Summary
Aqui, descrevemos o uso da tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) para visualizar estruturas retinianas e oculares in vivo em modelos de degeneração da retina, glaucoma, retinopatia diabética e miopia.
Abstract
A tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) é útil para visualizar estruturas retinianas e oculares in vivo. Em pesquisa, o SD-OCT é uma ferramenta valiosa para avaliar e caracterizar alterações em uma variedade de modelos de doenças e lesões retinianas e oculares. Em modelos de degeneração retiniana induzida pela luz, o SD-OCT pode ser usado para rastrear o afinamento da camada fotorreceptora ao longo do tempo. Em modelos de glaucoma, o SD-OCT pode ser usado para monitorar a diminuição da camada de fibras nervosas da retina e da espessura total da retina e para observar a ventosa do nervo óptico após a indução da hipertensão ocular. Em roedores diabéticos, o SD-OCT ajudou os pesquisadores a observar a diminuição da espessura total da retina, bem como a diminuição da espessura de camadas específicas da retina, particularmente a camada de fibras nervosas da retina com a progressão da doença. Em modelos de miopia em camundongos, o SD-OCT pode ser usado para avaliar parâmetros axiais, como alterações de comprimento axial. As vantagens do SD-OCT incluem imagens in vivo de estruturas oculares, a capacidade de rastrear quantitativamente as mudanças nas dimensões oculares ao longo do tempo e sua rápida velocidade de varredura e alta resolução. Aqui, detalhamos os métodos do SD-OCT e mostramos exemplos de seu uso em nosso laboratório em modelos de degeneração da retina, glaucoma, retinopatia diabética e miopia. Os métodos incluem anestesia, imagens SD-OCT e processamento das imagens para medições de espessura.
Introduction
A tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) é uma modalidade de imagem precisa e de alta resolução que permite que clínicos e pesquisadores examinem estruturas oculares de forma não invasiva. Essa técnica de imagem baseia-se na interferometria para capturar imagens tridimensionais da retina in vivo em escala microscópica 1,2. Tornou-se uma das modalidades de imagem mais utilizadas na pesquisa da visão e na clínica, devido à fácil detecção e precisão de características patológicas, como defeitos estruturais e/ou afinamento das camadas retinianas e do líquido sub-retiniano3. Em pesquisas utilizando modelos animais de distúrbios relacionados à visão, a SD-OCT forneceu análises não invasivas essenciais das relações entre estrutura e função e suas origens histopatológicas4. Devido à sua resolução (até 2-3 mícrons, dependendo da profundidade no olho5), o SD-OCT tem a capacidade de detectar até mesmo pequenas alterações na espessura da camada da retina. Esse tipo de análise pode fornecer informações essenciais para a progressão da doença e avaliar a eficácia de métodos e tratamentos neuroprotetores para distúrbios relacionados à visão.
O DS-OCT é uma alternativa não invasiva ao exame histológico da estrutura, e os dois demonstraram estar correlacionados6. Embora o SD-OCT não atinja a resolução celular, ele permite estudos longitudinais em animais. Isso é vantajoso porque a progressão da doença pode ser rastreada em animais individuais ao longo do tempo, em vez de ter que sacrificar animais em pontos de tempo específicos. À medida que as técnicas de imagem continuam a melhorar, a tecnologia SD-OCT também progredirá, proporcionando melhor qualidade de imagem, bem como a capacidade de avaliar processos biológicos, como a função dos vasos sanguíneos da retina, em detalhes. Mesmo desde o seu advento em 1991, a tecnologia SD-OCT tem visto enormes avanços em resolução, velocidade e sensibilidade7.
O presente estudo utiliza um sistema SD-OCT para quantificar alterações nas camadas da retina em modelos de roedores de degeneração da retina, glaucoma e retinopatia diabética. O sistema SD-OCT usado aqui é um sistema OCT de domínio Fourier que utiliza luz infravermelha próxima de baixa potência para adquirir, processar e armazenar imagens resolvidas em profundidade em tempo real. O sistema SD-OCT tem capacidade de imagem de profundidade estendida na faixa de comprimento de onda de 800 nm, fornecendo 8 mm de profundidade e resolução de 4 μm. Na detecção do domínio de Fourier, o sinal de interferência entre a luz dispersa do tecido e um caminho de referência é transformado de Fourier para construir varreduras axiais e/ou perfis de profundidade axial de intensidade dispersa8. Para os estudos aqui, o feixe OCT é escaneado sobre a estrutura da retina desejada enquanto adquire varreduras axiais em série. Normalmente, um padrão de varredura adquire a grade bidimensional (B-Scans) como uma coleção de linhas de varredura unidimensionais lineares (A-Scans), que correspondem a imagens transversais 2D usando um padrão de varredura raster. Para estudos focados na miopia em camundongos, esse sistema também é usado para medir as dimensões das estruturas oculares (por exemplo, espessura da córnea, espessura da lente, profundidade da câmara vítrea e comprimento axial).
