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Developmental Biology

लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण तैयारी और माइक्रोइंजेक्शन एक स्वचालित उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करके किया जाता है

Published: January 19, 2021 doi: 10.3791/61589
Automatic Translation
1,2, 2, 1
1Department of Biology, San Francisco State University, 2Department of Biochemistry & Biophysics, UCSF Mission Bay

Summary

यहां प्रस्तुत एक प्लेट आधारित, उच्च सामग्री इमेजर का उपयोग करके भ्रूण के विकास के दौरान माइक्रोजेक्ट और साथ ही इमेज मल्टीपल ड्रोसोफिला भ्रूण के लिए एक प्रोटोकॉल है।

Abstract

मात्रात्मक लाइव सेल इमेजिंग में आधुनिक दृष्टिकोण जैविक प्रक्रियाओं को वर्गीकृत करने और तुलना करने के लिए सांख्यिकी और कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग के उपयोग को सक्षम करके सेल जीव विज्ञान की खोज के लिए एक आवश्यक उपकरण बन गए हैं। यद्यपि सेल संस्कृति मॉडल सिस्टम उच्च सामग्री इमेजिंग के लिए महान हैं, सेल आकृति विज्ञान के उच्च थ्रूपुट अध्ययन बताते हैं कि पूर्व वीवो संस्कृतियां जीवित जीवों के भीतर कोशिकाओं में पाई जाने वाली रूपात्मक जटिलता को पुनः प्राप्त करने में सीमित हैं। इस प्रकार, एक अक्षुण्ण जीव के भीतर जीवित कोशिकाओं को छवि देने के लिए एक स्केलेबल उच्च थ्रूपुट मॉडल प्रणाली की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित एक उच्च सामग्री छवि विश्लेषक का उपयोग करने के लिए एक साथ सिंकाइटियल ब्लास्टोडर्म चरण के दौरान भ्रूण ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर विकास के कई समय-चूक वीडियो प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। सिंक्टियल ब्लास्टोडर्म ने पारंपरिक रूप से जैविक घटनाओं इमेजिंग के लिए वीवो मॉडल में एक महान के रूप में कार्य किया है; हालांकि, मात्रात्मक और उच्च थ्रूपुट दृष्टिकोणों के लिए प्रयोगात्मक प्रतिकृति की एक महत्वपूर्ण संख्या प्राप्त करना श्रम गहन और प्रयोगात्मक दोहराने के प्रति एक भ्रूण की इमेजिंग द्वारा सीमित किया गया है। यहां प्रस्तुत एक उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम, या स्वचालित मल्टीपॉइंट अधिग्रहण में सक्षम किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप के अनुरूप इमेजिंग और माइक्रोइंजेक्शन दृष्टिकोण को अनुकूलित करने की एक विधि है। यह दृष्टिकोण एक ही इमेजिंग सत्र के भीतर वांछित अधिग्रहण कारकों के आधार पर 6-12 भ्रूण के एक साथ अधिग्रहण को सक्षम बनाता है।

Introduction

पिछले 30 वर्षों में, इमेजिंग प्रौद्योगिकियों और लाइव सेल इमेजिंग के लिए आणविक जांच में प्रगति ने कोशिका की जटिलता और आंतरिक कामकाज की हमारी समझ को उन्नत किया है। प्रौद्योगिकी में इस प्रगति के साथ उच्च थ्रूपुट इमेजिंग डेटा के अधिग्रहण के लिए पूर्व वीवो सेल संस्कृति मॉडल के उपयोग पर अधिक निर्भरता है। सेल कल्चर मॉडल माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम के माध्यम से माइक्रोएनवायरमेंट का नियंत्रण और एक साथ कई कोशिकाओं को छवि देने की क्षमता सहित कई फायदे प्रदान करते हैं, जिससे उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग1,2के लिए आवश्यक मात्रात्मक दृष्टिकोणों का उपयोग सक्षम होता है। हालांकि, रूपात्मक अध्ययनों के संदर्भ में सेल संस्कृति मॉडल से जुड़े महत्वपूर्ण नुकसान भी हैं, जैसे कि दो-आयामी ग्लास या प्लास्टिक की सतहें सेल आकृति विज्ञान और इसके विनियमन3,4,5पर भ्रामक प्रभाव पैदा करती हैं। ये प्रभाव सेलुलर आकृति विज्ञान को विनियमित करने वाली जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के संबंध में झूठे या भ्रामक डेटा प्रदान कर सकते हैं।

यद्यपि विकल्प एक अक्षुण्ण जीव6के संदर्भ में सेलुलर आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया गया है, कुछ उपयुक्त अक्षुण्ण जीव पूरे जीवों को इमेजिंग के माध्यम से जीवित रखने में कठिनाइयों के कारण उच्च थ्रूपुट मात्रात्मक लाइव सेल इमेजिंग की सुविधा प्रदान करते हैं, और एक बड़े बहुकोशिकीय जीव के अंदर इमेजिंग से जुड़ी चुनौतियां। नतीजतन, अक्षुण्ण जीवों में सेल जैविक अध्ययन ने आम तौर पर समय के साथ एक ही जीव को देखने पर ध्यान केंद्रित किया है, जो नमूना आकार को बहुत सीमित करता है। इसके अलावा, यह एक-पशु-एट-ए-टाइम सीमा लाइव इमेजिंग को स्क्रीन के रूप में नियोजित करने के लिए मुश्किल और महंगा बनाती है और मात्रात्मक विश्लेषणात्मक उपकरण लागू करने की क्षमता को प्रतिबंधित करती है क्योंकि नमूनों की संख्या आम तौर पर बहुत छोटी होती है। इस प्रकार, एक बहुकोशिकीय मॉडल जीव की आवश्यकता उत्पन्न होती है जिसका उपयोग उच्च सामग्री आधारित मात्रात्मक दृष्टिकोणों के लिए किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल मात्रात्मक विश्लेषण के लिए काफी बड़े प्रयोगात्मक नमूना आकार उत्पन्न करने के लिए प्लेट-आधारित उच्च सामग्री इमेजिंग के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण को अनुकूलित करता है। ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टर को आमतौर पर पहले मॉडल जीव के रूप में जाना जाता है। ड्रोसोफिला का उपयोग करके किए गए शोध से कोशिका और आणविक जीव विज्ञान में सफलताएं मिली हैं, जिनमें आनुवंशिक जानकारी का संचरण, कोशिका संकेत रास्ते की पहचान और भ्रूण विकास की आनुवंशिक आवश्यकताएं7,8, 9शामिल हैं। इसकेअलावा सेलुलर डिवीजन10, 11, 12के दौरान वीवो माइक्रोट्यूबुले डायनेमिक्स में एक्सप्लोर करने के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण का इस्तेमाल किया गया है । छोटे अणुओं और आणविक जांच को वितरित करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग अस्थायी नियंत्रण प्रदान करता है जो ड्रोसोफिला भ्रूणीय विकास को विशेष रूप से वीवो13,14में सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच के लिए शक्तिशाली बनाता है । हालांकि, पारंपरिक इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ प्रयोगात्मक दोहराता की एक महत्वपूर्ण संख्या पैदा करना बेहद श्रम गहन है और उच्च थ्रूपुट इमेजिंग स्क्रीन और मात्रात्मक विश्लेषण में सीमित उपयोग है। हमारा दृष्टिकोण एक उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करता है जो आमतौर पर एकल सेल विश्लेषण के लिए आरक्षित होता है और शुरुआती ड्रोसोफिला ईएमब्रेओ के सिंक्टियम में वीवो इमेजिंग विश्लेषण में अनुकूलित होता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग माइटोसिस15के दौरान एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) में रूपात्मक परिवर्तनों को चलाने वाले तंत्रों का पता लगाने के लिए, मंच और माइक्रोजेक्ट ड्रोसोफिला भ्रूण एकत्र करने के लिए किया गया था। यद्यपि कई अध्ययनों ने कोशिकाचक्र16, 17,18,19केदौरानईआर की गतिशील प्रकृति को रेखांकित किया है, लेकिन ईआर आकृति विज्ञान पर समय भर में कई क्षोभ के प्रभावों की तुलना करना मुश्किल रहा है। कोशिका विभाजन में ईआर आकृति विज्ञान में परिवर्तन करने वाले घटकों की पहचान करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध तरीकों का उपयोग प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण में कॉर्टिकल सिंक्टियल डिवीजन का उपयोग करके मिटोटिक ईआर पुनर्गठन पर माइक्रोट्यूबुल और अन्य साइटोस्केलेल कारकों की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया था। एक साथ लिया, ड्रोसोफिला समुदाय के भीतर आनुवंशिक क्षोभ की उपलब्धता, विकास के दौरान सटीक समय पर दवाओं और आणविक जांच को माइक्रोजेक्ट करने की क्षमता, और ड्रोसोफिला के साथ काम करने की सस्ती लागत इस दृष्टिकोण को उच्च थ्रूपुट छवि-आधारित स्क्रीनिंग के लिए अत्यधिक उत्तरदायी बनाती है। यहां वर्णित विधियां ड्रोसोफिला भ्रूण20का उपयोग करके वीवो में विभिन्न प्रकार की सेलुलर और विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू हैं । विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल जैविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित है जो एक विस्तारित अवधि में और ड्रोसोफिला भ्रूण कॉर्टेक्स के 100 माइक्रोन के भीतर होते हैं।

