Summary
Здесь мы описываем использование спектрально-доменной оптической когерентной томографии (SD-OCT) для визуализации структур сетчатки и глаз in vivo в моделях дегенерации сетчатки, глаукомы, диабетической ретинопатии и близорукости.
Abstract
Спектрально-доменная оптическая когерентная томография (SD-OCT) полезна для визуализации структур сетчатки и глаз in vivo. В исследованиях SD-OCT является ценным инструментом для оценки и характеристики изменений в различных моделях заболеваний сетчатки и глаз и травм. В моделях дегенерации сетчатки, индуцированных светом, SD-OCT может использоваться для отслеживания истончения слоя фоторецептора с течением времени. В моделях глаукомы SD-OCT может использоваться для мониторинга уменьшения слоя нервных волокон сетчатки и общей толщины сетчатки, а также для наблюдения за купированием зрительного нерва после индуцирования глазной гипертензии. У грызунов с диабетом SD-OCT помог исследователям наблюдать уменьшение общей толщины сетчатки, а также уменьшение толщины определенных слоев сетчатки, особенно слоя нервных волокон сетчатки с прогрессированием заболевания. В мышиных моделях близорукости SD-OCT можно использовать для оценки осевых параметров, таких как изменения осевой длины. Преимущества SD-OCT включают в себя визуализацию глазных структур in vivo, возможность количественно отслеживать изменения размеров глаза с течением времени, а также его быструю скорость сканирования и высокое разрешение. Здесь мы подробно описываем методы SD-OCT и показываем примеры его использования в нашей лаборатории в моделях дегенерации сетчатки, глаукомы, диабетической ретинопатии и близорукости. Методы включают анестезию, визуализацию SD-OCT и обработку изображений для измерения толщины.
Introduction
Спектрально-доменная оптическая когерентная томография (SD-OCT) является точной модальностью визуализации с высоким разрешением, которая позволяет клиницистам и исследователям исследовать глазные структуры неинвазивно. Этот метод визуализации основан на интерферометрии для захвата трехмерных изображений сетчатки in vivo в микрометровом масштабе 1,2. Он стал одним из наиболее часто используемых методов визуализации в исследованиях зрения и в клинике из-за легкого обнаружения и точности патологических особенностей, таких как структурные дефекты и / или истончение слоев сетчатки и субретинальной жидкости3. В исследованиях с использованием животных моделей расстройств, связанных со зрением, SD-OCT предоставила необходимые неинвазивные анализы отношений между структурой и функцией и их гистопатологическим происхождением4. Благодаря своему разрешению (до 2-3 мкм, в зависимости от глубины в глаз5), SD-OCT обладает способностью обнаруживать даже небольшие изменения толщины слоя сетчатки. Этот тип анализа может предоставить важную информацию для прогрессирования заболевания и оценить эффективность нейропротекторных методов и методов лечения расстройств, связанных со зрением.
SD-OCT является неинвазивной альтернативой изучению структуры гистологически, и было показано, что они коррелируют6. Хотя SD-OCT не достигает клеточного разрешения, он позволяет проводить продольные исследования на животных. Это выгодно, потому что прогрессирование заболевания может отслеживаться у отдельных животных с течением времени, в отличие от необходимости усыплять животных в определенные моменты времени. По мере того, как методы визуализации продолжают совершенствоваться, технология SD-OCT также будет развиваться, обеспечивая улучшенное качество изображения, а также возможность оценивать биологические процессы, такие как функция кровеносных сосудов сетчатки в мельчайших деталях. Даже с момента своего появления в 1991 году технология SD-OCT добилась огромных успехов в разрешении, скорости и чувствительности7.
Настоящее исследование использует систему SD-OCT для количественной оценки изменений в слоях сетчатки в моделях дегенерации сетчатки, глаукомы и диабетической ретинопатии. Система SD-OCT, используемая здесь, представляет собой OCT-систему с доменом Фурье, которая использует маломощный ближний инфракрасный свет для получения, обработки и хранения изображений с глубинным разрешением в режиме реального времени. Система SD-OCT имеет расширенные возможности визуализации глубины в диапазоне длин волн 800 нм, обеспечивая глубину 8 мм и разрешение 4 мкм. При обнаружении домена Фурье интерференционный сигнал между рассеянным светом от ткани и эталонным путем преобразуется Фурье для построения осевых сканирований и/или осевых профилей глубины рассеянной интенсивности8. Для исследований здесь пучок OCT сканируется над желаемой структурой сетчатки при последовательном получении осевого сканирования. Как правило, шаблон сканирования получает двумерную сетку (B-Scans) в виде коллекции линейных одномерных линий сканирования (A-Scans), которые соответствуют 2D-изображениям поперечного сечения с использованием растрового шаблона сканирования. Для исследований, посвященных близорукости у мышей, эта система также используется для измерения размеров глазных структур (например, толщины роговицы, толщины хрусталика, глубины стекловидной камеры и осевой длины).