O sistema atual permite que os usuários projetem seus próprios protocolos, criando varreduras que podem ser adaptadas e selecionadas com base nas estruturas oculares de interesse. As principais varreduras apresentadas nesses protocolos definidos pelo usuário tornam essa técnica de imagem fácil de usar. Para análises de imagens, desenvolvemos programação personalizada em um programa de modelagem matemática. O SD-OCT é uma ferramenta poderosa para identificar e quantificar de forma não invasiva as alterações patomorfológicas nas estruturas oculares e monitorar a progressão da doença relacionada à visão.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de Atlanta Veterans Affairs e em conformidade com o guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório (NIH Publications,8ª edição, atualizada em 2011).
NOTA: O sistema SD-OCT usado para desenvolver o protocolo abaixo é descrito na Tabela de Materiais. Embora alguns dos procedimentos sejam específicos para este sistema específico, a abordagem global pode ser adaptada para outros dispositivos PTU e modelos animais. Além disso, em nosso laboratório, esses protocolos são comumente usados em camundongos e ratos; no entanto, a abordagem geral pode ser adotada para diferentes modelos animais e dispositivos SD-OCT, desde que um indivíduo tenha a lente e os recursos corretos em seu dispositivo.
1. Configurar o equipamento de tomografia de coerência óptica
- Abra o software SD-OCT (Tabela de Materiais).
- Defina quem está tomando a OCT, o estudo e o braço de tratamento (se relevante). Nomeie essas categorias de uma maneira que ajude os pesquisadores a procurar as varreduras desejadas mais tarde durante a análise dos dados.
- Na guia Paciente/Exame , clique em Examinador de Teste. Selecione o nome do examinador. Use o botão Configurar examinadores e médicos para adicionar novos examinadores.
- Clique em Nome do estudo para definir o estudo. Clique na guia Estudo para adicionar um novo estudo ou modificar tratamentos em um estudo existente. Clique à direita de Selecionar braço de tratamento para selecionar um braço de tratamento.
- Clique no botão Adicionar paciente , que é usado para adicionar um novo ponto de tempo para um grupo inteiro. Quando a janela for exibida, insira Número de identificação, Nome e Sobrenome. Selecione Masculino ou Feminino. Insira a Data de Nascimento.
- Clique no botão Adicionar exame para adicionar os ratos individuais. Para identificar os ratos, clique em um exame. Clique em Editar Exame. Insira o número de ID na caixa Inserir anotações . Clique no botão Salvar alterações .
- Conecte a lente adequada ao dispositivo (Figura 1B), selecione a configuração correspondente no software e disque na posição do braço de referência associada.
NOTA: O sistema SD-OCT descrito possui lentes personalizadas, padrões de varredura predefinidos e configurações de braço de referência específicas para a espécie animal e a região do olho que está sendo fotografada (retina ou córnea, rato ou rato). Alguns desses detalhes são específicos do sistema SD-OCT descrito (consulte a tabela de materiais). Por exemplo, nem todos os dispositivos oferecem ajuste manual do comprimento do caminho do braço de referência. - Na guia Paciente/Exame, clique duas vezes no exame destacado para prosseguir para a guia Imagem e iniciar a geração de imagens ou simplesmente clique na guia Imagem. Se houver uma verificação padrão, clique com o botão direito do mouse para excluí-la.
- Carregue um protocolo de varredura predefinido clicando no botão Selecionar um protocolo na lista . Como alternativa, adicione varreduras individuais.
- Para modelos de ratos de glaucoma e retinopatia diabética e modelos de camundongos de degeneração da retina, escolha uma pré-configuração que consiste em quatro imagens: 2 OD e 2 OS. Para miopia do mouse, escolha uma predefinição que consiste em 8 imagens: 4 varreduras OD e 4 OS.