Protocol

नोट: मीडिया और समाधान के व्यंजनों के लिए तालिका 1 का उल्लेख करें।

1. की स्थापना और लाइव विश्लेषण के लिए एक भ्रूण संग्रह पिंजरे को बनाए रखने21

  1. ताजा मक्खियों के साथ एक ताजा भ्रूण संग्रह पिंजरे आबाद।
    नोट: जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संग्रह पिंजरों की सिफारिश की जाती है, संग्रह पिंजरों को आसानी से खाली फ्लाई बोतलों21से बनाया जा सकता है।
    1. जब कई पिल्ले चरण p14 पर काला होना शुरू करते हैं तो वयस्क मक्खियों को बोतलों से त्यागें या स्थानांतरित करें; 20 डिग्री सेल्सियस पर यह लगभग 14 दिनों के बाद अंडे22रखी गई है होता है .
    2. Pupae को 12-24 घंटे के लिए बोतलों को हैच और पॉप्युलेट करने की अनुमति दें।
    3. मक्खियों को बचने से रोकने के लिए संग्रह पिंजरे खोलने पर एक छोटे कीप का उपयोग करके एक छोटे संग्रह पिंजरे में ताजा मक्खियों को स्थानांतरित करें। 200 से 500 मक्खियों वाले घनी आबादी वाले पिंजरे का उत्पादन करने के लिए 3 बोतलों तक मिलाएं।
    4. बार-बार एक कठिन सतह (मक्खियों को अचेत करने के लिए) के खिलाफ फ्लाई बोतल को टैप करके संग्रह पिंजरे में स्थानांतरित करें। फिर संग्रह पिंजरे कीप पर फ्लाई बोतल खोलें और उलटा करें। संग्रह पिंजरे में मक्खियों को छोड़ने के लिए कई बार संग्रह पिंजरे पर खुली बोतल टैप करें।
    5. इसे अपने प्लग पर जल्दी से सेट करके खुली फ्लाई बोतल को बंद करें। कीप से अपने प्लग में खुली फ्लाई बोतल स्थानांतरित करते समय, यह सुनिश्चित करें कि बोतल खोलने के बिंदु नीचे की ओर जाते हैं क्योंकि मक्खियां टैपिंग के स्रोत से दूर क्रॉल करती हैं।
    6. फ्लाई पिंजरे खोलने के खिलाफ कीप दबाएं और अंदर मक्खियों को अचेत करने के लिए एक कठिन सतह पर बार-बार पिंजरे को टैप करें। तुरंत कीप को हटा दें और फ्लाई पिंजरे को खोलने के लिए एक ताजा अंगूर की प्लेट सुरक्षित करें। अंगूर की थाली को सुरक्षित करने के लिए लेबलिंग टेप का उपयोग करें। घनी आबादी वाले संग्रह पिंजरे का उत्पादन करने के लिए 3 बोतलों तक गठबंधन करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, सीओ2 या अन्य फ्लाई स्लीपिंग एजेंटों का उपयोग करके मक्खियों को एनेस्थेटाइज किया जा सकता है; हालांकि, यह चरण 1.2 में अभिनंदन अवधि में वृद्धि करेगा।
  2. 24-48 घंटे के लिए नए संग्रह पिंजरे acclimate । यदि सीओ2 या किसी अन्य स्लीपिंग एजेंट का उपयोग किया जाता था, तो संग्रह पिंजरे को कम से कम 48 घंटे के लिए स्वीकार करें।
    1. संग्रह पिंजरे में अंगूर की थाली को दिन में दो बार खमीर पेस्ट युक्त एक ताजा के साथ बदलें, 8-10 घंटे के अलावा।
  3. सेटअप हर 5 दिनों में एक ताजा संग्रह पिंजरे।

