Summary
Här beskriver vi användningen av spektraldomänoptisk koherenstomografi (SD-OCT) för att visualisera retinala och okulära strukturer in vivo i modeller av retinal degeneration, glaukom, diabetisk retinopati och myopi.
Abstract
Spektral-domän optisk koherens tomografi (SD-OCT) är användbar för att visualisera retinala och okulära strukturer in vivo. Inom forskning är SD-OCT ett värdefullt verktyg för att utvärdera och karakterisera förändringar i en mängd olika modeller av retinala och okulära sjukdomar och skador. I ljusinducerade retinala degenerationsmodeller kan SD-OCT användas för att spåra gallring av fotoreceptorskiktet över tid. I glaukommodeller kan SD-OCT användas för att övervaka minskat retinalt nervfiberskikt och total retinal tjocklek och för att observera optisk nervkoppning efter inducering av okulär hypertoni. Hos diabetiska gnagare har SD-OCT hjälpt forskare att observera minskad total retinal tjocklek samt minskad tjocklek på specifika retinala lager, särskilt retinal nervfiberskikt med sjukdomsprogression. I musmodeller av närsynthet kan SD-OCT användas för att utvärdera axiella parametrar, såsom axiella längdförändringar. Fördelar med SD-OCT inkluderar in vivo-avbildning av okulära strukturer, förmågan att kvantitativt spåra förändringar i okulära dimensioner över tid och dess snabba skanningshastighet och höga upplösning. Här beskriver vi metoderna för SD-OCT och visar exempel på dess användning i vårt laboratorium i modeller av retinal degeneration, glaukom, diabetisk retinopati och myopi. Metoderna inkluderar anestesi, SD-OCT-avbildning och bearbetning av bilderna för tjockleksmätningar.
Introduction
Spektral-domän optisk koherens tomografi (SD-OCT) är en exakt, högupplöst bildmodalitet som gör det möjligt för kliniker och forskare att undersöka okulära strukturer icke-invasivt. Denna avbildningsteknik är baserad på interferometri för att fånga tredimensionella retinala bilder in vivo på en mikrometerskala 1,2. Det har blivit en av de mest använda avbildningsmetoderna inom synforskning och i kliniken på grund av enkel upptäckt och noggrannhet av patologiska egenskaper som strukturella defekter och / eller gallring av retinala lager och subretinal vätska3. I forskning med djurmodeller av synrelaterade sjukdomar har SD-OCT tillhandahållit väsentliga icke-invasiva analyser av samband mellan struktur och funktion och deras histopatologiska ursprung4. På grund av sin upplösning (upp till 2-3 mikron, beroende på djupet i ögat5) har SD-OCT förmågan att upptäcka även små förändringar i näthinnans skikttjocklek. Denna typ av analys kan ge viktig information för sjukdomsprogression och bedöma effekten av neuroprotektiva metoder och behandlingar för synrelaterade störningar.
SD-OCT är ett icke-invasivt alternativ till att undersöka strukturen histologiskt, och de två har visat sig vara korrelerade6. Medan SD-OCT inte når cellulär upplösning, tillåter det longitudinella studier på djur. Detta är fördelaktigt eftersom sjukdomsprogression kan spåras hos enskilda djur över tid i motsats till att behöva avliva djur vid specifika tidpunkter. Eftersom bildtekniken fortsätter att förbättras kommer SD-OCT-tekniken också att utvecklas, vilket ger förbättrad bildkvalitet samt förmågan att bedöma biologiska processer som retinal blodkärlsfunktion i detalj. Även sedan tillkomsten 1991 har SD-OCT-tekniken sett stora framsteg i upplösning, hastighet och känslighet7.
Den aktuella studien använder ett SD-OCT-system för att kvantifiera förändringar i retinala lager i gnagarmodeller av retinal degeneration, glaukom och diabetisk retinopati. SD-OCT-systemet som används här är ett Fourier-domän OCT-system som använder lågeffekt, nära infrarött ljus för att förvärva, bearbeta och lagra djupupplösta bilder i realtid. SD-OCT-systemet har utökad djupbildskapacitet i 800 nm-våglängdsbandet, vilket ger 8 mm djup och 4 μm upplösning. I Fourierdomändetektion transformeras interferenssignalen mellan spritt ljus från vävnaden och en referensväg Fourier för att konstruera axiella skanningar och/eller axiella djupprofiler med spridd intensitet8. För studierna här skannas OCT-strålen över den önskade retinala strukturen medan den seriellt förvärvar axiella skanningar. Vanligtvis förvärvar ett skanningsmönster det tvådimensionella rutnätet (B-Scans) som en samling linjära endimensionella skanningslinjer (A-Scans), som motsvarar 2D-tvärsnittsbilder med hjälp av ett rasterskanningsmönster. För studier fokuserade på närsynthet hos möss används detta system också för att mäta dimensioner av okulära strukturer (t.ex. hornhinnans tjocklek, linstjocklek, glaskammardjup och axiell längd).