NOTA: A imagem predefinida será explicada em mais detalhes na Seção 3. Isso é algo que cada laboratório faz para si mesmo ou com o fabricante durante a instalação no local.
2. Anestesiar o animal
- Administrar anestésico.
- Anestesiar ratos com cetamina (60 mg/kg) e xilazina (7,5 mg/kg) através de injeção intraperitoneal.
- Anestesiar camundongos com cetamina (80 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg) por injeção intraperitoneal.
- Espere até que os animais estejam totalmente anestesiados e não respondam ao beliscão do dedo do pé.
- Administrar gotas de dilatação da pupila (1% de tropicamida). Espere que as pupilas se dilatem antes de fazer a imagem.
NOTA: A dilatação das pupilas aumenta o campo de visão, mas não é um requisito. Gotas anestésicas locais (córnea) (tetracaína a 0,5%) para anestesiar o olho também devem ser usadas se algo estiver tocando o olho (por exemplo, se aplicar lentes de contato ou usar um guia). Um guia é um dispositivo que é colocado sobre a cabeça de varredura e ajuda os iniciantes a alinhar o olho e a cabeça de varredura. - Depois de anestesiar o roedor, coloque o roedor em um sistema de alinhamento de roedores que possa girar o animal no espaço tridimensional (Figura 1A, 1C e 1D). Fornecer suporte térmico.
NOTA: Atualmente, usamos sistemas de alinhamento de roedores para camundongos e ratos projetados e vendidos com o dispositivo SD-OCT. - Aplique líquido (por exemplo, soro fisiológico ou lágrimas artificiais) para manter os olhos lubrificados. Certifique-se de que o olho não seque durante a imagem para que as propriedades ópticas do olho sejam mantidas entre os exames (quando a córnea está molhada, a retina pode ser vista claramente).
- Certifique-se de manter a umidade no olho oposto ao escanear o primeiro olho para que ele não seque.
- Use uma limpeza de tarefas delicadas para eliminar o excesso de solução salina antes da imagem, pois muito ou pouco lubrificante no olho afetará a qualidade da imagem.
NOTA: O uso de gel lubrificante estéril não é recomendado durante a OCT, uma vez que pode interferir com a imagem. Se necessário, gel lubrificante estéril pode ser usado após o procedimento. Uma lente de contato também pode ser aplicada para garantir a umidade adequada no olho durante todo o teste. Em nossa experiência, uma lente de contato não proporcionou uma melhoria acentuada na qualidade da imagem, mas as lentes de contato ajudam a reduzir o risco de secagem da córnea durante a sessão de imagem.
3. Imagem OCT de roedores
- Comece com um olho (OS ou OD) e imagine o olho contralateral depois.
- Posicione o animal usando os dois movimentos rotacionais do sistema de alinhamento de roedores, de modo que o olhar seja horizontal e olhando para baixo no eixo da lente OCT (Figura 1D).
- Use a OCT no modo Free Run para orientar a retina para a coleta de dados. Use o modo Apontar (clicando no botão Apontar ) inicialmente para uma exibição contínua de varreduras B horizontais e verticais em tempo real.
- Mova a cabeça de varredura para mais perto do olho até que a retina esteja visível (como as lentes de retina de rato e rato são de foco fixo, movendo a lente em direção ao olho foca mais profundamente na retina). Em seguida, use o sistema de alinhamento de roedores para ajustar a posição do animal para cima/para baixo e girar/torcer para posicionar a cabeça do nervo óptico no centro, fazer a varredura horizontal horizontal e a varredura vertical vertical (Figura 1A).
- Ajuste a distância de trabalho de modo que a imagem da retina seja plana e não curva.
- Ajuste a posição do braço de referência para manter a imagem perto da parte superior da janela de exibição. Tenha cuidado para não ir muito longe ou a imagem do olho vai virar de volta sobre si mesma.
- Imagem da retina
- Para modelos de glaucoma, degeneração da retina e retinopatia diabética: Defina uma varredura de volume que consista em 1000 x 100 x 1 (exames A x exames B x exames B repetidos) para média. Em ratos, faça uma varredura de volume que seja de 3 x 3 mm. Em camundongos, faça uma varredura de volume de 1,5 x 1,5 mm.