2. इमेजिंग के लिए भ्रूण एकत्र करना और तैयार करना

  1. सिंक्रोनाइज्ड विकास के साथ भ्रूण प्राप्त करना
    1. केंद्र में खमीर पेस्ट का एक थपका युक्त एक ताजा एक के साथ संग्रह पिंजरे पर अंगूर की थाली का आदान प्रदान करें। मक्खियों को 1 घंटे के लिए भ्रूण बिछाने की अनुमति दें। पुरानी अंगूर की थाली टॉस करें।
      नोट: मक्खियों भ्रूण उन्हें बिछाने से पहले निषेचित कर सकते हैं। पहले संग्रह प्लेट में इनमें से कई पूर्वविकसित भ्रूण होंगे। मक्खियों को पुराने भ्रूण को डंप करने की अनुमति देने से पहले भ्रूण के बीच विकासात्मक समकालिकता में सुधार होगा।
    2. केंद्र में खमीर पेस्ट का एक थपका युक्त एक ताजा एक के लिए अंगूर की थाली का आदान प्रदान करें और मक्खियों को 10 मिनट के लिए भ्रूण रखना। पुरानी अंगूर की थाली टॉस करें।
      नोट: ठंडी प्लेटों पर भ्रूणीय विकास को धीमा करने से बचने के लिए, उपयोग करने से पहले अंगूर की प्लेट और खमीर पेस्ट को कमरे के तापमान पर गर्म करें।
    3. अंगूर की थाली को एक ताजा (खमीर पेस्ट के बिना) के साथ विनिमय करें और पुराने अंगूर की प्लेट को बचाएं, इसमें इमेजिंग के लिए भ्रूण हैं। यदि आवश्यक हो, तो चरण 2.1.2 और 2.1.3 दोहराकर इस पिंजरे से भ्रूण एकत्र करना जारी रखें।
  2. आयु 30-45 मिनट के लिए भ्रूण एकत्र छवि सिंक्मिटियल डिवीजनों23।
    नोट: भ्रूण के विकास में सिंक्टाइल ब्लास्टोडर्म चरण की छवि के लिए, भ्रूण को संग्रह के 90 मिनट के भीतर और माइक्रोस्कोप पर रखा जाना चाहिए। जब पहली बार के लिए इस प्रोटोकॉल का प्रयास, आयु भ्रूण कदम २.२ में 10-20 मिनट के लिए अतिरिक्त समय प्रदान करने के लिए कदम के बीच स्थापित ।
  3. डीआई पानी में 50% ब्लीच के साथ डिकोरियोनेट भ्रूण।
    1. चरण 2.2 से वृद्ध भ्रूण को डीआई पानी के साथ अंगूर की प्लेट भरकर 140 एनएम छलनी में स्थानांतरित करें, धीरे-धीरे भ्रूण को पेंट ब्रश से उखाड़ फेंकें, और भ्रूण के साथ पानी को 140 एनएम छलनी(चित्रा 1A)में डाल दें।
      नोट: यह एक सिंक या 1,000 एमएल बीकर पर किया जा सकता है।
    2. धार की बोतल का उपयोग करके एक डीआई पानी के साथ भ्रूण को सख्ती से कुल्ला। एक सूखे कागज तौलिया पर छलनी दाग द्वारा सूखे भ्रूण। छलनी दाग जब तक यह कागजतौलिया (चित्रा 1B)पर पानी के निशान छोड़ बंद हो जाता है ।
      नोट: भ्रूण से सभी खमीर पेस्ट निकालें क्योंकि यह अगले चरण में ब्लीच उपचार अप्रभावी प्रदान कर सकता है।
    3. डीआई पानी (1:1 ब्लीच: डीआई पानी) के साथ ताजा तैयार 50% ब्लीच के साथ एक खाली 10 सेमी प्लेट भरें। 2 मिनट 45 एस के लिए 50% ब्लीच में छलनी डुबकी। जैसे ही छलनी 50% ब्लीच को छूती है, स्टॉपवॉच शुरू करें। में और ५०% ब्लीच 3-4x के बाहर छलनी दाग पहले 15 एस में गोलमाल भ्रूण झुरमुट(चित्रा 1C)।
    4. धार की बोतल का उपयोग करके डीआई पानी के साथ भ्रूण को सख्ती से कुल्ला। एक सूखे कागज तौलिया पर छलनी दाग द्वारा भ्रूण सूखी। 5x(चित्रा 1D)के लिए जोरदार कुल्ला और दाग सुखाने की प्रक्रिया दोहराएं।
      नोट: यह कोरियो पर छोड़ दिया हटाने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है । एक पूर्ण DI धार की बोतल का उपयोग करें और इस कदम में बोतल के आधे का उपयोग करें।
    5. दाग सूखे भ्रूण को छलनी से पेंट ब्रश 21(चित्रा 1E)का उपयोग करके10 सेमी अंगूर प्लेटों में स्थानांतरित करें
      नोट: मैनुअल डाइक्लोरिनेशन का उपयोग ब्लीच डेक्रिनेशन24के विकल्प के रूप में किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1: भ्रूण डिकेरेशन। (A)भ्रूण एक DI H20 धार की बोतल, पेंट ब्रश, और १४० एनएम छलनी का उपयोग कर एकत्र किए गए । (ख)भ्रूण को एक कागज तौलिया पर एक DI H20 धार की बोतल और दाग सूखी का उपयोग कर तेजी से धोया गया । (ग)भ्रूण का डिकेरेशन 2 मिनट के लिए ५०% ब्लीच में किया गया था और ४५ एस(डी)भ्रूण को एक कागज तौलिया पर एक DI H20 धार की बोतल और दाग सूखी का उपयोग करते हुए जोरदार ढंग से धोया गया था । अतिरिक्त चोरों को हटाने के लिए इसे 4 बार दोहराया गया। (ई)भ्रूण तो एक पेंट ब्रश का उपयोग कर 10 सेमी अंगूर की थाली में स्थानांतरित कर रहे थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. कवरस्लिप के लिए बढ़ते भ्रूण