Det nuvarande systemet tillåter användare att utforma sina egna protokoll, skapa skanningar som kan skräddarsys och väljas utifrån de okulära strukturerna av intresse. De viktigaste skanningarna i dessa användardefinierade protokoll gör denna bildteknik användarvänlig. För bildanalyser har vi utvecklat anpassad programmering i ett matematiskt modelleringsprogram. SD-OCT är ett kraftfullt verktyg för att icke-invasivt identifiera och kvantifiera patomorfologiska förändringar i okulära strukturer och övervaka synrelaterad sjukdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla beskrivna förfaranden godkändes av Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee och överensstämde med National Institutes of Health-guiden för vård och användning av laboratoriedjur (NIH Publications, 8: e upplagan, uppdaterad 2011).
OBS: SD-OCT-systemet som används för att utveckla protokollet nedan beskrivs i materialtabellen. Vissa av förfarandena är specifika för just detta system, men det övergripande tillvägagångssättet kan anpassas för andra ULT-produkter och djurmodeller. Vidare, i vårt labb, används dessa protokoll ofta hos möss och råttor; Det övergripande tillvägagångssättet kan dock antas till olika djurmodeller och SD-OCT-enheter förutsatt att en individ har rätt lins och kapacitet på sin enhet.
1. Ställ in den optiska koherenstomografiutrustningen
- Öppna SD-OCT-programvaran (Materialförteckning).
- Definiera vem som tar OCT, studien och behandlingsarmen (om relevant). Namnge dessa kategorier på ett sätt som hjälper forskare att söka efter önskade skanningar senare under dataanalys.
- På fliken Patient/Exam klickar du på Test Examiner. Välj examinators namn. Använd knappen Konfigurera examinatorer och läkare för att lägga till nya examinatorer .
- Klicka på Studienamn för att definiera studien. Klicka på fliken Studie om du vill lägga till en ny studie eller ändra behandlingar i en befintlig studie. Klicka till höger om Select Treatment Arm för att välja en behandlingsarm.
- Klicka på knappen Lägg till patient , som används för att lägga till en ny tidpunkt för en hel grupp. När fönstret visas anger du ID-nummer, Förnamn och Efternamn. Välj Man eller Kvinna. Ange födelsedatum.
- Klicka på knappen Lägg till prov för att lägga till de enskilda råttorna. För att identifiera råttorna, klicka på ett prov. Klicka på Redigera prov. Ange ID-numret i Ange anteckningar låda. Klicka på knappen Spara ändringar .
- Anslut rätt objektiv till enheten (bild 1B), välj motsvarande konfiguration i programvaran och ställ in tillhörande referensarmsposition.
OBS: SD-OCT-systemet som beskrivs har anpassade linser, förinställda skanningsmönster och referensarminställningar som är specifika för djurarten och ögonområdet som avbildas (näthinnan eller hornhinnan, mus eller råtta). Några av dessa detaljer är specifika för det beskrivna SD-OCT-systemet (se materialtabell). Till exempel erbjuder inte alla enheter manuell justering av referensarmens väglängd. - På fliken Patient/undersökning dubbelklickar du på det markerade provet för att gå vidare till fliken Bildbehandling och börjar avbilda eller klicka helt enkelt på fliken Bildbehandling. Om det finns en standardskanning högerklickar du för att radera den.
- Läs in ett förinställt skanningsprotokoll genom att klicka på knappen Välj ett protokoll i listan . Du kan också lägga till enskilda skanningar.
- För råttmodeller av glaukom och diabetisk retinopati och musmodeller av retinal degeneration, välj en förinställning som består av fyra bilder: 2 OD- och 2 OS-skanningar. För musmyopi väljer du en förinställning som består av 8 bilder: 4 OD- och 4 OS-skanningar.
OBS: Förinställd avbildning kommer att förklaras mer detaljerat i avsnitt 3. Detta är något som varje laboratorium gör för sig själva eller med tillverkaren under installationen på plats.
2. Bedöva djuret
- Administrera bedövningsmedel.
- Bedövar råttor med ketamin (60 mg/kg) och xylazin (7,5 mg/kg) via intraperitoneal injektion.
- Bedövar möss med ketamin (80 mg/kg) och xylazin (16 mg/kg) via intraperitoneal injektion.
- Vänta tills djuren är helt bedövade och inte svarar på tånypningen.
- Administrera pupillutvidgningsdroppar (1% tropicamid). Vänta tills eleverna vidgas innan du bildar.
OBS: Utvidgning av pupillerna ökar synfältet men är inte ett krav. Lokala (hornhinnan) bedövningsdroppar (0,5% tetrakain) för att bedöva ögat bör också användas om något kommer att röra ögat (till exempel om du applicerar kontaktlinser eller använder en guide). En guide är en enhet som placeras över skanningshuvudet och hjälper nybörjare att ställa in ögat och skanningshuvudet. - Efter bedövning av gnagaren, placera gnagaren i ett gnagarjusteringssystem som kan rotera djuret i 3-dimensionellt utrymme (figur 1A, 1C och 1D). Ge termiskt stöd.
