Summary
Hier beschreiben wir die Verwendung der spektralen optischen Kohärenztomographie (SD-OCT) zur Visualisierung von Netzhaut- und Augenstrukturen in vivo in Modellen der Netzhautdegeneration, des Glaukoms, der diabetischen Retinopathie und der Myopie.
Abstract
Die optische Kohärenztomographie im Spektralbereich (SD-OCT) ist nützlich, um Netzhaut- und Augenstrukturen in vivo sichtbar zu machen. In der Forschung ist SD-OCT ein wertvolles Werkzeug, um Veränderungen in einer Vielzahl von Netzhaut- und Augenerkrankungs- und Verletzungsmodellen zu bewerten und zu charakterisieren. In lichtinduzierten Netzhautdegenerationsmodellen kann SD-OCT verwendet werden, um die Ausdünnung der Photorezeptorschicht im Laufe der Zeit zu verfolgen. In Glaukommodellen kann SD-OCT verwendet werden, um die verminderte retinale Nervenfaserschicht und die gesamte Netzhautdicke zu überwachen und das Schröpfen des Sehnervs nach Induktion einer okulären Hypertonie zu beobachten. Bei diabetischen Nagetieren hat SD-OCT den Forschern geholfen, eine verringerte Gesamtdicke der Netzhaut sowie eine verringerte Dicke bestimmter Netzhautschichten, insbesondere der Nervenfaserschicht der Netzhaut, mit fortschreitender Krankheit zu beobachten. In Mausmodellen der Myopie kann SD-OCT verwendet werden, um axiale Parameter, wie z.B. axiale Längenänderungen, zu bewerten. Zu den Vorteilen von SD-OCT gehören die In-vivo-Bildgebung von Augenstrukturen, die Fähigkeit, Änderungen der Augenabmessungen im Laufe der Zeit quantitativ zu verfolgen, sowie die schnelle Scangeschwindigkeit und die hohe Auflösung. Hier beschreiben wir die Methoden der SD-OCT und zeigen Beispiele für ihre Anwendung in unserem Labor in Modellen der Netzhautdegeneration, des Glaukoms, der diabetischen Retinopathie und der Myopie. Zu den Methoden gehören Anästhesie, SD-OCT-Bildgebung und Verarbeitung der Bilder für Dickenmessungen.
Introduction
Die spektrale optische Kohärenztomographie (SD-OCT) ist eine präzise, hochauflösende Bildgebungsmodalität, die es Klinikern und Forschern ermöglicht, Augenstrukturen nichtinvasiv zu untersuchen. Dieses bildgebende Verfahren basiert auf der Interferometrie, um dreidimensionale Netzhautbilder in vivo auf einer Mikrometerskala 1,2 zu erfassen. Es hat sich zu einer der am häufigsten verwendeten bildgebenden Verfahren in der Sehforschung und in der Klinik entwickelt, da pathologische Merkmale wie strukturelle Defekte und/oder Ausdünnung der Netzhautschichten und der subretinalen Flüssigkeit leicht erkannt und genau erkannt werdenkönnen 3. In der Forschung unter Verwendung von Tiermodellen für Sehstörungen hat SD-OCT wesentliche nichtinvasive Analysen der Beziehungen zwischen Struktur und Funktion und ihrer histopathologischen Ursprünge geliefert4. Aufgrund seiner Auflösung (bis zu 2-3 Mikrometer, abhängig von der Tiefe in das Auge5) ist SD-OCT in der Lage, auch kleine Veränderungen in der Dicke der Netzhautschicht zu erkennen. Diese Art der Analyse kann wichtige Informationen für das Fortschreiten der Erkrankung liefern und die Wirksamkeit neuroprotektiver Methoden und Behandlungen für Sehstörungen beurteilen.
SD-OCT ist eine nicht-invasive Alternative zur histologischen Strukturuntersuchung, und es wurde gezeigt, dass die beiden korrelieren6. Während SD-OCT keine zelluläre Auflösung erreicht, ermöglicht es Längsschnittstudien an Tieren. Dies ist von Vorteil, da das Fortschreiten der Krankheit bei einzelnen Tieren im Laufe der Zeit verfolgt werden kann, anstatt Tiere zu bestimmten Zeitpunkten einschläfern zu müssen. Mit der kontinuierlichen Verbesserung der bildgebenden Verfahren wird auch die SD-OCT-Technologie weiterentwickelt und bietet eine verbesserte Bildqualität sowie die Möglichkeit, biologische Prozesse wie die Funktion der retinalen Blutgefäße detailliert zu beurteilen. Seit ihrer Einführung im Jahr 1991 hat die SD-OCT-Technologie enorme Fortschritte in Bezug auf Auflösung, Geschwindigkeit und Empfindlichkeit gemacht7.
