Summary
Burada, retinal dejenerasyon, glokom, diyabetik retinopati ve miyopi modellerinde retinal ve oküler yapıları in vivo olarak görselleştirmek için spektral-alan optik koherens tomografinin (SD-OCT) kullanımını açıklamaktayız.
Abstract
Spektral-alan optik koherens tomografi (SD-OCT), retinal ve oküler yapıları in vivo olarak görselleştirmek için yararlıdır. Araştırmada, SD-OCT, çeşitli retinal ve oküler hastalık ve yaralanma modellerindeki değişiklikleri değerlendirmek ve karakterize etmek için değerli bir araçtır. Işık kaynaklı retinal dejenerasyon modellerinde, SD-OCT, fotoreseptör tabakasının zamanla incelmesini izlemek için kullanılabilir. Glokom modellerinde SD-OCT, azalmış retina sinir lifi tabakasını ve toplam retina kalınlığını izlemek ve oküler hipertansiyonu indükledikten sonra optik sinir kapanmasını gözlemlemek için kullanılabilir. Diyabetik kemirgenlerde, SD-OCT, araştırmacıların toplam retina kalınlığının azalmasının yanı sıra spesifik retina tabakalarının, özellikle de hastalık progresyonu ile retinal sinir lifi tabakasının kalınlığının azaldığını gözlemlemelerine yardımcı olmuştur. Miyopinin fare modellerinde, SD-OCT, eksenel uzunluk değişiklikleri gibi eksenel parametreleri değerlendirmek için kullanılabilir. SD-OCT'nin avantajları arasında oküler yapıların in vivo görüntülenmesi, zaman içinde oküler boyutlardaki değişiklikleri kantitatif olarak izleme yeteneği ve hızlı tarama hızı ve yüksek çözünürlüğü sayılabilir. Burada, SD-OCT yöntemlerini detaylandırdık ve retinal dejenerasyon, glokom, diyabetik retinopati ve miyopi modellerinde laboratuvarımızda kullanım örneklerini gösterdik. Yöntemler anestezi, SD-OCT görüntüleme ve kalınlık ölçümleri için görüntülerin işlenmesini içerir.
Introduction
Spektral-alan optik koherens tomografi (SD-OCT), klinisyenlerin ve araştırmacıların oküler yapıları noninvaziv olarak incelemelerini sağlayan hassas, yüksek çözünürlüklü bir görüntüleme yöntemidir. Bu görüntüleme tekniği, mikrometre ölçeğinde 1,2 inç vivo üç boyutlu retinal görüntüler yakalamak için interferometriye dayanmaktadır. Yapısal defektler ve/veya retina tabakaları ve subretinal sıvının incelmesi gibi patolojik özelliklerin kolay saptanması ve doğruluğu nedeniyle görme araştırmalarında ve klinikte en sık kullanılan görüntüleme yöntemlerinden biri haline gelmiştir3. SD-OCT, görme ile ilişkili bozuklukların hayvan modellerini kullanan araştırmalarda, yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkilerin ve histopatolojik kökenlerinin temel noninvaziv analizlerini sağlamıştır4. SD-OCT, çözünürlüğü nedeniyle (gözün derinliğine bağlı olarak 2-3 mikrona kadar5), retina tabakası kalınlığındaki küçük değişiklikleri bile tespit etme yeteneğine sahiptir. Bu tür bir analiz, hastalığın ilerlemesi için gerekli bilgileri sağlayabilir ve görme ile ilgili bozukluklar için nöroprotektif yöntemlerin ve tedavilerin etkinliğini değerlendirebilir.
SD-OCT, yapının histolojik olarak incelenmesine noninvaziv bir alternatiftir ve ikisinin korelasyon gösterdiği gösterilmiştir6. SD-OCT hücresel çözünürlüğe ulaşmazken, hayvanlarda uzunlamasına çalışmalara izin verir. Bu avantajlıdır, çünkü belirli zaman noktalarında hayvanları ötenazi yapmak zorunda kalmanın aksine, zaman içinde bireysel hayvanlarda hastalık ilerlemesi izlenebilir. Görüntüleme teknikleri gelişmeye devam ettikçe, SD-OCT teknolojisi de ilerleyecek ve gelişmiş görüntü kalitesinin yanı sıra retinal kan damarı fonksiyonu gibi biyolojik süreçleri ince ayrıntılarla değerlendirme yeteneği sağlayacaktır. SD-OCT teknolojisi, 1991 yılında ortaya çıkışından bu yana bile çözünürlük, hız ve hassasiyette büyük ilerlemelerkaydetmiştir 7.
Bu çalışmada, retinal dejenerasyon, glokom ve diyabetik retinopatinin kemirgen modellerinde retina tabakalarındaki değişiklikleri ölçmek için bir SD-OCT sistemi kullanılmaktadır. Burada kullanılan SD-OCT sistemi, derinliği çözümlenmiş görüntüleri gerçek zamanlı olarak elde etmek, işlemek ve depolamak için düşük güçlü, yakın kızılötesi ışık kullanan bir Fourier etki alanı OCT sistemidir. SD-OCT sistemi, 800 nm dalga boyu bandında genişletilmiş derinlik görüntüleme kapasitesine sahiptir ve 8 mm derinlik ve 4 μm çözünürlük sağlar. Fourier etki alanı tespitinde, dokudan gelen dağınık ışık ile bir referans yolu arasındaki girişim sinyali, Fourier'in eksenel taramalar ve/veya dağınık yoğunlukta eksenel derinlik profilleri oluşturmak üzere dönüştürülmesi8. Buradaki çalışmalar için OCT ışını istenilen retinal yapı üzerinden taranırken, seri olarak eksenel taramalar elde edilir. Tipik olarak, bir tarama deseni, iki boyutlu ızgarayı (B-Taramalar), bir raster tarama deseni kullanarak 2B kesitsel görüntülere karşılık gelen doğrusal tek boyutlu tarama çizgilerinin (A-Taramalar) bir koleksiyonu olarak alır. Farelerde miyopiye odaklanan çalışmalar için, bu sistem aynı zamanda oküler yapıların boyutlarını ölçmek için de kullanılır (örneğin, kornea kalınlığı, lens kalınlığı, vitreus odası derinliği ve eksenel uzunluk).