OBS: För närvarande använder vi gnagarjusteringssystem för möss och råttor designade och sålda med SD-OCT-enheten. - Applicera vätska (t.ex. saltlösning eller konstgjorda tårar) för att hålla ögonen smorda. Se till att ögat inte torkar ut under avbildning så att ögats optiska egenskaper bibehålls mellan skanningarna (när hornhinnan är våt kan näthinnan ses tydligt).
- Se till att behålla fukt i motsatt öga när du skannar det första ögat så att det inte torkar ut.
- Använd en känslig arbetstorka för att transportera bort överflödig saltlösning strax före avbildning, eftersom för mycket eller för lite smörjmedel på ögat kommer att påverka bildkvaliteten.
OBS: Användning av steril smörjgel, rekommenderas inte under OCT eftersom det kan störa avbildningen. Vid behov kan steril smörjgel användas efter proceduren. En kontaktlins kan också appliceras för att säkerställa tillräcklig fukt på ögat under hela testet. Enligt vår erfarenhet gav en kontaktlins inte en markant förbättring av bildkvaliteten, men kontaktlinser hjälper till att minska risken för att hornhinnan torkar under bildsessionen.
3. OCT-avbildning av gnagare
- Börja med ett öga (OS eller OD) och avbilda det kontralaterala ögat efter.
- Placera djuret med hjälp av de två rotationsrörelserna i gnagaruppriktningssystemet, så att blicken är horisontell och tittar ner längs OCT-linsens axel (figur 1D).
- Använd OCT i Free Run-läge för att orientera näthinnan för datainsamling. Använd siktläget (genom att klicka på Aim-knappen ) initialt för en kontinuerlig visning av både horisontella och vertikala B-skanningar i realtid.
- Flytta skanningshuvudet närmare ögat tills näthinnan är synlig (eftersom mus- och råttnäthinnelinser är fast fokus, flyttar linsen mot ögat fokuserar djupare in i näthinnan). Använd sedan gnagarjusteringssystemet för att justera djurets position upp / ner och vrida / vrida för att placera synnervhuvudet i mitten, gör den horisontella skanningen horisontell och den vertikala skanningen vertikal (figur 1A).
- Justera arbetsavståndet så att näthinnebilden är platt och inte krökt.
- Justera referensarmens position för att hålla bilden nära toppen av visningsfönstret. Var försiktig så att du inte trycker in för långt, annars kommer ögonbilden att vända tillbaka på sig själv.
- Retinal avbildning
- För glaukom, retinal degeneration och diabetisk retinopati modeller: Definiera en volymskanning som består av 1000 x 100 x 1 (A-skanningar x B-skanningar x upprepade B-skanningar) för medelvärde. Hos råttor, ta en volymskanning som är 3 x 3 mm. I möss, ta en 1,5 x 1,5 mm volymsökning.
- Centrera synnerven i horisontell och vertikal åtkomst så att volymskanningen är i mitten. Ta dig tid att se till att det optiska nervhuvudet är i mitten av skanningen och rakt längs de nasal-temporala och överlägsna underlägsna axlarna (figur 2). Skanna och centrera om för att se till att den är exakt i mitten, om det behövs. Upprepa denna skanning vid behov tills synnervhuvudet är centrerat och inriktat längs båda axlarna. Klicka på knappen Ögonblicksbild för att ta ett foto.
OBS: Vissa SD-OCT-enheter har möjlighet att optiskt manipulera ögats krökning (t.ex. bilden är platt) genom att justera ögats avstånd från ljuskällan med referensarmen. Vi rekommenderar att du plattar ut och centrerar bilderna när du gör direkta tjockleksmätningar genom näthinnans lager för att förbättra noggrannheten längs den främre-bakre riktningen. - Klicka på knappen Spara för att spara bilden.
- Ta en radiell skanning centrerad vid synnervhuvudet som är 1000 x 4 x 20 (A-skanning x B-skanning x upprepade B-skanningar). Använd upprepade B-skanningar för att förbättra bildklarheten i ögat eller näthinnan, vilket hjälper till att tolka områden i ögat eller näthinnans lager under dataanalys.
OBS: Återigen, hos råttor är denna radiella skanning 3 mm, medan hos möss är radialskanningen 1,5 mm. - Spara bilden.
- Upprepa steg 3.1 till 3.2.5 i det kontralaterala ögat.
- Axiella längdmätningar
- För projekt som involverar avbildning av hela ögat, såsom musmyopi, ta tre skanningar av hela ögat och en näthinneskanning för varje öga. Välj en förinställning som består av en radiell skanning som är 500 x 20 x 1 och omfattar ögats fulla diameter.
OBS: Den här inställningen ger en bild av hela musögats längd från hornhinnan till åderhinnan. - Centrera mitten av ögat och näthinnan i synfältet. Ta tre radiella skanningar (hela ögonskanningar): en linjär B-skanning som är 1000 x 5 x 2 och ytterligare två linjära B-skanningar på 1000 x 5 x 2 på samma plats. Spara bilderna.
