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Bioengineering

Évaluations structurales in vivo des maladies oculaires dans des modèles de rongeurs utilisant la tomographie par cohérence optique

Published: July 24, 2020 doi: 10.3791/61588
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2,3
1Center of Excellence for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Ophthalmology, Emory University

Summary

Ici, nous décrivons l’utilisation de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) pour visualiser les structures rétiniennes et oculaires in vivo dans des modèles de dégénérescence rétinienne, de glaucome, de rétinopathie diabétique et de myopie.

Abstract

La tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) est utile pour visualiser les structures rétiniennes et oculaires in vivo. En recherche, le SD-OCT est un outil précieux pour évaluer et caractériser les changements dans une variété de modèles de maladies et de blessures rétiniennes et oculaires. Dans les modèles de dégénérescence rétinienne induite par la lumière, le SD-OCT peut être utilisé pour suivre l’amincissement de la couche photoréceptrice au fil du temps. Dans les modèles de glaucome, le SD-OCT peut être utilisé pour surveiller la diminution de la couche de fibres nerveuses rétiniennes et de l’épaisseur totale de la rétine et pour observer les ventouses du nerf optique après avoir induit une hypertension oculaire. Chez les rongeurs diabétiques, le SD-OCT a aidé les chercheurs à observer une diminution de l’épaisseur totale de la rétine ainsi qu’une diminution de l’épaisseur de couches rétiniennes spécifiques, en particulier la couche de fibres nerveuses rétiniennes avec la progression de la maladie. Dans les modèles murins de myopie, le SD-OCT peut être utilisé pour évaluer les paramètres axiaux, tels que les changements de longueur axiale. Les avantages du SD-OCT comprennent l’imagerie in vivo des structures oculaires, la capacité de suivre quantitativement les changements dans les dimensions oculaires au fil du temps, ainsi que sa vitesse de balayage rapide et sa haute résolution. Ici, nous détaillons les méthodes de SD-OCT et montrons des exemples de son utilisation dans notre laboratoire dans des modèles de dégénérescence rétinienne, de glaucome, de rétinopathie diabétique et de myopie. Les méthodes comprennent l’anesthésie, l’imagerie SD-OCT et le traitement des images pour les mesures d’épaisseur.

Introduction

La tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) est une modalité d’imagerie précise à haute résolution qui permet aux cliniciens et aux chercheurs d’examiner les structures oculaires de manière non invasive. Cette technique d’imagerie est basée sur l’interférométrie pour capturer des images rétiniennes tridimensionnelles in vivo à l’échellemicrométrique 1,2. Il est devenu l’une des modalités d’imagerie les plus fréquemment utilisées dans la recherche sur la vision et en clinique en raison de la détection facile et de la précision des caractéristiques pathologiques telles que les défauts structurels et / ou l’amincissement des couches rétiniennes et du liquide sous-rétinien3. Dans le cadre de recherches utilisant des modèles animaux de troubles liés à la vision, le SD-OCT a fourni des analyses non invasives essentielles des relations entre la structure et la fonction et de leurs origines histopathologiques4. En raison de sa résolution (jusqu’à 2-3 microns, selon la profondeur dans l’œil5), SD-OCT a la capacité de détecter même de petits changements dans l’épaisseur de la couche rétinienne. Ce type d’analyse peut fournir des informations essentielles pour la progression de la maladie et évaluer l’efficacité des méthodes neuroprotectrices et des traitements pour les troubles liés à la vision.

Le SD-OCT est une alternative non invasive à l’examen histologique de la structure, et il a été démontré que les deux sont corrélés6. Bien que le SD-OCT n’atteigne pas la résolution cellulaire, il permet des études longitudinales chez l’animal. Ceci est avantageux parce que la progression de la maladie peut être suivie chez des animaux individuels au fil du temps plutôt que d’avoir à euthanasier les animaux à des moments précis. Au fur et à mesure que les techniques d’imagerie continueront de s’améliorer, la technologie SD-OCT progressera également, offrant une qualité d’image améliorée ainsi que la capacité d’évaluer en détail les processus biologiques tels que la fonction des vaisseaux sanguins rétiniens. Même depuis son avènement en 1991, la technologie SD-OCT a connu d’énormes progrès en termes de résolution, de vitesse et de sensibilité7.