Die vorliegende Studie verwendet ein SD-OCT-System zur Quantifizierung von Veränderungen der Netzhautschichten in Nagetiermodellen für Netzhautdegeneration, Glaukom und diabetische Retinopathie. Das hier verwendete SD-OCT-System ist ein Fourier-Domain-OCT-System, das energiesparendes Nahinfrarotlicht nutzt, um tiefenaufgelöste Bilder in Echtzeit zu erfassen, zu verarbeiten und zu speichern. Das SD-OCT-System verfügt über erweiterte Tiefenbildgebungsfunktionen im Wellenlängenbereich von 800 nm und bietet eine Tiefe von 8 mm und eine Auflösung von 4 μm. Bei der Fourier-Domänendetektion wird das Interferenzsignal zwischen Streulicht aus dem Gewebe und einem Referenzpfad Fourier-transformiert, um axiale Abtastungen und/oder axiale Tiefenprofile der Streuintensität8 zu konstruieren. Für die Untersuchungen hier wird der OCT-Strahl über die gewünschte Netzhautstruktur gescannt, während serielle axiale Scans aufgenommen werden. In der Regel erfasst ein Scanmuster das zweidimensionale Raster (B-Scans) als eine Sammlung linearer eindimensionaler Scanlinien (A-Scans), die 2D-Querschnittsbildern entsprechen, die ein Rasterscanmuster verwenden. Für Studien, die sich auf Myopie bei Mäusen konzentrieren, wird dieses System auch verwendet, um die Dimensionen von Augenstrukturen zu messen (z. B. Hornhautdicke, Linsendicke, Glaskammertiefe und axiale Länge).
Das aktuelle System ermöglicht es Benutzern, ihre eigenen Protokolle zu entwerfen und Scans zu erstellen, die basierend auf den interessierenden Augenstrukturen angepasst und ausgewählt werden können. Die wichtigsten Scans, die in diesen benutzerdefinierten Protokollen enthalten sind, machen diese Bildgebungstechnik benutzerfreundlich. Für Bildanalysen haben wir eine maßgeschneiderte Programmierung in einem mathematischen Modellierungsprogramm entwickelt. SD-OCT ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur nicht-invasiven Identifizierung und Quantifizierung pathomorphologischer Veränderungen in Augenstrukturen und zur Überwachung des sehbedingten Krankheitsverlaufs.
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Protocol
Alle beschriebenen Verfahren wurden vom Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und entsprachen dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publications, 8. Auflage, aktualisiert 2011).
HINWEIS: Das SD-OCT-System, das zur Entwicklung des Protokolls verwendet wurde, ist in der nachstehenden Materialtabelle beschrieben. Während einige der Verfahren für dieses spezielle System spezifisch sind, kann der Gesamtansatz für andere ÜLG-Produkte und Tiermodelle angepasst werden. Darüber hinaus werden diese Protokolle in unserem Labor häufig bei Mäusen und Ratten verwendet. Der Gesamtansatz kann jedoch auf verschiedene Tiermodelle und SD-OCT-Geräte angewendet werden, vorausgesetzt, eine Person verfügt über das richtige Objektiv und die richtigen Fähigkeiten auf ihrem Gerät.
1. Richten Sie den optischen Kohärenztomographen ein
- Öffnen Sie die SD-OCT-Software (Materialverzeichnis).
- Legen Sie fest, wer die OCT, die Studie und den Behandlungsarm (falls relevant) einnimmt. Benennen Sie diese Kategorien so, dass Forscher später während der Datenanalyse nach den gewünschten Scans suchen können.
- Klicken Sie auf der Registerkarte " Patient/Untersuchung " auf "Testprüfer". Wählen Sie den Namen des Prüfers aus. Verwenden Sie die Schaltfläche "Prüfer und Ärzte einrichten ", um neue Untersucher hinzuzufügen.
- Klicken Sie auf Studienname , um die Studie zu definieren. Klicken Sie auf die Registerkarte Studie, um eine neue Studie hinzuzufügen oder Behandlungen in einer vorhandenen Studie zu ändern. Klicken Sie rechts neben Behandlungsarm auswählen, um einen Behandlungsarm auszuwählen.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Patient hinzufügen, mit der Sie einen neuen Zeitpunkt für eine ganze Gruppe hinzufügen können. Wenn das Fenster angezeigt wird, geben Sie ID-Nummer, Vorname und Nachname ein. Wählen Sie Männlich oder Weiblich aus. Geben Sie das Geburtsdatum ein.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Prüfung hinzufügen , um die einzelnen Ratten hinzuzufügen. Um die Ratten zu identifizieren, klicken Sie auf eine Untersuchung. Klicken Sie auf Prüfung bearbeiten. Geben Sie die ID-Nummer in das Feld " Notizen eingeben" ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Änderungen speichern .
- Schließen Sie das richtige Objektiv an das Gerät an (Abbildung 1B), wählen Sie die entsprechende Konfiguration in der Software aus, und wählen Sie die zugehörige Position des Referenzarms.
HINWEIS: Das beschriebene SD-OCT-System verfügt über angepasste Linsen, voreingestellte Scanmuster und Referenzarmeinstellungen , die für die abgebildete Tierart und Augenregion (Netzhaut oder Hornhaut, Maus oder Ratte) spezifisch sind. Einige dieser Details sind spezifisch für das beschriebene SD-OCT-System (siehe Materialtabelle). Zum Beispiel bieten nicht alle Geräte eine manuelle Einstellung der Referenzarmweglänge . - Doppelklicken Sie auf der Registerkarte "Patient/Untersuchung" auf die markierte Untersuchung, um zur Registerkarte "Bildgebung" zu gelangen und mit der Bildgebung zu beginnen, oder klicken Sie einfach auf die Registerkarte "Bildgebung". Wenn ein Standard-Scan vorhanden ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste, um ihn zu löschen.
- Laden Sie ein voreingestelltes Scan-Protokoll, indem Sie auf die Schaltfläche Protokoll aus der Liste auswählen klicken. Alternativ können Sie einzelne Scans hinzufügen.
