Summary
这里介绍的是一个协议，在胚胎 发育过程中，使用基于 板的、高含量的成像器，对多个果蝇胚胎进行显微成像并同时成像。
Abstract
定量活细胞成像的现代方法已成为探索细胞生物学的重要工具，它使统计数据和计算建模能够对生物过程进行分类和比较。虽然细胞培养模型系统非常适合高含量成像，但细胞形态学的高通量研究表明，在重述生物体内细胞中的形态复杂性方面，体外培养能力有限。因此，需要一个可扩展的高吞吐量模型系统来成像完整生物体内的活细胞。此处描述的是使用高含量图像分析仪同时获取胚胎果蝇黑色 素 发育的多个延时视频的协议，该视频在同步爆炸阶段。同步爆炸历来是成像生物事件的一个很好的体内模型;然而，获得大量的定量和高通量方法的实验复制一直是劳动密集型的，并限制每个实验重复单个胚胎的成像。此处介绍的是一种适应成像和微注射方法的方法，以适应高含量成像系统或任何能够自动多点采集的倒置显微镜。这种方法允许在单个成像会话内同时采集 6-12 个胚胎，具体取决于所需的采集因子。
Introduction
在过去 30 年中，成像技术和活细胞成像的分子探针的进步增进了我们对细胞复杂性和内部工作性的理解。伴随着这一技术的进步，我们更加依赖使用外体细胞培养模型来获取高通量成像数据。细胞培养模型具有若干优点，包括通过微流体系统控制微环境，以及能够同时对多个细胞进行成像，从而能够使用高通量筛选1、2所需的定量方法。然而，在形态学研究的背景下，细胞培养模型也有显著的缺点，例如二维玻璃或塑料表面对细胞形态学及其规则3、4、5产生混淆效应。这些效应可以提供虚假或误导性的数据，用于研究调节细胞形态的生物过程。
虽然替代方案是研究完整生物体6的细胞形态，但很少有合适的完整生物体能够促进高吞吐量定量活细胞成像，因为很难通过外成像保持整个生物体的生命，而且大型多细胞生物体内的成像也面临挑战。因此，在完整生物体中的细胞生物学研究通常侧重于观察单个生物体，这极大地限制了样本大小。此外，这种一次动物的限制使得活成像难以以屏幕的形式使用，而且成本高昂，并限制了应用定量分析工具的能力，因为样本数量通常太少。因此，需要一种多细胞模型生物体，可用于高含量的定量方法。
该协议使果蝇胚胎适应基于板的高含量成像，以生成足够大的实验样本大小进行定量分析。嗜血杆菌素俗称第一种模型生物体。使用果蝇的研究在细胞和分子生物学上取得了突破，包括遗传信息的传递、细胞信号通路的识别以及胚胎发育的遗传需求7、8、9。此外，果蝇胚胎已用于探索细胞分裂10、11、12期间体内微管动力学。使用微注射提供小分子和分子探针提供时间控制，使果蝇胚胎发育特别强大，在体内13，14的细胞过程探测。然而，使用传统成像方法生成大量实验重复是极其劳动密集型的，在高通量成像屏幕和定量分析中的使用有限。我们的方法使用通常为单细胞分析保留的高含量分析仪，并在早期果蝇 e mbryo的同步中适应体内成像分析。