La présente étude utilise un système SD-OCT pour quantifier les changements dans les couches rétiniennes dans les modèles de rongeurs de dégénérescence rétinienne, de glaucome et de rétinopathie diabétique. Le système SD-OCT utilisé ici est un système OCT à domaine de Fourier qui utilise une lumière proche infrarouge de faible puissance pour acquérir, traiter et stocker des images résolues en profondeur en temps réel. Le système SD-OCT a une capacité d’imagerie de profondeur étendue dans la bande de longueur d’onde de 800 nm, offrant une profondeur de 8 mm et une résolution de 4 μm. Dans la détection du domaine de Fourier, le signal d’interférence entre la lumière diffusée du tissu et un chemin de référence est transformé de Fourier pour construire des balayages axiaux et/ou des profils de profondeur axiale d’intensité dispersée8. Pour les études ici, le faisceau OCT est balayé sur la structure rétinienne souhaitée tout en acquérant des balayages axiaux en série. En règle générale, un motif de balayage acquiert la grille bidimensionnelle (B-Scans) sous la forme d’une collection de lignes de balayage linéaires unidimensionnelles (A-Scans), qui correspondent à des images en coupe 2D à l’aide d’un motif de balayage raster. Pour les études axées sur la myopie chez la souris, ce système est également utilisé pour mesurer les dimensions des structures oculaires (par exemple, l’épaisseur de la cornée, l’épaisseur du cristallin, la profondeur de la chambre vitrée et la longueur axiale).

Le système actuel permet aux utilisateurs de concevoir leurs propres protocoles, en créant des scans qui peuvent être adaptés et sélectionnés en fonction des structures oculaires d’intérêt. Les principaux scans présentés dans ces protocoles définis par l’utilisateur rendent cette technique d’imagerie conviviale. Pour les analyses d’images, nous avons développé une programmation personnalisée dans un programme de modélisation mathématique. Le SD-OCT est un outil puissant pour identifier et quantifier de manière non invasive les changements pathomorphologiques dans les structures oculaires et surveiller la progression des maladies liées à la vision.

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Protocol

Toutes les procédures décrites ont été approuvées par l’Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee et conformes au guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications, 8e édition, mise à jour en 2011).

REMARQUE : Le système SD-OCT utilisé pour développer le protocole ci-dessous est décrit dans le tableau des matériaux. Bien que certaines procédures soient spécifiques à ce système particulier, l’approche globale peut être adaptée à d’autres dispositifs et modèles animaux de PTO. De plus, dans notre laboratoire, ces protocoles sont couramment utilisés chez les souris et les rats; cependant, l’approche globale peut être adoptée pour différents modèles animaux et dispositifs SD-OCT à condition qu’une personne dispose de l’objectif et des capacités appropriés sur son appareil.

1. Mettre en place l’équipement de tomographie par cohérence optique

  1. Ouvrez le logiciel SD-OCT (Table of Materials).
  2. Définir qui prend l’EAO, l’étude et le bras de traitement (le cas échéant). Nommez ces catégories de manière à aider les chercheurs à rechercher les analyses souhaitées plus tard au cours de l’analyse des données.
    1. Dans l’onglet Patient/Examen , cliquez sur Examinateur de test. Sélectionnez le nom de l’examinateur. Utilisez le bouton Configurer les examinateurs et les médecins pour ajouter de nouveaux examinateurs .
    2. Cliquez sur Nom de l’étude pour définir l’étude. Cliquez sur l’onglet Étude pour ajouter une nouvelle étude ou modifier des traitements dans une étude existante. Cliquez à droite de Select Treatment Arm pour sélectionner un bras de traitement.
  3. Cliquez sur le bouton Ajouter un patient , qui permet d’ajouter un nouveau point de temps pour un groupe entier. Lorsque la fenêtre s’affiche, entrez le numéro d’identification, le prénom et le nom. Sélectionnez Homme ou Femme. Entrez la date de naissance.
  4. Cliquez sur le bouton Ajouter un examen pour ajouter les rats individuels. Pour identifier les rats, cliquez sur un examen. Cliquez sur Modifier l’examen. Entrez le numéro d’identification dans la zone Entrer les notes . Cliquez sur le bouton Enregistrer les modifications .
  5. Fixez l’objectif approprié à l’appareil (Figure 1B), sélectionnez la configuration correspondante dans le logiciel et réglez la position du bras de référence associée.
    REMARQUE: Le système SD-OCT décrit a des lentilles personnalisées, des modèles de balayage prédéfinis et des réglages de bras de référence spécifiques à l’espèce animale et à la région de l’œil à imager (rétine ou cornée, souris ou rat). Certains de ces détails sont spécifiques au système SD-OCT décrit (voir tableau des matériaux). Par exemple, tous les appareils n’offrent pas un réglage manuel de la longueur du bras de référence .
  6. Dans l’onglet Patient/Examen , double-cliquez sur l’examen en surbrillance pour passer à l’onglet Imagerie et commencer l’imagerie ou cliquez simplement sur l’onglet Imagerie . S’il existe une analyse par défaut, cliquez avec le bouton droit de la souris pour la supprimer.
  7. Chargez un protocole d’analyse prédéfini en cliquant sur le bouton Sélectionner un protocole dans la liste . Vous pouvez également ajouter des analyses individuelles.
  8. Pour les modèles de rats de glaucome et de rétinopathie diabétique et les modèles murins de dégénérescence rétinienne, choisissez un préréglage composé de quatre images: 2 OD et 2 OS. Pour la myopie de souris, choisissez un préréglage composé de 8 images : 4 OD et 4 OS scans.
    REMARQUE: L’imagerie prédéfinie sera expliquée plus en détail dans la section 3. C’est quelque chose que chaque laboratoire fabrique pour lui-même ou avec le fabricant lors de l’installation sur site.