- Für Rattenmodelle für Glaukom und diabetische Retinopathie und Mausmodelle für Netzhautdegeneration wählen Sie eine Voreinstellung, die aus vier Bildern besteht: 2 OD- und 2 OS-Scans. Wählen Sie für die Kurzsichtigkeit der Maus eine Voreinstellung, die aus 8 Bildern besteht: 4 OD- und 4 OS-Scans.
HINWEIS: Die voreingestellte Bildgebung wird in Abschnitt 3 ausführlicher erläutert. Dies ist etwas, das jedes Labor für sich selbst oder mit dem Hersteller während der Installation vor Ort macht.
2. Betäuben Sie das Tier
- Verabreichen Sie Anästhetika.
- Ratten werden mit Ketamin (60 mg/kg) und Xylazin (7,5 mg/kg) mittels intraperitonealer Injektion betäubt.
- Anästhesieren Sie Mäuse mit Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (16 mg/kg) mittels intraperitonealer Injektion.
- Warten Sie, bis die Tiere vollständig betäubt sind und reagieren Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen.
- Verabreichung von Pupillenerweiterungstropfen (1% Tropicamid). Warten Sie, bis sich die Pupillen erweitert haben, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen.
HINWEIS: Die Erweiterung der Pupillen vergrößert das Sichtfeld, ist aber keine Voraussetzung. Lokalanästhesietropfen (0,5% Tetracain) zur Betäubung des Auges sollten auch verwendet werden, wenn etwas das Auge berührt (z. B. beim Anlegen von Kontaktlinsen oder bei Verwendung einer Führung). Eine Führung ist ein Gerät, das über dem Scankopf platziert wird und Anfängern hilft, das Auge und den Scankopf auszurichten. - Platzieren Sie das Nagetier nach der Betäubung in ein Nagetierausrichtungssystem, das das Tier im 3-dimensionalen Raum drehen kann (Abbildung 1A, 1C und 1D). Bieten Sie thermische Unterstützung.
HINWEIS: Derzeit verwenden wir Nagetierausrichtungssysteme für Mäuse und Ratten, die mit dem SD-OCT-Gerät entwickelt und verkauft werden. - Tragen Sie Flüssigkeit (z. B. Kochsalzlösung oder künstliche Tränen) auf, um die Augen geschmiert zu halten. Stellen Sie sicher, dass das Auge während der Bildgebung nicht austrocknet, damit die optischen Eigenschaften des Auges zwischen den Scans erhalten bleiben (wenn die Hornhaut nass ist, ist die Netzhaut deutlich zu sehen).
- Achten Sie darauf, die Feuchtigkeit im gegenüberliegenden Auge zu halten, wenn Sie das erste Auge scannen, damit es nicht austrocknet.
- Verwenden Sie ein empfindliches Task-Tuch, um überschüssige Kochsalzlösung kurz vor der Bildgebung abzuleiten, da zu viel oder zu wenig Gleitmittel auf dem Auge die Bildqualität beeinträchtigt.
HINWEIS: Die Verwendung von sterilem Gleitgel wird während der OCT nicht empfohlen, da dies die Bildgebung beeinträchtigen kann. Bei Bedarf kann nach dem Eingriff steriles Gleitgel verwendet werden. Eine Kontaktlinse kann auch angewendet werden, um während des gesamten Tests eine ausreichende Feuchtigkeit für das Auge zu gewährleisten. Unserer Erfahrung nach hat eine Kontaktlinse die Bildqualität nicht deutlich verbessert, aber Kontaktlinsen tragen dazu bei, das Risiko des Austrocknens der Hornhaut während der Bildgebung zu reduzieren.
3. OCT-Bildgebung für Nagetiere
- Beginnen Sie mit einem Auge (OS oder OD) und bilden Sie danach das kontralaterale Auge ab.
- Positionieren Sie das Tier mit den beiden Drehbewegungen des Nagetierausrichtungssystems so, dass der Blick horizontal ist und auf die Achse der OCT-Linse blickt (Abbildung 1D).
- Verwenden Sie das OAT im Freistartmodus, um die Netzhaut für die Datenerfassung auszurichten. Verwenden Sie zunächst den Zielmodus (durch Klicken auf die Schaltfläche Ziel ), um eine kontinuierliche Anzeige von horizontalen und vertikalen B-Scans in Echtzeit zu erhalten.
- Bewegen Sie den Scankopf näher an das Auge, bis die Netzhaut sichtbar ist (da die Netzhautlinsen von Maus und Ratte einen Fixfokus haben, konzentriert sich die Linse in Richtung des Auges tiefer in die Netzhaut). Verwenden Sie dann das Nagetierausrichtungssystem, um die Tierposition nach oben / unten einzustellen und schwenken / drehen Sie, um den Sehnervenkopf in der Mitte zu positionieren, machen Sie den horizontalen Scan horizontal und den vertikalen Scan vertikal (Abbildung 1A).
- Stellen Sie den Arbeitsabstand so ein, dass das Netzhautbild flach und nicht gekrümmt ist.
- Passen Sie die Position des Referenzarms so an, dass sich das Bild am oberen Rand des Anzeigefensters befindet. Achten Sie darauf, nicht zu weit hinein zu drücken, da sich das Augenbild sonst von selbst zurückdreht.
- Bildgebung der Netzhaut
- Für Glaukom-, Netzhautdegenerations- und diabetische Retinopathie-Modelle: Definieren Sie einen Volumenscan, der aus 1000 x 100 x 1 (A-Scans x B-Scans x wiederholte B-Scans) für die Mittelwertbildung besteht. Bei Ratten wird ein Volumenscan von 3 x 3 mm durchgeführt. Bei Mäusen ist ein Scan mit einem Volumen von 1,5 x 1,5 mm durchzuführen.