Текущая система позволяет пользователям разрабатывать свои собственные протоколы, создавая сканы, которые могут быть адаптированы и выбраны на основе интересующих глазных структур. Основные сканирования, представленные в этих пользовательских протоколах, делают этот метод обработки изображений удобным для пользователя. Для анализа изображений мы разработали индивидуальное программирование в программе математического моделирования. SD-OCT является мощным инструментом для неинвазивного выявления и количественной оценки патоморфологических изменений в глазных структурах и мониторинга прогрессирования заболеваний, связанных со зрением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные процедуры были одобрены Комитетом по институциональным делам ветеранов Атланты по уходу за животными и их использованию и соответствовали руководству Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (NIH Publications,8-е издание, обновлено в 2011 году).
ПРИМЕЧАНИЕ: Система SD-OCT, используемая для разработки протокола ниже, описана в Таблице материалов. Хотя некоторые из процедур специфичны для этой конкретной системы, общий подход может быть адаптирован для других устройств OCT и моделей животных. Кроме того, в нашей лаборатории эти протоколы обычно используются у мышей и крыс; однако общий подход может быть принят для различных моделей животных и устройств SD-OCT при условии, что человек имеет правильный объектив и возможности на своем устройстве.
1. Установка оборудования оптической когерентной томографии
- Откройте программное обеспечение SD-OCT (Таблица материалов).
- Определите, кто принимает ОКТ, исследование и группу лечения (если это уместно). Назовите эти категории таким образом, чтобы помочь исследователям искать желаемые сканы позже во время анализа данных.
- На вкладке Пациент/Экзамен щелкните Тестовый экзаменатор. Выберите имя экзаменатора. Используйте кнопку Setup Examiners & Physicians , чтобы добавить новых экспертов.
- Щелкните Название исследования , чтобы определить исследование. Перейдите на вкладку Исследование , чтобы добавить новое исследование или изменить методы лечения в существующем исследовании. Щелкните справа от Select Treatment Arm, чтобы выбрать лечебную руку.
- Нажмите кнопку Добавить пациента , которая используется для добавления новой временной точки для всей группы. Когда появится окно, введите идентификационный номер, имя и фамилию. Выберите Мужской или Женский. Введите дату рождения.
- Нажмите кнопку Добавить экзамен , чтобы добавить отдельных крыс. Чтобы идентифицировать крыс, нажмите на экзамен. Нажмите Изменить экзамен. Введите идентификационный номер в поле Введите примечания . Нажмите кнопку Сохранить изменения .
- Прикрепите к устройству соответствующий объектив (рисунок 1B), выберите соответствующую конфигурацию в программном обеспечении и наберите соответствующее положение опорного кронштейна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная система SD-OCT имеет настраиваемые линзы, предустановленные шаблоны сканирования и настройки эталонной руки , специфичные для вида животных и области изображения глаз (сетчатка или роговица, мышь или крыса). Некоторые из этих деталей относятся к описанной системе SD-OCT (см. таблицу материалов). Например, не все устройства предлагают ручную регулировку длины опорного кронштейна . - На вкладке Пациент/Экзамен дважды щелкните выделенный экзамен, чтобы перейти на вкладку Визуализация и начать визуализацию, или просто перейдите на вкладку Визуализация . Если есть сканирование по умолчанию, щелкните его правой кнопкой мыши, чтобы удалить его.
- Загрузите предустановленный протокол сканирования, нажав кнопку Выбрать протокол из списка . Кроме того, можно добавить отдельные сканы.
- Для крысиных моделей глаукомы и диабетической ретинопатии и мышиных моделей дегенерации сетчатки выберите предустановленный, состоящий из четырех изображений: 2 OD и 2 OS сканов. Для близорукости мыши выберите предустановку, состоящую из 8 изображений: 4 OD и 4 сканирования ОС.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предустановленная визуализация будет более подробно объяснена в разделе 3. Это то, что каждая лаборатория делает для себя или с производителем во время установки на месте.
2. Обезболить животное
- Вводят анестетик.
- Анестезируйте крыс кетамином (60 мг/кг) и ксилазином (7,5 мг/кг) с помощью внутрибрюшинной инъекции.
- Анестезируйте мышей кетамином (80 мг/кг) и ксилазином (16 мг/кг) с помощью внутрибрюшинной инъекции.
- Подождите, пока животные полностью обезболятся и не отреагируют на защемление пальцев ног.
- Вводят капли для расширения зрачка (1% тропикамида). Подождите, пока зрачки расширятся, прежде чем делать снимки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расширение зрачков увеличивает поле зрения, но не является обязательным требованием. Местные (роговичные) обезболивающие капли (0,5% тетракаина) для обезболивания глаза также следует использовать, если что-либо будет касаться глаза (например, при применении контактных линз или использовании направляющей). Гид - это устройство, которое размещается над сканирующей головкой и помогает новичкам выровнять глаз и сканированную голову. - После обезболивания грызуна поместите грызуна в систему выравнивания грызунов, которая может вращать животное в 3-мерном пространстве (рисунок 1A, 1C и 1D). Обеспечьте тепловую поддержку.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящее время мы используем системы выравнивания грызунов для мышей и крыс, разработанные и продаваемые с помощью устройства SD-OCT. - Нанесите жидкость (например, физиологический раствор или искусственные слезы), чтобы сохранить глаза смазанными. Убедитесь, что глаз не высыхает во время визуализации, чтобы оптические свойства глаза сохранялись между сканированиями (когда роговица влажная, сетчатка может быть хорошо видна).