Mevcut sistem, kullanıcıların kendi protokollerini tasarlamalarına, ilgilendikleri oküler yapılara göre uyarlanabilen ve seçilebilen taramalar oluşturmalarına olanak tanır. Bu kullanıcı tanımlı protokollerde yer alan temel taramalar, bu görüntüleme tekniğini kullanıcı dostu hale getirir. Görüntü analizleri için, matematiksel modelleme programında özelleştirilmiş programlama geliştirdik. SD-OCT, oküler yapılardaki patomorfolojik değişiklikleri non-invaziv olarak tanımlamak ve ölçmek ve görme ile ilişkili hastalık progresyonunu izlemek için güçlü bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm prosedürler Atlanta Veterans Affairs Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzuna uygun hale getirilmiştir (NIH Yayınları, 8. baskı, güncellenmiş 2011).
NOT: Aşağıdaki protokolü geliştirmek için kullanılan SD-OCT sistemi Malzeme Tablosunda açıklanmıştır. Bazı prosedürler bu özel sisteme özgü olsa da, genel yaklaşım diğer OCT cihazları ve hayvan modelleri için uyarlanabilir. Ayrıca, laboratuvarımızda bu protokoller farelerde ve sıçanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır; Bununla birlikte, genel yaklaşım, bir bireyin cihazında doğru lens ve yeteneklere sahip olması koşuluyla farklı hayvan modellerine ve SD-OCT cihazlarına uyarlanabilir.
1. Optik koherens tomografi cihazını kurun
- SD-OCT yazılımını açın (Malzeme Tablosu).
- OCT'yi, çalışmayı ve tedavi kolunu (eğer ilgiliyse) kimin aldığını tanımlayın. Bu kategorileri, araştırmacıların daha sonra veri analizi sırasında istenen taramaları aramalarına yardımcı olacak şekilde adlandırın.
- Hasta/Sınav sekmesinde, Test Examiner'ı tıklatın. Sınav görevlisinin adını seçin. Yeni denetçiler eklemek için Sınav Görevlileri ve Doktorları Ayarla düğmesini kullanın.
- Etüdü tanımlamak için Etüt Adı'nı tıklatın. Yeni bir etüt eklemek veya mevcut bir etütteki tedavileri değiştirmek için Etüt sekmesine tıklayın. Bir tedavi kolu seçmek için Tedavi Kolunu Seç'in sağına tıklayın.
- Tüm grup için yeni bir zaman noktası eklemek üzere kullanılan Hasta Ekle düğmesini tıklatın. Pencere göründüğünde kimlik numarası, Ad ve Soyadı girin. Erkek veya Kadın'ı seçin. Doğum Tarihi'ni girin.
- Tek tek fareleri eklemek için Sınav Ekle düğmesini tıklatın. Sıçanları tanımlamak için bir sınava tıklayın. Edit Exam'ı (Sınavı Düzenle) tıklayın. Kimlik numarasını Notları Gir kutusuna girin . Değişiklikleri Kaydet düğmesini tıklatın.
- Uygun lensi cihaza takın (Şekil 1B), yazılımda ilgili Yapılandırmayı seçin ve ilişkili referans kolu konumunda çevirin.
NOT: Açıklanan SD-OCT sistemi, hayvan türüne ve görüntülenen göz bölgesine (retina veya kornea, fare veya sıçan) özgü özelleştirilmiş lenslere, önceden ayarlanmış tarama desenlerine ve referans kolu ayarlarına sahiptir. Bu detaylardan bazıları açıklanan SD-OCT sistemine özgüdür (bkz. malzeme tablosu). Örneğin, tüm cihazlar referans kolu yol uzunluğunun manuel olarak ayarlanmasını sağlamaz. - Hasta/Sınav sekmesinde, Görüntüleme sekmesine devam etmek ve görüntülemeye başlamak için vurgulanan sınavı çift tıklatın veya Görüntüleme sekmesini tıklatın. Varsayılan bir tarama varsa, silmek için sağ tıklayın.
- Listeden bir protokol seçin düğmesini tıklatarak önceden ayarlanmış bir Tarama Protokolü yükleyin. Alternatif olarak, tek tek taramalar ekleyin.
- Glokom ve diyabetik retinopatinin sıçan modelleri ve retinal dejenerasyonun fare modelleri için, dört görüntüden oluşan bir ön ayar seçin: 2 OD ve 2 OS taraması. Fare miyopisi için, 8 görüntüden oluşan bir ön ayar seçin: 4 OD ve 4 işletim sistemi taraması.
NOT: Önceden ayarlanmış görüntüleme, Bölüm 3'te daha ayrıntılı olarak açıklanacaktır. Bu, her laboratuvarın yerinde kurulum sırasında kendileri için veya üreticiyle yaptığı bir şeydir.
2. Hayvanı anestezi altına alın
- Anestezi uygulayın.
- Sıçanları intraperitoneal enjeksiyon yoluyla ketamin (60 mg / kg) ve ksilazin (7.5 mg / kg) ile uyuşturun.
- İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla fareleri ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (16 mg / kg) ile anestezi altına alın.
- Hayvanlar tamamen uyuşturulana kadar bekleyin ve ayak parmağı sıkışmasına cevap vermeyin.
- Öğrenci dilatasyon damlalarını uygulayın (% 1 tropikamid). Görüntülemeden önce öğrencilerin genişlemesini bekleyin.