- Zentrieren Sie den Sehnerv im horizontalen und vertikalen Zugang, so dass sich der Volumenscan in der Mitte befindet. Nehmen Sie sich Zeit, um sicherzustellen, dass sich der Sehnervenkopf in der Mitte des Scans befindet und gerade entlang der Nasen-Temporal- und Ober-Unter-Achse verläuft (Abbildung 2). Scannen Sie und zentrieren Sie es erneut, um sicherzustellen, dass es sich bei Bedarf genau in der Mitte befindet. Wiederholen Sie diesen Scan nach Bedarf, bis der Sehnervenkopf zentriert und entlang beider Achsen ausgerichtet ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche Schnappschuss , um ein Foto aufzunehmen.
HINWEIS: Einige SD-OCT-Geräte haben die Möglichkeit, die Krümmung des Auges optisch zu manipulieren (z. B. das Bild wird abgeflacht), indem der Abstand des Auges von der Lichtquelle mit dem Referenzarm angepasst wird. Wir empfehlen, die Bilder abzuflachen und zu zentrieren, wenn direkte Dickenmessungen durch die Netzhautschichten durchgeführt werden, um die Genauigkeit entlang der anterior-posterioren Richtung zu verbessern. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um das Bild zu speichern.
- Machen Sie einen radialen Scan, der auf den Sehnervenkopf zentriert ist, der 1000 x 4 x 20 ist (A-Bild x B-Bild x wiederholte B-Scans). Verwenden Sie wiederholte B-Scans, um die Bildschärfe des Auges oder der Netzhaut zu verbessern, was bei der Interpretation von Regionen des Auges oder Schichten der Netzhaut während der Datenanalyse hilft.
HINWEIS: Auch hier beträgt dieser radiale Scan bei Ratten 3 mm, während er bei Mäusen 1,5 mm beträgt. - Speichern Sie das Bild.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.2.5 im kontralateralen Auge.
- Axiale Längenmessungen
- Bei Projekten, bei denen das gesamte Auge abgebildet wird, z. B. bei der Kurzsichtigkeit der Maus, machen Sie drei Scans des gesamten Auges und einen Netzhautscan für jedes Auge. Wählen Sie eine Voreinstellung, die aus einem radialen Scan besteht, der 500 x 20 x 1 groß ist und den gesamten Durchmesser des Auges umfasst.
HINWEIS: Diese Einstellung liefert ein Bild der gesamten Länge des Mausauges von der Hornhaut bis zur Aderhaut. - Zentrieren Sie die Mitte des Auges und die Netzhaut im Sichtfeld. Machen Sie drei radiale Scans (Ganzaugenscans): einen linearen B-Scan mit 1000 x 5 x 2 und zwei zusätzliche lineare B-Scans von 1000 x 5 x 2 an derselben Stelle. Speichern Sie die Bilder.
- Vergrößern Sie anschließend bei Bedarf und machen Sie einen Volumen- oder rechteckigen Scan (Retina-Scan) ähnlich der Beschreibung in 3.2, der aus 1000 x 20 A-Scans x B-Scans besteht. Speichern Sie den Volume-Scan.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.3.3 im kontralateralen Auge.
HINWEIS: Axiallängenmessungen sind nur bei kleinen Augen (Maus oder kleiner) möglich, da das Bildgebungsfenster aktueller Systeme nicht groß genug ist, um ein größeres Auge zu erfassen.
- Bei Projekten, bei denen das gesamte Auge abgebildet wird, z. B. bei der Kurzsichtigkeit der Maus, machen Sie drei Scans des gesamten Auges und einen Netzhautscan für jedes Auge. Wählen Sie eine Voreinstellung, die aus einem radialen Scan besteht, der 500 x 20 x 1 groß ist und den gesamten Durchmesser des Auges umfasst.
4. Schritte nach der Bildgebung
- Speichern Sie gespeicherte Daten in einer Cloud, was eine gute Praxis für das Datenmanagement ist und einen einfachen Zugriff für spätere Analysen ermöglicht. Führen Sie Datenanalysen mit einer benutzerdefinierten Software durch, die in einem mathematischen Modellierungsprogramm (Table of Materials) entwickelt wurde.
- Entfernen Sie das Nagetier aus dem Nagetierausrichtungssystem und verabreichen Sie eine intraperitoneale Injektion von Atipamezol (1 mg/kg für Ratten und Mäuse), um die Wirkung des Xylazins umzukehren, damit das Nagetier schneller aufwacht.
- Lassen Sie Nagetiere sich bei schwacher Hitze auf einem Heizkissen erholen. Geben Sie bei Bedarf zusätzliche Salztropfen. Bringen Sie Nagetiere in ihren Heimatkäfig zurück, wenn sie wieder voll beweglich sind.
- Schließen Sie das Programm, und deaktivieren Sie das OAT.
5. Nachbearbeitung von OCT-Bildern
- Verarbeiten Sie die Bilder mit einer benutzerdefinierten Software, die in einem mathematischen Modellierungsprogramm entwickelt wurde, um den spezifischen Anforderungen des OCT gerecht zu werden (z. B. Messen Sie die Dicke von Interessenbereichen durch manuelles Markieren der Bilder).