2. Anesthésier l’animal

  1. Administrer un anesthésique.
    1. Anesthésier les rats avec de la kétamine (60 mg/kg) et de la xylazine (7,5 mg/kg) par injection intrapéritonéale.
    2. Anesthésier les souris avec de la kétamine (80 mg/kg) et de la xylazine (16 mg/kg) par injection intrapéritonéale.
    3. Attendez que les animaux soient complètement anesthésiés et ne répondent pas au pincement des orteils.
  2. Administrer des gouttes de dilatation pupillaire (1% de tropicamide). Attendez que les pupilles se dilatent avant l’imagerie.
    NOTE: La dilatation des pupilles augmente le champ de vision mais n’est pas une exigence. Des gouttes anesthésiques locales (cornéennes) (0,5% de tétracaïne) pour engourdir l’œil doivent également être utilisées si quelque chose touche l’œil (par exemple, si vous appliquez des lentilles cornéennes ou utilisez un guide). Un guide est un dispositif qui est placé sur la tête de numérisation et aide les débutants à aligner l’œil et la tête de numérisation.
  3. Après avoir anesthésié le rongeur, placez-le dans un système d’alignement du rongeur qui peut faire pivoter l’animal dans un espace à 3 dimensions (Figure 1A, 1C et 1D). Fournir un support thermique.
    REMARQUE: Actuellement, nous utilisons des systèmes d’alignement de rongeurs pour souris et rats conçus et vendus avec le dispositif SD-OCT.
  4. Appliquez du liquide (par exemple, une solution saline ou des larmes artificielles) pour garder les yeux lubrifiés. S’assurer que l’œil ne se dessèche pas pendant l’imagerie afin que les propriétés optiques de l’œil soient maintenues entre les examens (lorsque la cornée est mouillée, la rétine peut être vue clairement).
    1. Assurez-vous de maintenir l’humidité dans l’œil opposé lorsque vous scannez le premier œil afin qu’il ne se dessèche pas.
  5. Utilisez une lingette délicate pour évacuer l’excès de solution saline juste avant l’imagerie, car trop ou trop peu de lubrifiant sur l’œil affectera la qualité de l’image.
    REMARQUE: L’utilisation de gel lubrifiant stérile n’est pas recommandée pendant la TCO car elle peut interférer avec l’imagerie. Si nécessaire, un gel lubrifiant stérile peut être utilisé après la procédure. Une lentille de contact peut également être appliquée pour assurer une humidité adéquate sur l’œil tout au long du test. D’après notre expérience, une lentille de contact n’a pas apporté une amélioration marquée de la qualité de l’image, mais les lentilles cornéennes aident à réduire le risque de séchage de la cornée pendant la séance d’imagerie.