NOT: Öğrencilerin genişlemesi görüş alanını arttırır, ancak bir gereklilik değildir. Gözü uyuşturmak için lokal (kornea) anestezik damlalar (% 0.5 tetrakain), göze dokunacak bir şey varsa da kullanılmalıdır (örneğin, kontakt lens kullanıyorsanız veya bir kılavuz kullanıyorsanız). Kılavuz, tarama kafasının üzerine yerleştirilen ve yeni başlayanların gözü ve tarama kafasını hizalamasına yardımcı olan bir cihazdır. - Kemirgenleri anestezi altına aldıktan sonra, kemirgeni hayvanı 3 boyutlu uzayda döndürebilen bir kemirgen hizalama sistemine yerleştirin (Şekil 1A, 1C ve 1D). Termal destek sağlayın.
NOT: Şu anda, SD-OCT cihazı ile tasarlanan ve satılan fareler ve sıçanlar için kemirgen hizalama sistemleri kullanıyoruz. - Gözleri yağlanmış tutmak için sıvı (örneğin, tuzlu su veya yapay gözyaşları) uygulayın. Görüntüleme sırasında gözün kurumadığından emin olun, böylece taramalar arasında gözün optik özellikleri korunur (kornea ıslandığında, retina net bir şekilde görülebilir).
- İlk gözü tararken karşı gözdeki nemi koruduğunuzdan emin olun, böylece kurumaz.
- Görüntülemeden hemen önce fazla salini uzaklaştırmak için hassas bir görev mendili kullanın, çünkü gözdeki çok fazla veya çok az kayganlaştırıcı görüntü kalitesini etkileyecektir.
NOT: OCT sırasında steril yağlayıcı jel kullanılması önerilmez, çünkü görüntülemeye müdahale edebilir. Gerekirse, işlemden sonra steril yağlayıcı jel kullanılabilir. Test boyunca gözde yeterli nemi sağlamak için bir kontakt lens de uygulanabilir. Deneyimlerimize göre, bir kontakt lens görüntü kalitesinde belirgin bir iyileşme sağlamamıştır, ancak kontakt lensler görüntüleme seansı sırasında kornea kuruma riskini azaltmaya yardımcı olmaktadır.
3. Kemirgen OCT görüntüleme
- Bir gözle başlayın (OS veya OD) ve ardından kontralateral gözü görüntüleyin.
- Kemirgen hizalama sisteminin iki dönme hareketini kullanarak hayvanı, bakışlar yatay olacak ve OCT Lensin ekseninden aşağıya bakacak şekilde konumlandırın (Şekil 1D).
- Veri toplama amacıyla retinayı yönlendirmek için OCT'yi Serbest Çalışma modunda kullanın. Hem yatay hem de dikey B taramalarının gerçek zamanlı olarak sürekli görüntülenmesi için başlangıçta Nişan Alma modunu (Nişan Al düğmesine tıklayarak) kullanın.
- Retina görünene kadar tarama kafasını göze yaklaştırın (fare ve sıçan retina lensleri sabit odaklı olduğundan, lensi göze doğru hareket ettirmek retinanın derinliklerine odaklanır). Ardından, hayvan pozisyonunu yukarı/aşağı ayarlamak için kemirgen hizalama sistemini kullanın ve optik sinir kafasını merkeze konumlandırmak, yatay taramayı yatay yapmak ve dikey taramayı dikey yapmak için döndürmek / bükmek (Şekil 1A).
- Çalışma mesafesini, retinal görüntü düz olacak ve kavisli olmayacak şekilde ayarlayın.
- Görüntüyü ekran penceresinin üst kısmına yakın tutmak için referans kolu konumunu ayarlayın. Çok fazla zorlamamaya dikkat edin, aksi takdirde göz görüntüsü kendi kendine geri döner.
- Retinal görüntüleme
- Glokom, retina dejenerasyonu ve diyabetik retinopati modelleri için: Ortalama almak için 1000 x 100 x 1'den (A taramaları x B taramaları x tekrarlanan B taramaları) oluşan bir hacim taraması tanımlayın. Sıçanlarda, 3 x 3 mm boyutunda bir hacim taraması yapın. Farelerde, 1,5 x 1,5 mm hacimli bir tarama yapın.
- Optik siniri yatay ve dikey erişimde ortalayın, böylece hacim taraması merkezde olur. Optik sinir kafasının taramanın merkezinde ve nazal-temporal ve üst-inferior eksenler boyunca düz olduğundan emin olmak için zaman ayırın (Şekil 2). Gerekirse tam olarak merkezde olduğundan emin olmak için tarayın ve yeniden ortalayın. Optik sinir kafası ortalanana ve her iki eksen boyunca hizalanana kadar bu taramayı gerektiği gibi tekrarlayın. Fotoğraf çekmek için Anlık Görüntü düğmesini tıklatın.
NOT: Bazı SD-OCT cihazları, referans kolu ile gözün ışık kaynağından uzaklığını ayarlayarak gözün eğriliğini optik olarak manipüle etme (örneğin, görüntü düzleştirilmiş) seçeneğine sahiptir. Anterior-posterior yön boyunca doğruluğu artırmak için retina katmanları boyunca doğrudan kalınlık ölçümleri alırken görüntüleri düzleştirmenizi ve ortalamanızı öneririz. - Görüntüyü kaydetmek için Kaydet düğmesini tıklatın.
- Optik sinir kafasında ortalanmış 1000 x 4 x 20 (A-tarama x B-tarama x tekrarlanan B-taramaları) olan radyal bir tarama yapın. Veri analizi sırasında gözün bölgelerini veya retina katmanlarını yorumlamaya yardımcı olacak gözün veya retinanın görüntü netliğini artırmak için tekrarlanan B taramaları kullanın.
NOT: Yine, sıçanlarda bu radyal tarama 3 mm, farelerde ise radyal tarama 1,5 mm'dir. - Resmi kaydedin.
- Kontralateral gözde 3.1 ile 3.2.5 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Eksenel uzunluk ölçümleri
- Fare miyopisi gibi tüm gözün görüntülenmesini içeren projeler için, tüm gözün üç taramasını ve her göz için bir retina taraması yapın. 500 x 20 x 1 boyutunda ve gözün tam çapını kapsayan radyal taramadan oluşan bir ön ayar seçin.
NOT: Bu ayar, korneadan koroide kadar fare gözünün tüm uzunluğunun bir görüntüsünü sağlar. - Gözün ve retinanın ortasını görüş alanında ortalayın. Üç radyal tarama yapın (tüm göz taramaları): 1000 x 5 x 2 boyutunda doğrusal bir B taraması ve aynı konumda 1000 x 5 x 2'lik iki ek doğrusal B taraması. Görüntüleri kaydedin.
- Daha sonra, istenirse, yakınlaştırın ve 1000 x 20 A taramaları x B taramalarından oluşan 3.2'deki açıklamaya benzer bir hacim veya dikdörtgen tarama (retina taraması) yapın. Birim taramasını kaydedin.
- Kontralateral gözde 3.3 ile 3.3.3 arasındaki adımları tekrarlayın.
NOT: Eksenel uzunluk ölçümleri yalnızca küçük gözlerde (fare veya daha küçük) mümkündür, çünkü mevcut sistemlerin görüntüleme penceresi daha büyük bir gözü yakalamak için yeterince büyük değildir.
- Fare miyopisi gibi tüm gözün görüntülenmesini içeren projeler için, tüm gözün üç taramasını ve her göz için bir retina taraması yapın. 500 x 20 x 1 boyutunda ve gözün tam çapını kapsayan radyal taramadan oluşan bir ön ayar seçin.
4. Görüntüleme sonrası adımlar
- Kayıtlı verileri, veri yönetimi için iyi bir uygulama olan ve daha sonra analiz için kolay erişim sağlayan bir bulutta depolayın. Bir matematiksel modelleme programında (Malzeme Tablosu) geliştirilen özel bir yazılımla veri analizi yapın.
- Kemirgenleri kemirgen hizalama sisteminden çıkarın ve ksilazinin etkilerini tersine çevirmek için intraperitoneal bir atipamezol enjeksiyonu (sıçanlar ve fareler için 1 mg / kg) verin, böylece kemirgen daha çabuk uyanır.
- Kemirgenlerin düşük ateşte bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin. Gerektiğinde ek tuzlu su damlaları verin. Kemirgenleri, tam ambulasyonu geri kazandıklarında ev kafeslerine geri döndürün.
- Programı kapatın ve OCT'yi kapatın.
5. OCT görüntülerinin sonradan işlenmesi
- Belirli OCT ihtiyaçlarına uyacak şekilde matematiksel bir modelleme programında geliştirilen özel yazılımı kullanarak görüntüleri işleyin (örneğin; görüntüleri manuel olarak işaretleyerek ilgi alanlarının kalınlığını ölçün).
- Görüntünün amacına bağlı olarak (fare retinası, sıçan retinası veya miyopi/eksenel uzunluk), üç farklı programdan birini kullanın:
- Retinayı işlemek için, yüklenecek OCT taramalarını seçin. İlk olarak, optik sinir kafasının merkezini basit bir tıklama ile tanımlayın.
- Program, optik sinir kafasının her iki tarafındaki mesafeleri tanımlayan dikey çizgiler oluştururken izleyin. Sıçan retinasında, bu çizgilerin optik sinir başının merkezinden 0,5 mm ve 1,2 mm uzakta olduğunu, şu anda analiz edilen radyal B taramasına bağlı olarak gözün nazal-temporal ve inferior-superior eksenlerini temsil eden toplam 4 dikey çizgi olduğunu unutmayın.
NOT: Fare retinasında, bu dikey çizgiler optik sinir başı merkezinden 0,25 mm ve 0,5 mm uzaklıktadır. - Her satır boyunca aşağıdaki katmanları tanımlayın:
Retinal sinir lifi tabakası (RNFL), iç pleksiform tabaka (IPL), iç nükleer tabaka (INL), dış pleksiform tabaka (OPL), dış nükleer tabaka (ONL), dış sınırlayıcı membran (ELM), iç segmentler/dış segmentler (IS/OS), retinal pigment epiteli (RPE) ve toplam retina kalınlığı.
NOT: Radyal tarama, açıldığında tipik olarak nazal/temporal ve üst/alt etiketlere sahip değildir. Taramalar, n / t ve s / I yönüne sahip olacak şekilde oluşturulabilir ve özellikle bu taramalar daha sonra analiz edilir. - Bir görüntü tanımlandıktan ve program kapatıldıktan sonra, bu ölçümleri veri analizi için bir elektronik tablo yazılımına aktarın.
- Gruplar arasında karşılaştırmalar yapmak için adım 5'teki bu uzunluk ve kalınlık değerlerini kullanın, örneğin bölgesel farklılıklar (n/t/s/i) veya uzunlamasına değişiklikler olup olmadığını belirleyin.
- Retinal ölçümler için öncelikle 0,5 mm ve 1,2 mm mesafelerde nazal-temporal ve inferior-superior eksende herhangi bir fark olup olmadığını belirleyin.
NOT: Kadranlardaki farklılıklar gözlenmezse, 0,5 mm ve 1,2 mm ölçülerinin ortalaması birlikte alınabilir. Bu, yalnızca 0,25 mm ve 0,5 mm'de fare retinal taramaları için benzer bir yaklaşımdır. - Miyopi çalışmaları için, gözün optik ekseni boyunca oküler parametreleri değerlendirmek için bu programı kullanın. Matematiksel modelleme programını açın. İlk olarak, yüklenecek bir görüntü seçin.
- Görüntüyü yükledikten sonra, her taramayı manuel olarak işaretleyin (radyal ve B taramaları). Korneanın ön ve arka kenarlarını, lensini, vitreus odacığını ve retinasını işaretleyin, böylece program kornea kalınlığını, lens kalınlığını, ön ve vitreus odası derinliğini, toplam retina kalınlığını, toplam eksenel uzunluğu hesaplayacaktır.
- İşaretledikten sonra, bir kaydet menüsü isteyen programdan çıkın. Açıklanan değerleri bir elektronik tablo yazılımına kaydedin ve üç ayrı taramanın ortalamasını birlikte alın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SD-OCT, oküler boyutların güvenilir bir şekilde ölçülebileceği şekilde yüksek kaliteli görüntüler elde edilirse başarılı kabul edilir. Burada, SD-OCT'nin çeşitli kullanımları retinal dejenerasyon, glokom, diyabetik retinopati ve miyopi modelleri kullanılarak gösterilmiştir.
Işığa bağlı retinal dejenerasyon (LIRD) modelinde, parlak ışığa (10.000 lüks) maruz kalmak, retinadaki fotoreseptör hücrelerin dejenerasyonunu indükler9. Temsili SD-OCT görüntüleri, LIRD BALB / c farelerinden retinalarda, hasarsız (kontrol) farelere kıyasla fotoreseptör hücre cisimciklerini içeren daha ince bir dış nükleer tabaka ortaya koymaktadır (Şekil 3 A& 3B). Retina tabakası kalınlığı ölçüldükten sonra, toplam retina kalınlığı (Şekil 3C), dış nükleer tabaka kalınlığı (Şekil 3D) ve IS/OS kalınlığı (Şekil 3E) için hasarsız ve LIRD fareler arasında anlamlı bir fark gözlenmiştir.
Glokomatöz hasarı deneysel olarak modellemek için, bir oküler hipertansiyon (OHT) 10 modeli kullandık. Kısacası, Kahverengi Norveç sıçanları (n = 35) bir gözün limbus damarına hipertonik salin enjeksiyonu alırken, kontralateral göz iç kontrol11 olarak görev yaptı. Glokom çalışmaları için retinal sinir lifi tabakası (RNFL) kalınlığını ölçtük. 8 haftalık OHT'den sonra, optik sinir kafasında, optik sinir kupası da dahil olmak üzere farklı bir yeniden yapılanma gözlemledik (Şekil 4 A& B). Daha sonra RNFL kalınlığını ölçtük ve temel ölçümlere kıyasla 8 haftalık OHT sonrası RNFL incelmesini bulduk (Şekil 4C).
Diyabetik retinopatiyi modellemek için, 2-3 haftalıkken hiperglisemi geliştiren obez olmayan, poligenik bir diyabet modeli olan Goto-Kakizaki sıçanları kullanıldı12,13. Goto-Kakizaki sıçanlarından ve Wistar sıçanlarından (diyabetik olmayan kontroller) retinalar SD-OCT kullanılarak görüntülendi (Şekil 5A & 5B). 6 haftalıkken, Goto-Kakizaki sıçanlarında RNFL ve toplam retina kalınlığı, merkezi retinadaki Wistar sıçanlarına (veriler gösterilmemiştir) ve periferik retinaya (Şekil 5C & 5D) kıyasla azalmıştır. En büyük farklılıklar retinanın inferior ve temporal kadranlarında gözlenmiştir (Şekil 5C&5D).
Miyopi için fare modellerini değerlendirmek için, eksenel uzunluk Bmal1-/- farelerde ölçüldü. Bmal1 ilgi çekici bir saat genidir, çünkü sirkadiyen ritimler miyopi gelişiminde rol oynayabilir14,15. Bmal1-/- fare gözünün eksenel uzunluğu (Şekil 6B), OCT görüntülerindeki vahşi tip gözden (Şekil 6A) gözle görülür şekilde daha uzundur. Eksenel uzunluğun nicelleştirilmesi, Bmal1-/- farelerin 84 günlükken önemli ölçüde daha uzun eksenel uzunluklara sahip olduğunu doğrulamaktadır (Şekil 6C), saat geninin eksikliğinin miyopi gelişimine katkıda bulunduğunu göstermektedir.
Bu protokol, retinal dejenerasyon, glokom, diyabetik retinopati ve miyopi modellerinde oküler yapıların görüntülerini üretti. Görüntüler, dış nükleer tabaka, retinal sinir lifi tabakası, toplam retina kalınlığı ve aksiyel uzunluk dahil olmak üzere oküler boyutların ölçülebileceği şekilde yeterli kalitedeydi. Sonuçlar, SD-OCT kullanılarak oküler yapıların boyutlarında in vivo olarak anlamlı farklılıklar gözlenebileceğini göstermiştir.
Resim 1: SD-OCT ekipmanının kurulumu.
(A) Kemirgen hizalama sisteminin ve OCT tarama kafasının resmi. (B) Sıçan ve fare OCT lenslerinin resmi. (C) 3 boyutlu uzayda hareket etme yeteneğini gösteren fare kemirgen hizalama sisteminin resmi. (D) Kemirgen hizalama sisteminin, özellikle de hareketini kontrol eden düğmelerin yakın çekimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SD-OCT örnek taraması.
Hacim veya radyal tarama yapmadan hemen önce fare retinasının canlı taramasının resmi. (A) nazal-temporal hizalamayı gösterirken, (B) üst-alt hizalamayı gösterir. Bu iki görüntüdeki retinalar kendi dikey veya yatay düzlemlerinde düz olduğunda ve optik sinir her iki görüntüde de ortalandığında, SD-OCT görüntüsünü elde etmeye devam ederiz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bir fare retinal dejenerasyon modelinde fotoreseptör tabakasının zaman içinde incelmesini izlemek için SD-OCT'yi kullanma.
(A) Bir BALB/c fareden hasarsız (kontrollü) retinanın temsili SD-OCT taraması. (B) Işık kaynaklı retinal dejenerasyon (LIRD) BALB/c faresinden retinanın temsili SD-OCT taraması. (C-E) Hasarsız ve LIRD Balb/c farelerde toplam retinal kalınlık (C), dış nükleer tabaka (ONL) kalınlığı (D) ve iç segment/dış segment (IS/OS) kalınlığının (E) miktarı. Ortalama ± SEM. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: SD-OCT kullanarak retina sinir lifi tabakası kalınlığında bir azalma ölçtük ve glokomun bir sıçan modelinde oküler hipertansiyonu indükledikten sonra optik sinir kupasını gözlemledik.
(A) Oküler hipertansiyonu indüklemeden önce alınan bir sıçan gözünden retina ve optik sinir başının temsili SD-OCT taraması (Başlangıç: OHT). (B) 8 haftalık OHT sonrası aynı sıçan retinasının SD-OCT taraması (glokomun deneysel modeli). (C) Retinal sinir lifi tabakası (RNFL) kalınlığının OHT gözlere kıyasla taban çizgisinde miktarının ölçülmesi. Sem'± ortalama. Bu veriler Feola ve ark.11'den değiştirilmiştir Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Bir sıçan diyabet modelinde toplam retina kalınlığının azalmasının yanı sıra spesifik retinal tabakaların kalınlığının azaldığını gözlemlemek için SD-OCT kullanımı.
(A) Bir Wistar (Wild-type control) sıçanından retinanın temsili SD-OCT taraması. (B) Goto-Kakizaki (diyabetik) sıçanından retinanın temsili SD-OCT taraması. Retina tabakaları: retinal sinir lifi tabakası (RNFL), iç pleksiform tabaka (IPL), iç nükleer tabaka (INL), dış pleksiform tabaka (OPL), dış nükleer tabaka (ONL), dış sınırlayıcı membran (ELM), iç segmentler/dış segmentler (IS/OS), retinal pigment epiteli (RPE) ve toplam retina kalınlığı (TRT). (C-D) Wistar ve Goto-Kakizaki retinalarında RNFL (C) ve toplam retina kalınlığının (D) miktarının belirlenmesi, merkezi çizginin ortalama ve gölgeli alanın dört kadran için de SEM olduğu (Sup, Superior; Sıcaklık, Zamansal; Inf, Inferior; Nas, Nasal) periferik retinanın (optik sinir kafasından 1.2 mm). ** p 0,01 <, *** p 0,001 <. Bu rakam Allen ve ark.13'ten değiştirilmiştir Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Bir fare miyopi modelinde eksenel uzunluğu değerlendirmek için SD-OCT kullanımı.
84 günlükken vahşi tip (A) ve Bmal1-/ - (B) fare gözlerinin tüm göz SD-OCT görüntüleri. Bmal1-/- farelerin gözleri, vahşi tip gözlerden (C) önemli ölçüde daha uzun eksenel uzunluğa sahiptir. AL: eksenel uzunluk; RT: retina kalınlığı; VCD: vitreus odası derinliği; LT: lens kalınlığı; ACD: ön kamara derinliği; BT: kornea kalınlığı. Uzun dikey çizgi, vahşi tip göz için eksenel uzunluk sınırlarını (üst ve alt kısım yatay çizgi ile gösterilir) gösterir. Kısa ok, Bmal1-/- gözü için arka eksenel uzunluk işaretini gösterir. Sem'± ortalama. Her görüntünün ortasındaki merkezi çizgi (A & B) dikey bir doygunluk eseridir. Genellikle gözü ortalamak için bir kılavuz olarak kullanılır, ancak tarama iyi hizalanmışsa, kaybolması sağlanabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oküler yapıların in vivo yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi, zaman içinde retina ve oküler değişikliklerin değerlendirilmesine olanak sağlar. Bu protokolde SD-OCT'nin retinal dejenerasyon, glokom, diyabetik retinopati ve miyopi modellerinde in vivo oküler yapılardaki farklılıkları yakaladığı gösterilmiştir.
SD-OCT yaparken en kritik husus, retinanın veya ilgilenilen diğer oküler yapının net bir görüntüsünü elde etmektir. Retinanın mükemmel bir şekilde ortalandığından ve mükemmel netliğe sahip olduğundan emin olmak için zaman ayırmak önemlidir. Kemirgen tarafından ağır nefes alınması gürültülü görüntülere neden olabilir (retinanın aslında ekranda kıpırdadığı görülebilir). Bu bazen bir hayvan anestezik uygulamadan sonra tamamen bilinçsiz değilse olur. Bu soruna geçici bir çözüm bulmak için, retina katmanlarının sınırlarının nerede olduğunu görselleştirmeye yardımcı olmak için birden fazla B taramasının ortalaması alınabilir ve ardından en iyi tek B tarama görüntüsü analiz edilebilir.
Bir diğer yaygın hata, gözün çok kuru veya çok ıslak olmasıdır. Bu, ek bir damla salin uygulayarak, bir laboratuvar mendili ile uzaklaştırarak ve görüntünün netlikte iyileşip iyileşmediğini değerlendirerek kolayca kontrol edilebilir. SD-OCT görüntülerde retinal tabaka kalınlıklarını işaretlerken dikkate alınması gereken bir husus, RNFL'nin nasıl işaretleneceğidir. Bazı kemirgen OKT'lerde RNFL ve GCL arasında ayrım yapmak mümkün olsa da, genellikle bu iki katman ayırt edilemez. Tutarlılık için, tüm RNFL bölgesini (görünür olduğunda RNFL + GCL) RNFL olarak işaretleriz. Bazı çalışmalar RNFL ve GCL'yi ayrı katmanlar olarak bildirmekte veya GCL ve iç pleksiform tabaka16,17,18'i birleştirmektedir, ancak bu araştırma tipik olarak kemirgenlerden çok daha büyük gözleri olan insanlarda gerçekleştirilmiştir. RNFL kalınlığının raporlanması kemirgen çalışmalarında daha tipiktir11,13,19,20. Bir diğer önemli konu ise işaretlemedeki çok ufak değişikliklerin, ölçülen yapıların küçük boyutlarından dolayı özellikle miyoplukta çok büyük bir değişikliğe neden olabilmesidir. Örneğin, ölçümdeki 6 μm'lik bir fark,kırılma hatası 21'deki bir diyoptri değişimine eşittir. Küçük değişiklikler ölçümde bu kadar büyük bir fark yarattığından, görüntü netliği kritik öneme sahiptir.
Bu protokolün ve genel olarak SD-OCT'nin bir sınırlaması, iyi bir görüntü için net oküler ortamın gerekli olmasıdır. Örneğin, kornea lezyonları, lens anormallikleri ve katarakt, kullanıcıların net görüntüler elde etmesini engelleyebilir. Bu, diyabetik retinopati görüntülemesinde bir sorundur, özellikle de diyabetik kemirgenlerde katarakt yaygın olarak geliştiğiiçin 22. Katarakt veya diğer oküler sorun küçükse, bazen tarama kafasını etrafında manevra yapmak mümkündür. Daha büyük oküler ortam bozulmaları için, retinal OCT görüntüleri elde etmek imkansızdır. Bu retinalar, retinal histoloji berrak oküler ortama bağlı olmadığından histoloji kullanılarak araştırılabilir.
Diğer bir sınırlama ise, eksüda ve kanamalar gibi hiperreflektif lezyonların yanı sıra majör retinal damarların altta yatan retinal yapıların gölgelenmesine neden olması ve böylece altta yatan morfolojinin ayrıntılarının kaybolmasıdır. Retina kalınlığının 400 μm'nin üzerinde olduğu koroidal neovasküler membran ve diyabetik retinopati/makula ödemi gelişen bir olguda, altta yatan patolojiyi ve koroid23'ü ayırt etmek zordu. Ek olarak, SD-OCT yalnızca belirli konumlardaki kalınlığı değerlendirmek için kullanılabilir. SD-OCT ayrıca koroidi görüntülemek ve tüm gözlerin görüntülenmesi için sınırlı bir penetrasyon derinliğine sahiptir (tüm göz bir farede görüntülenebilir, ancak daha büyük hayvanlarda görüntülenemez). Diğer bir sınırlama ise, floresan veya diğer belirteçlerin, taramalı lazer oftalmoskopide (SLO) olduğu gibi SD-OCT ile kullanılamamasıdır. Bununla birlikte, tipik SLO cihazları, retina tabakalarının SD-OCT ile gözlemlenen aynı kolaylıkla enine kesitte görselleştirilmesine izin vermez. Son olarak, SD-OCT ile çözünürlük mükemmel değil. Bununla birlikte, SD-OCT'nin başlangıcında mevcut olan çözünürlüğe göre çok daha iyi ve zamanla gelişmeye devam ediyor.
Sonuç olarak, SD-OCT tekniğinin avantajları ve önemi, oküler yapıların in vivo görüntülenmesine ve zaman içinde oküler boyutlardaki değişikliklerin kantitatif olarak izlenmesine olanak sağlaması ve bu görüntülemeyi hızlı tarama hızıyla gerçekleştirmesidir. SD-OCT'nin yüksek çözünürlüğü nedeniyle, çıplak gözle gözlemlenemeyen ince farklılıkları tespit etmek için kullanılabilir (Şekil 4 ve Şekil 5). Ayrıca, SD-OCT, bir dizi hastalık ve yaralanma modelinde gözün çoklu parametrelerini ölçmek için kullanışlı bir araçtır. Sadece bu protokolde, retinal dejenerasyon ve diyabetik retinopati modellerinde retina kalınlığını, glokom modelinde retina kalınlığını ve kupasını ve miyopi modelinde eksenel uzunluğu ölçmek için SD-OCT kullanılmıştır. SD-OCT ayrıca kornea eğriliği24'ü ölçmek, patlama ve travmatik beyin hasarı sonrası retina değişikliklerini değerlendirmek 19,25,26, yaşa bağlı makula dejenerasyonunda patolojiyi tanımlamak 27 ve oküler enjeksiyonlar sırasında ve sonrasında retina sağlığını izlemek için de kullanılabilir 28 ve retina altı implantlar gibi protez cihazların retinal yerleştirilmesi 29. Ağaç sivri fareleri30 ve insan olmayan primatlar31 gibi diğer hayvan modellerinde de kullanılabilir. SD-OCT ayrıca retinal patolojiyi kadran (üstün, inferior, nazal, zamansal) ve lokalizasyona (merkezi ve periferik) göre lokalize etmek için de kullanılabilir. Gelecekteki SD-OCT cihazları daha da yüksek çözünürlük elde edecek. Ek olarak, OCT anjiyografi, retinal vaskülatür boyunca hareket ederken lazer ışığının kırmızı kan hücrelerinin yüzeyinden yansıması kullanılarak retinal ve koroidal mikrovaskülatürün görüntülenmesine izin vermektedir32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Gazi İşleri Bakanlığı Rehabilitasyon Ar-Ge Hizmeti Kariyer Geliştirme Ödülleri (CDA-1, RX002111; CDA-2; RSA'ya RX002928), MTP'ye Liyakat Ödülü (RX002615) ve Araştırma Kariyer Bilim İnsanı Ödülü (RX003134), AJF'ye Kariyer Geliştirme Ödülü (CDA-2, RX002342), MTP'ye EY028859, NEI Core Grant P30EY006360, Körlüğü Önleme Araştırması ve Körlükle Mücadele Vakfı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% tropicamide | Sandoz | Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59 | |
| 0.5% tetracaine | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| AIM-RAS G3 120 V | Leica Bioptigen | 90-AIMRAS-G3-120 | Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice |
| Celluvisc gel | REFRESH CELLUVISC | #4554; NDC-0023-4554-30 | |
| G3 18 mm Telecentric Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-18 | |
| G3 Mouse Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-M | |
| G3 Rat Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-R | |
| heating pad | Fabrication | 11-1130 | |
| InVivoVue software | Leica Bioptigen | Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system | |
| MATLAB | Mathworks | mathematical modeling program | |
| Mouse/Rat Kit | Leica Bioptigen | 90-KIT-M/R | Mouse/rat rodent alignment system |
| saline | ADDIPAK | 200-39 | |
| System Envisu R4300 VHR 120 V | Leica Bioptigen | 90-R4300-V1-120 | SD-OCT system |
References
- Wojtkowski, M., et al. Ultrahigh-resolution, high-speed, Fourier domain optical coherence tomography and methods for dispersion compensation. Optics Express. 12 (11), 2404-2422 (2004).