- Verwenden Sie je nach Zweck des Bildes (Netzhaut der Maus, Rattennetzhaut oder Myopie/axiale Länge) eines von drei verschiedenen Programmen:
- Wählen Sie für die Verarbeitung der Netzhaut die zu ladenden OAT-Scans aus. Definieren Sie zunächst das Zentrum des Sehnervenkopfes mit einem einfachen Klick.
- Beobachten Sie, wie das Programm vertikale Linien erzeugt, die Entfernungen auf beiden Seiten des Sehnervenkopfes definieren. Beachten Sie, dass diese Linien in der Netzhaut der Ratte 0,5 mm und 1,2 mm von der Mitte des Sehnervenkopfes entfernt sind, für insgesamt 4 vertikale Linien, die die nasal-temporale und untere-superior-Achse des Auges darstellen, abhängig von dem radialen B-Scan, der derzeit analysiert wird.
HINWEIS: In der Netzhaut der Maus sind diese vertikalen Linien 0,25 mm und 0,5 mm vom Zentrum des Sehnervenkopfes entfernt. - Zeichnen Sie die folgenden Ebenen entlang jeder Linie ab:
Die retinale Nervenfaserschicht (RNFL), die innere plexiforme Schicht (IPL), die innere Kernschicht (INL), die äußere plexiforme Schicht (OPL), die äußere Kernschicht (ONL), die externe begrenzende Membran (ELM), die inneren Segmente / äußeren Segmente (IS / OS), das retinale Pigmentepithel (RPE) und die gesamte Netzhautdicke.
HINWEIS: Der Radialscan weist beim Öffnen in der Regel keine nasalen/temporalen und oberen/minderwertigen Beschriftungen auf. Scans können so erstellt werden, dass sie eine N/T- und S/I-Orientierung haben, und insbesondere diese Scans werden später analysiert. - Nachdem ein Bild abgegrenzt und das Programm geschlossen wurde, exportieren Sie diese Messungen zur Datenanalyse in eine Tabellenkalkulationssoftware.
- Verwenden Sie diese Längen- und Dickenwerte aus Schritt 5, um Vergleiche zwischen Gruppen anzustellen, z. B. um festzustellen, ob regionale Unterschiede (n/t/s/i) oder Längsänderungen vorliegen.
- Bei Netzhautmessungen wird zunächst festgestellt, ob es im Abstand von 0,5 mm und 1,2 mm Unterschiede in der Nasen-Temporal- und Unter-Ober-Achse gibt.
HINWEIS: Wenn keine Unterschiede in den Quadranten beobachtet werden, können die 0,5-mm- und 1,2-mm-Messungen zusammen gemittelt werden. Dies ist ein ähnlicher Ansatz für die Netzhautscans der Maus, nur bei 0,25 mm und 0,5 mm. - Verwenden Sie dieses Programm für Myopie-Studien, um die Augenparameter entlang der optischen Achse des Auges zu beurteilen. Öffnen Sie das mathematische Modellierungsprogramm. Wählen Sie zunächst ein Bild aus, das geladen werden soll.
- Nachdem Sie das Bild geladen haben, markieren Sie jeden Scan manuell (radiale und B-Scans). Markieren Sie die vorderen und hinteren Ränder der Hornhaut, der Linse, der Glaskammer und der Netzhaut, so dass das Programm die Hornhautdicke, die Linsendicke, die Tiefe der vorderen und Glaskörperkammer, die gesamte Netzhautdicke und die gesamte axiale Länge berechnet.
- Beenden Sie nach dem Markieren das Programm, das Sie zu einem Speichermenü auffordert. Speichern Sie die abgegrenzten Werte in einer Tabellenkalkulationssoftware und berechnen Sie den Mittelwert der drei separaten Scans.
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Representative Results
SD-OCT gilt als erfolgreich, wenn qualitativ hochwertige Bilder erhalten werden, so dass die Augenabmessungen zuverlässig gemessen werden können. Hier wird eine Vielzahl von Anwendungen von SD-OCT anhand von Modellen der Netzhautdegeneration, des Glaukoms, der diabetischen Retinopathie und der Myopie veranschaulicht.
In einem lichtinduzierten Netzhautdegeneration-Modell (LIRD) induziert die Exposition gegenüber hellem Licht (10.000 Lux) eine Degeneration von Photorezeptorzellen in der Netzhaut9. Repräsentative SD-OCT-Bilder zeigen eine dünnere äußere Kernschicht, die die Photorezeptor-Zellkörper enthält, in der Netzhaut von LIRD BALB/c-Mäusen im Vergleich zu unbeschädigten (Kontroll-)Mäusen (Abbildung 3A&3B). Nach der Quantifizierung der Netzhautschichtdicke wurde ein signifikanter Unterschied zwischen unbeschädigten und LIRD-Mäusen in Bezug auf die gesamte Netzhautdicke (Abbildung 3C), die äußere Kernschichtdicke (Abbildung 3D) und die IS/OS-Dicke (Abbildung 3E) beobachtet.
Um glaukomöse Schäden experimentell zu modellieren, verwendeten wir ein Modell der okulären Hypertonie (OHT)10. Kurz gesagt, Braune Wanderratten (n = 35) erhielten eine Injektion von hypertoner Kochsalzlösung in die Limbusvene eines Auges, während das kontralaterale Auge als interne Kontrolle diente11. Für Glaukomstudien haben wir die Dicke der retinalen Nervenfaserschicht (RNFL) quantifiziert. Nach 8 Wochen OHT beobachteten wir einen deutlichen Umbau am Sehnervenkopf, einschließlich Schröpfen des Sehnervs (Abbildung 4A&B). Wir quantifizierten dann die RNFL-Dicke und fanden eine RNFL-Ausdünnung nach 8 Wochen OHT im Vergleich zu Baseline-Messungen (Abbildung 4C).