- Centralize o nervo óptico no acesso horizontal e vertical para que a varredura de volume esteja no centro. Reserve um tempo para se certificar de que a cabeça do nervo óptico está no centro da varredura e reta ao longo dos eixos nasal-temporal e superior-inferior (Figura 2). Digitalize e recarregue novamente para se certificar de que está exatamente no centro, se necessário. Repita esta varredura conforme necessário até que a cabeça do nervo óptico esteja centrada e alinhada ao longo de ambos os eixos. Clique no botão Instantâneo para tirar uma foto.
NOTA: Alguns dispositivos SD-OCT têm a opção de manipular opticamente a curvatura do olho (por exemplo, a imagem é achatada) ajustando a distância do olho da fonte de luz com o braço de referência. Recomendamos achatar e centralizar as imagens ao fazer medições diretas de espessura através das camadas da retina para melhorar a precisão ao longo da direção anteroposterior. - Clique no botão Salvar para salvar a imagem.
- Faça uma varredura radial centrada na cabeça do nervo óptico que é 1000 x 4 x 20 (A-scan x B-scan x repetidas B-scans). Use exames B repetidos para melhorar a clareza da imagem do olho ou da retina, o que ajudará a interpretar regiões do olho ou camadas da retina durante a análise de dados.
NOTA: Novamente, em ratos esta varredura radial é de 3 mm, enquanto em camundongos a varredura radial é de 1,5 mm. - Salve a imagem.
- Repita os passos 3.1 a 3.2.5 no olho contralateral.
- Medidas axiais do comprimento
- Para projetos que envolvam imagens de todo o olho, como miopia de camundongo, faça três exames de todo o olho e uma varredura de retina para cada olho. Escolha uma pré-definição que consista em uma varredura radial que seja 500 x 20 x 1 e englobe todo o diâmetro do olho.
NOTA: Esta configuração fornece uma imagem de todo o comprimento do olho do rato, desde a córnea até à coroide. - Centralize o meio do olho e da retina no campo de visão. Faça três varreduras radiais (varreduras de olho inteiro): uma varredura B linear que é 1000 x 5 x 2 e duas varreduras B lineares adicionais de 1000 x 5 x 2 no mesmo local. Salve as imagens.
- Depois, se desejar, aumente o zoom e faça uma varredura de volume ou retangular (varredura de retina) semelhante à descrição no 3.2, que consiste em varreduras de 1000 x 20 A x varreduras B. Salve a varredura de volume.
- Repita os passos 3.3 a 3.3.3 no olho contralateral.
NOTA: As medições axiais do comprimento só são possíveis em olhos pequenos (mouse ou menores), uma vez que a janela de imagem dos sistemas atuais não é grande o suficiente para capturar um olho maior.
- Para projetos que envolvam imagens de todo o olho, como miopia de camundongo, faça três exames de todo o olho e uma varredura de retina para cada olho. Escolha uma pré-definição que consista em uma varredura radial que seja 500 x 20 x 1 e englobe todo o diâmetro do olho.
4. Etapas pós-imagem
- Armazene dados salvos em uma nuvem, o que é uma boa prática para o gerenciamento de dados e permite fácil acesso para análise posterior. Realizar análise de dados com software personalizado desenvolvido em um programa de modelagem matemática (Tabela de Materiais).
- Remova o roedor do sistema de alinhamento de roedores e dê uma injeção intraperitoneal de atipamezol (1 mg/kg para ratos e camundongos) para reverter os efeitos da xilazina, para que o roedor acorde mais rapidamente.
- Permita que os roedores se recuperem em uma almofada de aquecimento em fogo baixo. Dê gotas salinas adicionais, conforme necessário. Devolva os roedores à sua gaiola de origem quando recuperarem a deambulação completa.
- Feche o programa e desative a OCT.
5. Pós-processamento de imagens OCT
- Processe as imagens usando um software personalizado desenvolvido em um programa de modelagem matemática para atender às necessidades específicas da OCT (por exemplo, medir a espessura das áreas de interesse marcando manualmente as imagens).
- Dependendo da finalidade da imagem (retina de camundongo, retina de rato ou miopia/comprimento axial), use um dos três programas diferentes:
- Para processar a retina, selecione as varreduras OCT a serem carregadas. Primeiro, defina o centro da cabeça do nervo óptico com um simples clique.
- Veja como o programa gera linhas verticais que definem distâncias em ambos os lados da cabeça do nervo óptico. Note-se que na retina de ratos, essas linhas estão a 0,5 mm e 1,2 mm de distância do centro da cabeça do nervo óptico, para um total de 4 linhas verticais que representam os eixos nasal-temporal e inferior-superior do olho, dependendo da varredura radial B atualmente analisada.