- Efteråt, om så önskas, zooma in och ta en volym eller rektangulär skanning (näthinneskanning) som liknar beskrivningen i 3.2 som består av 1000 x 20 A-skanningar x B-skanningar. Spara volymgenomsökningen.
- Upprepa steg 3.3 till 3.3.3 i det kontralaterala ögat.
OBS: Axiella längdmätningar är endast möjliga på små ögon (mus eller mindre) eftersom bildfönstret för nuvarande system inte är tillräckligt stort för att fånga ett större öga.
- För projekt som involverar avbildning av hela ögat, såsom musmyopi, ta tre skanningar av hela ögat och en näthinneskanning för varje öga. Välj en förinställning som består av en radiell skanning som är 500 x 20 x 1 och omfattar ögats fulla diameter.
4. Steg efter avbildning
- Lagra sparade data i ett moln, vilket är god praxis för datahantering och möjliggör enkel åtkomst för senare analys. Utför dataanalys med anpassad programvara utvecklad i ett matematiskt modelleringsprogram (Table of Materials).
- Ta bort gnagaren från gnagaruppriktningssystemet och ge en intraperitoneal injektion av atipamezol (1 mg/kg för råttor och möss) för att vända effekterna av xylazin, så att gnagaren vaknar snabbare.
- Låt gnagare återhämta sig på en värmedyna på låg värme. Ge ytterligare saltlösningsdroppar efter behov. Återför gnagare till sin hembur när de har återfått full rörlighet.
- Stäng programmet och stäng av OCT.
5. Efterbehandling av OCT-bilder
- Bearbeta bilderna med hjälp av anpassad programvara som utvecklats i ett matematiskt modelleringsprogram för att passa specifika OCT-behov (t.ex. mäta tjockleken på intressanta områden genom att manuellt markera bilderna).
- Beroende på bildens syfte (musens näthinna, råttnäthinna eller närsynthet/axiallängd), använd ett av tre olika program:
- För bearbetning av näthinnan, välj OCT-skanningar för att ladda. Definiera först mitten av det optiska nervhuvudet med ett enkelt klick.
- Titta när programmet genererar vertikala linjer som definierar avstånd på vardera sidan av synnervhuvudet. Observera att i råttans näthinna är dessa linjer 0,5 mm och 1,2 mm från mitten av det optiska nervhuvudet, för totalt 4 vertikala linjer som representerar ögats nasal-temporala och underlägsna överlägsna axlar beroende på den radiella B-skanningen som för närvarande analyseras.
OBS: I musens näthinna är dessa vertikala linjer 0,25 mm och 0,5 mm från synnervens huvudcentrum. - Avgränsa följande lager längs varje rad:
Det retinala nervfiberskiktet (RNFL), det inre plexiformskiktet (IPL), det inre kärnskiktet (INL), det yttre plexiformskiktet (OPL), det yttre kärnskiktet (ONL), det yttre begränsande membranet (ELM), de inre segmenten/de yttre segmenten (IS/OS), det retinala pigmentepitelet (RPE) och den totala näthinnans tjocklek.
OBS: Den radiella skanningen har vanligtvis inte nasala / temporala och överlägsna / sämre etiketter när den öppnas. Skanningar kan skapas så att de har en n / t och s / I-orientering, och dessa skanningar i synnerhet analyseras senare. - När en bild har avgränsats och programmet stängts, exportera dessa mätningar till ett kalkylprogram för dataanalys.
- Använd dessa längd- och tjockleksvärden från steg 5 för att göra jämförelser mellan grupper, till exempel för att avgöra om det finns regionala skillnader (n / t / s / i) eller longitudinella förändringar.
- För retinala mätningar, bestäm först om det finns några skillnader i den nasal-temporala och underlägsna överlägsna axeln på 0,5 mm och 1,2 mm avstånd.
OBS: Om skillnader i kvadranter inte observeras kan medelvärdet av måtten på 0,5 mm och 1,2 mm beräknas tillsammans. Detta är ett liknande tillvägagångssätt för musens retinala skanningar endast vid 0,25 mm och 0,5 mm. - För myopistudier, använd detta program för att bedöma de okulära parametrarna längs ögats optiska axel. Öppna det matematiska modelleringsprogrammet. Välj först en bild som ska laddas.
- När du har laddat bilden markerar du manuellt varje skanning (radiell och B-skanning). Markera de främre och bakre kanterna på hornhinnan, linsen, glaskroppen och näthinnan, så att programmet beräknar hornhinnans tjocklek, linstjocklek, främre och glaskroppsdjup, total retinaltjocklek, total axiell längd.
- Efter markering, avsluta programmet som uppmanar en spara-meny. Spara de avgränsade värdena i ett kalkylprogram och beräkna medelvärdet av de tre separata skanningarna tillsammans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SD-OCT anses vara framgångsrikt om högkvalitativa bilder erhålls så att okulära dimensioner kan mätas på ett tillförlitligt sätt. Här illustreras en mängd olika användningar av SD-OCT med hjälp av modeller av retinal degeneration, glaukom, diabetisk retinopati och myopi.
