו על-ידי M-CSF + IL-4, מונוציטים שטופלו ב-CB-SC-Exo הביעו רמות דומות של סמנים המשויכים ל- M2 כגון CD163, CD206, CD209, ללא הבדלים משמעותיים(איור 3C). לכן, הנתונים מצביעים על כך מונוציטים להבדיל מקרופאגים עם פנוטיפ M2 לאחר הטיפול עם exosomes CB-SC נגזר.

Figure 1
איור 1: אפיון אקסוזומים הנגזרים מ-CB-SC. (א)אפיון פנוטיפי של CB-SC, ביטוי גבוה של CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 ו- Galectin-9, אין ביטוי של CD34. (ב)ביטויים של סמנים המשויכים אקסו-סם (CD63, CD9, CD81) באקסוזומים הנגזרים מ-CB-SC. IgGs תואמי Isotype שימשו כפקדים עבור ציטומטריית זרימה (היסטוגרמה אפורה). (ג)תיבת הילוכים אלקטרון מיקרוסקופית (TEM) תמונה של exosomes CB-SC נגזר. (D) התפלגות גודל של אקסוזומים הנגזרים מ- CB-SC באמצעות פיזור אור דינמיטי (DLS). (E) כתמים מערביים מראים כי exosomes נגזר CB-SC להציג את אליקס סמן אקסו-ספציפי, אבל שלילי עבור רטיטולום אנדופלסמי (ER)המשויך סמן קלנקסין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אינטראקציה של אקסוזומים הנגזרים מ-CB-SC עם אוכלוסיות שונות של PBMC. (א)האינטראקציה של CB-SC-Exo עם תווית דיו (ירוק) עם PBMC (כחול, כתם גרעיני עם Hoechst 33342) צולם עם ניקון Eclipse Ti2 מיקרוסקופ עם תוכנה NIS-אלמנטס גרסה 5.11.02, עם הגדלה גבוהה מראה את ההפצה של exosomes Dio-תווית (ירוק) בתאי PBMC לאחר הדגירה המשותף עבור 4 h 5% CO2 בצלחת 24-טוב תרבות שאינה רקמות מטופלות. n = 2. (ב)אסטרטגיית גתות לניתוח ציתומיה זרימה עם סמני משטח ספציפיים לתא עבור תת אוכלוסיות שונות ב PBMC, כולל CD3 עבור תאי T, CD14 עבור מונוציטים, CD19 עבור תאי B, CD56 עבור תאי NK ו- CD11c עבור תקליטורי DVD.(C)הצג עוצמה פלואורסצטית חציון שונה (MFI) של exosome בעלי תווית Dio בקרב אוכלוסיות משנה שונות של PBMC (לדוגמה, תאי T, חד-אופן, תאי B, תאי NK, DCs). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: השפעות של אקסוזומים המופקים מ-CB-SC על מונוציטים. (א)שינוי מורפולוגי של מונוציטים לתוך התאים כמו ציר לאחר הטיפול עם exosomes CB-SC נגזר. (ב)מווסתת למעלה את רמת הביטוי של סמנים M2-associate לאחר הטיפול עם exosomes CB-SC נגזר, כגון CD163, CD206, ו CD209 (קו אדום). מונוציטים לא מטופלים (קו ירוק) שימשו כשליטה. IgGs תואמי Isotype שימשו כפקדים שליליים (קו אפור). (ג)השוואה פנוטיפית בין מקרופאגים M2 קונבנציונליים למקרופאגים M2 המושרה על-ידי CB-SC-Exo. כדי ליצור מקרופאגים M2 קונבנציונליים, CD14מטוהר + מונוציטים טופלו עם 50 ng/mL מקרופאג מושבה מגרה גורם (M-CSF) ב 37 ° C, 5% CO2 תנאים במשך 7 ימים, ואחריו טיפול לילה עם 10 ng/mL IL-4. סמנים המשויכים ל- M2 כולל CD14. CD80, CD86, CD163, CD206 ו- CD209 הוערכו על-ידי ציתום זרימה. אימונוגלובולין G (IgG) התואם לאימוטיפ משמש כשליטה. הנתונים מוצגים כ-SD ±; N = 3. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יישום אקסוזומים הוא תחום מתפתח לאבחון קליני, פיתוחים תרופתיים ורפואה רגנרטיבית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לגבי הכנת exosomes CB-SC נגזר והמחקר הפונקציונלי של exosomes על ההבידול של מונוציטים אנושיים. הפרוטוקול הנוכחי הוכיח כי exosomes CB-SC פונקציונלי נגזר מבודדים על ידי צנטריפוגה רציף ultracentrifugation עם טוהר גבוה ותצוגה אפנון חיסוני על מונוציטים.