该协议用于收集、阶段和微基因果蝇胚胎，以探索在线粒体15期间推动内质性细胞（ER）形态变化的机制。虽然许多研究已经概述了ER在细胞周期16，17，18，19的动态性质，但很难比较跨时间多次扰动对ER形态的影响。为了识别推动细胞分裂中ER形态变化的成分，本协议中列出的方法用于利用早期果蝇胚胎的皮质同步分裂，探寻微管和其他细胞骨骼因子对线粒体ER重组的作用。综合起来，在果蝇社区内遗传扰动的可用性、在开发过程中精确时对药物和分子探针进行微注射的能力，以及与果蝇合作的成本低廉，使得这种方法高度适应高通量图像的筛选。这里描述的方法适用于研究广泛的细胞和发育过程在体内使用果蝇胚胎20。具体来说，这个协议很适应研究长期发生的生物事件，在果蝇胚胎皮层100微米范围内。
Protocol
注：有关介质和解决方案的配方，请参阅表1。
1. 建立和维护胚胎收集笼进行活体分析21
- 用新鲜的苍蝇填充一个新鲜的胚胎收集笼。
注：虽然建议使用商业售的收集笼，但收集笼可以很容易地用空飞瓶21建造。- 当许多幼蝇在阶段p14开始变暗时，丢弃或转移瓶子中成年苍蝇;在20°C，这发生在大约14天后，鸡蛋已经下了22。
- 允许幼崽孵化和填充瓶子12-24小时。
- 将新鲜苍蝇转移到一个小收集笼中，使用一个小漏斗在收集笼开口，以防止苍蝇逃跑。组合多达3瓶，生产一个人口稠密的笼子，里面装着200到500只苍蝇。
- 通过反复敲击坚硬表面的苍蝇瓶（使苍蝇眩晕），将苍蝇转移到收集笼中。然后打开并反转收集笼漏斗上的飞行瓶。将打开的瓶子敲到收集笼上几次，将苍蝇放入收集笼中。
- 关闭打开的飞瓶，快速将其放在插头上。当将打开的飞瓶从漏斗转移到其插头时，确保瓶打开点向下，因为苍蝇往往会从攻丝源爬起来。
- 将漏斗按压在苍蝇笼开口上，在坚硬的表面上反复敲击笼子，使里面的苍蝇眩晕。立即拆下漏斗，将新鲜葡萄板固定到飞笼开口上。使用标签胶带固定葡萄盘。重复此过程，可组合多达 3 瓶，以生产人口稠密的收集笼。
注：或者，苍蝇可以使用CO2或其他苍蝇 睡眠剂麻醉;但是，这将增加步骤 1.2 中的适应期。
- 适应新的收集笼24-48小时。如果使用 CO2 或任何其他睡眠剂，请将收集笼适应至少 48 小时。
- 将收集笼中的葡萄盘更换为每天两次含有酵母酱的新鲜葡萄盘，相距8-10小时。
- 每 5 天设置一个新的收集笼。
2. 收集和准备胚胎进行成像
- 获得胚胎同步发育
- 将收集笼上的葡萄盘与中间含有酵母酱的新鲜葡萄盘交换。允许苍蝇在1小时外放胚胎。扔旧葡萄盘。
注：苍蝇可以在胚胎受精之前，奠定了他们。第一个收集板将包含许多这些预先发育的胚胎。允许苍蝇首先倾倒旧胚胎将改善胚胎之间的发育同步。 - 将葡萄盘更换为新鲜葡萄盘，在中间加入含有酵母酱的葡萄，让苍蝇将胚胎放下10分钟。扔旧葡萄盘。
注：为避免降低冷盘胚胎发育速度，请在使用前将葡萄盘和酵母酱加热至室温。 - 用新鲜的葡萄盘交换（无酵母膏），保存旧葡萄盘，有胚胎进行成像。如有必要，继续通过重复步骤2.1.2和2.1.3从这个笼子里收集胚胎。
- 将收集笼上的葡萄盘与中间含有酵母酱的新鲜葡萄盘交换。允许苍蝇在1小时外放胚胎。扔旧葡萄盘。
- 年龄收集胚胎30-45分钟图像同步分裂23。
注：要成像胚胎发育中的同步胚胎阶段，胚胎必须在采集后90分钟内安装在显微镜上。首次尝试此协议时，在步骤 2.2 中对胚胎进行 10-20 分钟的年龄，以提供额外的时间在步骤之间进行设置。 - 在DI水中用50%的漂白剂去分胚胎。
- 将年龄介母胚胎从步骤2.2转移到140纳米筛中，用DI水填充葡萄盘，用油漆刷轻轻将胚胎分离，然后将胚胎的水倒入140纳米筛（图1A）。