  1. ओवरहेड हंस नेक लाइटिंग से लैस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, अंडा बीनने वाले उपकरण का उपयोग करके अंगूर की प्लेट के एक साफ खंड पर 15-20 भ्रूणों की दो पंक्तियों को व्यवस्थित करें। पूर्वकाल और पीछे समाप्त होने के संबंध में एक ही अभिविन्यास में उनके वेंट्रल साइड पर भ्रूण को संरेखित करें। अंडा बीनने के लिए ठीक टिप स्टेनलेस स्टील चिमटी 45 ° कोण को मोड़ने के लिए। डी/वी भ्रूण अभिविन्यास की समीक्षा करने के लिए Campos-Ortega एट अल20देखें ।
    नोट: यह वेंट्रल सतह के लिए महत्वपूर्ण है अंगूर की थाली पर बैठने के रूप में भ्रूण कदम ३.५ में एक कवर पर्ची पर दबाया जाएगा, इमेजिंग के लिए पृष्ठीय सतह को उजागर । चूंकि पृष्ठीय सतह वेंट्रल सतह की तुलना में बहुत चापलूसी है, इसलिए पृष्ठीय पक्ष की सतह इमेजिंग एक जेड विमान के भीतर मौजूद नाभिक की संख्या को बढ़ाता है।
  2. 75 एमएम x 25 एमएम सिलिकॉन स्पेसर कवरस्लिप तैयार करें।
    नोट: यह समय से पहले तैयार किया जा सकता है । कई कवरस्लिप तैयार करें और उन्हें साफ रखने के लिए उन्हें स्लाइड बॉक्स में स्टोर करें।
    1. 1.6 मिमी मोटी सिलिकॉन स्पेसर शीट पर 75 मिमी x 25 मिमी कवरलिप की रूपरेखा का पता लगाएं और कैंची(चित्रा 2A)का उपयोग करके सिलिकॉन स्पेसर को काट दें।
    2. रेजर ब्लेड का उपयोग करके, स्पेसर(चित्रा 2 ए)से 40 मिमी x 15 मिमी इनसेट काट लें।
    3. उजागर कवरस्लिप ग्लास इनसेट(चित्रा 2A)के नीचे हेप्टेन गोंद के कवरस्लिप और स्ट्रीक 10 माइक्रोल पर स्पेसर का पालन करें।
      नोट: नीचे लाना और यहां तक कि लकीर एक ही जेड विमान पर इमेजिंग भ्रूण सुनिश्चित करेगा ।
  3. जबकि स्टेप 3.2.3 से हेप्टेन गोंद, अंगूर की प्लेट के एक आयताकार खंड को काटता है जिसमें चरण 3.1 से भ्रूण होते हैं।
    1. भ्रूण की दो पंक्तियों के आसपास आयत (40 मिमी x 15 मिमी से छोटे) को काटने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। आयत को अभी तक न हटाएं।
    2. पहले के बगल में एक दूसरा आयत काट लें। स्टेनलेस-स्टील स्पैटुला के सीधे किनारे की ओर का उपयोग करके दूसरा आयत निकालें।
    3. ध्यान से पहले आयत के नीचे एक स्टेनलेस स्टील स्पैटुला के सीधे किनारे स्लाइड और इसे हटा(चित्रा 2B)।
  4. अंगूर की थाली कटआउट को 3.5 सेमी डिश(चित्रा 2 सी)के बाहरी किनारे पर भ्रूण के साथ रखें।
  5. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, भ्रूण पर एक तैयार कवरस्लिप कम करें और धीरे से गोंद(चित्रा 2D)पर भ्रूण की दो पंक्तियों को दबाएं।
  6. यदि भ्रूण माइक्रोइंजेक्टिंग, 4.1 कदम करने के लिए छोड़ दें। यदि माइक्रोजेक्टिंग 3.7 चरण जारी नहीं है।
  7. 1:1 के साथ सिलिकॉन स्पेसर (आधे रास्ते) को भरकर भ्रूण को कवर करें - हेलोकार्बन तेल 700: हेलोकार्बन तेल 27।
  8. कवर स्लिप को आगे बढ़ने से रोकने के लिए डबल तरफा टेप के साथ 4-स्लाइड प्लेट एडाप्टर के निचले किनारों को लाइन करें लेकिन यह सुनिश्चित करें कि टेप को ऑब्जेक्टिव लेंस के रास्ते में न रखें। यह टेप महत्वपूर्ण है । यदि कवरलिप केवल एडाप्टर पर बैठा है, तो यह पूरे अधिग्रहण में आगे बढ़ेगा। 4 स्लाइड प्लेट एडाप्टर पर कवर स्लिप माउंट करें।

Figure 2
चित्रा 2: कवरलिप तैयारी और बढ़ते। (A)1.6 मिमी मोटी सिलिकॉन शीट पर 75 मिमी x 25 मिमी कवरस्लिप की रूपरेखा का पता लगाया गया था। रूपरेखा को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें। 40 मिमी x 15 मिमी इनसेट सिलिकॉन स्पेसर से काट दिया गया और फिर कवरस्लिप पर चढ़कर। इनसेट के केंद्र के नीचे 15 μL लकीर । (ख)४० मिमी x 15 मिमी से छोटे क्षेत्र में एक अंगूर की थाली पर 15-20 भ्रूण की दो पंक्तियों का आयोजन किया गया था, तो उस क्षेत्र को एक उस्तरा और स्टेनलेस स्टील स्पैटुला का उपयोग करके काट दिया गया था । (ग)अंगूर की थाली कट आउट एक खाली ३.५ सेमी पकवान के शीर्ष पर रखा गया था । (घ)एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, (ए) से कवरस्लिप को कम किया गया था और भ्रूण गोंद की लकीर पर अटक गए थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. भ्रूण को कम करने और माइक्रोइंजेक्टिंग करना

  1. सीसिपेशन और माइक्रोइंजेक्शन के दौरान कवरस्लिप के नीचे गंदे होने से रोकने के लिए एक स्लाइड पर भ्रूण के साथ कवरस्लिप रखें।
    नोट: कवर स्लिप से जुड़ी स्लाइड के बिना छवि होगी। इसलिए इमेजिंग के लिए उल्टे माइक्रोस्कोप जरूरी है।
  2. कमरे के तापमान के आधार पर 5-10 मिनट के लिए भ्रूण को एएसिकेट करें। प्रतिनिधि परिणामों में इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले भ्रूण को एक कक्ष में 20 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए डिसिकेटेड किया गया था जिसमें एक सुखाने वाले एजेंट(चित्रा 3 ए)पर सिलिका जेल मोतियों की 1:1 परत होती थी।
  3. इसके तुरंत बाद, 1:1 के साथ भ्रूण को कवर करें - हेलोकार्बन तेल 700: हेलोकार्बन तेल 27। सिलिकॉन स्पेसर को आधे रास्ते में भरें।
    नोट: कम चिपचिपाहट हेलोकार्बन तेल के साथ एक उच्च चिपचिपाहट हेलोकार्बन तेल मिलाना महत्वपूर्ण है। शुद्ध हेलोकार्बन तेल 700 (उच्च चिपचिपाहट) कोशिका चक्र प्रगति 30 मिनट के बाद आवेदन को धीमा कर देता है। हेलोकार्बन तेल 700 और हेलोकार्बन तेल 27 के मिश्रण ने इस विरूपण साक्ष्य को ठीक किया।
  4. इंजेक्शन के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को लोड करें, फिर माइक्रोइंजेक्टर में एक माउंट करें और दबाव में इसे खोलें।
    नोट: किसी भी मूल्यवान अभिकर्ता के साथ पूर्ण परख करने से पहले कुछ समय चरण 4.4 का अभ्यास करें। माइक्रोइंजेक्शन प्रोसेस में यह सबसे मुश्किल कदम है।
    1. एक विस्तारित लोडिंग टिप का उपयोग करके इंजेक्टेंट के 2 माइक्रोल के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुई लोड करें। केवल एक माइक्रोइंजेक्शन सुई की आवश्यकता होती है, लेकिन अतिरिक्त लोडेड सुइयों को 2 या 3 सुइयों को तैयार करने के लिए अच्छा है।
      नोट: विस्तारित लोडिंग सुझावों पर विशिष्टताओं के लिए सामग्री की तालिका का उल्लेख करें। माइक्रोइंजेक्शन सुई हमारे माइक्रोइंजेक्शन तकनीक की अनूठी प्रकृति के कारण विस्तारित लोडिंग युक्तियों के बिना लोड नहीं की जा सकती है, जो इसकी टिप खोलने से पहले सीलबंद और लोडेड सुई के अंदर हवा के दबाव के निर्माण पर निर्भर करती है।
    2. माइक्रोइंजेक्टर पर एक सुई माउंट और टिप करने के लिए आधे रास्ते प्लंजर दबाना। लक्ष्य ग्लास केशिका(चित्रा 4A)के अंदर हवा के दबाव को बढ़ाना है।
      नोट: खनिज तेल के बिना एक प्लंजर खनिज तेल आधारित माइक्रोइंजेक्टर का उपयोग करें। खनिज तेल के साथ दबाव बनाने के बजाय, हवा के दबाव का निर्माण करने के लिए प्लंजर का उपयोग करें।
    3. कांच की सुई को एक ग्लास स्लाइड पर कम करें और एक नए #9 रेजर का उपयोग करके सुई की नोक को खोलें। एक तेज खुली नोक का उत्पादन करने के लिए सुई को 45 डिग्री कोण पर काट लें। इंजेक्टेंट को सुई से बाहर बहने के बिना टिप के नीचे तक प्रवाहित करना चाहिए। ध्यान से सुई की नोक पर हेलोकार्बन तेल के 20 माइक्रोन जोड़ें और इसे 45 डिग्री पर फिर से काट लें। इंजेक्टेंट तेजी से बहने लगे।
    4. प्लंजर को वापस लेकर तुरंत हवा के दबाव को कम करें लेकिन इंजेक्शन के बीच भ्रूण झिल्ली के साथ सुई को रोकने के लिए एक निरंतर प्रवाह दर बनाए रखना सुनिश्चित करें। (चित्रा 4B)।
      नोट: यदि इंजेक्टेंट स्पष्ट है, तो प्रभामंडल तेल में और बाहर माइक्रोइंजेक्शन सुई को उठाकर इंजेक्टेंट प्रवाह दर देखें और एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत इंजेक्टेंट बूंदों के लिए गठन की दर को देख रहे हैं। एक समय में कुछ क्लिकों प्लंजर को निराशाजनक करके हवा के दबाव को समायोजित करें, फिर नई बूंदों के बाद समायोजन के लिए गठन की दर को देखने के लिए प्रभामंडल तेल में और बाहर माइक्रोइंजेक्शन टिप को डुबोएं।
    5. देखने के क्षेत्र के केंद्र में सुई की स्थिति के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करें, फिर माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करके सुई उठाएं और इसके नीचे से ग्लास स्लाइड को हटा दें। सुई अब इंजेक्शन के लिए अंशांकित है।