Zur Modellierung der diabetischen Retinopathie wurden Goto-Kakizaki-Ratten, ein nicht fettleibiges, polygenes Diabetesmodell, das bereits im Alter von 2-3 Wochen eine Hyperglykämie entwickelt, verwendet12,13. Die Netzhaut von Goto-Kakizaki-Ratten und Wistar-Ratten (nicht-diabetische Kontrollen) wurde mit SD-OCT abgebildet (Abbildung 5A&5B). Im Alter von 6 Wochen waren die RNFL und die Gesamtdicke der Netzhaut bei Goto-Kakizaki-Ratten im Vergleich zu Wistar-Ratten in der zentralen Netzhaut (Daten nicht gezeigt) und der peripheren Netzhaut reduziert (Abbildung 5C&5D). Die größten Unterschiede wurden in den unteren und temporalen Quadranten der Netzhaut beobachtet (Abbildung 5C&5D).
Um Mausmodelle auf Myopie zu untersuchen, wurde die axiale Länge bei Bmal1-/- Mäusen gemessen. Bmal1 ist ein Uhrengen, das von Interesse ist, da circadiane Rhythmen eine Rolle bei der Entwicklung von Kurzsichtigkeit spielen können14,15. Die axiale Länge des Bmal1-/- Mausauges (Abbildung 6B) ist auf den OCT-Bildern sichtbar länger als die des Wildtyp-Auges (Abbildung 6A). Die Quantifizierung der Achsenlänge bestätigt, dass Bmal1-/--Mäuse im Alter von 84 Tagen signifikant längere Achsenlängen aufweisen (Abbildung 6C), was zeigt, dass das Fehlen des Uhrengens zur Myopieentwicklung beiträgt.
Dieses Protokoll erzeugte Bilder von Augenstrukturen in Modellen der Netzhautdegeneration, des Glaukoms, der diabetischen Retinopathie und der Myopie. Die Bilder waren von ausreichender Qualität, so dass die Augenabmessungen, einschließlich der äußeren Kernschicht, der retinalen Nervenfaserschicht, der gesamten Netzhautdicke und der axialen Länge, quantifiziert werden konnten. Die Ergebnisse zeigten, dass signifikante Unterschiede in den Dimensionen der Augenstrukturen in vivo mit SD-OCT beobachtet werden konnten.
Abbildung 1: Einrichtung der SD-OCT-Ausrüstung.
(A) Bild des Nagetierausrichtungssystems und des OCT-Scankopfes. (B) Bild von Ratten- und Maus-OCT-Linsen. (C) Bild eines Maus-Nagetier-Ausrichtungssystems, das seine Fähigkeit veranschaulicht, sich im 3-dimensionalen Raum zu bewegen. (D) Nahaufnahme des Nagetierausrichtungssystems, insbesondere der Knöpfe, die seine Bewegung steuern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: SD-OCT-Beispielscan.
Bild eines Live-Scans der Netzhaut der Maus kurz vor einem Volumen- oder Radialscan. (A) zeigt die nasale-temporale Ausrichtung, während (B) die ober-untere Ausrichtung zeigt. Sobald die Netzhaut in diesen beiden Bildern in ihren jeweiligen vertikalen oder horizontalen Ebenen gerade ist und der Sehnerv in beiden Bildern zentriert ist, fahren wir mit der Aufnahme des SD-OCT-Bildes fort. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Verwendung von SD-OCT zur Verfolgung der Ausdünnung der Photorezeptorschicht im Laufe der Zeit in einem Mausmodell der Netzhautdegeneration.
(A) Repräsentativer SD-OCT-Scan einer unbeschädigten (Kontroll-) Netzhaut von einer BALB/c-Maus. (B) Repräsentativer SD-OCT-Scan einer Netzhaut von einer lichtinduzierten Netzhautdegeneration (LIRD) BALB/c-Maus. (C-E) Quantifizierung der gesamten Netzhautdicke (C), der Dicke der äußeren Kernschicht (ONL) (D) und der Dicke des inneren Segments/äußeren Segments (IS/OS) (E) bei unbeschädigten und LIRD Balb/c-Mäusen. Mittlere ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Unter Verwendung von SD-OCT maßen wir eine Abnahme der Dicke der retinalen Nervenfaserschicht und beobachteten eine Schröpfung des Sehnervs nach Induktion einer okulären Hypertonie in einem Rattenmodell des Glaukoms.
(A) Repräsentativer SD-OCT-Scan einer Netzhaut und eines Sehnervenkopfes aus einem Rattenauge, aufgenommen vor der Induktion einer okulären Hypertonie (Baseline: OHT). (B) SD-OCT-Scan der gleichen Netzhaut der Ratte nach 8-wöchiger OHT (experimentelles Modell des Glaukoms). (C) Quantifizierung der Dicke der retinalen Nervenfaserschicht (RNFL) zu Beginn der Studie im Vergleich zu OHT-Augen. Mittlere ± SEM. Diese Daten wurden von Feola et al. modifiziert.11Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Verwendung von SD-OCT zur Beobachtung einer verminderten Gesamtdicke der Netzhaut sowie einer verringerten Dicke bestimmter Netzhautschichten in einem Rattenmodell für Diabetes.