注：这可以通过水槽或 1，000 mL 烧杯完成。 - 使用喷瓶用 DI 水大力冲洗胚胎。通过用干纸巾印迹筛子来干燥胚胎。将筛子擦开，直到它停止在纸巾上留下水痕（图1B）。
注意：从胚胎中去除所有酵母糊，因为它会使漂白剂处理在下一步无效。 - 用 DI 水稀释的新鲜准备的 50% 漂白剂（1：1 漂白剂：DI 水）填充空的 10 厘米板。将筛子浸入 50% 漂白剂中 2 分钟 45 秒。一旦筛子接触 50% 的漂白剂，立即开始秒表。前15 s中，将50%漂白剂3-4倍的筛子中，3-4倍的筛子中，将胚胎团块破裂（图1C）。
- 使用喷瓶用 DI 水大力冲洗胚胎。用干纸巾印制筛子，擦干胚胎。重复剧烈冲洗和印迹干燥过程 5x（图 1D）。
注意：这是删除左四的最重要的步骤。在此步骤中，使用完整的 DI 喷瓶并使用一半的瓶子。 - 使用油漆刷将印迹干燥的胚胎从筛子转移到 10 厘米的葡萄板21 （图 1E）
注：手动二氯化可用作漂白剂装饰的替代品24。
- 将年龄介母胚胎从步骤2.2转移到140纳米筛中，用DI水填充葡萄盘，用油漆刷轻轻将胚胎分离，然后将胚胎的水倒入140纳米筛（图1A）。
图1：胚胎脱胎。 （A） 胚胎是使用DI H20喷瓶、油漆刷和140纳米筛收集的。（B） 用DI H20喷瓶和纸巾上的印迹进行大力冲洗。（C） 在50%漂白中进行胚胎脱氧，2分钟，45秒（D） 用DI H20喷瓶大力冲洗胚胎，并用纸巾擦干斑点。这是重复4次，以消除多余的胆小差。（E） 胚胎然后被转移到10厘米的葡萄板使用油漆刷. 请单击此处查看此图的较大版本。
3. 将胚胎安装到盖玻片上
- 在配备头顶鹅颈照明的立体显微镜下，使用鸡蛋采摘工具在葡萄盘的干净部分组织两排15-20个胚胎。将胚胎在腹侧以相同的方向与前端和后端对齐。使采蛋机将细尖不锈钢钳子弯曲到 45° 角。要查看D/V胚胎的取向，见坎波斯-奥尔特加等人20。
注：对于腹体表面来说，坐在葡萄板上很重要，因为胚胎将被压在步骤3.5的盖滑上，露出后表面进行成像。由于后侧表面比腹体表面更平坦，因此成像后侧表面会增加单个 Z 平面内存在的核数。 - 准备 75 mm x 25 mm 硅胶垫片。
注意：可以提前准备。准备多个盖玻片，并将其存放在幻灯片盒中，以保持其清洁。- 将 75 mm x 25 mm 盖玻片的轮廓追踪到 1.6 mm 厚的硅胶垫片上，然后用剪刀切出硅胶垫片（图 2A）。
- 使用剃须刀刀片，从分片器中切出 40 mm x 15 mm 的内嵌（图 2A）。
- 将空间器粘附在盖玻片上，将何氨酯胶粘在外露的盖玻玻片玻璃内嵌上（图 2A）。
注：放下甚至条纹将确保在同一z平面上成像胚胎。
- 当步骤3.2.3的六烷胶干燥时，切开一个长方形的葡萄板部分，其中包含第3.1步胚胎。
- 使用剃须刀刀片在两排胚胎周围切割矩形（小于 40 mm x 15 mm）。请勿删除矩形。
- 在第一个矩形旁边剪切第二个矩形。使用不锈钢铲的直边侧移除第二个矩形。
- 小心地将不锈钢铲的直边滑到第一个矩形下并将其拆下（图 2B）。
- 将带胚胎的葡萄板切口放在 3.5 厘米菜的外侧（图 2C）。