Figure 3
चित्रा 3: Desiccation कक्ष आरेख। (क)यह एक ह्रास कक्ष का आरेख है । कक्ष में ड्रायराइट की एक परत पर सिलिका जेल मोतियों की 1:1 परत होती है। desiccation प्रदर्शन करने के लिए, भ्रूण एक अच्छी तरह से थाली ढक्कन के शीर्ष पर रखा गया था । डिमिटेशन चैंबर 7 मिनट बंद हो गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. माइक्रोइंजेक्ट भ्रूण
    1. भ्रूण को माइक्रोइंजेक्शन सुई के नीचे स्टीरियोमाइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें लेकिन सुई को कम न करें।
    2. 50x आवर्धन पर भ्रूण पर ध्यान केंद्रित करें।
    3. सुई कम जब तक यह भ्रूण के रूप में एक ही ध्यान विमान में आता है । एक हाथ से स्लाइड चलती है और दूसरे के साथ माइक्रोइंजेक्टर का संचालन, भ्रूण की एक पंक्ति सुई ।
    4. सुई उठाएं और माइक्रोइंजेक्शन सुई के लिए भ्रूण की दूसरी पंक्ति का पर्दाफाश करने के लिए स्लाइड 180 ° घुमाएं। सुई को कम करें और भ्रूण की दूसरी पंक्ति इंजेक्ट करें।
      नोट: 10 मिनट के तहत में ऐसा करने की कोशिश करो । कुछ संयुक्त राष्ट्र के इंजेक्शन भ्रूण नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए छोड़ दें ।

Figure 4
चित्रा 4: माइक्रोइंजेक्शन सुई तैयारी। (क)इसदृष्टांत में सुई में मजेंटा की तीव्रता हवा के दबाव के लिए प्रतिनिधि है । एक भरी हुई सुई माइक्रोइंजेक्टर पर मुहिम शुरू की गई थी और सुई के अंदर हवा के दबाव को बढ़ाने के लिए प्लंजर को 50% बढ़ाया गया था। सुनिश्चित करें कि प्लंजर बढ़ते से पहले अधिकतम रूप से मुकर गया है। (ख)सुई टिप दबाव में काट दिया गया था और प्लंजर हवा के दबाव और प्रवाह दर को कम करने के लिए मुकर गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