- Убедитесь, что при сканировании первого глаза сохраняется влажность в противоположном глазу, чтобы он не пересыхал.
- Используйте деликатную салфетку, чтобы удалить избыток физиологического раствора непосредственно перед визуализацией, так как слишком много или слишком мало смазки на глазу повлияет на качество изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование стерильного смазочного геля не рекомендуется во время ОКТ, так как он может мешать визуализации. При необходимости после процедуры можно использовать стерильный смазочный гель. Контактные линзы также могут быть применены для обеспечения достаточной влажности глаза на протяжении всего теста. По нашему опыту, контактные линзы не обеспечили заметного улучшения качества изображения, но контактные линзы помогают снизить риск высыхания роговицы во время сеанса визуализации.
3. Oct визуализация грызунов
- Начните с одного глаза (OS или OD) и визуализируйте контралатеральный глаз после.
- Расположите животное, используя два вращательных движения системы выравнивания грызунов, так, чтобы взгляд был горизонтальным и смотрел вниз по оси объектива OCT (рисунок 1D).
- Используйте центр развертывания Office в режиме свободного выполнения, чтобы сориентировать сетчатку для сбора данных. Используйте режим Aim (нажав кнопку Aim ) изначально для непрерывного отображения как горизонтального, так и вертикального B-сканирования в режиме реального времени.
- Переместите сканирующую головку ближе к глазу, пока не станет видна сетчатка (поскольку линзы сетчатки мыши и крысы имеют фиксированный фокус, перемещение хрусталика к глазу фокусируется глубже в сетчатке). Затем используйте систему выравнивания грызунов для регулировки положения животного вверх / вниз и поворота / скручивания, чтобы расположить головку зрительного нерва в центре, сделать горизонтальное сканирование горизонтальным, а вертикальное сканирование вертикальным (рисунок 1A).
- Отрегулируйте рабочее расстояние таким образом, чтобы изображение сетчатки было плоским и не изогнутым.
- Отрегулируйте положение опорного кронштейна, чтобы изображение оставалось в верхней части окна дисплея. Будьте осторожны, чтобы не зайти слишком далеко, иначе изображение глаза перевернется обратно на себя.
- Визуализация сетчатки
- Для моделей глаукомы, дегенерации сетчатки и диабетической ретинопатии: определите объемное сканирование, состоящее из 1000 x 100 x 1 (сканирование A x сканирование B x повторное сканирование B) для усреднения. У крыс возьмите объем сканирования, который составляет 3 х 3 мм. У мышей выполните сканирование объемом 1,5 x 1,5 мм.
- Центрируйте зрительный нерв в горизонтальном и вертикальном доступе так, чтобы объем сканирования находился в центре. Потратьте время, чтобы убедиться, что головка зрительного нерва находится в центре сканирования и прямая вдоль носовой височной и верхне-нижней осей (рисунок 2). Сканируйте и перецентрируйте, чтобы убедиться, что он находится точно в центре, если это необходимо. Повторяйте это сканирование по мере необходимости, пока головка зрительного нерва не будет центрирована и выровнена вдоль обеих осей. Нажмите кнопку Снимок , чтобы сделать снимок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые устройства SD-OCT имеют возможность оптического манипулирования кривизной глаза (например, изображение сплющивается) путем регулировки расстояния глаза от источника света с помощью опорного рычага. Мы рекомендуем сглаживать и центрировать изображения при проведении прямых измерений толщины через слои сетчатки для повышения точности вдоль передне-заднего направления. - Нажмите кнопку Сохранить , чтобы сохранить изображение.
- Возьмите радиальное сканирование, центрированное на головке зрительного нерва, которое составляет 1000 x 4 x 20 (A-scan x B-scan x повторные B-сканирования). Используйте повторное сканирование B для повышения четкости изображения глаза или сетчатки, что поможет интерпретировать области глаза или слои сетчатки во время анализа данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, у крыс это радиальное сканирование составляет 3 мм, в то время как у мышей радиальное сканирование составляет 1,5 мм. - Сохраните изображение.
- Повторите шаги с 3.1 по 3.2.5 в контралатеральном глазу.
- Измерение осевой длины
- Для проектов, которые включают визуализацию всего глаза, таких как близорукость мыши, сделайте три сканирования всего глаза и одно сканирование сетчатки для каждого глаза. Выберите предустановку, состоящую из радиального сканирования размером 500 x 20 x 1 и охватывающего весь диаметр глаза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта настройка обеспечивает изображение всей длины глаза мыши от роговицы до сосудистой оболочки. - Центрирование середины глаза и сетчатки в поле зрения. Выполните три радиальных сканирования (сканирование всего глаза): линейное сканирование B с разрешением 1000 x 5 x 2 и два дополнительных линейных сканирования B 1000 x 5 x 2 в том же месте. Сохраните изображения.
- После этого, при желании, увеличьте масштаб и сделайте объемное или прямоугольное сканирование (сканирование сетчатки), аналогичное описанию в 3.2, которое состоит из сканирования 1000 x 20 A x B. Сохраните сканирование тома.
- Повторите шаги с 3.3 по 3.3.3 в контралатеральном глазу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения осевой длины возможны только на маленьких глазах (мышиных или меньших), поскольку окно визуализации современных систем недостаточно велико, чтобы захватить больший глаз.
- Для проектов, которые включают визуализацию всего глаза, таких как близорукость мыши, сделайте три сканирования всего глаза и одно сканирование сетчатки для каждого глаза. Выберите предустановку, состоящую из радиального сканирования размером 500 x 20 x 1 и охватывающего весь диаметр глаза.
4. Этапы после создания изображений
- Храните сохраненные данные в облаке, что является хорошей практикой для управления данными и обеспечивает легкий доступ для последующего анализа. Выполняйте анализ данных с помощью пользовательского программного обеспечения, разработанного в программе математического моделирования (Таблица материалов).
- Удалите грызуна из системы выравнивания грызунов и сделайте внутрибрюшинную инъекцию атипамезола (1 мг / кг для крыс и мышей), чтобы обратить вспять эффекты ксилазина, чтобы грызун просыпался быстрее.
- Позвольте грызунам восстановиться на грелке на слабом огне. Давайте дополнительные солевые капли по мере необходимости. Верните грызунов в их домашнюю клетку, когда они восстановят полную амбулацию.
- Закройте программу и выключите центр развертывания Office.
5. Постобработка изображений OCT
- Обрабатывайте изображения с помощью пользовательского программного обеспечения, разработанного в программе математического моделирования в соответствии с конкретными потребностями OCT (например, измерьте толщину интересующих областей, вручную отмечая изображения).
- В зависимости от назначения изображения (сетчатка мыши, сетчатка крысы или близорукость /осевая длина), используйте одну из трех различных программ:
- Для обработки сетчатки выберите сканирование центра развертывания Office для загрузки. Во-первых, определите центр головки зрительного нерва простым щелчком.
- Посмотрите, как программа генерирует вертикальные линии, определяющие расстояния по обе стороны головки зрительного нерва. Обратите внимание, что в сетчатке крыс эти линии находятся на расстоянии 0,5 мм и 1,2 мм от центра головки зрительного нерва, в общей сложности 4 вертикальные линии, представляющие носовую и нижнюю верхнюю оси глаза в зависимости от анализируемого в настоящее время радиального сканирования B.
ПРИМЕЧАНИЕ: В сетчатке мыши эти вертикальные линии находятся на расстоянии 0,25 мм и 0,5 мм от центра головки зрительного нерва. - Очертите следующие слои вдоль каждой строки:
Слой нервных волокон сетчатки (RNFL), внутренний плексиформный слой (IPL), внутренний ядерный слой (INL), внешний плексиформный слой (OPL), внешний ядерный слой (ONL), внешняя ограничивающая мембрана (ELM), внутренние сегменты / внешние сегменты (IS / OS), пигментный эпителий сетчатки (RPE) и общая толщина сетчатки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Радиальное сканирование обычно не имеет носовых/временных и верхних/нижних меток при открытии. Сканы могут быть созданы таким образом, чтобы они имели ориентацию n/t и s/I, и эти сканы, в частности, анализируются позже. - После того, как изображение было очерчено и программа закрыта, экспортируйте эти измерения в программное обеспечение для анализа данных.
- Используйте эти значения длины и толщины из шага 5 для сравнения между группами, например, определения наличия региональных различий (н/т/с/и) или продольных изменений.
- Для измерений сетчатки сначала определите, есть ли какие-либо различия в носовой височной и нижней верхней оси на расстояниях 0,5 мм и 1,2 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если различия в квадрантах не наблюдаются, измерения 0,5 мм и 1,2 мм могут быть усреднены вместе. Это аналогичный подход для сканирования сетчатки мыши только на 0,25 мм и 0,5 мм. - Для исследований близорукости используйте эту программу для оценки глазных параметров вдоль оптической оси глаза. Откройте программу математического моделирования. Сначала выберите изображение для загрузки.
- После загрузки изображения вручную отметьте каждое сканирование (радиальное и B-сканирование). Отметьте передний и задний края роговицы, хрусталика, стекловидной камеры и сетчатки, чтобы программа рассчитала толщину роговицы, толщину хрусталика, глубину передней и стекловидной камеры, общую толщину сетчатки, общую осевую длину.
- После отметки выйдите из программы, которая запрашивает меню сохранения. Сохраните очерченные значения в программном обеспечении для работы с электронными таблицами и усредните три отдельных сканирования вместе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SD-OCT считается успешным, если получены высококачественные изображения, позволяющие надежно измерить размеры глаза. Здесь различные применения SD-OCT проиллюстрированы с использованием моделей дегенерации сетчатки, глаукомы, диабетической ретинопатии и близорукости.
В модели световой дегенерации сетчатки (LIRD) воздействие яркого света (10 000 люкс) вызывает дегенерацию фоторецепторных клеток в сетчатке9. Репрезентативные изображения SD-OCT показывают более тонкий внешний ядерный слой, который содержит тела фоторецепторных клеток, в сетчатке мышей LIRD BALB / c по сравнению с неповрежденными (контрольными) мышами (рисунок 3A & 3B). После количественной оценки толщины слоя сетчатки наблюдалась значительная разница между неповрежденными мышами и мышами LIRD по общей толщине сетчатки (рисунок 3C), толщине внешнего ядерного слоя (рисунок 3D) и толщине IS/OS (рисунок 3E).
Для экспериментального моделирования глаукоматозного повреждения мы использовали модель глазной гипертензии (OHT)10. Короче говоря, крысы коричневой норвегии (n = 35) получали инъекцию гипертонического физиологического раствора в лимбозную вену одного глаза, в то время как контралатеральный глаз служил внутренним контролем11. Для исследований глаукомы мы количественно определили толщину слоя нервных волокон сетчатки (RNFL). После 8 недель OHT мы наблюдали отчетливое ремоделирование в головке зрительного нерва, включая купирование зрительного нерва (рисунок 4A & B). Затем мы количественно оценили толщину RNFL и обнаружили истончение RNFL после 8 недель OHT по сравнению с исходными измерениями (рисунок 4C).
Для моделирования диабетической ретинопатии крысы Гото-Какидзаки, не ожирение, полигенная модель диабета, которая развивает гипергликемию уже в возрасте 2-3 недель, были использованы12,13. Сетчатки у крыс Гото-Какизаки и крыс Вистар (контрольная группа без диабета) были визуализированы с использованием SD-OCT (рисунок 5A & 5B). В возрасте 6 недель РНФЛ и общая толщина сетчатки были снижены у крыс Гото-Какизаки по сравнению с крысами Wistar в центральной сетчатке (данные не показаны) и периферической сетчатке (рисунок 5C & 5D). Наибольшие различия наблюдались в нижнем и височном квадрантах сетчатки (рисунок 5C&5D).
Чтобы оценить мышиные модели близорукости, осевая длина была измерена у мышей Bmal1-/-. Bmal1 является часовым геном, представляющим интерес, потому что циркадные ритмы могут играть роль в развитии близорукости14,15. Осевая длина глаза мыши Bmal1-/- (рисунок 6B) заметно длиннее, чем глаз дикого типа (рисунок 6A) на изображениях OCT. Количественная оценка осевой длины подтверждает, что мыши Bmal1-/- имеют значительно более длинные осевые длины в возрасте 84 дней (рисунок 6C), показывая, что отсутствие часового гена способствует развитию близорукости.
Этот протокол генерировал изображения глазных структур в моделях дегенерации сетчатки, глаукомы, диабетической ретинопатии и близорукости. Изображения были достаточного качества, так что размеры глаз, включая внешний ядерный слой, слой нервных волокон сетчатки, общую толщину сетчатки и осевую длину, можно было количественно оценить. Результаты показали, что значительные различия в размерах глазных структур можно наблюдать in vivo с помощью SD-OCT.
Рисунок 1: Настройка оборудования SD-OCT.
(A) Изображение системы выравнивания грызунов и головки сканирования OCT. (B) Изображение крысиных и мышиных OCT-линз. (C) Изображение системы выравнивания грызунов мыши, иллюстрирующее ее способность перемещаться в 3-мерном пространстве. (D) Крупный план системы выравнивания грызунов, в частности ручки, которые контролируют его движение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сканирование образцов SD-OCT.
Изображение живого сканирования сетчатки мыши непосредственно перед объемным или радиальным сканированием. (A) изображает носово-височное выравнивание, в то время как (B) показывает выравнивание верхнего-нижнего. Как только сетчатка на этих двух изображениях прямая в соответствующих вертикальных или горизонтальных плоскостях, а зрительный нерв центрирован на обоих изображениях, мы приступаем к получению изображения SD-OCT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Использование SD-OCT для отслеживания истончения слоя фоторецептора с течением времени в мышиной модели дегенерации сетчатки.
(A) Репрезентативное SD-OCT сканирование неповрежденной (контрольной) сетчатки от мыши BALB/c. (B) Репрезентативное SD-OCT сканирование сетчатки у светоиндуцированной мыши BALB/c дегенерации сетчатки (LIRD). (С-Е) Количественная оценка общей толщины сетчатки (C), толщины наружного ядерного слоя (ONL) (D) и толщины внутреннего сегмента/наружного сегмента (IS/OS) (E) у неповрежденных мышей и мышей LIRD Balb/c. Среднее значение ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Используя SD-OCT, мы измерили уменьшение толщины слоя нервных волокон сетчатки и наблюдали купирование зрительного нерва после индуцирования глазной гипертензии на крысиной модели глаукомы.
(A) Репрезентативное SD-OCT сканирование сетчатки и головки зрительного нерва из глаза крысы, сделанное до индуцирования глазной гипертензии (исходный уровень: OHT). (B) SD-OCT сканирование той же сетчатки крысы после 8-недельного OHT (экспериментальная модель глаукомы). (C) Количественная оценка толщины слоя нервных волокон сетчатки (RNFL) на исходном уровне по сравнению с OHT глаз. Среднее ± SEM. Эти данные были изменены из Feola et al.11Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Использование SD-OCT для наблюдения за уменьшением общей толщины сетчатки, а также уменьшением толщины специфических слоев сетчатки в крысиной модели диабета.
(A) Репрезентативное SD-OCT сканирование сетчатки у крысы Wistar (wild-type control). (B) Репрезентативное SD-OCT сканирование сетчатки у крысы Гото-Какизаки (диабетика). Слои сетчатки: слой нервных волокон сетчатки (RNFL), внутренний плексиформный слой (IPL), внутренний ядерный слой (INL), наружный плексиформный слой (OPL), внешний ядерный слой (ONL), внешняя ограничивающая мембрана (ELM), внутренние сегменты / внешние сегменты (IS / OS), пигментный эпителий сетчатки (RPE) и общая толщина сетчатки (TRT). (С-Д) Количественная оценка RNFL (C) и общей толщины сетчатки (D) в сетчатке Wistar и Goto-Kakizaki, где центральная линия является средней, а затененная область - SEM для всех четырех квадрантов (Sup, Superior; Временная, временная; Инф, Нижний; Nas, Nasal) периферической сетчатки (1,2 мм от головки зрительного нерва). ** p < 0,01, *** p < 0,001. Этот рисунок был изменен из Allen et al.13Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Использование SD-OCT для оценки осевой длины в мышиной модели близорукости.
Изображения SD-OCT целых глаз глаз диких (A) и Bmal1-/- (B) мышей в возрасте 84 дней. Глаза мышей Bmal1-/- имеют значительно большую осевую длину, чем глаза дикого типа (C). AL: осевая длина; RT: толщина сетчатки; VCD: глубина стекловидной камеры; LT: толщина линзы; ACD: глубина передней камеры; КТ: толщина роговицы. Длинная вертикальная линия указывает границы осевой длины (сверху и снизу обозначены горизонтальной линией) для глаза дикого типа. Короткая стрелка указывает на маркировку задней осевой длины для глаза Bmal1-/- . Среднее ± SEM. Центральная линия посередине каждого изображения (A & B) представляет собой артефакт вертикальной насыщенности. Он обычно используется в качестве ориентира для центрирования глаза, но если сканирование хорошо выровнено, его можно заставить исчезнуть. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Визуализация глазных структур in vivo с высоким разрешением позволяет оценить изменения сетчатки и глаз с течением времени. В этом протоколе было продемонстрировано, что SD-OCT фиксирует различия в глазных структурах in vivo в моделях дегенерации сетчатки, глаукомы, диабетической ретинопатии и близорукости.
Наиболее важным аспектом при выполнении SD-OCT является получение четкого изображения сетчатки или другой глазной структуры, представляющей интерес. Важно потратить время, чтобы убедиться, что сетчатка идеально центрирована и имеет отличную четкость. Тяжелое дыхание грызуна может привести к шумным изображениям (сетчатку действительно можно увидеть, чтобы покачиваться на экране). Это иногда происходит, если животное не находится полностью без сознания после введения анестетика. Чтобы обойти эту проблему, можно усреднить несколько сканирований B, чтобы помочь визуализировать, где находятся границы слоев сетчатки, а затем можно проанализировать лучшее изображение сканирования B.
Еще одна распространенная ошибка заключается в том, что глаз слишком сухой или слишком влажный. Это можно легко проверить, нанеся дополнительную каплю физиологического раствора, удалив ее лабораторной салфеткой и оценив, улучшилось ли четкость изображения. При маркировке толщины слоя сетчатки на изображениях SD-OCT следует учитывать, как маркировать RNFL. Хотя можно дифференцировать RNFL и GCL на некоторых ОКТ грызунов, часто эти два слоя неразличимы. Для согласованности мы помечаем всю область RNFL (RNFL + GCL, когда она видна) как RNFL. В некоторых исследованиях сообщается, что RNFL и GCL являются отдельными слоями или объединяют GCL и внутренний плексиформный слой 16,17,18, хотя это исследование обычно проводилось на людях, у которых глаза намного больше, чем у грызунов. Отчетность о толщине RNFL более типична в исследованиях на грызунах 11,13,19,20. Другой важный вопрос заключается в том, что очень незначительные изменения в маркировке могут вызвать очень большие изменения, особенно при близорукости из-за небольшого размера измеряемых структур. Например, разница в измерении в 6 мкм равна диоптрии изменения погрешности преломления21. Поскольку небольшие изменения делают такую большую разницу в измерении, четкость изображения имеет решающее значение.
Ограничение этого протокола и SD-OCT в целом заключается в том, что для хорошего изображения требуются прозрачные глазные среды. Например, поражения роговицы, аномалии хрусталика и катаракта могут помешать пользователям получать четкие изображения. Это проблема при визуализации диабетической ретинопатии, в частности, поскольку катаракта обычно развивается у диабетических грызунов22. Если катаракта или другая глазная проблема невелика, иногда можно маневрировать сканирующей головкой вокруг нее. Для более крупных нарушений глазных сред изображения OCT сетчатки невозможно получить. Эти сетчатки все еще могут быть исследованы с использованием гистологии, поскольку гистология сетчатки не зависит от прозрачных глазных сред.
Еще одним ограничением является тот факт, что гиперрефлексивные поражения, такие как экссудаты и кровоизлияния, а также крупные сосуды сетчатки, приводят к затенению нижележащих структур сетчатки, и тем самым теряются детали основной морфологии. В случае с хориоидальной неоваскулярной мембраной и диабетической ретинопатией / макулярным отеком, когда толщина сетчатки составляла более 400 мкм, было трудно различить основную патологию и сосудистую оболочку23. Кроме того, SD-OCT можно использовать только для оценки толщины в определенных местах. SD-OCT также имеет ограниченную глубину проникновения для визуализации сосудистой оболочки и для визуализации целых глаз (весь глаз может быть изображен у мыши, но не у более крупных животных). Другим ограничением является то, что флуоресцентные или другие маркеры не могут использоваться с SD-OCT, как при сканирующей лазерной офтальмоскопии (SLO). Однако типичные устройства SLO не позволяют визуализировать слои сетчатки в поперечном сечении с той же легкостью, которая наблюдается при SD-OCT. Наконец, разрешение с SD-OCT не идеально. Тем не менее, он значительно улучшен по сравнению с разрешением, доступным в начале SD-OCT, и продолжает улучшаться с течением времени.
В заключение, преимущества и значение метода SD-OCT заключаются в том, что он позволяет получать in vivo визуализацию глазных структур и количественное отслеживание изменений размеров глаза с течением времени, и что он выполняет эту визуализацию с быстрой скоростью сканирования. Из-за высокого разрешения SD-OCT его можно использовать для обнаружения тонких различий, которые не наблюдаются невооруженным глазом (рисунок 4 и рисунок 5). Кроме того, SD-OCT является полезным инструментом для измерения нескольких параметров глаза в ряде моделей заболеваний и травм. Только в этом протоколе SD-OCT использовался для измерения толщины сетчатки в моделях дегенерации сетчатки и диабетической ретинопатии, толщины сетчатки и купирования в модели глаукомы и осевой длины в модели близорукости. SD-OCT также может быть использован для измерения искривления роговицы24, оценки изменений сетчатки после бластной и черепно-мозговой травмы 19,25,26, выявления патологии при возрастной макулярной дегенерации27 и мониторинга здоровья сетчатки во время и после глазных инъекций28 и установки протезов сетчатки, таких как субретинальные имплантаты 29. Он может быть использован в других животных моделях, таких как древесные землеройки30 и нечеловеческие приматы31. SD-OCT также может быть использован для локализации патологии сетчатки на основе квадранта (верхний, нижний, носовой, височный) и местоположения (центральный против периферического). Будущие устройства SD-OCT достигнут еще большего разрешения. Кроме того, ОКТ-ангиография позволяет визуализировать микроциркулятор сетчатки и хориоидального русла, используя отражение лазерного света от поверхности красных кровяных клеток, когда они движутся через сосудистую систему сетчатки32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана наградами Департамента по делам ветеранов rehab R&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; КДА-2; RX002928) для RSA, Merit Award (RX002615) и Research Career Scientist Award (RX003134) для MTP, Career Development Award (CDA-2, RX002342) для AJF, EY028859 для MTP, NEI Core Grant P30EY006360, Research to Prevention Blindness и Foundation Fighting Blindness.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% tropicamide | Sandoz | Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59 | |
| 0.5% tetracaine | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| AIM-RAS G3 120 V | Leica Bioptigen | 90-AIMRAS-G3-120 | Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice |
| Celluvisc gel | REFRESH CELLUVISC | #4554; NDC-0023-4554-30 | |
| G3 18 mm Telecentric Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-18 | |
| G3 Mouse Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-M | |
| G3 Rat Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-R | |
| heating pad | Fabrication | 11-1130 | |
| InVivoVue software | Leica Bioptigen | Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system | |
| MATLAB | Mathworks | mathematical modeling program | |
| Mouse/Rat Kit | Leica Bioptigen | 90-KIT-M/R | Mouse/rat rodent alignment system |
| saline | ADDIPAK | 200-39 | |
| System Envisu R4300 VHR 120 V | Leica Bioptigen | 90-R4300-V1-120 | SD-OCT system |
References
- Wojtkowski, M., et al. Ultrahigh-resolution, high-speed, Fourier domain optical coherence tomography and methods for dispersion compensation. Optics Express. 12 (11), 2404-2422 (2004).
- Nassif, N., et al. In vivo high-resolution video-rate spectral-domain optical coherence tomography of the human retina and optic nerve. Optics Express. 12 (3), 367-376 (2004).
- Theelen, T., Teussink, M. M. Inspection of the Human Retina by Optical Coherence Tomography. Methods in Molecular Biology. 1715, 351-358 (2018).
- Nakazawa, M., Hara, A., Ishiguro, S. I. Optical Coherence Tomography of Animal Models of Retinitis Pigmentosa: From Animal Studies to Clinical Applications. Biomed Research International. 2019, 8276140 (2019).
- Drexler, W., et al. Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography. Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).
- VanLeeuwen, J. E., et al. Altered AMPA receptor expression with treadmill exercise in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned mouse model of basal ganglia injury. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 650-668 (2010).
- Tian, J., et al. Performance evaluation of automated segmentation software on optical coherence tomography volume data. Journal of Biophotonics. 9 (5), 478-489 (2016).
- Kraus, M. F., et al. Motion correction in optical coherence tomography volumes on a per A-scan basis using orthogonal scan patterns. Biomedical Optics Express. 3 (6), 1182-1199 (2012).
- Boatright, J. H., et al. Tool from ancient pharmacopoeia prevents vision loss. Molecular Vision. 12, 1706-1714 (2006).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
- Goto, Y., Kakizaki, M., Masaki, N. Production of spontaneous diabetic rats by repetition of selective breeding. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 119 (1), 85-90 (1976).
- Allen, R. S., et al. Retinal Deficits Precede Cognitive and Motor Deficits in a Rat Model of Type II Diabetes. Investigative Ophthalmolology & Visual Science. 60 (1), 123-133 (2019).
- Stone, R. A., et al. Altered ocular parameters from circadian clock gene disruptions. PLoS One. 14 (6), 0217111 (2019).
- Chakraborty, R., et al. Circadian rhythms, refractive development, and myopia. Ophthalmic & Physiological Optics. 38 (3), 217-245 (2018).
- Davies, E. C., et al. Retinal ganglion cell layer volumetric assessment by spectral-domain optical coherence tomography in multiple sclerosis: application of a high-precision manual estimation technique. Journal of Neuro-ophthalmology. 31 (3), 260-264 (2011).
- Carnevali, A., et al. Optical coherence tomography angiography analysis of retinal vascular plexuses and choriocapillaris in patients with type 1 diabetes without diabetic retinopathy. Acta Diabetologica. 54 (7), 695-702 (2017).
- Springelkamp, H., et al. Population-based evaluation of retinal nerve fiber layer, retinal ganglion cell layer, and inner plexiform layer as a diagnostic tool for glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 8428-8438 (2014).
- Allen, R. S., et al. Long-Term Functional and Structural Consequences of Primary Blast Overpressure to the Eye. Journal of Neurotrauma. 35 (17), 2104-2116 (2018).
- Zhao, D., et al. Age-related changes in the response of retinal structure, function and blood flow to pressure modification in rats. Scientific Reports. 8 (1), 2947 (2018).
- Schmucker, C., Schaeffel, F. A paraxial schematic eye model for the growing C57BL/6 mouse. Vision Research. 44 (16), 1857-1867 (2004).
- Aung, M. H., Kim, M. K., Olson, D. E., Thule, P. M., Pardue, M. T. Early visual deficits in streptozotocin-induced diabetic long evans rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (2), 1370-1377 (2013).
- Puzyeyeva, O., et al. High-Resolution Optical Coherence Tomography Retinal Imaging: A Case Series Illustrating Potential and Limitations. Journal of Ophthalmology. 2011, 764183 (2011).
- Liu, A. S., et al. Topography and pachymetry maps for mouse corneas using optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 190, 107868 (2020).
- Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino, E., Kardon, R. H., Harper, M. M. Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (5), 3440-3450 (2013).
- Harper, M. M., et al. Blast-Mediated Traumatic Brain Injury Exacerbates Retinal Damage and Amyloidosis in the APPswePSENd19e Mouse Model of Alzheimer's Disease. Investigative Ophthalmology Visual Science. 60 (7), 2716-2725 (2019).
- Zhang, M., et al. Advanced image processing for optical coherence tomographic angiography of macular diseases. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4661-4675 (2015).
- Muhlfriedel, R., et al. Optimized Subretinal Injection Technique for Gene Therapy Approaches. Methods in Molecular Biology. 1834, 405-412 (2019).
- Adekunle, A. N., et al. Integration of Perforated Subretinal Prostheses With Retinal Tissue. Translational Vision Science & Technology. 4 (4), 5 (2015).
- Sajdak, B. S., et al. Noninvasive imaging of the tree shrew eye: Wavefront analysis and retinal imaging with correlative histology. Experimental Eye Research. 185, 107683 (2019).
- Dominik Fischer, M., et al. Detailed functional and structural characterization of a macular lesion in a rhesus macaque. Documenta Ophthalmologica. 125 (3), 179-194 (2012).
- Hagag, A. M., Gao, S. S., Jia, Y., Huang, D. Optical coherence tomography angiography: Technical principles and clinical applications in ophthalmology. Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (3), 115-129 (2017).
- Treister, A. D., et al. Prevalence of Subclinical CNV and Choriocapillaris Nonperfusion in Fellow Eyes of Unilateral Exudative AMD on OCT Angiography. Translational Vision Science & Technology. 7 (5), 19 (2018).