(A) Repräsentativer SD-OCT-Scan einer Netzhaut von einer Wistar-Ratte (Wildtyp-Kontrolle). (B) Repräsentativer SD-OCT-Scan einer Netzhaut von einer Goto-Kakizaki-Ratte (Diabetiker). Netzhautschichten: retinale Nervenfaserschicht (RNFL), innere plexiforme Schicht (IPL), innere Kernschicht (INL), äußere plexiforme Schicht (OPL), äußere Kernschicht (ONL), externe begrenzende Membran (ELM), innere Segmente / äußere Segmente (IS / OS), retinales Pigmentepithel (RPE) und Gesamtnetzhautdicke (TRT). (C-D) Quantifizierung der RNFL (C) und der Gesamtnetzhautdicke (D) in der Netzhaut von Wistar und Goto-Kakizaki, wobei die Mittellinie der Mittelwert und die schattierte Fläche das REM für alle vier Quadranten ist (Sup, Superior; Temp, Temporal; Inf, minderwertig; Nas, Nasal) der peripheren Netzhaut (1,2 mm vom Sehnervenkopf). ** p < 0,01, *** p < 0,001. Diese Abbildung wurde von Allen et al. modifiziert.13Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Verwendung von SD-OCT zur Bewertung der axialen Länge in einem Mausmodell der Myopie.
SD-OCT-Bilder des ganzen Auges von Wildtyp-Mausaugen (A) und Bmal1-/- (B) im Alter von 84 Tagen. Die Augen von Bmal1-/- Mäusen haben eine deutlich längere Achsenlänge als die Wildtyp-Augen (C). AL: axiale Länge; RT: Netzhautdicke; VCD: Glaskammertiefe; LT: Linsenstärke; ACD: Vorderkammertiefe; CT: Hornhautdicke. Die lange vertikale Linie zeigt axiale Längengrenzen (oben und unten durch horizontale Linie gekennzeichnet) für das Wildtyp-Auge. Der kurze Pfeil zeigt die hintere axiale Längenmarkierung für das Bmal1-/- Auge an. Mittlere ± SEM. Die mittlere Linie in der Mitte jedes Bildes (A&B) ist ein vertikales Sättigungsartefakt. Es wird normalerweise als Leitfaden verwendet, um das Auge zu zentrieren, aber wenn der Scan gut ausgerichtet ist, kann er zum Verschwinden gebracht werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die hochauflösende Bildgebung von Augenstrukturen in vivo ermöglicht die Beurteilung von Netzhaut- und Augenveränderungen im Laufe der Zeit. In diesem Protokoll wurde gezeigt, dass SD-OCT Unterschiede in den Augenstrukturen in vivo in Modellen der Netzhautdegeneration, des Glaukoms, der diabetischen Retinopathie und der Myopie erfasst.
Der kritischste Aspekt bei der Durchführung von SD-OCT ist es, ein klares Bild der Netzhaut oder einer anderen Augenstruktur von Interesse zu erhalten. Es ist wichtig, sich Zeit zu nehmen, um sicherzustellen, dass die Netzhaut perfekt zentriert ist und eine ausgezeichnete Klarheit aufweist. Starkes Atmen durch das Nagetier kann zu verrauschten Bildern führen (die Netzhaut kann tatsächlich gesehen werden, wie sie auf dem Bildschirm wackelt). Dies geschieht manchmal, wenn ein Tier nach der Verabreichung von Anästhesien nicht vollständig bewusstlos ist. Um dieses Problem zu umgehen, können mehrere B-Scans gemittelt werden, um zu visualisieren, wo sich die Grenzen der Netzhautschichten befinden, und dann kann das beste einzelne B-Scan-Bild analysiert werden.
Ein weiterer häufiger Fehler ist, dass das Auge zu trocken oder zu nass ist. Dies kann leicht überprüft werden, indem ein zusätzlicher Tropfen Kochsalzlösung aufgetragen, mit einem Labortuch abtransportiert und beurteilt wird, ob sich die Klarheit des Bildes verbessert hat. Eine Überlegung, die bei der Markierung von Netzhautschichtdicken auf SD-OCT-Bildern zu berücksichtigen ist, ist die Markierung der RNFL. Während es bei einigen Nagetier-OCTs möglich ist, zwischen RNFL und GCL zu unterscheiden, sind diese beiden Schichten oft nicht zu unterscheiden. Aus Gründen der Konsistenz markieren wir die gesamte RNFL-Region (RNFL + GCL, wenn sichtbar) als RNFL. Einige Studien berichten von RNFL und GCL als separate Schichten oder kombinieren die GCL und die innere plexiforme Schicht16,17,18, obwohl diese Forschung typischerweise bei Menschen durchgeführt wurde, die viel größere Augen haben als Nagetiere. Die Angabe der RNFL-Dicke ist typischer in Nagetierstudien11,13,19,20. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass sehr geringfügige Änderungen in der Markierung eine sehr große Veränderung verursachen können, insbesondere bei Myopie aufgrund der geringen Größe der zu messenden Strukturen. Zum Beispiel ist ein Messunterschied von 6 μm gleich einer Dioptrienänderung des Brechungsfehlers21. Da geringfügige Änderungen einen so großen Unterschied bei der Messung machen, ist die Bildschärfe von entscheidender Bedeutung.