5. एक उच्च सामग्री विश्लेषक पर इमेजिंग

  1. इस परख चलाने से पहले एक स्लाइड एडाप्टर के लिए एक प्लेट नक्शा बनाएं। कस्टम प्लेट एडाप्टर के लिए आयाम दर्ज करने के लिए प्लेट मैप मैनेजर मेनू में पाए गए प्लेट होल्डर एडिटर का उपयोग करें।
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लेट एडाप्टर (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए एक कस्टम प्लेट मैप बनाया गया था। प्लेट मैप में निम्नलिखित सेटिंग्स शामिल हैं; स्लाइड मोटाई: 1000 माइक्रोन, नीचे ऊंचाई: 1.607 मिमी, नीचे ऊंचाई परिवर्तनशीलता: 100 माइक्रोन, सब्सट्रेट सामग्री: ग्लास, कवरलिप मोटाई: 150 माइक्रोन, कवरलिप स्थिति: नीचे - पंक्तियां: 1 - रिक्ति: 56.987 मिमी, कॉलम: 4 - अंतर 28.391, आकार और आकार: आयत, चौड़ाई 23.00 मिमी, ऊंचाई: 73.00 मिमी, ए1 21.29 मिमी - 42.7 मिमी तक ऑफसेट
  2. माइक्रोस्कोप पर स्लाइड एडाप्टर लोड करें और कवरस्लिप की ब्राइटफील्ड 10x इमेज को टाइल करने के लिए प्रिव्यू फीचर का इस्तेमाल करें ।
  3. एक पंक्ति के ऊपर या नीचे से एक भ्रूण का चयन करें, तो उद्देश्य का चयन करें और 60x (NA 0.95) पर स्विच करें। वांछित फ्लोरेसेंस चैनल के लिए एक उपयुक्त एक्सपोजर निर्धारित करें।
    नोट: लाइव सेल इमेजिंग के लिए 25% के तहत लेजर तीव्रता बनाए रखें।
  4. मुख्य डैशबोर्ड पर, भ्रूण की दोनों पंक्तियों वाले फ्लोरोसेंट 60x छवि को टाइल करने के लिए पूर्वावलोकन सुविधा का उपयोग करें।
  5. मुख्य डैशबोर्ड पर, बिनिंग ड्रॉप डाउन मेनू का चयन करें और इष्टतम रिज़ॉल्यूशन के लिए बिनिंग को 1 x 1 सेट करें।
  6. जेड स्टैक स्टैक के लिए मापदंडों को परिभाषित करने के लिए जेड स्टैक सेटअप टैब का उपयोग करें।
    1. जेड स्टैक सेटअप टैब में, ऊपर और नीचे तीर का उपयोग करें तो ऊपर और नीचे जेड ढेर सीमा को परिभाषित खोजने के लिए । एक बार ऊपर और नीचे की सीमाओं को परिभाषित कर रहे हैं, जेड ढेर स्थिति को बचाने के लिए ग्रीन पेंसिल आइकन का चयन करें । जेड स्टैक स्थिति पर ध्यान दें क्योंकि इसका उपयोग चरण 5.6.5 में किया जाएगा।
    2. जेड स्टैक सेटअप टैब में, जेड स्लाइस के बीच की दूरी को परिभाषित करने वाले जेड स्टेप इनपुट बॉक्स का उपयोग करें।
      नोट: स्लाइस की कुल संख्या कदम 5.6.1 और 5.6.2 मॉड्यूलिंग द्वारा निर्धारित किया जाता है।
    3. मुख्य डैशबोर्ड पर, फ्लोरोसेंट चैनल पर सही क्लिक करें और इमेजिंग मोड को 3D में सेट करने के लिए इमेज मोड ड्रॉप डाउन मेनू का उपयोग करें।
    4. मुख्य डैशबोर्ड पर, ऑटोफोकस को अक्षम करने के लिए लेजर ऑटोफोकस बॉक्स का चयन करें।
    5. मुख्य डैशबोर्ड पर, चरण 5.6.1 से जेड-स्टैक स्थिति के साथ प्रारंभिक फोकस को परिभाषित करें, फिर"हर समय बिंदु पर Refocus"सुविधा को निष्क्रिय करने के लिए प्रारंभिक फोकस बॉक्स का चयन करें।
  7. फ़ील्ड टैब में, कस्टम पॉइंट्सको सक्षम करने के लिए फ़ील्ड प्लेसमेंट ड्रॉप डाउन मेनू का उपयोग करें, फिर इमेजिंग के लिए बिंदुओं का चयन करने के लिए तीर का उपयोग करें।
    नोट: अधिग्रहण (चरण 5.8) के बीच समय अंतराल यह निर्धारित करेगा कि एक साथ कितने कस्टम बिंदुओं को चित्रित किया जा सकता है।
  8. टाइम सीरीज टैब में, समय श्रृंखला सुविधा को सक्षम करने के लिए अधिग्रहण टाइम सीरीज बॉक्स का चयन करें, फिर समय अंकों की कुल संख्या को परिभाषित करें।
    नोट: 6 कस्टम अंक x 5 z स्लाइस x 80 स्टैक = 2,400 छवियां, 2,400 छवियां x 8.2 एमबी प्रति छवि = 19.68 जीबी डिस्क स्पेस।
  9. मुख्य डैशबोर्ड पर, अधिग्रहण सेटिंग्स का नाम देने के लिए नाम इनपुट बॉक्स का उपयोग करें, फिर फ़ाइल का चयन करें और अधिग्रहण सेटिंग्स को बचाने के लिए सहेजें।
  10. मुख्य डैशबोर्ड पर, अधिग्रहण चलाने के लिए स्कैन बटन का चयन करें।

6. पोस्ट इमेज प्रोसेसिंग

  1. इमेज सीरीज को बहुआयामी हाइपरस्टैक के रूप में खोलने के लिए एक्सडीई फाइल को फिजी में खींचें और छोड़ दें।
  2. एक tif फ़ाइल के रूप में हाइपरस्टैक को सहेजें।
  3. अधिकतम तीव्रता अनुमान बनाएं और उन्हें एक tif फ़ाइलों के रूप में सहेजें।
  4. अधिकतम तीव्रता अनुमानों की एक पुस्तकालय को इकट्ठा करें और डेटा निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए एक पाइपलाइन का निर्माण करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत दृष्टिकोण का उपयोग ड्रोसोफिला भ्रूण15में माइटोसिस के दौरान एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) पुनर्गठन में माइक्रोट्यूबुल की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया था। माइटोसिस के दौरान, ईआर की संरचना एक नाटकीय पुनर्गठन प्रदर्शित करता है, हालांकि, इन परिवर्तनों को चलाने वाली ताकतों को खराब समझा जाता है। हाल ही में, ईआर आकार देने वाले प्रोटीन के एक परिवार को ईआर ट्यूबल 25 , 26,27,28केगठनको बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया था, जो माइक्रोट्यूबुल्स28के साथ उनके करीब निकटता के लिए जानाजाताहै। ईआर आकृति विज्ञान पर माइक्रोट्यूबुल्स के रोल का अध्ययन करने के लिए, प्रोटोकॉल में प्रदान किए गए तरीकों का उपयोग माइटोसिस के दौरान ईआर पुनर्गठन पर कई माइक्रोइंजेक्टेड दवा उपचारों के प्रभावों की मात्रात्मक रूप से तुलना करने के लिए डेटा उत्पन्न करने के लिए किया गया था। कोल्चिसिन, जो नए माइक्रोट्यूबुले बहुलीकरण को रोकता है, को माइटोसिस के दौरान ईआर के पुनर्गठन को काफी कम करने के लिए पाया गया जैसा कि चित्र 5 और चित्रा 6में दिखाया गया है। इसके अलावा, यहां वर्णित दृष्टिकोण ३२ भ्रूण के लिए समय गोद इमेजिंग डेटा के उत्पादन में सक्षम । एक कस्टम मैटलैब स्क्रिप्ट का उपयोग करके ब्याज के 12,800 क्षेत्रों से औसत और अधिकतम तीव्रता माप का उत्पादन किया गया था, जिसने दवा उपचार के बीच तुलना करने के लिए वर्णनात्मक और अनुमानित आंकड़े भी उत्पन्न किए थे। आणविक जांच की उपलब्धता और माइक्रोइंजेक्शन की आसानी के कारण, यहां वर्णित तरीकों को फ्लोरेसेंस तीव्रता मात्राकरण के माध्यम से विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय हैं।