3. Imagerie de la TCO chez les rongeurs

  1. Commencez par un œil (OS ou OD) et imagez ensuite l’œil controlatéral.
    1. Positionnez l’animal en utilisant les deux mouvements de rotation du système d’alignement des rongeurs, de sorte que le regard soit horizontal et regarde vers le bas l’axe de la lentille OCT (figure 1D).
    2. Utilisez l’OPO en mode Exécution libre pour orienter la rétine pour la collecte de données. Utilisez d’abord le mode Visée (en cliquant sur le bouton Viser ) pour un affichage continu des balayages B horizontaux et verticaux en temps réel.
    3. Rapprochez la tête de balayage de l’œil jusqu’à ce que la rétine soit visible (car les lentilles de la rétine de souris et de rat sont à focale fixe, déplaçant la lentille vers l’œil se concentre plus profondément dans la rétine). Ensuite, utilisez le système d’alignement des rongeurs pour ajuster la position de l’animal vers le haut / bas et pivoter / tordre pour positionner la tête du nerf optique au centre, rendre le balayage horizontal horizontal horizontal et le balayage vertical vertical (Figure 1A).
    4. Ajustez la distance de travail de sorte que l’image rétinienne soit plate et non incurvée.
    5. Ajustez la position du bras de référence pour conserver l’image près du haut de la fenêtre d’affichage. Veillez à ne pas pousser trop loin ou l’image de l’œil retournera sur elle-même.
  2. Imagerie rétinienne
    1. Pour les modèles de glaucome, de dégénérescence rétinienne et de rétinopathie diabétique : Définissez un balayage volumique composé de 1000 x 100 x 1 (balayage A x balayage B scans x scans B répétés) pour la moyenne. Chez les rats, effectuez un balayage de volume de 3 x 3 mm. Chez la souris, effectuez un balayage de volume de 1,5 x 1,5 mm.
    2. Centrez le nerf optique dans l’accès horizontal et vertical afin que le balayage de volume soit au centre. Prenez le temps de vous assurer que la tête du nerf optique est au centre de la scintigraphie et droite le long des axes nasal-temporal et supérieur-inférieur (Figure 2). Scannez et recentrez pour vous assurer qu’il est exactement au centre, si nécessaire. Répétez cette analyse si nécessaire jusqu’à ce que la tête du nerf optique soit centrée et alignée le long des deux axes. Cliquez sur le bouton Instantané pour prendre une photo.
      REMARQUE: Certains appareils SD-OCT ont la possibilité de manipuler optiquement la courbure de l’œil (par exemple, l’image est aplatie) en ajustant la distance de l’œil à la source lumineuse avec le bras de référence. Nous recommandons d’aplatir et de centrer les images lors de la prise de mesures directes de l’épaisseur à travers les couches rétiniennes pour améliorer la précision le long de la direction antéro-postérieure.
    3. Cliquez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer l’image.
    4. Prenez un balayage radial centré sur la tête du nerf optique qui est de 1000 x 4 x 20 (A-scan x B-scan x B-scans répétés). Utilisez des balayages B répétés pour améliorer la clarté de l’image de l’œil ou de la rétine, ce qui aidera à interpréter les régions de l’œil ou les couches de la rétine pendant l’analyse des données.
      NOTE: Encore une fois, chez les rats, ce balayage radial est de 3 mm, tandis que chez la souris, le balayage radial est de 1,5 mm.
    5. Enregistrez l’image.
    6. Répétez les étapes 3.1 à 3.2.5 dans l’œil controlatéral.
  3. Mesures de longueur axiale
    1. Pour les projets qui impliquent l’imagerie de l’œil entier, comme la myopie de souris, prenez trois scans de l’œil entier et un scanner de la rétine pour chaque œil. Choisissez un préréglage qui consiste en un balayage radial de 500 x 20 x 1 et qui englobe tout le diamètre de l’œil.
      REMARQUE: Ce paramètre fournit une image de toute la longueur de l’œil de souris de la cornée à la choroïde.
    2. Centrez le milieu de l’œil et de la rétine dans le champ de vision. Prenez trois balayages radiaux (balayages de l’œil entier): un balayage linéaire B de 1000 x 5 x 2 et deux scans B linéaires supplémentaires de 1000 x 5 x 2 au même endroit. Enregistrez les images.
    3. Ensuite, si vous le souhaitez, zoomez et effectuez un balayage de volume ou rectangulaire (balayage de la rétine) similaire à la description en 3.2 qui consiste en des scans 1000 x 20 A x B scans. Enregistrez l’analyse du volume.
    4. Répétez les étapes 3.3 à 3.3.3 dans l’œil controlatéral.
      REMARQUE: Les mesures de longueur axiale ne sont possibles que sur de petits yeux (souris ou plus petits) car la fenêtre d’imagerie des systèmes actuels n’est pas assez grande pour capturer un œil plus grand.

4. Étapes post-imagerie

  1. Stockez les données sauvegardées sur un cloud, ce qui est une bonne pratique pour la gestion des données et permet un accès facile pour une analyse ultérieure. Effectuer l’analyse de données avec un logiciel personnalisé développé dans un programme de modélisation mathématique (Table of Materials).
  2. Retirer le rongeur du système d’alignement des rongeurs et administrer une injection intrapéritonéale d’atipamézole (1 mg/kg pour les rats et les souris) pour inverser les effets de la xylazine, afin que le rongeur se réveille plus rapidement.
  3. Laissez les rongeurs récupérer sur un coussin chauffant à feu doux. Donnez des gouttes salines supplémentaires au besoin. Retournez les rongeurs dans leur cage d’origine lorsqu’ils ont retrouvé leur pleine marche.
  4. Fermez le programme et désactivez l’OPO.