I en ljusinducerad retinal degeneration (LIRD) -modell inducerar exponering för starkt ljus (10 000 lux) degenerering av fotoreceptorceller i näthinnan9. Representativa SD-OCT-bilder avslöjar ett tunnare yttre kärnskikt, som innehåller fotoreceptorcellkropparna, i näthinnor från LIRD BALB / c-möss jämfört med oskadade (kontroll) möss (figur 3A&3B). Efter kvantifiering av näthinnans skikttjocklek observerades en signifikant skillnad mellan oskadade möss och LIRD-möss för total näthinnetjocklek (figur 3C), yttre kärnskikttjocklek (figur 3D) och IS/OS-tjocklek (figur 3E).
För att experimentellt modellera glaucomatous skada använde vi en modell av okulär hypertoni (OHT)10. I korthet fick bruna norska råttor (n = 35) en injektion av hyperton saltlösning i limbusvenen i ett öga medan det kontralaterala ögat fungerade som en intern kontroll11. För glaukomstudier kvantifierade vi tjockleken på retinala nervfiberskiktet (RNFL). Efter 8 veckors OHT observerade vi distinkt ombyggnad vid synnervhuvudet, inklusive optisk nervkoppning (figur 4A&B). Vi kvantifierade sedan RNFL-tjockleken och fann RNFL-gallring efter 8 veckors OHT jämfört med baslinjemätningar (figur 4C).
För att modellera diabetisk retinopati användes Goto-Kakizaki-råttor, en icke-överviktig, polygen modell av diabetes som utvecklar hyperglykemi så tidigt som 2-3 veckors ålder,12,13. Näthinnor från Goto-Kakizaki-råttor och Wistar-råttor (icke-diabetiska kontroller) avbildades med SD-OCT (figur 5A&5B). Vid 6 veckors ålder var RNFL och total näthinnetjocklek reducerad hos Goto-Kakizaki-råttor jämfört med Wistar-råttor i den centrala näthinnan (data visas inte) och den perifera näthinnan (figur 5C&5D). De största skillnaderna observerades i näthinnans nedre och tidsmässiga kvadranter (figur 5C&5D).
För att utvärdera musmodeller för närsynthet mättes axiell längd i Bmal1-/- möss. Bmal1 är en klockgen av intresse eftersom dygnsrytmen kan spela en roll i myopiutveckling14,15. Den axiella längden på musögat Bmal1-/- (figur 6B) är synligt längre än vildtypsögat (figur 6A) i OCT-bilderna. Kvantifiering av den axiella längden bekräftar att Bmal1-/- möss har signifikant längre axiella längder vid 84 dagars ålder (figur 6C), vilket visar att avsaknaden av klockgenen bidrar till myopiutveckling.
Detta protokoll genererade bilder av okulära strukturer i modeller av retinal degeneration, glaukom, diabetisk retinopati och myopi. Bilderna var av tillräcklig kvalitet så att okulära dimensioner, inklusive yttre kärnskikt, retinalt nervfiberskikt, total näthinnetjocklek och axiell längd, kunde kvantifieras. Resultaten visade att signifikanta skillnader i dimensionerna av okulära strukturer kunde observeras in vivo med SD-OCT.
Bild 1: Installation av SD-OCT-utrustning.
A) Bild av systemet för justering av gnagare och OCT-skanningshuvud. (B) Bild av OCT-linser för råtta och mus. (C) Bild av musgnagarjusteringssystem som illustrerar dess förmåga att röra sig i 3-dimensionellt utrymme. (D) Närbild av gnagarjusteringssystemet, särskilt de knoppar som styr dess rörelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Provsökning i SD-OCT.
Bild av en direktsänd genomsökning av musens näthinna precis innan en volym- eller radiell skanning tas. (A) visar den nasal-temporala inriktningen, medan (B) visar den överlägsna-underlägsna inriktningen. När näthinnorna i dessa två bilder är raka i sina respektive vertikala eller horisontella plan och synnerven är centrerad i båda bilderna, fortsätter vi att förvärva SD-OCT-bilden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Använda SD-OCT för att spåra gallring av fotoreceptorskiktet över tid i en musmodell av retinal degeneration.
(A) Representativ SD-OCT-skanning av en oskadad (kontroll) näthinna från en BALB / c-mus. (B) Representativ SD-OCT-skanning av en näthinna från en ljusinducerad retinal degeneration (LIRD) BALB / c-mus. (C–E) Kvantifiering av total näthinnetjocklek (C), yttre kärnskikt (ONL) tjocklek (D) och inre segment/yttre segment (IS/OS) tjocklek (E) i oskadade och LIRD Balb/c möss. Medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Med hjälp av SD-OCT mätte vi en minskning av näthinnans nervfiberskikttjocklek och observerade optisk nervkoppning efter inducering av okulär hypertoni i en råttmodell av glaukom.