Figure 5
चित्रा 5: माइटोसिस के दौरान धुरी डंडे पर RTnl1-GFP और ReepB-GFP संवर्धन के प्रतिनिधि छवियां । (A)सेल चक्र 10 में माइटोसिस के दौरान रीप्ब-जीएफपी के दृश्य का 60x क्षेत्र। ब्लू स्क्वायर पैनल बी-ई के लिए उपयोग किए जाने वाले दृश्य के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। पैनल ए को थ्रेसहोल्ड बाइनरी फ़िल्टर के साथ संसाधित किया जाता है। यह फ़िल्टर पैनल बी-ई पर लागू नहीं किया गया था क्योंकि इसमें सेट सीमा से नीचे पिक्सल से डेटा शामिल नहीं है. (B,D) नियंत्रण में ReepB-GFP, और कोलचिसिन में। (C,E) नियंत्रण में RTnl1-GFP, और कोल्चिसिन में। इस आंकड़े को डियाज़ एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: माइटोसिस के दौरान धुरी ध्रुवों पर RTnl1-GFP और ReepB-GFP संवर्धन का परिमाण। निम्नलिखित स्थितियों में 32 भ्रूणों के लिए 10 फ्रेम में 20 स्पिंडल और 20 साइटोप्लाज्म आरओआई का विश्लेषण किया गया। (A)RTnl1-GFP के लिए 10% DMSO नियंत्रण इंजेक्शन । नियंत्रण भ्रूण गैर इंजेक्शन नमूनों (पी एंड एलटी; ०.००१ टी 210 में सभी नमूनों के लिए) की तुलना में संवर्धन में ०.१ गुना वृद्धि (पी एंड एलटी; ०.००१) दिखाया । (ख)ReepB-GFP भ्रूण नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए 10% DMSO के साथ इंजेक्शन । नियंत्रण भ्रूण ने टी-210 में सभी नमूनों के लिए संवर्धन (पीएंड एलटी;0.001) में 0.1 गुना वृद्धि दिखाई, जबकि टी-210 में सभी नमूनों के लिए गैर-इंजेक्शननमूनों (चित्रा 1E;पी एंड एलटी; 0.001) की तुलना में। (ग)Rtnl1-GFP भ्रूण 5 μM Colchicine के साथ इंजेक्शन । यहां हमने टी210 में सभी नमूनों के लिए नियंत्रण (ए) (पी एंड एलटी; 0.001) की तुलना में टी210 में सभी नमूनों के लिए स्पिंडल (पी एंड एलटी; 0.001) के लिए RTnl1-GFP संवर्धन में कमी मापी। (घ)ReepB-GFP भ्रूण 5 μM Colchicine के साथ इंजेक्शन । हमने टी-210 में सभी नमूनों के लिए नियंत्रण (बी) (पीएंडटी;001) की तुलना में स्पिंडल (टी-210 में सभी नमूनों के लिए पीएंडटी;0.001) के लिए ReepB-GFP संवर्धन में कमी मापी। इस आंकड़े को डियाज़ एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

1. खमीर पेस्ट21 2. अंगूर प्लेटें21 3. हेप्टेन गोंद24
1.1 50 मिलीलीटर शंकु के लिए 7 ग्राम सक्रिय शुष्क खमीर जोड़ें। डीआई पानी के 9 मिलीलीटर जोड़ें और एक धातु स्पैटुला के साथ भी स्थिरता के लिए मिश्रण। 2.1 समाधान एक बनाओ: 250 मिलीलीटर फ्लास्क में 140 मिलीलीटर डीआई पानी में 6 ग्राम एगर जोड़ें और इसे ऑटोक्लेव करें। 3.1 50 इंच के दो तरफा टेप के साथ एक ग्लास प्रस्फुटन शीशी भरें।
1.1 50 मिलीलीटर शंकु के लिए 7 ग्राम सक्रिय शुष्क खमीर जोड़ें। डीआई पानी के 9 मिलीलीटर जोड़ें और एक धातु स्पैटुला के साथ भी स्थिरता के लिए मिश्रण। 2.2 समाधान बी बनाएं: इथेनॉल के 2 मिलीलीटर में 0.1 ग्राम मिथाइल पैराबेन मिलाएं, फिर इस समाधान को 60 मिलीलीटर अंगूर का रस ध्यान से जोड़ें। 3.2 पैराफिल्म के साथ 20 मिलीलीटर हेप्टेन और सील ग्लास प्रस्फुटन शीशी जोड़ें। कमरे के तापमान पर रात भर घुमाएं।
2.3 ऑटोक्लेविंग समाधान ए के तुरंत बाद, समाधान बी में मिलाएं और मिश्रण को 10 x 35 मिमी perti व्यंजनों में डालें। (35 अंगूर प्लेटें बनाता है) 3.3 2 15 मिलीलीटर शंकु नलियों में गोंद स्थानांतरित करके प्लास्टिक टेप मलबे को हटा दें और 15 मिनट के लिए 3000 आरपीएम पर अपकेंद्रित्र करें।
2.4 अंगूर की प्लेटों को प्लेट ढक्कन के साथ रात भर कमरे के तापमान पर सेट करने की अनुमति दें। ढक्कन के साथ प्लेटों को कवर करें और सेट करने के बाद 4C ° में स्टोर करें। 3.4 भंडारण के लिए गोंद सुपरनेट को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।

तालिका 1: मीडिया और समाधान के व्यंजनों।

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला भ्रूणीय विकास में विभिन्न चरणों में जैविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक बहुमुखी और आसानी से अनुकूलनीय है। यह प्रोटोकॉल लंबे समय तक होने वाली जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। उदाहरण के लिए, सेलुलराइजेशन29, 30या ड्रोसोफिला31 में हेट्रोक्रोमेटिन डोमेन केगठनके अध्ययन,32 इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों का उपयोग करने से लाभान्वित हो सकते हैं क्योंकि ये प्रक्रियाएं विस्तारित अवधि में होती हैं। इसके अलावा, नमूना आकार को उन प्रश्नों का अध्ययन करने के लिए आवर्धन को कम करके बढ़ाया जा सकता है जिन्हें कम ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होती है, जैसे कि सिंक्टियल डिवीजनों33 या गैस्ट्रुलेशन34की अवधि के बीच का समय।  इसी तरह, एक 20x उद्देश्य दो भ्रूण के लिए एक इमेजिंग विमान के भीतर छवि के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल में तरीके मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में भ्रूणीय विकास का उपयोग कर जैविक प्रश्न पूछने के लिए एक गतिशील मंच प्रदान करते हैं।

इस प्रोटोकॉल में 3 महत्वपूर्ण कदम हैं। 50% ब्लीच में पोस्ट डिकेरेशन यह जरूरी है कि भ्रूण को 5 बार (2.3.4) से धोया और सूख जाए। यह कदम कोरियन के किसी भी बचे हुए छोटे टुकड़े को हटा देता है। जब भ्रूण इमेजिंग देखने के क्षेत्र में बाधा डालती है बचा हुआ chorion । जब कांच कवरलिप (३.५) पर भ्रूण बढ़ते, यह एक समान दबाव के साथ गोंद पर भ्रूण प्रेस करने के लिए महत्वपूर्ण है । इससे भ्रूण एक ही जेड प्लेन पर जगह देगा। माइक्रोइंजेक्शन सुई को खोलते समय, सुई के प्रवाह दर को समायोजित करने के लिए तुरंत प्लंजर को वापस लेना महत्वपूर्ण है या आप अपने सभी इंजेक्टेंट खो देंगे।