5. Post-traitement des images de l’OCT

  1. Traiter les images à l’aide d’un logiciel personnalisé développé dans un programme de modélisation mathématique pour répondre à des besoins spécifiques de l’OCT (par exemple, mesurer l’épaisseur des zones d’intérêt en marquant manuellement les images).
  2. Selon le but de l’image (rétine de souris, rétine de rat ou myopie/longueur axiale), utilisez l’un des trois programmes suivants :
    1. Pour traiter la rétine, sélectionnez les scans de l’OCO à charger. Tout d’abord, définissez le centre de la tête du nerf optique d’un simple clic.
    2. Regardez comment le programme génère des lignes verticales définissant les distances de chaque côté de la tête du nerf optique. Notons que dans la rétine du rat, ces lignes sont à 0,5 mm et 1,2 mm du centre de la tête du nerf optique, pour un total de 4 lignes verticales représentant les axes nasal-temporal et inférieur-supérieur de l’œil en fonction du scanner radial B actuellement analysé.
      REMARQUE: Dans la rétine de la souris, ces lignes verticales sont à 0,25 mm et 0,5 mm du centre de la tête du nerf optique.
    3. Délimitez les couches suivantes le long de chaque ligne :
      La couche de fibres nerveuses rétiniennes (RNFL), la couche plexiforme interne (IPL), la couche nucléaire interne (INL), la couche plexiforme externe (OPL), la couche nucléaire externe (ONL), la membrane limitante externe (ELM), les segments internes / segments externes (IS / OS), l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) et l’épaisseur totale de la rétine.
      REMARQUE: Le balayage radial n’a généralement pas d’étiquettes nasales / temporales et supérieures / inférieures lorsqu’il est ouvert. Les scans peuvent être créés de telle sorte qu’ils ont une orientation n/t et s/i, et ces scans en particulier sont analysés ultérieurement.
    4. Une fois qu’une image a été délimitée et que le programme a été fermé, exportez ces mesures dans un tableur pour l’analyse des données.
  3. Utilisez ces valeurs de longueur et d’épaisseur de l’étape 5 pour faire des comparaisons entre les groupes, par exemple, déterminer s’il existe des différences régionales (n/t/s/i) ou des changements longitudinaux.
  4. Pour les mesures rétiniennes, déterminez d’abord s’il existe des différences dans l’axe nasal-temporal et inférieur-supérieur aux distances de 0,5 mm et 1,2 mm.
    NOTE: Si les différences entre les quadrants ne sont pas observées, les mesures de 0,5 mm et de 1,2 mm peuvent être moyennées ensemble. Il s’agit d’une approche similaire pour les scintigraphies rétiniennes de souris seulement à 0,25 mm et 0,5 mm.
  5. Pour les études de myopie, utilisez ce programme pour évaluer les paramètres oculaires le long de l’axe optique de l’œil. Ouvrez le programme de modélisation mathématique. Tout d’abord, sélectionnez une image à charger.
    1. Après avoir chargé l’image, marquez manuellement chaque numérisation (radiales et B). Marquez les bords antérieur et postérieur de la cornée, du cristallin, de la chambre vitrée et de la rétine, de sorte que le programme calcule l’épaisseur de la cornée, l’épaisseur du cristallin, la profondeur de la chambre antérieure et vitrée, l’épaisseur totale de la rétine, la longueur axiale totale.
    2. Après le marquage, quittez le programme qui invite un menu d’enregistrement. Enregistrez les valeurs délimitées dans un tableur et faites la moyenne des trois numérisations distinctes ensemble.

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Representative Results

Le SD-OCT est considéré comme un succès si des images de haute qualité sont obtenues de manière à ce que les dimensions oculaires puissent être mesurées de manière fiable. Ici, une variété d’utilisations de SD-OCT sont illustrées à l’aide de modèles de dégénérescence rétinienne, de glaucome, de rétinopathie diabétique et de myopie.

Dans un modèle de dégénérescence rétinienne induite par la lumière (LIRD), l’exposition à une lumière vive (10 000 lux) induit une dégénérescence des cellules photoréceptrices de la rétine9. Les images SD-OCT représentatives révèlent une couche nucléaire externe plus mince, qui contient les corps cellulaires photorécepteurs, dans les rétines de souris LIRD BALB / c par rapport aux souris non endommagées (témoins) (Figure 3A & 3B). Après avoir quantifié l’épaisseur de la couche rétinienne, une différence significative entre les souris intactes et les souris LIRD a été observée pour l’épaisseur totale de la rétine (Figure 3C), l’épaisseur de la couche nucléaire externe (Figure 3D) et l’épaisseur IS/OS (Figure 3E).

Pour modéliser expérimentalement les dommages glaucomateux, nous avons utilisé un modèle d’hypertension oculaire (OHT)10. En bref, les rats bruns bruns (n = 35) ont reçu une injection de solution saline hypertonique dans la veine limbique d’un œil tandis que l’œil controlatéral servait de contrôle interne11. Pour les études sur le glaucome, nous avons quantifié l’épaisseur de la couche de fibres nerveuses rétiniennes (RNFL). Après 8 semaines d’OHT, nous avons observé un remodelage distinct au niveau de la tête du nerf optique, y compris des ventouses du nerf optique (Figure 4A & B). Nous avons ensuite quantifié l’épaisseur de la RNFL et constaté un amincissement de la RNFL après 8 semaines d’OHT par rapport aux mesures de référence (Figure 4C).

Pour modéliser la rétinopathie diabétique, des rats Goto-Kakizaki, un modèle polygénique non obèse de diabète qui développe une hyperglycémie dès l’âge de 2-3 semaines, ont été utilisés12,13. Les rétines de rats Goto-Kakizaki et de rats Wistar (témoins non diabétiques) ont été imagées à l’aide de SD-OCT (Figure 5A & 5B). À l’âge de 6 semaines, la RNFL et l’épaisseur totale de la rétine ont été réduites chez les rats Goto-Kakizaki par rapport aux rats Wistar de la rétine centrale (données non présentées) et de la rétine périphérique (Figure 5C&5D). Les plus grandes différences ont été observées dans les quadrants inférieur et temporal de la rétine (Figure 5C&5D).

Pour évaluer les modèles murins pour la myopie, la longueur axiale a été mesurée chez des souris Bmal1-/-. Bmal1 est un gène d’horloge d’intérêt car les rythmes circadiens peuvent jouer un rôle dans le développement de la myopie14,15. La longueur axiale de l’œil de souris Bmal1-/- (Figure 6B) est visiblement plus longue que celle de l’œil de type sauvage (Figure 6A) dans les images OCT. La quantification de la longueur axiale confirme que les souris Bmal1-/- ont des longueurs axiales significativement plus longues à l’âge de 84 jours (Figure 6C), montrant que l’absence du gène de l’horloge contribue au développement de la myopie.

Ce protocole a généré des images de structures oculaires dans des modèles de dégénérescence rétinienne, de glaucome, de rétinopathie diabétique et de myopie. Les images étaient d’une qualité suffisante pour que les dimensions oculaires, y compris la couche nucléaire externe, la couche de fibres nerveuses rétiniennes, l’épaisseur totale de la rétine et la longueur axiale, puissent être quantifiées. Les résultats ont montré que des différences significatives dans les dimensions des structures oculaires pouvaient être observées in vivo en utilisant SD-OCT.

Figure 1
Figure 1 : Configuration de l’équipement SD-OCT.
(A) Image du système d’alignement des rongeurs et de la tête de balayage OCT. (B) Image de lentilles OCT de rats et de souris. (C) Image d’un système d’alignement de rongeurs de souris illustrant sa capacité à se déplacer dans un espace en 3 dimensions. (D) Gros plan du système d’alignement des rongeurs, en particulier des boutons qui contrôlent son mouvement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : analyse de l’échantillon SD-OCT.
Image d’un balayage en direct de la rétine de la souris juste avant de prendre un balayage de volume ou radial. (A) représente l’alignement nasal-temporal, tandis que (B) montre l’alignement supérieur-inférieur. Une fois que les rétines de ces deux images sont droites dans leurs plans verticaux ou horizontaux respectifs et que le nerf optique est centré dans les deux images, nous procédons à l’acquisition de l’image SD-OCT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Utilisation de la SD-OCT pour suivre l’amincissement de la couche photoréceptrice au fil du temps dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne.
(A) Scan SD-OCT représentatif d’une rétine (témoin) intacte à partir d’une souris BALB/c. (B) Balayage SD-OCT représentatif d’une rétine à partir d’une souris BALB/c à dégénérescence rétinienne induite par la lumière (LIRD). (C-E) Quantification de l’épaisseur totale de la rétine (C), de l’épaisseur de la couche nucléaire externe (ONL) (D) et de l’épaisseur du segment interne/segment externe (IS/OS) (E) chez les souris non endommagées et LIRD Balb/c. Moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : À l’aide de SD-OCT, nous avons mesuré une diminution de l’épaisseur de la couche de fibres nerveuses rétiniennes et observé des ventouses du nerf optique après avoir induit une hypertension oculaire dans un modèle de glaucome chez le rat.
(A) Scintigraphie SD-OCT représentative d’une tête de rétine et de nerf optique à partir d’un œil de rat prise avant d’induire une hypertension oculaire (Baseline: OHT). (B) SD-OCT scan de la même rétine de rat après 8 semaines d’OHT (modèle expérimental de glaucome). (C) Quantification de l’épaisseur de la couche de fibres nerveuses rétiniennes (RNFL) au départ par rapport aux yeux OHT. Moyenne ± SEM. Ces données ont été modifiées à partir de Feola et al.11Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Utilisation du SD-OCT pour observer une diminution de l’épaisseur totale de la rétine ainsi qu’une diminution de l’épaisseur de couches rétiniennes spécifiques dans un modèle de diabète chez le rat.
(A) Balayage SD-OCT représentatif d’une rétine d’un rat Wistar (témoin de type sauvage). (B) Balayage SD-OCT représentatif d’une rétine d’un rat Goto-Kakizaki (diabétique). Couches rétiniennes : couche de fibres nerveuses rétiniennes (RNFL), couche plexiforme interne (IPL), couche nucléaire interne (INL), couche plexiforme externe (OPL), couche nucléaire externe (ONL), membrane limitante externe (ELM), segments internes / segments externes (IS / OS), épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et épaisseur rétinienne totale (TRT). (C-D) Quantification de la RNFL (C) et de l’épaisseur totale de la rétine (D) dans les rétines de Wistar et de Goto-Kakizaki où la ligne centrale est la moyenne et la zone ombrée est le MEB pour les quatre quadrants (Sup, Supérieur; Temp, Temporel; Inf, inférieur; Nas, Nasal) de la rétine périphérique (1,2 mm de la tête du nerf optique). ** p < 0,01, *** p < 0,001. Cette figure a été modifiée à partir d’Allen et al.13Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Utilisation de SD-OCT pour évaluer la longueur axiale dans un modèle murin de myopie.
Images SD-OCT de l’œil entier d’yeux de souris de type sauvage (A) et Bmal1-/- (B) à l’âge de 84 jours. Les yeux des souris Bmal1-/- ont une longueur axiale significativement plus longue que les yeux de type sauvage (C). AL: longueur axiale; RT: épaisseur de la rétine; VCD: profondeur de la chambre vitrée; LT: épaisseur de la lentille; ACD: profondeur de la chambre antérieure; CT : épaisseur cornéenne. La longue ligne verticale indique les limites de longueur axiale (haut et bas indiqués par une ligne horizontale) pour l’œil de type sauvage. La flèche courte indique le marquage de longueur axiale postérieure pour l’œil Bmal1-/- . Moyenne ± SEM. La ligne centrale au milieu de chaque image (A & B) est un artefact de saturation verticale. Il est généralement utilisé comme guide pour centrer l’œil, mais si le scan est bien aligné, il peut être fait disparaître. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’imagerie à haute résolution des structures oculaires in vivo permet d’évaluer les changements rétiniens et oculaires au fil du temps. Dans ce protocole, il a été démontré que le SD-OCT capturait les différences dans les structures oculaires in vivo dans des modèles de dégénérescence rétinienne, de glaucome, de rétinopathie diabétique et de myopie.