(A) Representativ SD-OCT-skanning av en näthinna och ett synnervshuvud från ett råttöga som tagits före inducering av okulär hypertension (baslinje: OHT). (B) SD-OCT-skanning av samma råttnäthinna efter 8 veckors OHT (experimentell modell av glaukom). (C) Kvantifiering av retinala nervfiberskiktets (RNFL) tjocklek vid baslinjen jämfört med OHT-ögon. Medelvärde ± SEM. Dessa data har modifierats från Feola et al.11Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Använda SD-OCT för att observera minskad total retinal tjocklek samt minskad tjocklek på specifika retinala lager i en råttmodell av diabetes.
(A) Representativ SD-OCT-skanning av en näthinna från en Wistar-råtta (Wild-type control). (B) Representativ SD-OCT-skanning av en näthinna från en Goto-Kakizaki (diabetiker) råtta. Retinala lager: retinalt nervfiberskikt (RNFL), inre plexiformskikt (IPL), inre kärnskikt (INL), yttre plexiformskikt (OPL), yttre kärnskikt (ONL), yttre begränsande membran (ELM), inre segment / yttre segment (IS/OS), retinalt pigmentepitel (RPE) och total retinal tjocklek (TRT). (CD) Kvantifiering av RNFL (C) och total näthinnetjocklek (D) i Wistar och Goto-Kakizaki näthinnor där mittlinjen är medelvärdet och det skuggade området är SEM för alla fyra kvadranterna (Sup, Superior; Temporal, Temporal; Inf, sämre; Nas, Nasal) i den perifera näthinnan (1,2 mm från synnervhuvudet). ** p < 0,01, *** p < 0,001. Denna siffra har modifierats från Allen et al.13Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Använda SD-OCT för att utvärdera axiell längd i en musmodell av närsynthet.
Helögda SD-OCT-bilder av vildtyp (A) och Bmal1-/- (B) musögon vid 84 dagars ålder. Ögonen hos Bmal1-/- möss har betydligt längre axiell längd än vildtypsögonen (C). AL: axiell längd; RT: retinal tjocklek; VCD: glaskammardjup; LT: linstjocklek; ACD: främre kammardjup; CT: hornhinnans tjocklek. Den långa vertikala linjen indikerar axiella längdgränser (topp och botten indikeras av horisontell linje) för vildtypsögat. Kort pil anger den bakre axiella längdmarkeringen för Bmal1-/- ögat. Medelvärde ± SEM. Den centrala linjen i mitten av varje bild (A&B) är en artefakt med lodrät mättnad. Det används vanligtvis som en guide för att centrera ögat, men om skanningen är väl inriktad kan den fås att försvinna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Högupplöst avbildning av okulära strukturer in vivo möjliggör bedömning av retinala och okulära förändringar över tid. I detta protokoll visades SD-OCT för att fånga skillnader i okulära strukturer in vivo i modeller av retinal degeneration, glaukom, diabetisk retinopati och myopi.
Den mest kritiska aspekten när man utför SD-OCT är att få en tydlig bild av näthinnan eller annan okulär struktur av intresse. Det är viktigt att ta tid att se till att näthinnan är perfekt centrerad och har utmärkt klarhet. Tung andning av gnagaren kan resultera i bullriga bilder (näthinnan kan faktiskt ses vicka på skärmen). Detta händer ibland om ett djur inte är helt medvetslöst efter anestetisk administrering. Undvik det här problemet kan flera B-skanningar medelvärde för att visualisera var gränserna för näthinnelagren är, och sedan kan den bästa enskilda B-skanningsbilden analyseras.
Ett annat vanligt misstag är att ögat är för torrt eller för vått. Detta kan enkelt kontrolleras genom att applicera en extra droppe saltlösning, transportera bort den med en laboratorietorkning och bedöma om bilden förbättrades i klarhet. En faktor att ta hänsyn till när man markerar näthinnans skikttjocklekar på SD-OCT-bilder är hur man markerar RNFL. Även om det är möjligt att skilja mellan RNFL och GCL på vissa gnagare OCT, är dessa två lager ofta oskiljbara. För konsekvensens skull markerar vi hela RNFL-regionen (RNFL + GCL, när den är synlig) som RNFL. Vissa studier rapporterar RNFL och GCL som separata lager eller kombinerar GCL och inre plexiformskiktet16,17,18, även om denna forskning vanligtvis utfördes hos människor, som har mycket större ögon än gnagare. Rapportering av RNFL-tjocklek är mer typisk i gnagarstudier11,13,19,20. En annan viktig fråga är att mycket små förändringar i märkningen kan orsaka en mycket stor förändring, särskilt i närsynthet på grund av den lilla storleken på de strukturer som mäts. Till exempel är en 6 μm skillnad i mätning lika med en dioptrier av förändring i brytningsfel21. Eftersom små förändringar gör en så stor skillnad i mätningen är bildens klarhet avgörande.
En begränsning av detta protokoll, och av SD-OCT i allmänhet, är att tydliga okulära medier krävs för en bra bild. Till exempel kan hornhinneskador, linsavvikelser och grå starr hindra användare från att få tydliga bilder. Detta är ett problem vid diabetisk retinopatiavbildning, i synnerhet eftersom grå starr vanligtvis utvecklas hos diabetiska gnagare22. Om grå starr eller annan okulär fråga är liten, är det ibland möjligt att manövrera skanningshuvudet runt det. För större störningar i ögonmedia är retinala OCT-bilder omöjliga att få. Dessa näthinnor kan fortfarande undersökas med hjälp av histologi eftersom retinal histologi inte är beroende av klara okulära medier.