בהשוואה לפרוטוקולים קונבנציונליים אחרים, ultrafiltration היא גישה מבוססת לבידוד וטיהור של exosomes מתאי או מדיה שונים, בהתבסס על משקל מולקולרי וגדלים הדרה השונים של שלולים חוץ תאיים אחרים (EVs). בעוד בידוד אולטרה סינון הוא יותר חיסכון בזמן מאשר ההפרדה מבוססת ultracentrifugation, זה עלול לגרום נזק מבני שלפוחיות בגדלים גדולים. Exosomes ניתן גם לאסוף על ידי פוליאתילן גליקול (PEG)-בתיווך משקעים בעלות נמוכה, אם כי שיטה זו מסכנת את טוהר exosome בשלזיהום חלבון 13,14. לכן, הפרוטוקול הנוכחי היה חסכוני כדי לייצר exosomes בטוהר גבוה. בהתבסס על אפנון החיסון של exosomes נגזר CB-SC10, אפיון של exosomes נגזר CB-SC עשוי להציע סמן ביולוגי יקר כדי להעריך את העוצמה של מחנך תאי גזע עם CB-SC לפני יישומים קליניים.

מקרופאגים הם תאים מקצועיים נגד אנטיגן מציגים תאים נגד זיהומים ויראליים וחיידקיים, עם פונקציות ביולוגיות מגוונות הטרוגניות. בהתבסס על ההבדלים שלהם סמני פני השטח ותפקוד מערכת החיסון, מקרופאגים מסווגים עם שתי תת אוכלוסיות: סוג 1 מקרופאגים (M1, מקרופאגים קונבנציונליים הגורמים לדלקת) וסוג 2 מקרופאגים (M2, הצגת אנטי דלקת)15. מחקר זה קבע כי מונוציטים אנושיים מטוהרים היו מובדילים לתוך סוג 2 מקרופאגים לאחר הטיפול עם אקסוזומים CB-SC נגזר, הצגת פנוטיפ אנטי דלקת10. מונוציטים שטופלו באקסוזום נגזר CB-SC הציגו את המורפולוגיה המוארך והביעו את סמני פני השטח המשויכים M2 (למשל, CD163, CD206 ו- CD209), עם פנוטיפ דומה כמו מקרופאגים M2 קונבנציונלי שנוצר באמצעות ציטוקינים M-CSF + IL-4. שינויים פנוטיפיים כאלה של מונוציטים להדגיש את המנגנון החדש הבסיסי את אפנון החיסון של CB-SC לטיפול בסוכרת מסוג 1 ומחלות אוטואימוניות אחרות. במהלך הטיפול SCE, תאים חיסוניים של חולים היו שיתוף תרבות עם CB-SC עבור סביב 8\u20129 שעות. מונוציטים שטופלו SCE נשאו exosomes CB-SC נגזר בחזרה לתוך הגוף, אשר תרם בידול M2 והרחבת האינדוקציה של סובלנות חיסונית, המוביל לשיפור של תוצאות קליניות לאחר הטיפול עם טיפול SCE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד"ר זאו הוא מייסד של Tianhe תאי גזע ביוטכנולוגיה Inc. ד"ר זאו הוא ממציא של טכנולוגיית מחנך תאי גזע. לכל המחברים האחרים אין אינטרסים כלכליים שעשויים להיות רלוונטיים לעבודה שהוגשה.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה למר פודדר ולמר לודוויג על תמיכה נדיבה במימון באמצעות קרן האקנסק UMC. אנו מעריכים את לורה זאו לעריכה אנגלית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-129
15 ml conical tube Falcon 352196
24-well plate Falcon 351147 Non-tissue culture
plate
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) Millipore sigma D4292-20MG Store at 4 °C
300 Mesh Grids Ted Pella 1GC300
50 mL conical tube Falcon 352070
6-well plate Falcon 353046 Tissue culture plate
96-well plate Falcon 353072 Tissue culture plate
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E 100 ml
Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit Millipore sigma UFC901024
Anti-Human Alix Biolegend 634501 store at 4 °C, RRID: AB_2268110
Anti-Human Calnexin Biolegend 699401 store at 4 °C, RRID: AB_2728519
Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 BD Bioscience 561356 store at 4 °C, RRID: AB_10611859
Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange Beckman Coulter B36294 store at 4 °C, RRID: AB_2728099
Anti-Human CD163 antibody, PE BD Bioscience 556018 store at 4 °C, RRID: AB_396296
Anti-Human CD19 antibody, PC5 Beckman Coulter IM2643U store at 4 °C, RRID: AB_131160
Anti-Human CD206 antibody, FITC BD Bioscience 551135 store at 4 °C, RRID: AB_394065
Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 BD Bioscience 564127 store at 4 °C, RRID: AB_2738610
Anti-Human CD270 antibody, PE Biolegend 318806 store at 4 °C, RRID: AB_2203703
Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue Biolegend 300431 store at 4 °C, RRID: AB_1595437
Anti-Human CD34 antibody, APC Beckman Coulter IM2427U store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD4 antibody, APC BD Bioscience 555349 store at 4 °C, RRID: AB_398593
Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 Beckman Coulter IM3548U store at 4 °C, RRID: AB_1575969
Anti-Human CD56 antibody, PE Beckman Coulter IM2073U store at 4 °C, RRID: AB_131195
Anti-Human CD63 antibody,PE BD Bioscience 561925 store at 4 °C, RRID: AB_10896821
Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 Beckman Coulter A94686 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD80 antibody, APC Beckman Coulter B30642 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD81 antibody, FITC BD Bioscience 561956 store at 4 °C, RRID: AB_394049
Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 Beckman Coulter B30646 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD9 antibody, FITC ThermoScientic MA5-16860 store at 4 °C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 Biolegend 348919 store at 4 °C, RRID: AB_2716134
Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 ThermoScientic 50-5841-82 store at 4 °C, RRID: AB_11218882
Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 ThermoScientic 53-9811-82 store at 4 °C, RRID: AB_2574479
BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A1933
Buffy coat New York Blood Center 40-60 ml/unit
Cell scraper Falcon 353085
Disposable semi-micro cuvette VWR 97000590
Dissociation buffer Gibco 131510014 100 ml
Dual-Chanber cell counting slides Bio-Rad 1450015
Exosome-Human CD63 Detection reagent ThermoFisher Scientific 10606D store at 4 °C
Ficoll-Paque PLUS density grandient media GE Health 17-1440-03 500 ml
Fixed-Angle Rotor(25°) Thermo Scientifc 75003698 Maxium 24,700 x g
Gallios flow cytometer Beckman Coulter 3 lasers
10 Color Max
Human cord blood Cryo-Cell International 40-100 ml/unit
Human Fc Block BD Bioscience 564220 store at 4 °C
Immun-Blot PVDF membrane Bio-Rad 1620177
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore Sigma SLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentriguge Beckman Coulter
Orbital Shaker MP4 BioExpress S-3500-1
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 500 ml
Propidium Iodide BD Bioscience 56-66211E store at 4 °C
Nikon Eclipse Ti2 microscope Nikon instruments Inc Eclipse Ti2 NIS-Elements software version 5.11.02
Hochest 33342 Thermo Scientifc 62249 5 ml
Revert microsopy Fisher scientific 12563518
Rotor 41 Ti Beckman Coulter 331362 Maxium 41,000 rpm
Sorvall St 16R Centrifuge Thermo Scientifc 75004381
Swinging Bucket Rotor Thermo Scientifc 75003655
TC-20 cell counter Bio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific
Transmission electron microscopy JEOL JEM-2100 PLUS
Ultracentrifuge tube Beckman Coulter 331372
X'VIVO 15 Serum-free medium Lonza BEBP04-744Q 1000 ml Culture medium, store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
  2. Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
  3. Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
  4. Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
  5. Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
  6. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  7. Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
  8. Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
  9. Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
  10. Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
  11. Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
  12. Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
  13. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  15. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 165 CB-SC מחנך תאי גזע (SCE) טיפול exosomes מונוצייט סוג 2 מקרופאג' בידול אפנון חיסוני
בידול של מונוציטים לתוך מקרופאגים שונים Phenotypically לאחר טיפול עם תאי גזע דם חוט אנושי (CB-SC)נגזר אקסוזומים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J.,… More

Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes. J. Vis. Exp. (165), e61562, doi:10.3791/61562 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter