Summary
Her beskriver vi brugen af spektraldomæne optisk kohærenstomografi (SD-OCT) til at visualisere retinale og okulære strukturer in vivo i modeller af retinal degeneration, glaukom, diabetisk retinopati og nærsynethed.
Abstract
Spektraldomæne optisk kohærenstomografi (SD-OCT) er nyttig til visualisering af retinale og okulære strukturer in vivo. I forskning er SD-OCT et værdifuldt værktøj til at evaluere og karakterisere ændringer i en række retinale og okulære sygdoms- og skademodeller. I lysinducerede retinale degenerationsmodeller kan SD-OCT bruges til at spore udtynding af fotoreceptorlaget over tid. I glaukom modeller, SD-OCT kan bruges til at overvåge nedsat retinal nerve fiber lag og total retinal tykkelse og til at observere optisk nerve cupping efter inducering okulær hypertension. Hos diabetiske gnavere har SD-OCT hjulpet forskere med at observere nedsat total retinal tykkelse samt nedsat tykkelse af specifikke retinale lag, især retinal nervefiberlag med sygdomsprogression. I musemodeller af nærsynethed kan SD-OCT bruges til at evaluere aksiale parametre, såsom aksiale længdeændringer. Fordelene ved SD-OCT inkluderer in vivo-billeddannelse af okulære strukturer, evnen til kvantitativt at spore ændringer i okulære dimensioner over tid og dens hurtige scanningshastighed og høje opløsning. Her beskriver vi metoderne til SD-OCT og viser eksempler på dets anvendelse i vores laboratorium i modeller af retinal degeneration, glaukom, diabetisk retinopati og nærsynethed. Metoder inkluderer anæstesi, SD-OCT-billeddannelse og behandling af billederne til tykkelsesmålinger.
Introduction
Spektraldomæne optisk kohærenstomografi (SD-OCT) er en præcis billeddannelsesmodalitet med høj opløsning, der gør det muligt for klinikere og forskere at undersøge okulære strukturer ikke-invasivt. Denne billeddannelsesteknik er baseret på interferometri til at optage tredimensionelle retinale billeder in vivo på en mikrometerskala 1,2. Det er blevet en af de hyppigst anvendte billeddannelsesmetoder i synsforskning og i klinikken på grund af den lette påvisning og nøjagtighed af patologiske træk såsom strukturelle defekter og / eller udtynding af retinale lag og subretinal væske3. I forskning ved hjælp af dyremodeller af synsrelaterede lidelser har SD-OCT leveret væsentlige ikke-invasive analyser af forholdet mellem struktur og funktion og deres histopatologiske oprindelse4. På grund af sin opløsning (op til 2-3 mikron, afhængigt af dybden i øjet5), SD-OCT har evnen til at detektere selv små ændringer i retinal lag tykkelse. Denne type analyse kan give vigtige oplysninger til sygdomsprogression og vurdere effektiviteten af neurobeskyttende metoder og behandlinger for synsrelaterede lidelser.
SD-OCT er et ikke-invasivt alternativ til at undersøge struktur histologisk, og de to har vist sig at være korreleret6. Mens SD-OCT ikke når cellulær opløsning, giver det mulighed for langsgående undersøgelser hos dyr. Dette er fordelagtigt, fordi sygdomsprogression kan spores hos individuelle dyr over tid i modsætning til at skulle aflive dyr på bestemte tidspunkter. Efterhånden som billeddannelsesteknikkerne forbedres, vil SD-OCT-teknologien også udvikle sig, hvilket giver forbedret billedkvalitet samt evnen til at vurdere biologiske processer såsom retinal blodkarfunktion i detaljer. Selv siden sin fremkomst i 1991 har SD-OCT-teknologien set enorme fremskridt inden for opløsning, hastighed og følsomhed7.
Denne undersøgelse anvender et SD-OCT-system til at kvantificere ændringer i retinale lag i gnavermodeller af retinal degeneration, glaukom og diabetisk retinopati. SD-OCT-systemet, der bruges her, er et Fourier-domæne OCT-system, der bruger laveffekt, nær-infrarødt lys til at erhverve, behandle og gemme dybdeopløste billeder i realtid. SD-OCT-systemet har udvidet dybdebilleddannelseskapacitet i 800 nm bølgelængdebåndet, hvilket giver 8 mm dybde og 4 μm opløsning. I Fourier-domænedetektion transformeres interferenssignalet mellem spredt lys fra vævet og en referencevej Fourier til at konstruere aksiale scanninger og / eller aksiale dybdeprofiler med spredt intensitet8. Til undersøgelserne her scannes OCT-strålen over den ønskede retinale struktur, mens den serielt erhverver aksiale scanninger. Typisk henter et scanningsmønster det todimensionelle gitter (B-scanninger) som en samling lineære endimensionelle scanningslinjer (A-scanninger), som svarer til 2D-tværsnitsbilleder ved hjælp af et rasterscanningsmønster. For undersøgelser med fokus på nærsynethed hos mus bruges dette system også til at måle dimensioner af okulære strukturer (f.eks. hornhindetykkelse, linsetykkelse, glaslegemedybde og aksial længde).
Det nuværende system giver brugerne mulighed for at designe deres egne protokoller og skabe scanninger, der kan skræddersys og vælges ud fra de okulære strukturer af interesse. De vigtigste scanninger i disse brugerdefinerede protokoller gør denne billedteknik brugervenlig. Til billedanalyser har vi udviklet skræddersyet programmering i et matematisk modelleringsprogram. SD-OCT er et kraftfuldt værktøj til ikke-invasivt at identificere og kvantificere patomorfologiske ændringer i okulære strukturer og overvåge synsrelateret sygdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne procedurer blev godkendt af Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee og i overensstemmelse med National Institutes of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr (NIH Publications, 8. udgave, opdateret 2011).
BEMÆRK: SD-OCT-systemet, der bruges til at udvikle nedenstående protokol, er beskrevet i materialetabellen. Mens nogle af procedurerne er specifikke for dette særlige system, kan den overordnede tilgang tilpasses til andet OLT-udstyr og dyremodeller. Desuden anvendes disse protokoller i vores laboratorium almindeligvis hos mus og rotter; den overordnede tilgang kan dog anvendes til forskellige dyremodeller og SD-OCT-enheder, forudsat at en person har den korrekte linse og kapacitet på deres enhed.
1. Opsæt det optiske kohærenstomografiudstyr
- Åbn SD-OCT-softwaren (Materialefortegnelse).
- Definer, hvem der tager OCT, undersøgelsen og behandlingsarmen (hvis relevant). Navngiv disse kategorier på en måde, der hjælper forskere med at søge efter de ønskede scanninger senere under dataanalyse.
- På fanen Patient/eksamen skal du klikke på Testeksaminator. Vælg navnet på eksaminatoren. Brug knappen Konfigurer eksaminatorer og læger til at tilføje nye eksaminatorer.
- Klik på Studienavn for at definere undersøgelsen. Klik på fanen Undersøgelse for at tilføje en ny undersøgelse eller ændre behandlinger i en eksisterende undersøgelse. Klik til højre for Vælg behandlingsarm for at vælge en behandlingsarm .
- Klik på knappen Tilføj patient , som bruges til at tilføje et nyt tidspunkt for en hel gruppe. Når vinduet vises, skal du indtaste id-nummer, fornavn og efternavn. Vælg Mand eller Kvinde. Indtast fødselsdatoen.
- Klik på knappen Tilføj eksamen for at tilføje de enkelte rotter. For at identificere rotterne skal du klikke på en eksamen. Klik på Rediger eksamen. Indtast id-nummeret i feltet Indtast noter . Klik på knappen Gem ændringer .
- Fastgør det korrekte objektiv til enheden (figur 1B), vælg den tilsvarende konfiguration i softwaren, og indtast den tilknyttede referencearmposition.
BEMÆRK: Det beskrevne SD-OCT-system har tilpassede linser, forudindstillede scanningsmønstre og referencearmindstillinger , der er specifikke for den dyreart og det øjenområde, der afbildes (nethinden eller hornhinden, musen eller rotten). Nogle af disse detaljer er specifikke for det beskrevne SD-OCT-system (se materialetabel). For eksempel tilbyder ikke alle enheder manuel justering af referencearmens banelængde. - På fanen Patient/eksamen skal du dobbeltklikke på den fremhævede eksamen for at gå videre til fanen Billedbehandling og begynde billedbehandling eller blot klikke på fanen Billedbehandling. Hvis der er en standardscanning, skal du højreklikke for at slette den.
- Indlæs en forudindstillet scanningsprotokol ved at klikke på knappen Vælg en protokol på listen . Alternativt kan du tilføje individuelle scanninger.
- For rottemodeller af glaukom og diabetisk retinopati og musemodeller af retinal degeneration skal du vælge en forudindstilling, der består af fire billeder: 2 OD- og 2 OS-scanninger. For musenærsynethed skal du vælge en forudindstilling, der består af 8 billeder: 4 OD- og 4 OS-scanninger.
BEMÆRK: Forudindstillet billeddannelse vil blive forklaret mere detaljeret i afsnit 3. Dette er noget, hvert laboratorium gør for sig selv eller med producenten under installationen på stedet.
2. Bedøv dyret
- Administrer bedøvelse.
- Bedøv rotter med ketamin (60 mg/kg) og xylazin (7,5 mg/kg) via intraperitoneal injektion.
- Bedøv mus med ketamin (80 mg / kg) og xylazin (16 mg / kg) via intraperitoneal injektion.
- Vent, indtil dyrene er fuldt bedøvet og ikke reagerer på tåklemmen.
- Administrer pupildilatationsdråber (1% tropamid). Vent på, at eleverne udvider sig, før de billeddannes.
BEMÆRK: Udvidelse af pupillerne øger synsfeltet, men er ikke et krav. Lokale (hornhinde) anæstetiske dråber (0,5% tetracain) for at bedøve øjet bør også bruges, hvis noget vil røre øjet (for eksempel hvis du anvender kontaktlinser eller bruger en guide). En guide er en enhed, der placeres over scanningshovedet og hjælper begyndere med at stille øjet og scanningshovedet op. - Efter bedøvelse af gnaveren skal du placere gnaveren i et gnaverjusteringssystem, der kan rotere dyret i 3-dimensionelt rum (figur 1A, 1C og 1D). Giv termisk støtte.
BEMÆRK: I øjeblikket bruger vi gnaverjusteringssystemer til mus og rotter designet og solgt med SD-OCT-enheden. - Påfør væske (f.eks. saltvand eller kunstige tårer) for at holde øjnene smurt. Sørg for, at øjet ikke tørrer ud under billeddannelsen, så øjets optiske egenskaber opretholdes mellem scanningerne (når hornhinden er våd, kan nethinden ses tydeligt).
- Sørg for at opretholde fugt i det modsatte øje, når du scanner det første øje, så det ikke tørrer ud.
- Brug en delikat opgaveserviet til at transportere overskydende saltvand væk lige før billeddannelse, da for meget eller for lidt smøremiddel på øjet vil påvirke billedkvaliteten.
BEMÆRK: Brug af steril smøremiddelgel anbefales ikke under OCT, da det kan forstyrre billeddannelsen. Om nødvendigt kan steril smøremiddelgel anvendes efter proceduren. En kontaktlinse kan også påføres for at sikre tilstrækkelig fugt på øjet under hele testen. Det er vores erfaring, at en kontaktlinse ikke gav en markant forbedring af billedkvaliteten, men kontaktlinser hjælper med at reducere risikoen for hornhindetørring under billedbehandlingen.
3. Gnaver OCT-billeddannelse
- Begynd med det ene øje (OS eller OD) og billede det kontralaterale øje efter.
- Placer dyret ved hjælp af de to rotationsbevægelser i gnaverjusteringssystemet, således at blikket er vandret og ser ned ad OCT-linsens akse (figur 1D).
- Brug OCT i Free Run-tilstand til at orientere nethinden til dataindsamling. Brug sigtetilstanden (ved at klikke på knappen Sigte ) i første omgang for at få en kontinuerlig visning af både vandrette og lodrette B-scanninger i realtid.
- Flyt scanningshovedet tættere på øjet, indtil nethinden er synlig (da muse- og rottenethindelinser er med fast fokus, fokuserer bevægelse af linsen mod øjet dybere ind i nethinden). Brug derefter gnaverjusteringssystemet til at justere dyrets position op/ned og dreje/vride for at placere synsnervehovedet i midten, gøre den vandrette scanning vandret og den lodrette scanning lodret (figur 1A).
- Juster arbejdsafstanden, så nethindebilledet er fladt og ikke buet.
- Juster referencearmens position for at holde billedet tæt på toppen af skærmvinduet. Pas på ikke at skubbe for langt ind, ellers vender øjenbilledet tilbage på sig selv.
- Nethindebilleddannelse
- For glaukom, retinal degeneration og diabetisk retinopati modeller: Definer en volumenscanning, der består af 1000 x 100 x 1 (A scanner x B scanner x gentagne B scanninger) for gennemsnit. Hos rotter skal du tage en volumenscanning, der er 3 x 3 mm. Hos mus skal du tage en 1,5 x 1,5 mm volumenscanning.
- Centrer synsnerven i vandret og lodret adgang, så volumenscanningen er i midten. Tag dig tid til at sikre, at synsnervehovedet er i centrum af scanningen og lige langs nasal-temporale og overlegne-ringere akser (figur 2). Scan og centrer igen for at sikre, at det er nøjagtigt i midten, hvis det er nødvendigt. Gentag denne scanning efter behov, indtil synsnervehovedet er centreret og justeret langs begge akser. Klik på knappen Snapshot for at tage et billede.
BEMÆRK: Nogle SD-OCT-enheder har mulighed for optisk at manipulere øjets krumning (f.eks. billedet er fladt) ved at justere øjets afstand fra lyskilden med referencearmen. Vi anbefaler, at du samkopierer og centrerer billederne, når du foretager målinger af direkte tykkelse gennem nethindelagene for at forbedre nøjagtigheden langs den forreste og bageste retning. - Klik på Gem knappen for at gemme billedet.
- Tag en radial scanning centreret ved synsnervehovedet, der er 1000 x 4 x 20 (A-scan x B-scan x gentagne B-scanninger). Brug gentagne B-scanninger til at forbedre billedets klarhed i øjet eller nethinden, hvilket vil hjælpe med at fortolke områder i øjet eller lag af nethinden under dataanalyse.
BEMÆRK: Igen, hos rotter er denne radiale scanning 3 mm, mens den radiale scanning hos mus er 1,5 mm. - Gem billedet.
- Gentag trin 3.1 til 3.2.5 i det kontralaterale øje.
- Målinger af aksial længde
- For projekter, der involverer billeddannelse af hele øjet, såsom musens nærsynethed, skal du tage tre scanninger af hele øjet og en nethindescanning for hvert øje. Vælg en forudindstilling, der består af en radial scanning, der er 500 x 20 x 1 og omfatter øjets fulde diameter.
BEMÆRK: Denne indstilling giver et billede af hele længden af museøjet fra hornhinden til choroid. - Centrer midten af øjet og nethinden i synsfeltet. Tag tre radiale scanninger (hele øjenscanninger): en lineær B-scanning, der er 1000 x 5 x 2 og to yderligere lineære B-scanninger på 1000 x 5 x 2 på samme sted. Gem billederne.
- Derefter, hvis det ønskes, zoome ind og tage en lydstyrke eller rektangulær scanning (retina scanning) svarende til beskrivelsen i 3.2, der består af 1000 x 20 A scanninger x B scanninger. Gem volumenscanningen.
- Gentag trin 3.3 til 3.3.3 i det kontralaterale øje.
BEMÆRK: Aksiallængdemålinger er kun mulige på små øjne (mus eller mindre), da billeddannelsesvinduet i nuværende systemer ikke er stort nok til at fange et større øje.
- For projekter, der involverer billeddannelse af hele øjet, såsom musens nærsynethed, skal du tage tre scanninger af hele øjet og en nethindescanning for hvert øje. Vælg en forudindstilling, der består af en radial scanning, der er 500 x 20 x 1 og omfatter øjets fulde diameter.
4. Trin efter billeddannelse
- Gem gemte data i en sky, hvilket er god praksis for datastyring og giver nem adgang til senere analyse. Udfør dataanalyse med brugerdefineret software udviklet i et matematisk modelleringsprogram (materialetabel).
- Fjern gnaveren fra gnaverjusteringssystemet og giv en intraperitoneal injektion af atipamezol (1 mg / kg for rotter og mus) for at vende virkningerne af xylazin, så gnaveren vågner hurtigere.
- Lad gnavere komme sig på en varmepude ved lav varme. Giv yderligere saltvandsdråber efter behov. Sæt gnavere tilbage i deres hjemmebur, når de har genvundet fuld ambulation.
- Luk programmet og sluk for OCT.
5. Efterbehandling af OLT-billeder
- Behandl billederne ved hjælp af brugerdefineret software udviklet i et matematisk modelleringsprogram, der passer til specifikke OCT-behov (f.eks. Mål tykkelsen af interesseområder ved manuelt at markere billederne).
- Afhængigt af billedets formål (musenethinden, rottenethinden eller nærsynethed/aksial længde) skal du bruge et af tre forskellige programmer:
- For at behandle nethinden skal du vælge de OCT-scanninger, der skal indlæses. Først skal du definere midten af synsnervehovedet med et enkelt klik.
- Se, når programmet genererer lodrette linjer, der definerer afstande på hver side af synsnervehovedet. Bemærk, at i rottenethinden er disse linjer 0,5 mm og 1,2 mm væk fra midten af synsnervehovedet, i alt 4 lodrette linjer, der repræsenterer øjets nasal-temporale og ringere overlegne akser afhængigt af den radiale B-scanning, der aktuelt analyseres.
BEMÆRK: I musens nethinde er disse lodrette linjer 0,25 mm og 0,5 mm fra synsnervens hovedcenter. - Afgræns følgende lag langs hver linje:
Det retinale nervefiberlag (RNFL), indre plexiformlag (IPL), indre nukleare lag (INL), ydre plexiformlag (OPL), ydre nukleare lag (ONL), ekstern begrænsende membran (ELM), indre segmenter / ydre segmenter (IS / OS), retinal pigmentepitel (RPE) og total retinal tykkelse.
BEMÆRK: Den radiale scanning har typisk ikke nasal/tidsmæssige og overlegne/ringere etiketter, når den åbnes. Scanninger kan oprettes således, at de har en n / t og s / I-retning, og især disse scanninger analyseres senere. - Når et billede er blevet afgrænset og programmet lukket, skal du eksportere disse målinger til et regnearkssoftware til dataanalyse.
- Brug disse længde- og tykkelsesværdier fra trin 5 til at foretage sammenligninger mellem grupper, f.eks. for at afgøre, om der er regionale forskelle (n/t/s/i) eller ændringer i længderetningen.
- Ved retinale målinger skal du først afgøre, om der er forskelle i nasal-temporale og ringere overlegne akser ved afstandene 0,5 mm og 1,2 mm.
BEMÆRK: Hvis forskelle i kvadranter ikke observeres, kan 0,5 mm og 1,2 mm målingerne beregnes som gennemsnit sammen. Dette er en lignende tilgang til musens retinale scanninger kun ved 0, 25 mm og 0, 5 mm. - Til nærsynethedsundersøgelser skal du bruge dette program til at vurdere de okulære parametre langs øjets optiske akse. Åbn det matematiske modelleringsprogram. Vælg først et billede, der skal indlæses.
- Når du har indlæst billedet, skal du manuelt markere hver scanning (radial- og B-scanninger). Marker de forreste og bageste kanter af hornhinden, linsen, glaslegemet og nethinden, så programmet beregner hornhindetykkelse, linsetykkelse, forreste og glasagtige kammerdybde, total retinal tykkelse, total aksial længde.
- Efter markering skal du afslutte programmet, der beder om en gemmenu. Gem de afgrænsede værdier i et regnearksprogram, og gennemsnit de tre separate scanninger sammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SD-OCT betragtes som vellykket, hvis der opnås billeder af høj kvalitet, således at okulære dimensioner kan måles pålideligt. Her illustreres en række anvendelser af SD-OCT ved hjælp af modeller af retinal degeneration, glaukom, diabetisk retinopati og nærsynethed.
I en lysinduceret retinal degeneration (LIRD) model, eksponering for stærkt lys (10.000 lux) inducerer degeneration af fotoreceptorceller i nethinden9. Repræsentative SD-OCT-billeder afslører et tyndere ydre kernelag, som indeholder fotoreceptorcellelegemerne, i nethinden fra LIRD BALB / c-mus sammenlignet med ubeskadigede (kontrol) mus (figur 3A & 3B). Efter kvantificering af retinallagets tykkelse blev der observeret en signifikant forskel mellem ubeskadigede mus og LIRD-mus for total retinal tykkelse (figur 3C), ydre nuklear lagtykkelse (figur 3D) og IS/OS-tykkelse (figur 3E).
For eksperimentelt at modellere glaukomatøs skade brugte vi en model af okulær hypertension (OHT)10. Kort fortalt fik brune norske rotter (n=35) en injektion af hypertonisk saltvand i limbusvenen i det ene øje, mens det kontralaterale øje fungerede som en intern kontrol11. Til glaukomundersøgelser kvantificerede vi retinal nervefiberlag (RNFL) tykkelse. Efter 8 ugers OHT observerede vi tydelig ombygning ved synsnervehovedet, herunder optisk nervecupping (figur 4A &). Vi kvantificerede derefter RNFL-tykkelsen og fandt RNFL-udtynding efter 8 ugers OHT sammenlignet med baseline-målinger (figur 4C).
Til model af diabetisk retinopati blev Goto-Kakizaki-rotter, en ikke-overvægtig, polygen model for diabetes, der udvikler hyperglykæmi så tidligt som 2-3 uger, brugt12,13. Nethinder fra Goto-Kakizaki rotter og Wistar rotter (ikke-diabetiske kontroller) blev afbildet ved hjælp af SD-OCT (figur 5A &5B). Ved 6 ugers alderen blev RNFL og total retinal tykkelse reduceret hos Goto-Kakizaki rotter sammenlignet med Wistar rotter i den centrale nethinden (data ikke vist) og den perifere nethinde (figur 5C&5D). De største forskelle blev observeret i nethindens nedre og tidsmæssige kvadranter (figur 5C&5D).
For at evaluere musemodeller for nærsynethed blev aksial længde målt i Bmal1-/- mus. Bmal1 er et urgen af interesse, fordi cirkadiske rytmer kan spille en rolle i nærsynethedudvikling 14,15. Den aksiale længde af Bmal1-/- museøjet (figur 6B) er synligt længere end vildtypeøjet (figur 6A) på OCT-billederne. Kvantificering af den aksiale længde bekræfter, at Bmal1-/- mus har signifikant længere aksiale længder ved 84 dages alderen (figur 6C), hvilket viser, at manglen på urgenet bidrager til udvikling af nærsynethed.
Denne protokol genererede billeder af okulære strukturer i modeller af retinal degeneration, glaukom, diabetisk retinopati og nærsynethed. Billeder var af tilstrækkelig kvalitet, således at okulære dimensioner, herunder ydre nukleare lag, retinal nervefiberlag, total retinal tykkelse og aksial længde, kunne kvantificeres. Resultaterne viste, at signifikante forskelle i dimensionerne af okulære strukturer kunne observeres in vivo ved anvendelse af SD-OCT.
Figur 1: Opsætning af SD-OCT-udstyr.
(A) Billede af gnaverjusteringssystem og OCT-scanningshoved. (B) Billede af OCT-linser med rotter og mus. (C) Billede af musens gnaverjusteringssystem, der illustrerer dets evne til at bevæge sig i 3-dimensionelt rum. (D) Nærbillede af gnaverjusteringssystemet, specifikt de knapper, der styrer dets bevægelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: SD-OCT-prøvescanning.
Billede af en live scanning af musens nethinde lige før du tager en lydstyrke eller radial scanning. (A) viser nasal-temporale justering, mens (B) viser den overlegne-ringere justering. Når nethinden i disse to billeder er lige i deres respektive lodrette eller vandrette planer, og synsnerven er centreret i begge billeder, fortsætter vi med at erhverve SD-OCT-billedet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Brug af SD-OCT til at spore udtynding af fotoreceptorlaget over tid i en musemodel af retinal degeneration.
(A) Repræsentativ SD-OCT-scanning af en ubeskadiget (kontrol) nethinde fra en BALB/c-mus. (B) Repræsentativ SD-OCT-scanning af en nethinde fra en lysinduceret retinal degeneration (LIRD) BALB/c-mus. (C-E) Kvantificering af total retinal tykkelse (C), ydre kernelag (ONL) tykkelse (D) og indre segment / ydre segment (IS/OS) tykkelse (E) i ubeskadigede og LIRD Balb / c mus. Gennemsnitlig ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Ved hjælp af SD-OCT målte vi et fald i retinal nervefiberlagtykkelse og observerede optisk nervecupping efter inducering af okulær hypertension i en rottemodel af glaukom.
(A) Repræsentativ SD-OCT-scanning af et nethinden og synsnervehovedet fra et rotteøje taget før inducering af okulær hypertension (baseline: OHT). (B) SD-OCT-scanning af den samme rottenethinde efter 8 ugers OHT (eksperimentel model af glaukom). (C) Kvantificering af retinal nervefiberlag (RNFL) tykkelse ved baseline sammenlignet med OHT-øjne. Gennemsnitlig ± SEM. Disse data er blevet ændret fra Feola et al.11Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Brug af SD-OCT til at observere nedsat total retinal tykkelse samt nedsat tykkelse af specifikke retinale lag i en rottemodel af diabetes.
(A) Repræsentativ SD-OCT-scanning af en nethinde fra en Wistar-rotte (vildtypekontrol). (B) Repræsentativ SD-OCT-scanning af en nethinde fra en Goto-Kakizaki (diabetiker) rotte. Nethindelag: retinal nervefiberlag (RNFL), indre plexiformlag (IPL), indre kernelag (INL), ydre plexiformlag (OPL), ydre nukleare lag (ONL), ekstern begrænsende membran (ELM), indre segmenter / ydre segmenter (IS / OS), retinal pigmentepitel (RPE) og total retinal tykkelse (TRT). (C-D) Kvantificering af RNFL (C) og total retinal tykkelse (D) i Wistar og Goto-Kakizaki nethinder, hvor den centrale linje er middelværdien, og det skraverede område er SEM for alle fire kvadranter (Sup, Superior; Temp, tidsmæssig; inf, ringere; Nas, Nasal) i den perifere nethinden (1,2 mm fra synsnervehovedet). ** p < 0,01, *** p < 0,001. Denne figur er blevet ændret fra Allen et al.13Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Brug af SD-OCT til at evaluere aksial længde i en musemodel af nærsynethed.
SD-OCT-heløjebilleder af vildtype (A) og Bmal1-/- (B) museøjne ved 84 dages alderen. Øjnene på Bmal1-/- mus har signifikant længere aksial længde end vildtypeøjnene (C). AL: aksial længde; RT: retinal tykkelse; VCD: glaslegeme kammerdybde; LT: linsetykkelse; ACD: forreste kammerdybde; CT: hornhinde tykkelse. Den lange lodrette linje angiver aksiale længdegrænser (top og bund angivet med vandret linje) for vildtypeøjet. Kort pil angiver den bageste aksiale længdemarkering for Bmal1-/- øjet. Gennemsnitlig ± SEM. Den centrale linje ned i midten af hvert billede (A&B) er en lodret mætningsartefakt. Det bruges typisk som en guide til at centrere øjet, men hvis scanningen er godt justeret, kan den gøres til at forsvinde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Højopløsningsbilleddannelse af okulære strukturer in vivo muliggør vurdering af retinale og okulære ændringer over tid. I denne protokol blev SD-OCT påvist at fange forskelle i okulære strukturer in vivo i modeller af retinal degeneration, glaukom, diabetisk retinopati og nærsynethed.
Det mest kritiske aspekt ved udførelse af SD-OCT er at opnå et klart billede af nethinden eller anden okulær struktur af interesse. Det er vigtigt at tage sig tid til at sikre, at nethinden er perfekt centreret og har fremragende klarhed. Tung vejrtrækning af gnaveren kan resultere i støjende billeder (nethinden kan faktisk ses at vrikke på skærmen). Dette sker undertiden, hvis et dyr ikke er helt bevidstløst efter anæstetisk administration. For at løse dette problem kan der beregnes et gennemsnit af flere B-scanninger for at hjælpe med at visualisere, hvor grænserne for nethindelagene er, og derefter kan det bedste enkelt B-scanningsbillede analyseres.
En anden almindelig fejl er, at øjet er for tørt eller for vådt. Dette kan nemt kontrolleres ved at anvende en ekstra dråbe saltvand, transportere det væk med en laboratorieserviet og vurdere, om billedet blev forbedret i klarhed. En overvejelse, der skal tages i betragtning ved markering af retinale lagtykkelser på SD-OCT-billeder, er, hvordan man markerer RNFL. Selvom det er muligt at skelne mellem RNFL og GCL på nogle gnaver-OLT'er, kan disse to lag ofte ikke skelnes. For konsistens markerer vi hele RNFL-regionen (RNFL + GCL, når den er synlig) som RNFL. Nogle undersøgelser rapporterer RNFL og GCL som separate lag eller kombinerer GCL og indre plexiformlag16,17,18, selvom denne forskning typisk blev udført hos mennesker, der har meget større øjne end gnavere. Rapportering af RNFL-tykkelse er mere typisk i gnaverstudier11,13,19,20. Et andet vigtigt spørgsmål er, at meget små ændringer i markering kan forårsage en meget stor ændring, især i nærsynethed på grund af den lille størrelse af de strukturer, der måles. For eksempel er en forskel på 6 μm i måling lig med en diopter af ændring i brydningsfejl21. Fordi små ændringer gør så stor en forskel i målingen, er billedets klarhed afgørende.
En begrænsning ved denne protokol og SD-OCT generelt er, at der kræves klare okulære medier for et godt billede. For eksempel kan hornhindelæsioner, linseabnormiteter og grå stær forhindre brugere i at få klare billeder. Dette er et problem i diabetisk retinopati billeddannelse, især som grå stær almindeligvis udvikler sig i diabetiske gnavere22. Hvis grå stær eller andet okulært problem er lille, er det nogle gange muligt at manøvrere scanningshovedet rundt om det. For større okulære medieforstyrrelser er retinale OCT-billeder umulige at opnå. Disse nethinden kan stadig undersøges ved hjælp af histologi, da retinal histologi ikke er betinget af klare okulære medier.
En yderligere begrænsning er, at hyperreflekterende læsioner, såsom ekssudater og blødninger, samt større retinale kar, resulterer i skygge af de underliggende retinale strukturer, og derved går detaljer om den underliggende morfologi tabt. I et tilfælde, der udviste choroidal neovaskulær membran og diabetisk retinopati / makulaødem, hvor nethindetykkelsen var over 400 μm, var det svært at skelne den underliggende patologi og choroid23. Derudover kan SD-OCT kun bruges til at vurdere tykkelse på bestemte steder. SD-OCT har også en begrænset penetrationsdybde til billeddannelse af choroid og til billeddannelse af hele øjne (hele øjet kan afbildes i en mus, men ikke i større dyr). En anden begrænsning er, at fluorescerende eller andre markører ikke kan bruges med SD-OCT som ved scanning laser oftalmoskopi (SLO). Imidlertid tillader typiske SLO-enheder ikke visualisering af retinale lag i tværsnit med samme lethed, som observeres med SD-OCT. Endelig er beslutningen med SD-OCT ikke perfekt. Det er dog meget forbedret i forhold til den opløsning, der var tilgængelig ved starten af SD-OCT og fortsætter med at forbedre sig over tid.
Afslutningsvis er fordelene og betydningen af SD-OCT-teknikken, at den giver mulighed for in vivo-billeddannelse af okulære strukturer og kvantitativ sporing af ændringer i okulære dimensioner over tid, og at den udfører denne billeddannelse med hurtig scanningshastighed. På grund af den høje opløsning af SD-OCT kan den bruges til at detektere subtile forskelle, der ikke kan observeres med det blotte øje (figur 4 & figur 5). Desuden er SD-OCT et nyttigt værktøj til at måle flere parametre i øjet i en række sygdoms- og skademodeller. I denne protokol alene blev SD-OCT brugt til at måle retinal tykkelse i modeller af retinal degeneration og diabetisk retinopati, retinal tykkelse og cupping i en glaukommodel og aksial længde i en nærsynethedsmodel. SD-OCT kan også bruges til at måle hornhindekrumning 24, vurdere retinale ændringer efter blast og traumatisk hjerneskade 19,25,26, identificere patologi i aldersrelateret makuladegeneration 27 og overvåge retinal sundhed under og efter okulære injektioner 28 og retinal placering af proteser som subretinale implantater 29. Det kan også bruges i andre dyremodeller såsom træspidsmus30 og ikke-menneskelige primater31. SD-OCT kan også bruges til at lokalisere retinal patologi baseret på kvadrant (overlegen, ringere, nasal, tidsmæssig) og placering (central vs. perifer). De fremtidige SD-OCT-enheder vil opnå endnu større opløsning. Derudover giver OCT-angiografi mulighed for billeddannelse af retinal og choroidal mikrovaskulatur ved at udnytte refleksion af laserlys fra overfladen af røde blodlegemer, når de bevæger sig gennem retinal vaskulatur32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Department of Veterans Affairs Rehab R&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) til RSA, Merit Award (RX002615) og Research Career Scientist Award (RX003134) til MTP, Career Development Award (CDA-2, RX002342) til AJF, EY028859 til MTP, NEI Core Grant P30EY006360, Research to Prevent Blindness og Foundation Fighting Blindness.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% tropicamide | Sandoz | Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59 | |
| 0.5% tetracaine | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| AIM-RAS G3 120 V | Leica Bioptigen | 90-AIMRAS-G3-120 | Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice |
| Celluvisc gel | REFRESH CELLUVISC | #4554; NDC-0023-4554-30 | |
| G3 18 mm Telecentric Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-18 | |
| G3 Mouse Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-M | |
| G3 Rat Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-R | |
| heating pad | Fabrication | 11-1130 | |
| InVivoVue software | Leica Bioptigen | Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system | |
| MATLAB | Mathworks | mathematical modeling program | |
| Mouse/Rat Kit | Leica Bioptigen | 90-KIT-M/R | Mouse/rat rodent alignment system |
| saline | ADDIPAK | 200-39 | |
| System Envisu R4300 VHR 120 V | Leica Bioptigen | 90-R4300-V1-120 | SD-OCT system |
References
- Wojtkowski, M., et al. Ultrahigh-resolution, high-speed, Fourier domain optical coherence tomography and methods for dispersion compensation. Optics Express. 12 (11), 2404-2422 (2004).
- Nassif, N., et al. In vivo high-resolution video-rate spectral-domain optical coherence tomography of the human retina and optic nerve. Optics Express. 12 (3), 367-376 (2004).
- Theelen, T., Teussink, M. M. Inspection of the Human Retina by Optical Coherence Tomography. Methods in Molecular Biology. 1715, 351-358 (2018).
- Nakazawa, M., Hara, A., Ishiguro, S. I. Optical Coherence Tomography of Animal Models of Retinitis Pigmentosa: From Animal Studies to Clinical Applications. Biomed Research International. 2019, 8276140 (2019).
- Drexler, W., et al. Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography. Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).
- VanLeeuwen, J. E., et al. Altered AMPA receptor expression with treadmill exercise in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned mouse model of basal ganglia injury. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 650-668 (2010).
- Tian, J., et al. Performance evaluation of automated segmentation software on optical coherence tomography volume data. Journal of Biophotonics. 9 (5), 478-489 (2016).
- Kraus, M. F., et al. Motion correction in optical coherence tomography volumes on a per A-scan basis using orthogonal scan patterns. Biomedical Optics Express. 3 (6), 1182-1199 (2012).
- Boatright, J. H., et al. Tool from ancient pharmacopoeia prevents vision loss. Molecular Vision. 12, 1706-1714 (2006).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
- Goto, Y., Kakizaki, M., Masaki, N. Production of spontaneous diabetic rats by repetition of selective breeding. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 119 (1), 85-90 (1976).
- Allen, R. S., et al. Retinal Deficits Precede Cognitive and Motor Deficits in a Rat Model of Type II Diabetes. Investigative Ophthalmolology & Visual Science. 60 (1), 123-133 (2019).
- Stone, R. A., et al. Altered ocular parameters from circadian clock gene disruptions. PLoS One. 14 (6), 0217111 (2019).
- Chakraborty, R., et al. Circadian rhythms, refractive development, and myopia. Ophthalmic & Physiological Optics. 38 (3), 217-245 (2018).
- Davies, E. C., et al. Retinal ganglion cell layer volumetric assessment by spectral-domain optical coherence tomography in multiple sclerosis: application of a high-precision manual estimation technique. Journal of Neuro-ophthalmology. 31 (3), 260-264 (2011).
- Carnevali, A., et al. Optical coherence tomography angiography analysis of retinal vascular plexuses and choriocapillaris in patients with type 1 diabetes without diabetic retinopathy. Acta Diabetologica. 54 (7), 695-702 (2017).
- Springelkamp, H., et al. Population-based evaluation of retinal nerve fiber layer, retinal ganglion cell layer, and inner plexiform layer as a diagnostic tool for glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 8428-8438 (2014).
- Allen, R. S., et al. Long-Term Functional and Structural Consequences of Primary Blast Overpressure to the Eye. Journal of Neurotrauma. 35 (17), 2104-2116 (2018).
- Zhao, D., et al. Age-related changes in the response of retinal structure, function and blood flow to pressure modification in rats. Scientific Reports. 8 (1), 2947 (2018).
- Schmucker, C., Schaeffel, F. A paraxial schematic eye model for the growing C57BL/6 mouse. Vision Research. 44 (16), 1857-1867 (2004).
- Aung, M. H., Kim, M. K., Olson, D. E., Thule, P. M., Pardue, M. T. Early visual deficits in streptozotocin-induced diabetic long evans rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (2), 1370-1377 (2013).
- Puzyeyeva, O., et al. High-Resolution Optical Coherence Tomography Retinal Imaging: A Case Series Illustrating Potential and Limitations. Journal of Ophthalmology. 2011, 764183 (2011).
- Liu, A. S., et al. Topography and pachymetry maps for mouse corneas using optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 190, 107868 (2020).
- Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino, E., Kardon, R. H., Harper, M. M. Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (5), 3440-3450 (2013).
- Harper, M. M., et al. Blast-Mediated Traumatic Brain Injury Exacerbates Retinal Damage and Amyloidosis in the APPswePSENd19e Mouse Model of Alzheimer's Disease. Investigative Ophthalmology Visual Science. 60 (7), 2716-2725 (2019).
- Zhang, M., et al. Advanced image processing for optical coherence tomographic angiography of macular diseases. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4661-4675 (2015).
- Muhlfriedel, R., et al. Optimized Subretinal Injection Technique for Gene Therapy Approaches. Methods in Molecular Biology. 1834, 405-412 (2019).
- Adekunle, A. N., et al. Integration of Perforated Subretinal Prostheses With Retinal Tissue. Translational Vision Science & Technology. 4 (4), 5 (2015).
- Sajdak, B. S., et al. Noninvasive imaging of the tree shrew eye: Wavefront analysis and retinal imaging with correlative histology. Experimental Eye Research. 185, 107683 (2019).
- Dominik Fischer, M., et al. Detailed functional and structural characterization of a macular lesion in a rhesus macaque. Documenta Ophthalmologica. 125 (3), 179-194 (2012).
- Hagag, A. M., Gao, S. S., Jia, Y., Huang, D. Optical coherence tomography angiography: Technical principles and clinical applications in ophthalmology. Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (3), 115-129 (2017).
- Treister, A. D., et al. Prevalence of Subclinical CNV and Choriocapillaris Nonperfusion in Fellow Eyes of Unilateral Exudative AMD on OCT Angiography. Translational Vision Science & Technology. 7 (5), 19 (2018).