हमारा अध्ययन दो कारकों से सीमित था । पहले कारक एक स्वचालित विभाजन प्रक्रिया नहीं था । हमने मैटलैब का उपयोग करके एक मैनुअल सेगमेंटेशन स्क्रिप्ट तैयार की है, हालांकि; एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड स्पिंडल मार्कर के साथ इस प्रक्रिया को स्वचालित किया जा सकता है। भविष्य में हम सीएनएन-आरएफपी21,Rtln1-GFP और सीएनएन-RFP का उत्पादन करना चाहते हैं; स्वचालित धुरी विभाजन को सक्षम करने के लिए ReepB-GFP ट्रांसजेनिक लाइनें। हमारे MATLAB स्क्रिप्ट और विश्लेषण पाइपलाइन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, Diaz एट अल15की पूरक सामग्री का उल्लेख है । दूसरे, हम भी ३५ एस है, जो केवल हमें एक साथ 6 भ्रूण छवि की अनुमति के हमारे अधिग्रहण अंतराल से सीमित थे । एक लंबा अधिग्रहण अंतराल हमें एक साथ अधिक भ्रूण छवि के लिए अनुमति होगी । हालांकि दवा वितरण थ्रूपुट को माइक्रोइंजेक्शन को पार करने के कदम के साथ बदलकर बढ़ाया जा सकता है, लेकिन हमने पाया कि यह अनावश्यक है क्योंकि हमारे नमूना आकार पहले से ही अधिग्रहण अंतराल तक सीमित था।

जबकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग ड्रोसोफिला भ्रूणीय विकास की छवि के लिए किया गया था, समग्र दृष्टिकोण अन्य बहुकोशिकीय मॉडल प्रणालियों में भ्रूणीय विकास का अध्ययन करने के लिए अनुकूलनीय है, जैसे सी एलिगेंस,सी आशीन, और ज़ेनोपस। भ्रूण मात्रात्मक विश्लेषण के लिए बेहद उपयोगी होते हैं क्योंकि वे आसानी से संग्रह या निषेचन के माध्यम से सिंक्रोनाइज्ड होते हैं। इसके अलावा, भ्रूण देखने के क्षेत्र से दूर नहीं जाते हैं या तैरते हैं, जिससे मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कई बार चूक वीडियो का उत्पादन करने के लिए एक सरल मल्टीपॉइंट अधिग्रहण सक्षम सॉफ्टवेयर का उपयोग सक्षम होता है। यद्यपि हमने अपने अध्ययन में एक उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग किया, मल्टीपॉइंट अधिग्रहण में सक्षम किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप प्रणाली को यहां उल्के तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है।

इसी तरह के परिणाम एक बहुबिंदु अधिग्रहण सक्षम उल्टे कंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है; हालांकि, एक उच्च सामग्री विश्लेषक के फायदे उभरने के रूप में एक नमूना आकार बढ़ जाती है सवाल है कि समय में कम संकल्प की आवश्यकता का अध्ययन करने के लिए । एक उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करने के लिए एक स्पष्ट लाभ पारंपरिक प्रणालियों पर 1 स्लाइड की तुलना में एक साथ 4 अलग स्लाइड छवि की क्षमता है । प्रत्येक स्लाइड पर 4 स्लाइड और 40 भ्रूण का एक पूरा सेट के साथ, 160 भ्रूण कई घंटों में छवि की जा सकती है, जब तक अधिग्रहण अंतराल फ्रेम के बीच कम से कम 15 मिनट है। एक उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करने के लिए एक और महत्वपूर्ण लाभ यह है कि नमूनों को किसी भी बाहरी प्रकाश स्रोतों से पूरी तरह से बंद कर दिया जाता है, जो फ्लोरेसेंस तीव्रता-आधारित माप के लिए आवश्यक है। अंत में, हमारे अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले उच्च सामग्री विश्लेषक में 5.5 मेगापिक्सल सीएमओएस कैमरा है जो 60x आवर्धन पर उदार 221.87 माइक्रोन क्षेत्र प्रदान करता है। देखने के इस बड़े क्षेत्र ने हमें अधिग्रहण बिंदु के अनुसार आधा भ्रूण छवि के लिए सक्षम बनाया ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यूडी, डब्ल्यूएफएम और बीआर को अनुदान समझौते डीबीआई-1548297 के तहत एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ) विज्ञान और प्रौद्योगिकी केंद्र, सेलुलर निर्माण केंद्र द्वारा समर्थित किया जाता है। बीआर को एनएसएफ करियर अवार्ड, 1553695 के माध्यम से भी समर्थन दिया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 x 35mm Micro Dish VWR Cat #: 10799-192 N/A
100% grape juice concentrate Welch's, 100% Concentrate Grape Juice N/A Purchase at Grocery Store
250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth VWR Cat #: 10536-914 N/A
3" Non-Metallic Sieve No. 140 Gilson Company SV-165 #140 N/A
4 Slide Imaging Tray Grace Biolabs SKU: 400104 N/A
ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy Fisher Scientific Cat #: AC411255000 N/A
Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof Fisher Scientific Cat# : AC615095000 N/A
Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) Fisher Scientific Cat#: AC126961000 N/A
Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass Fisher Scientific Cat #: 50-143-782 N/A
Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick Grace Biolabs SKU: 664273 N/A
DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials Fisher Scientific Cat #: 03-341-71A N/A
Embryo Collection Cage-Mini Genesee Scientific Cat #: 59-105 N/A
Eppendorf Microloader Pipette Tips Fisher Scientific Product Code: 10289651 N/A
Falcon 15mL Conical Centrifuge Fisher Scientific Cat #: 05-527-90 N/A
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific Cat #: 14-432-22 N/A
Fleischmann's, Active Dry Yeast Fleischmann's N/A Purchase at Grocery Store
Grape Plates REFFER TO RECIPE PREP N/A N/A
Halocarbon 27 Oil Genesee Scientific Cat #: 59-133 N/A
Halocarbon 700 Oil Genesee Scientific Cat #: 59-131 N/A
Heptane Glue REFFER TO RECIPE PREP N/A N/A
Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 VWR Cat #: 55411-050 N/A
Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll Fisher Scientific Cat #: 50-998-944 N/A
Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy Fisher Scientific Cat #: NC0879005 N/A
Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm Millipore Sigma SKU: 1077351000 N/A
Stainless Steel Spoon/Spatula VWR Cat #: 470149-044 N/A
W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents Fisher Scientific Cat #: 23-116582 N/A
Yeast Paste REFFER TO RECIPE PREP N/A N/A
EQUIPMENT
Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge Beckman Coulter N/A You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.
Autoclave N/A N/A Any autoclave will do fine.
Drummond Nanoject II Microinjector. Drummond Scientific N/A This is a mineral oil based injection system.
GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. GE healthcare N/A A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.
Refrigerator (4C°) N/A N/A Fly media and yeast paste must be stored at (4C°).
Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. Zeiss Microscopy N/A The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.

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Diaz, U., Marshall, W., Riggs, B. Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer. J. Vis. Exp. (167), e61589, doi:10.3791/61589 (2021).

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