NOTA: Na retina do rato, estas linhas verticais estão a 0,25 mm e a 0,5 mm do centro da cabeça do nervo óptico. - Delineie as seguintes camadas ao longo de cada linha:
A camada de fibras nervosas da retina (RNFL), a camada plexiforme interna (IPL), a camada nuclear interna (INL), a camada plexiforme externa (OPL), a camada nuclear externa (ONL), a membrana limitante externa (ELM), os segmentos internos/segmentos externos (IS/OS), o epitélio pigmentar da retina (PSE) e a espessura total da retina.
NOTA: A varredura radial normalmente não tem rótulos nasais/temporais e superiores/inferiores quando é aberta. As varreduras podem ser criadas de tal forma que tenham uma orientação n/t e s/I, e essas varreduras, em particular, são analisadas posteriormente. - Depois que uma imagem for delineada e o programa fechado, exporte essas medidas para um software de planilha para análise de dados.
- Use esses valores de comprimento e espessura da etapa 5 para fazer comparações entre grupos, por exemplo, determinando se há diferenças regionais (n/t/s/i) ou alterações longitudinais.
- Para medições da retina, primeiro determine se há diferenças no eixo nasal-temporal e inferior-superior nas distâncias de 0,5 mm e 1,2 mm.
NOTA: Se não forem observadas diferenças nos quadrantes, as medições de 0,5 mm e 1,2 mm podem ser calculadas em conjunto. Esta é uma abordagem semelhante para os exames de retina do rato apenas em 0,25 mm e 0,5 mm. - Para estudos de miopia, use este programa para avaliar os parâmetros oculares ao longo do eixo óptico do olho. Abra o programa de modelagem matemática. Primeiro, selecione uma imagem para carregar.
- Depois de carregar a imagem, marque manualmente cada digitalização (varreduras radiais e B). Marque as bordas anterior e posterior da córnea, lente, câmara vítrea e retina, de modo que o programa calcule a espessura da córnea, espessura da lente, profundidade da câmara anterior e vítrea, espessura total da retina, comprimento axial total.
- Após a marcação, saia do programa que solicita um menu de salvamento. Salve os valores delineados em um software de planilha e faça a média das três varreduras separadas juntas.
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Representative Results
O SD-OCT é considerado bem-sucedido se forem obtidas imagens de alta qualidade de modo que as dimensões oculares possam ser medidas de forma confiável. Aqui, uma variedade de usos do SD-OCT é ilustrada usando modelos de degeneração da retina, glaucoma, retinopatia diabética e miopia.
Em um modelo de degeneração retiniana induzida por luz (LIRD), a exposição à luz brilhante (10.000 lux) induz a degeneração das células fotorreceptoras na retina9. Imagens representativas de SD-OCT revelam uma camada nuclear externa mais fina, que contém os corpos celulares fotorreceptores, em retinas de camundongos LIRD BALB/c em comparação com camundongos não danificados (controle) (Figura 3A & 3B). Após a quantificação da espessura da camada retiniana, observou-se diferença significativa entre camundongos não danificados e LIRD para a espessura total da retina (Figura 3C), espessura da camada nuclear externa (Figura 3D) e espessura do IS/OS (Figura 3E).
Para modelar experimentalmente o dano glaucomatoso, utilizou-se um modelo de hipertensão ocular (ESB)10. Em resumo, ratos Brown Norway (n=35) receberam injeção de solução salina hipertônica na veia do limbo de um olho, enquanto o olho contralateral serviu como controle interno11. Para estudos de glaucoma, quantificamos a espessura da camada de fibras nervosas da retina (RNFL). Após 8 semanas de ESB, observamos remodelamento distinto na cabeça do nervo óptico, incluindo ventosa do nervo óptico (Figura 4A&B). Em seguida, quantificamos a espessura da RNFL e encontramos afinamento da RNFL após 8 semanas de OHT em comparação com as medições basais (Figura 4C).