En ytterligare begränsning är det faktum att hyperreflekterande lesioner, såsom exsudat och blödningar, liksom större näthinnekärl, resulterar i skuggning av de underliggande näthinnestrukturerna, och därmed går detaljer om den underliggande morfologin förlorade. I ett fall som uppvisade koroidalt neovaskulärt membran och diabetisk retinopati/makulaödem där näthinnans tjocklek var över 400 μm var det svårt att urskilja den underliggande patologin och koroidoiden23. Dessutom kan SD-OCT endast användas för att bedöma tjocklek på specifika platser. SD-OCT har också ett begränsat penetrationsdjup för avbildning av åderhinnan och för avbildning av hela ögon (hela ögat kan avbildas i en mus, men inte hos större djur). En annan begränsning är att fluorescerande eller andra markörer inte kan användas med SD-OCT som med sveplaseroftalmoskopi (SLO). Typiska SLO-enheter tillåter emellertid inte visualisering av retinala lager i tvärsnitt med samma lätthet som observeras med SD-OCT. Slutligen är upplösningen med SD-OCT inte perfekt. Det är dock mycket bättre än den upplösning som fanns tillgänglig vid starten av SD-OCT och fortsätter att förbättras med tiden.
Sammanfattningsvis är fördelarna och betydelsen av SD-OCT-tekniken att den möjliggör in vivo-avbildning av okulära strukturer och kvantitativ spårning av förändringar i okulära dimensioner över tid, och att den utför denna avbildning med snabb skanningshastighet. På grund av den höga upplösningen hos SD-OCT kan den användas för att upptäcka subtila skillnader som inte kan observeras med blotta ögat (figur 4 &; figur 5). Vidare är SD-OCT ett användbart verktyg för att mäta flera parametrar i ögat i ett antal sjukdoms- och skademodeller. Enbart i detta protokoll användes SD-OCT för att mäta retinal tjocklek i modeller av retinal degeneration och diabetisk retinopati, retinal tjocklek och koppning i en glaukommodell och axiell längd i en myopimodell. SD-OCT kan också användas för att mäta hornhinnans krökning24, bedöma näthinneförändringar efter blast och traumatisk hjärnskada 19,25,26, identifiera patologi vid åldersrelaterad makuladegeneration 27 och övervaka näthinnans hälsa under och efter okulära injektioner 28 och retinal placering av proteser som subretinala implantat 29. Den kan också användas i andra djurmodeller som trädskruvar30 och icke-mänskliga primater31. SD-OCT kan också användas för att lokalisera retinal patologi baserat på kvadrant (överlägsen, underlägsen, nasal, temporal) och plats (central kontra perifer). De framtida SD-OCT-enheterna kommer att uppnå ännu större upplösning. Dessutom möjliggör OCT-angiografi avbildning av retinal och koroidal mikrovaskulatur genom att utnyttja reflektionen av laserljus från ytan av röda blodkroppar när de rör sig genom retinal vaskulatur32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Department of Veterans Affairs Rehab R&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) till RSA, Merit Award (RX002615) och Research Career Scientist Award (RX003134) till MTP, Career Development Award (CDA-2, RX002342) till AJF, EY028859 till MTP, NEI Core Grant P30EY006360, Research to Prevent Blindness och Foundation Fighting Blindness.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% tropicamide | Sandoz | Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59 | |
| 0.5% tetracaine | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| AIM-RAS G3 120 V | Leica Bioptigen | 90-AIMRAS-G3-120 | Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice |
| Celluvisc gel | REFRESH CELLUVISC | #4554; NDC-0023-4554-30 | |
| G3 18 mm Telecentric Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-18 | |
| G3 Mouse Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-M | |
| G3 Rat Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-R | |
| heating pad | Fabrication | 11-1130 | |
| InVivoVue software | Leica Bioptigen | Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system | |
| MATLAB | Mathworks | mathematical modeling program | |
| Mouse/Rat Kit | Leica Bioptigen | 90-KIT-M/R | Mouse/rat rodent alignment system |
| saline | ADDIPAK | 200-39 | |
| System Envisu R4300 VHR 120 V | Leica Bioptigen | 90-R4300-V1-120 | SD-OCT system |
References
- Wojtkowski, M., et al. Ultrahigh-resolution, high-speed, Fourier domain optical coherence tomography and methods for dispersion compensation. Optics Express. 12 (11), 2404-2422 (2004).
- Nassif, N., et al. In vivo high-resolution video-rate spectral-domain optical coherence tomography of the human retina and optic nerve. Optics Express. 12 (3), 367-376 (2004).
- Theelen, T., Teussink, M. M. Inspection of the Human Retina by Optical Coherence Tomography. Methods in Molecular Biology. 1715, 351-358 (2018).