- Nassif, N., et al. In vivo high-resolution video-rate spectral-domain optical coherence tomography of the human retina and optic nerve. Optics Express. 12 (3), 367-376 (2004).
- Theelen, T., Teussink, M. M. Inspection of the Human Retina by Optical Coherence Tomography. Methods in Molecular Biology. 1715, 351-358 (2018).
- Nakazawa, M., Hara, A., Ishiguro, S. I. Optical Coherence Tomography of Animal Models of Retinitis Pigmentosa: From Animal Studies to Clinical Applications. Biomed Research International. 2019, 8276140 (2019).
- Drexler, W., et al. Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography. Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).
- VanLeeuwen, J. E., et al. Altered AMPA receptor expression with treadmill exercise in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned mouse model of basal ganglia injury. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 650-668 (2010).
- Tian, J., et al. Performance evaluation of automated segmentation software on optical coherence tomography volume data. Journal of Biophotonics. 9 (5), 478-489 (2016).
- Kraus, M. F., et al. Motion correction in optical coherence tomography volumes on a per A-scan basis using orthogonal scan patterns. Biomedical Optics Express. 3 (6), 1182-1199 (2012).
- Boatright, J. H., et al. Tool from ancient pharmacopoeia prevents vision loss. Molecular Vision. 12, 1706-1714 (2006).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
- Goto, Y., Kakizaki, M., Masaki, N. Production of spontaneous diabetic rats by repetition of selective breeding. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 119 (1), 85-90 (1976).
- Allen, R. S., et al. Retinal Deficits Precede Cognitive and Motor Deficits in a Rat Model of Type II Diabetes. Investigative Ophthalmolology & Visual Science. 60 (1), 123-133 (2019).
- Stone, R. A., et al. Altered ocular parameters from circadian clock gene disruptions. PLoS One. 14 (6), 0217111 (2019).
- Chakraborty, R., et al. Circadian rhythms, refractive development, and myopia. Ophthalmic & Physiological Optics. 38 (3), 217-245 (2018).
- Davies, E. C., et al. Retinal ganglion cell layer volumetric assessment by spectral-domain optical coherence tomography in multiple sclerosis: application of a high-precision manual estimation technique. Journal of Neuro-ophthalmology. 31 (3), 260-264 (2011).
- Carnevali, A., et al. Optical coherence tomography angiography analysis of retinal vascular plexuses and choriocapillaris in patients with type 1 diabetes without diabetic retinopathy. Acta Diabetologica. 54 (7), 695-702 (2017).
- Springelkamp, H., et al. Population-based evaluation of retinal nerve fiber layer, retinal ganglion cell layer, and inner plexiform layer as a diagnostic tool for glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 8428-8438 (2014).
- Allen, R. S., et al. Long-Term Functional and Structural Consequences of Primary Blast Overpressure to the Eye. Journal of Neurotrauma. 35 (17), 2104-2116 (2018).
- Zhao, D., et al. Age-related changes in the response of retinal structure, function and blood flow to pressure modification in rats. Scientific Reports. 8 (1), 2947 (2018).
- Schmucker, C., Schaeffel, F. A paraxial schematic eye model for the growing C57BL/6 mouse. Vision Research. 44 (16), 1857-1867 (2004).
- Aung, M. H., Kim, M. K., Olson, D. E., Thule, P. M., Pardue, M. T. Early visual deficits in streptozotocin-induced diabetic long evans rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (2), 1370-1377 (2013).
- Puzyeyeva, O., et al. High-Resolution Optical Coherence Tomography Retinal Imaging: A Case Series Illustrating Potential and Limitations. Journal of Ophthalmology. 2011, 764183 (2011).
- Liu, A. S., et al. Topography and pachymetry maps for mouse corneas using optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 190, 107868 (2020).
- Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino, E., Kardon, R. H., Harper, M. M. Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (5), 3440-3450 (2013).
- Harper, M. M., et al. Blast-Mediated Traumatic Brain Injury Exacerbates Retinal Damage and Amyloidosis in the APPswePSENd19e Mouse Model of Alzheimer's Disease. Investigative Ophthalmology Visual Science. 60 (7), 2716-2725 (2019).
- Zhang, M., et al. Advanced image processing for optical coherence tomographic angiography of macular diseases. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4661-4675 (2015).
- Muhlfriedel, R., et al. Optimized Subretinal Injection Technique for Gene Therapy Approaches. Methods in Molecular Biology. 1834, 405-412 (2019).
- Adekunle, A. N., et al. Integration of Perforated Subretinal Prostheses With Retinal Tissue. Translational Vision Science & Technology. 4 (4), 5 (2015).
- Sajdak, B. S., et al. Noninvasive imaging of the tree shrew eye: Wavefront analysis and retinal imaging with correlative histology. Experimental Eye Research. 185, 107683 (2019).
- Dominik Fischer, M., et al. Detailed functional and structural characterization of a macular lesion in a rhesus macaque. Documenta Ophthalmologica. 125 (3), 179-194 (2012).
- Hagag, A. M., Gao, S. S., Jia, Y., Huang, D. Optical coherence tomography angiography: Technical principles and clinical applications in ophthalmology. Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (3), 115-129 (2017).
- Treister, A. D., et al. Prevalence of Subclinical CNV and Choriocapillaris Nonperfusion in Fellow Eyes of Unilateral Exudative AMD on OCT Angiography. Translational Vision Science & Technology. 7 (5), 19 (2018).