Para modelar a retinopatia diabética, foram utilizados ratos Goto-Kakizaki, um modelo poligênico e não obeso de diabetes que desenvolve hiperglicemia a partir das 2-3 semanas deidade12,13. Retinas de ratos Goto-Kakizaki e ratos Wistar (controles não diabéticos) foram fotografadas usando SD-OCT (Figura 5A&5B). Às 6 semanas de idade, a RNFL e a espessura total da retina foram reduzidas em ratos Goto-Kakizaki em comparação com ratos Wistar na retina central (dados não mostrados) e na retina periférica (Figura 5C&5D). As maiores diferenças foram observadas nos quadrantes inferior e temporal da retina (Figura 5C&5D).
Para avaliar modelos de miopia em camundongos, o comprimento axial foi medido em camundongos Bmal1-/-. Bmal1 é um gene do relógio de interesse, pois os ritmos circadianos podem desempenhar um papel no desenvolvimento da miopia14,15. O comprimento axial do olho de camundongo Bmal1-/- (Figura 6B) é visivelmente maior do que o olho selvagem (Figura 6A) nas imagens OCT. A quantificação do comprimento axial confirma que os camundongos Bmal1-/- têm comprimentos axiais significativamente maiores aos 84 dias de idade (Figura 6C), mostrando que a falta do gene do relógio contribui para o desenvolvimento da miopia.
Esse protocolo gerou imagens de estruturas oculares em modelos de degeneração da retina, glaucoma, retinopatia diabética e miopia. As imagens foram de qualidade suficiente para que as dimensões oculares, incluindo a camada nuclear externa, a camada de fibras nervosas da retina, a espessura total da retina e o comprimento axial, pudessem ser quantificadas. Os resultados mostraram que diferenças significativas nas dimensões das estruturas oculares puderam ser observadas in vivo usando SD-OCT.
Figura 1: Configuração do equipamento SD-OCT.
(A) Imagem do sistema de alinhamento de roedores e da cabeça de varredura OCT. (B) Imagem de lentes OCT de rato e rato. (C) Imagem do sistema de alinhamento de roedores de rato ilustrando sua capacidade de se mover no espaço tridimensional. (D) Feche o sistema de alinhamento de roedores, especificamente os botões que controlam seu movimento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Varredura de amostra SD-OCT.
Imagem de uma varredura ao vivo da retina do rato pouco antes de fazer um volume ou varredura radial. (A) descreve o alinhamento nasal-temporal, enquanto (B) mostra o alinhamento superior-inferior. Uma vez que as retinas nessas duas imagens estão retas em seus respectivos planos verticais ou horizontais e o nervo óptico está centrado em ambas as imagens, procedemos à aquisição da imagem SD-OCT. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Usando SD-OCT para rastrear o afinamento da camada fotorreceptora ao longo do tempo em um modelo de camundongo de degeneração da retina.
(A) Varredura SD-OCT representativa de uma retina não danificada (controle) de um camundongo BALB/c. (B) Varredura representativa SD-OCT de uma retina de um rato BALB/c com degeneração da retina induzida pela luz (LIRD). (C-E) Quantificação da espessura total da retina (C), da espessura da camada nuclear externa (ONL) (D) e da espessura do segmento interno/segmento externo (IS/OS) (E) em camundongos não danificados e LIRD Balb/c. Significa ± SEM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Usando SD-OCT medimos uma diminuição na espessura da camada de fibras nervosas da retina e observamos ventosa do nervo óptico após a indução de hipertensão ocular em um modelo de glaucoma em ratos.
(A) Varredura representativa SD-OCT de uma retina e cabeça do nervo óptico de um olho de rato tomada antes da indução de hipertensão ocular (Linha de base: OHT). (B) Exame SD-OCT da mesma retina de rato após 8 semanas de OHT (modelo experimental de glaucoma). (C) Quantificação da espessura da camada de fibras nervosas da retina (RNFL) no início do estudo em comparação com os olhos de OHT. Média ± MEV. Esses dados foram modificados de Feola et al.11Clique aqui para visualizar uma versão maior dessa figura.
Figura 5: Usando SD-OCT para observar a diminuição da espessura total da retina, bem como a diminuição da espessura de camadas específicas da retina em um modelo de rato de diabetes.