Eine Einschränkung dieses Protokolls und von SD-OCT im Allgemeinen besteht darin, dass für ein gutes Bild klare Augenmedien erforderlich sind. Zum Beispiel können Hornhautläsionen, Linsenanomalien und Katarakte verhindern, dass Benutzer klare Bilder erhalten. Dies ist ein Problem insbesondere bei der Bildgebung der diabetischen Retinopathie, da sich bei diabetischen Nagetieren häufig Katarakte entwickeln22. Wenn der Katarakt oder ein anderes Augenproblem klein ist, ist es manchmal möglich, den Scankopf um ihn herum zu manövrieren. Bei größeren Störungen der okulären Medien sind retinale OCT-Bilder nicht zu erhalten. Diese Netzhäute könnten immer noch histologisch untersucht werden, da die Netzhauthistologie nicht von klaren Augenmedien abhängig ist.
Eine weitere Einschränkung ist die Tatsache, dass hyperreflektierende Läsionen, wie Exsudate und Blutungen, sowie große Netzhautgefäße zu einer Abschattung der darunter liegenden Netzhautstrukturen führen und dadurch Details der zugrunde liegenden Morphologie verloren gehen. In einem Fall mit choroidaler neovaskulärer Membran und diabetischer Retinopathie/Makulaödem, bei dem die Netzhautdicke über 400 μm betrug, war es schwierig, die zugrunde liegende Pathologie und Aderhaut23 zu erkennen. Darüber hinaus kann SD-OCT nur zur Beurteilung der Dicke an bestimmten Stellen verwendet werden. SD-OCT hat auch eine begrenzte Eindringtiefe für die Abbildung der Aderhaut und für die Abbildung ganzer Augen (das ganze Auge kann bei einer Maus abgebildet werden, aber nicht bei größeren Tieren). Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass fluoreszierende oder andere Marker nicht wie bei der Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (SLO) mit SD-OCT verwendet werden können. Typische SLO-Geräte erlauben jedoch nicht die Visualisierung von Netzhautschichten im Querschnitt mit der gleichen Leichtigkeit, die bei SD-OCT beobachtet wird. Schließlich ist die Auflösung mit SD-OCT nicht perfekt. Es ist jedoch viel besser als die Auflösung, die zu Beginn von SD-OCT verfügbar war, und wird im Laufe der Zeit weiter verbessert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Vorteile und die Bedeutung der SD-OCT-Technik darin bestehen, dass sie die In-vivo-Bildgebung von Augenstrukturen und die quantitative Verfolgung von Änderungen der Augenabmessungen im Laufe der Zeit ermöglicht und dass sie diese Bildgebung mit hoher Scangeschwindigkeit durchführt. Aufgrund der hohen Auflösung von SD-OCT kann es verwendet werden, um feine Unterschiede zu erkennen, die mit bloßem Auge nicht wahrnehmbar sind (Abbildung 4 und Abbildung 5). Darüber hinaus ist SD-OCT ein nützliches Werkzeug, um mehrere Parameter des Auges in einer Reihe von Krankheits- und Verletzungsmodellen zu messen. Allein in diesem Protokoll wurde SD-OCT verwendet, um die Netzhautdicke in Modellen der Netzhautdegeneration und diabetischen Retinopathie, die Netzhautdicke und das Schröpfen in einem Glaukommodell und die axiale Länge in einem Myopiemodell zu messen. SD-OCT kann auch verwendet werden, um die Hornhautverkrümmung 24 zu messen, Netzhautveränderungen nach Blasten und traumatischen Hirnverletzungen zu beurteilen 19,25,26, Pathologien bei altersbedingter Makuladegeneration 27 zu identifizieren und die Netzhautgesundheit während und nach Augeninjektionen 28 und die Netzhautplatzierung von Prothesen wie subretinalen Implantaten 29 zu überwachen. Es kann auch in anderen Tiermodellen wie Baumspitzmäusen30 und nichtmenschlichen Primaten31 verwendet werden. SD-OCT kann auch verwendet werden, um die retinale Pathologie basierend auf dem Quadranten (superior, inferior, nasal, temporal) und der Lage (zentral vs. peripher) zu lokalisieren. Die zukünftigen SD-OCT-Geräte werden eine noch höhere Auflösung erreichen. Darüber hinaus ermöglicht die OCT-Angiographie die Bildgebung der retinalen und choroidalen Mikrovaskulatur durch die Reflexion von Laserlicht von der Oberfläche der roten Blutkörperchen, während sie sich durch das retinale Gefäßsystem bewegen32,33.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Department of Veterans Affairs Rehab R&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) an RSA, Merit Award (RX002615) und Research Career Scientist Award (RX003134) an MTP, Career Development Award (CDA-2, RX002342) an AJF, EY028859 an MTP, NEI Core Grant P30EY006360, Forschung zur Verhinderung von Blindheit und Foundation Fighting Blindness.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% tropicamide | Sandoz | Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59 | |
| 0.5% tetracaine | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| AIM-RAS G3 120 V | Leica Bioptigen | 90-AIMRAS-G3-120 | Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice |
| Celluvisc gel | REFRESH CELLUVISC | #4554; NDC-0023-4554-30 | |
| G3 18 mm Telecentric Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-18 | |
| G3 Mouse Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-M | |
| G3 Rat Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-R | |
| heating pad | Fabrication | 11-1130 | |
| InVivoVue software | Leica Bioptigen | Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system | |
| MATLAB | Mathworks | mathematical modeling program | |
| Mouse/Rat Kit | Leica Bioptigen | 90-KIT-M/R | Mouse/rat rodent alignment system |
| saline | ADDIPAK | 200-39 | |
| System Envisu R4300 VHR 120 V | Leica Bioptigen | 90-R4300-V1-120 | SD-OCT system |
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