- Nakazawa, M., Hara, A., Ishiguro, S. I. Optical Coherence Tomography of Animal Models of Retinitis Pigmentosa: From Animal Studies to Clinical Applications. Biomed Research International. 2019, 8276140 (2019).
- Drexler, W., et al. Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography. Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).
- VanLeeuwen, J. E., et al. Altered AMPA receptor expression with treadmill exercise in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned mouse model of basal ganglia injury. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 650-668 (2010).
- Tian, J., et al. Performance evaluation of automated segmentation software on optical coherence tomography volume data. Journal of Biophotonics. 9 (5), 478-489 (2016).
- Kraus, M. F., et al. Motion correction in optical coherence tomography volumes on a per A-scan basis using orthogonal scan patterns. Biomedical Optics Express. 3 (6), 1182-1199 (2012).
- Boatright, J. H., et al. Tool from ancient pharmacopoeia prevents vision loss. Molecular Vision. 12, 1706-1714 (2006).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
- Goto, Y., Kakizaki, M., Masaki, N. Production of spontaneous diabetic rats by repetition of selective breeding. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 119 (1), 85-90 (1976).
- Allen, R. S., et al. Retinal Deficits Precede Cognitive and Motor Deficits in a Rat Model of Type II Diabetes. Investigative Ophthalmolology & Visual Science. 60 (1), 123-133 (2019).
- Stone, R. A., et al. Altered ocular parameters from circadian clock gene disruptions. PLoS One. 14 (6), 0217111 (2019).
- Chakraborty, R., et al. Circadian rhythms, refractive development, and myopia. Ophthalmic & Physiological Optics. 38 (3), 217-245 (2018).
- Davies, E. C., et al. Retinal ganglion cell layer volumetric assessment by spectral-domain optical coherence tomography in multiple sclerosis: application of a high-precision manual estimation technique. Journal of Neuro-ophthalmology. 31 (3), 260-264 (2011).
- Carnevali, A., et al. Optical coherence tomography angiography analysis of retinal vascular plexuses and choriocapillaris in patients with type 1 diabetes without diabetic retinopathy. Acta Diabetologica. 54 (7), 695-702 (2017).
- Springelkamp, H., et al. Population-based evaluation of retinal nerve fiber layer, retinal ganglion cell layer, and inner plexiform layer as a diagnostic tool for glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 8428-8438 (2014).
- Allen, R. S., et al. Long-Term Functional and Structural Consequences of Primary Blast Overpressure to the Eye. Journal of Neurotrauma. 35 (17), 2104-2116 (2018).
- Zhao, D., et al. Age-related changes in the response of retinal structure, function and blood flow to pressure modification in rats. Scientific Reports. 8 (1), 2947 (2018).
- Schmucker, C., Schaeffel, F. A paraxial schematic eye model for the growing C57BL/6 mouse. Vision Research. 44 (16), 1857-1867 (2004).
- Aung, M. H., Kim, M. K., Olson, D. E., Thule, P. M., Pardue, M. T. Early visual deficits in streptozotocin-induced diabetic long evans rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (2), 1370-1377 (2013).
- Puzyeyeva, O., et al. High-Resolution Optical Coherence Tomography Retinal Imaging: A Case Series Illustrating Potential and Limitations. Journal of Ophthalmology. 2011, 764183 (2011).
- Liu, A. S., et al. Topography and pachymetry maps for mouse corneas using optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 190, 107868 (2020).
- Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino, E., Kardon, R. H., Harper, M. M. Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (5), 3440-3450 (2013).
- Harper, M. M., et al. Blast-Mediated Traumatic Brain Injury Exacerbates Retinal Damage and Amyloidosis in the APPswePSENd19e Mouse Model of Alzheimer's Disease. Investigative Ophthalmology Visual Science. 60 (7), 2716-2725 (2019).
- Zhang, M., et al. Advanced image processing for optical coherence tomographic angiography of macular diseases. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4661-4675 (2015).
- Muhlfriedel, R., et al. Optimized Subretinal Injection Technique for Gene Therapy Approaches. Methods in Molecular Biology. 1834, 405-412 (2019).
- Adekunle, A. N., et al. Integration of Perforated Subretinal Prostheses With Retinal Tissue. Translational Vision Science & Technology. 4 (4), 5 (2015).
- Sajdak, B. S., et al. Noninvasive imaging of the tree shrew eye: Wavefront analysis and retinal imaging with correlative histology. Experimental Eye Research. 185, 107683 (2019).
- Dominik Fischer, M., et al. Detailed functional and structural characterization of a macular lesion in a rhesus macaque. Documenta Ophthalmologica. 125 (3), 179-194 (2012).
- Hagag, A. M., Gao, S. S., Jia, Y., Huang, D. Optical coherence tomography angiography: Technical principles and clinical applications in ophthalmology. Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (3), 115-129 (2017).
- Treister, A. D., et al. Prevalence of Subclinical CNV and Choriocapillaris Nonperfusion in Fellow Eyes of Unilateral Exudative AMD on OCT Angiography. Translational Vision Science & Technology. 7 (5), 19 (2018).