(A) Varredura SD-OCT representativa de uma retina de um rato Wistar (controle do tipo selvagem). (B) Varredura SD-OCT representativa de uma retina de um rato Goto-Kakizaki (diabético). Camadas da retina: camada de fibras nervosas da retina (RNFL), camada plexiforme interna (IPL), camada nuclear interna (INL), camada plexiforme externa (OPL), camada nuclear externa (ONL), membrana limitante externa (ELM), segmentos internos/segmentos externos (IS/OS), epitélio pigmentar da retina (PSE) e espessura total da retina (TRT). (C-D) Quantificação da RNFL (C) e da espessura total da retina (D) nas retinas Wistar e Goto-Kakizaki, onde a linha central é a média e a área sombreada é o MEV para os quatro quadrantes (Sup, Superior; Temp Temporal; Inf, Inferior; Nas, Nasal) da retina periférica (1,2 mm da cabeça do nervo óptico). ** p < 0,01, *** p < 0,001. Esta figura foi modificada de Allen et al.13Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Utilização do SD-OCT para avaliar o comprimento axial em um modelo de miopia em camundongo.
Imagens SD-OCT de olho inteiro de olhos de camundongos do tipo selvagem (A) e Bmal1-/- (B) aos 84 dias de idade. Os olhos dos camundongos Bmal1-/- têm comprimento axial significativamente maior do que os olhos do tipo selvagem (C). AL: comprimento axial; RT: espessura da retina; VCD: profundidade da câmara vítrea; LT: espessura da lente; DAC: profundidade da câmara anterior; TC: espessura da córnea. A linha vertical longa indica limites de comprimento axial (superior e inferior indicados pela linha horizontal) para o olho selvagem. Seta curta indica a marcação do comprimento axial posterior para o olho de Bmal1-/- . Média ± MEV. A linha central no meio de cada imagem (A & B) é um artefato de saturação vertical. É normalmente usado como um guia para centralizar o olho, mas se a varredura estiver bem alinhada, ela pode desaparecer. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A imagem de alta resolução de estruturas oculares in vivo permite a avaliação das alterações retinianas e oculares ao longo do tempo. Neste protocolo, a SD-OCT demonstrou capturar diferenças nas estruturas oculares in vivo em modelos de degeneração da retina, glaucoma, retinopatia diabética e miopia.
O aspecto mais crítico ao realizar o SD-OCT é a obtenção de uma imagem clara da retina ou de outra estrutura ocular de interesse. É importante ter tempo para se certificar de que a retina está perfeitamente centrada e tem excelente clareza. A respiração pesada pelo roedor pode resultar em imagens barulhentas (a retina pode realmente ser vista a mexer na tela). Isso às vezes acontece se um animal não estiver totalmente inconsciente após a administração do anestésico. Para contornar esse problema, várias varreduras B podem ser calculadas em média para ajudar a visualizar onde estão os limites das camadas da retina e, em seguida, a melhor imagem de varredura B única pode ser analisada.
Outro erro comum é que o olho está muito seco ou muito molhado. Isso pode ser verificado facilmente aplicando uma gota adicional de solução salina, absorvendo-a com uma limpeza de laboratório e avaliando se a imagem melhorou em clareza. Uma consideração a ter em conta ao marcar as espessuras da camada retiniana nas imagens SD-OCT é como marcar a RNFL. Embora seja possível diferenciar entre a RNFL e a GCL em alguns OCTs de roedores, muitas vezes essas duas camadas são indistinguíveis. Para consistência, marcamos toda a região RNFL (RNFL + GCL, quando visível) como RNFL. Alguns estudos relatam a RNFL e a GCL como camadas separadas ou combinam a GCL e a camada plexiforme interna16,17,18, embora esta pesquisa tenha sido tipicamente realizada em humanos, que têm olhos muito maiores do que os roedores. O relato da espessura da RNFL é mais típico em estudos com roedores 11,13,19,20. Outra questão importante é que mudanças muito pequenas na marcação podem causar uma mudança muito grande, especialmente na miopia, devido ao pequeno tamanho das estruturas que estão sendo medidas. Por exemplo, uma diferença de 6 μm na medição é igual a uma dioptria de mudança no erro de refração21. Como pequenas alterações fazem uma diferença tão grande na medição, a clareza da imagem é fundamental.
Uma limitação deste protocolo, e do SD-OCT em geral, é que a mídia ocular clara é necessária para uma boa imagem. Por exemplo, lesões na córnea, anormalidades do cristalino e catarata podem impedir que os usuários obtenham imagens claras. Esse é um problema na imagem da retinopatia diabética, em particular, pois a catarata comumente se desenvolve em roedores diabéticos22. Se a catarata ou outro problema ocular for pequeno, às vezes é possível manobrar a cabeça de varredura em torno dele. Para maiores interrupções do meio ocular, as imagens OCT da retina são impossíveis de obter. Essas retinas ainda podem ser investigadas usando histologia, pois a histologia da retina não depende de meios oculares claros.