L’aspect le plus critique lors de l’exécution de SD-OCT est d’obtenir une image claire de la rétine ou d’une autre structure oculaire d’intérêt. Il est important de prendre le temps de s’assurer que la rétine est parfaitement centrée et a une excellente clarté. Une respiration lourde par le rongeur peut entraîner des images bruyantes (la rétine peut en fait être vue pour bouger à l’écran). Cela se produit parfois si un animal n’est pas complètement inconscient après l’administration d’anesthésiques. Pour contourner ce problème, plusieurs scans B peuvent être moyennés pour aider à visualiser où se trouvent les limites des couches rétiniennes, puis la meilleure image de balayage B unique peut être analysée.

Une autre erreur courante est que l’œil est trop sec ou trop humide. Cela peut être vérifié facilement en appliquant une goutte supplémentaire de solution saline, en l’évacuant avec une lingette de laboratoire et en évaluant si l’image s’est améliorée en clarté. Une considération à prendre en compte lors du marquage des épaisseurs de couche rétinienne sur les images SD-OCT est de savoir comment marquer le RNFL. Bien qu’il soit possible de différencier le RNFL et le GCL sur certains TCO de rongeurs, ces deux couches sont souvent impossibles à distinguer. Par souci de cohérence, nous marquons l’ensemble de la région RNFL (RNFL + GCL, lorsqu’il est visible) comme RNFL. Certaines études rapportent que la RNFL et la GCL sont des couches séparées ou combinent la GCL et la couche plexiforme interne16,17,18, bien que cette recherche ait généralement été effectuée chez les humains, qui ont des yeux beaucoup plus grands que les rongeurs. La déclaration de l’épaisseur de la RNFL est plus courante dans les études sur les rongeurs11,13,19,20. Un autre problème important est que de très légers changements dans le marquage peuvent provoquer un changement très important, en particulier dans la myopie en raison de la petite taille des structures mesurées. Par exemple, une différence de mesure de 6 μm est égale à une dioptrie de changement de l’erreur de réfraction21. Parce que de légers changements font une grande différence dans la mesure, la clarté de l’image est essentielle.

Une limitation de ce protocole, et de SD-OCT en général, est que des milieux oculaires clairs sont nécessaires pour une bonne image. Par exemple, les lésions cornéennes, les anomalies du cristallin et les cataractes peuvent empêcher les utilisateurs d’obtenir des images claires. C’est un problème dans l’imagerie de la rétinopathie diabétique, en particulier, car les cataractes se développent couramment chez les rongeurs diabétiques22. Si la cataracte ou un autre problème oculaire est petit, il est parfois possible de manœuvrer la tête de balayage autour de celui-ci. Pour les perturbations plus importantes des milieux oculaires, les images OCT rétiniennes sont impossibles à obtenir. Ces rétines pourraient encore être étudiées à l’aide de l’histologie, car l’histologie rétinienne ne dépend pas de milieux oculaires clairs.

Une autre limitation est le fait que les lésions hyperréfléchissantes, telles que les exsudats et les hémorragies, ainsi que les principaux vaisseaux rétiniens, entraînent une ombre des structures rétiniennes sous-jacentes, ce qui entraîne la perte de détails de la morphologie sous-jacente. Dans un cas présentant une membrane néovasculaire choroïdienne et une rétinopathie diabétique/œdème maculaire où l’épaisseur rétinienne était supérieure à 400 μm, il était difficile de discerner la pathologie sous-jacente et la choroïde23. De plus, le SD-OCT ne peut être utilisé que pour évaluer l’épaisseur à des endroits spécifiques. SD-OCT a également une profondeur de pénétration limitée pour l’imagerie de la choroïde et pour l’imagerie des yeux entiers (l’œil entier peut être imagé chez une souris, mais pas chez les grands animaux). Une autre limitation est que les marqueurs fluorescents ou autres ne peuvent pas être utilisés avec SD-OCT comme avec l’ophtalmoscopie laser à balayage (SLO). Cependant, les dispositifs SLO typiques ne permettent pas de visualiser les couches rétiniennes en coupe transversale avec la même facilité que celle observée avec SD-OCT. Enfin, la résolution avec SD-OCT n’est pas parfaite. Cependant, il est beaucoup amélioré par rapport à la résolution disponible au début de SD-OCT et continue de s’améliorer au fil du temps.

En conclusion, les avantages et l’importance de la technique SD-OCT sont qu’elle permet l’imagerie in vivo des structures oculaires et le suivi quantitatif des changements dans les dimensions oculaires au fil du temps, et qu’elle effectue cette imagerie avec une vitesse de balayage rapide. En raison de la haute résolution du SD-OCT, il peut être utilisé pour détecter des différences subtiles qui ne sont pas observables à l’œil nu (Figure 4 & Figure 5). De plus, le SD-OCT est un outil utile pour mesurer plusieurs paramètres de l’œil dans un certain nombre de modèles de maladies et de blessures. Dans ce protocole seul, le SD-OCT a été utilisé pour mesurer l’épaisseur rétinienne dans des modèles de dégénérescence rétinienne et de rétinopathie diabétique, l’épaisseur et les ventouses rétiniennes dans un modèle de glaucome et la longueur axiale dans un modèle de myopie. Le SD-OCT peut également être utilisé pour mesurer la courbure cornéenne 24, évaluer les changements rétiniens après une explosion et une lésion cérébrale traumatique 19,25,26, identifier la pathologie de la dégénérescence maculaire liée à l’âge 27 et surveiller la santé rétinienne pendant et après les injections oculaires 28 et la mise en place rétinienne de dispositifs prothétiques tels que les implants sous-rétiniens 29. Il peut également être utilisé dans d’autres modèles animaux tels que les musaraignesarboricoles 30 et les primates non humains31. Le SD-OCT peut également être utilisé pour localiser la pathologie rétinienne en fonction du quadrant (supérieur, inférieur, nasal, temporel) et de l’emplacement (central ou périphérique). Les futurs appareils SD-OCT atteindront une résolution encore plus grande. De plus, l’angiographie OCT permet l’imagerie de la microvascularisation rétinienne et choroïdienne en utilisant la réflexion de la lumière laser sur la surface des globules rouges lorsqu’ils se déplacent dans le système vasculaire rétinien32,33.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par les Bourses de perfectionnement professionnel du service de réadaptation du ministère des Anciens Combattants (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) à RSA, Prix du mérite (RX002615) et Prix de carrière scientifique en recherche (RX003134) au PMT, Prix de développement de carrière (CDA-2, RX002342) à l’AJF, EY028859 au PMT, Subvention de base NEI P30EY006360, Recherche pour prévenir la cécité et Fondation pour combattre la cécité.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% tropicamide Sandoz Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59
0.5% tetracaine Alcon NDC 0065-0741-12
AIM-RAS G3 120 V Leica Bioptigen 90-AIMRAS-G3-120 Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice
Celluvisc gel REFRESH CELLUVISC #4554; NDC-0023-4554-30
G3 18 mm Telecentric Lens Leica Bioptigen 90-BORE-G3-18
G3 Mouse Lens Leica Bioptigen 90-BORE-G3-M
G3 Rat Lens Leica Bioptigen 90-BORE-G3-R
heating pad Fabrication 11-1130
InVivoVue software Leica Bioptigen Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system
MATLAB Mathworks mathematical modeling program
Mouse/Rat Kit Leica Bioptigen 90-KIT-M/R Mouse/rat rodent alignment system
saline ADDIPAK 200-39
System Envisu R4300 VHR 120 V Leica Bioptigen 90-R4300-V1-120 SD-OCT system

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Bioingénierie numéro 161 Tomographie par cohérence optique rétine dégénérescence rétinienne glaucome rétinopathie diabétique myopie rongeur
Évaluations structurales in vivo des maladies oculaires dans des modèles de rongeurs utilisant la tomographie par cohérence optique
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