Outra limitação é o fato de que lesões hiperreflexivas, como exsudatos e hemorragias, bem como os principais vasos da retina, resultam em sombreamento das estruturas retinianas subjacentes e, assim, os detalhes da morfologia subjacente são perdidos. Em um caso que exibia membrana neovascular coroidal e retinopatia diabética/edema macular em que a espessura da retina era superior a 400 μm, foi difícil discernir a patologia subjacente e a coroide23. Além disso, o SD-OCT só pode ser usado para avaliar a espessura em locais específicos. O SD-OCT também tem uma profundidade de penetração limitada para a imagem da coroide e para a imagem de olhos inteiros (o olho inteiro pode ser fotografado em um rato, mas não em animais maiores). Outra limitação é que os marcadores fluorescentes ou outros não podem ser usados com SD-OCT como com a oftalmoscopia a laser de varredura (SLO). No entanto, os dispositivos SLO típicos não permitem a visualização das camadas da retina em seção transversal com a mesma facilidade que é observada com o SD-OCT. Finalmente, a resolução com SD-OCT não é perfeita. No entanto, é muito melhorado em relação à resolução disponível no início do SD-OCT e continua a melhorar ao longo do tempo.
Em conclusão, as vantagens e o significado da técnica SD-OCT são que ela permite a imagem in vivo de estruturas oculares e o rastreamento quantitativo de mudanças nas dimensões oculares ao longo do tempo, e que realiza essa imagem com rápida velocidade de varredura. Devido à alta resolução do SD-OCT, ele pode ser usado para detectar diferenças sutis que não são observáveis a olho nu (Figura 4 e Figura 5). Além disso, o SD-OCT é uma ferramenta útil para medir múltiplos parâmetros do olho em vários modelos de doenças e lesões. Somente neste protocolo, o SD-OCT foi utilizado para medir a espessura da retina em modelos de degeneração da retina e retinopatia diabética, espessura e ventosa da retina em um modelo de glaucoma e comprimento axial em um modelo de miopia. O DS-OCT também pode ser usado para medir a curvatura da córnea24, avaliar alterações da retina após lesão cerebral blástica e traumática 19,25,26, identificar patologia na degeneração macular relacionada à idade 27 e monitorar a saúde da retina durante e após injeções oculares 28 e a colocação retiniana de dispositivos protéticos como implantes sub-retinianos 29. Pode ser usado em outros modelos animais, como musaranhos30 e primatas não humanos31 também. A DS-OCT também pode ser usada para localizar a patologia da retina com base no quadrante (superior, inferior, nasal, temporal) e na localização (central vs. periférica). Os futuros dispositivos SD-OCT alcançarão uma resolução ainda maior. Além disso, a angiografia OCT está permitindo a obtenção de imagens da microvasculatura retiniana e coroidal, utilizando a reflexão da luz laser na superfície dos glóbulos vermelhos à medida que se movem pela vasculatura da retina32,33.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Department of Veterans Affairs Rehab R&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) para RSA, Prêmio de Mérito (RX002615) e Prêmio de Cientista de Carreira de Pesquisa (RX003134) para MTP, Prêmio de Desenvolvimento de Carreira (CDA-2, RX002342) para AJF, EY028859 para MTP, NEI Core Grant P30EY006360, Pesquisa para Prevenir a Cegueira e Fundação de Combate à Cegueira.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% tropicamide | Sandoz | Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59 | |
| 0.5% tetracaine | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| AIM-RAS G3 120 V | Leica Bioptigen | 90-AIMRAS-G3-120 | Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice |
| Celluvisc gel | REFRESH CELLUVISC | #4554; NDC-0023-4554-30 | |
| G3 18 mm Telecentric Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-18 | |
| G3 Mouse Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-M | |
| G3 Rat Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-R | |
| heating pad | Fabrication | 11-1130 | |
| InVivoVue software | Leica Bioptigen | Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system | |
| MATLAB | Mathworks | mathematical modeling program | |
| Mouse/Rat Kit | Leica Bioptigen | 90-KIT-M/R | Mouse/rat rodent alignment system |
| saline | ADDIPAK | 200-39 | |
| System Envisu R4300 VHR 120 V | Leica Bioptigen | 90-R4300-V1-120 | SD-OCT system |
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