- 在立体显微镜下，在胚胎上放下准备好的盖玻片，轻轻将两排胚胎压在胶水上（图2D）。
- 如果微缩胚胎，跳到步骤4.1。如果不是微缩，请继续执行步骤 3.7。
- 通过填充硅胶垫片（到顶部的一半）用1：1 - 卤化碳油700：卤化碳油27覆盖胚胎。
- 用双面胶带将 4 滑板适配器的底部边缘对齐，以防止盖滑移动，但确保不将胶带放在客观镜头的路径中。此磁带至关重要。如果盖玻片仅位于适配器上，则在整个采集过程中，它将移动。将盖滑点安装在 4 个滑动板适配器上。
图 2：盖玻片准备和安装。 （A） 75毫米×25毫米盖玻片的轮廓被追踪到1.6毫米厚的硅胶片上。用剪刀剪出轮廓。40 mm x 15 mm 内嵌从硅胶垫片中切出，然后安装在盖玻片上。沿着内嵌的中心向下条纹 15 μL。（B） 两排15-20个胚胎被组织在小于40毫米×15毫米的葡萄盘上，然后用剃须刀和不锈钢铲切出这个区域。（C） 切出的葡萄板被放置在一个空的3.5厘米的盘子的顶部。（D） 在立体显微镜下，（A）的盖玻片被降低，胚胎粘在胶水的条纹上。 请单击此处查看此图的较大版本。
4. 脱盐和微缩胚胎
- 将带胚胎的盖玻片放在滑梯上，以防止盖玻片底部在干燥和微注射过程中变脏。
注：将成像封面滑轨，而不附加幻灯片。因此，倒置显微镜是成像所必需的。 - 干燥胚胎5-10分钟，视房间温度不同。用于在代表性结果中成像的胚胎在20°C下在含有1：1层硅胶珠的腔室中干燥7分钟（图3A）。
- 干燥后立即用1：1覆盖胚胎 - 卤化油700：卤化油27。将硅胶垫片填到顶部的一半。
注：将高粘度卤化碳油与低粘度卤化碳油混合非常重要。纯卤化碳油 700 （高粘度） 减缓细胞循环进展 30 分钟后应用。卤化油700和卤化碳油27的1：1混合物修复了这一神器。 - 用注射剂装载微注射针，然后将一根注射针安装到微注射器上，然后在压力下将其切开。
注：使用任何有价值的试剂进行完整检测之前，先练习步骤4.4。这是微注射过程中最困难的一步。- 使用延长的加载尖端用 2 μL 注射剂加载微注射针。只需要一个微注射针，但好有备用加载的针附近，所以准备2或3针。
注：有关扩展 装载技巧的 规格，请参阅材料表。微注射针不能加载没有延长加载提示，因为我们的微注射技术的独特性质，它依赖于建筑空气压力内密封和加载针之前打开其尖端。 - 将针头安装到微注射器上，将柱塞压到尖端的一半。目标是增加玻璃毛细管内部的气压（图4A）。
注：使用柱塞矿物油为基础的微反应器，不带矿物油。用矿物油制造压力，而不是使用柱塞来制造气压。 - 将玻璃针放到玻璃滑梯上，用新的剃须刀将针尖#9开。以 45° 角切割针头，以产生锋利的开刀尖。注射剂应向到尖端底部，而不流出针头。小心地在针头上加入 20 μL 的卤化油，然后以 45° 重新切割。注射剂应开始快速流动。
- 立即通过缩回柱塞降低气压，但确保保持连续的流速，以防止针头在注射之间用胚胎膜堵塞。（图4B）
注：如果注射剂是明确的，通过将微注射针提起和提起卤化碳油，并观察立体显微镜下注射液滴的形成速率，查看注射液流速。通过一次压压柱塞几下，然后浸入和浸出卤化碳油的微注射尖端，以查看新液滴的形成速率，然后进行调节。 - 使用微操纵器将针头定位在视野的中心，然后使用微操纵器抬起针头，然后从其下取下玻璃滑梯。针头现已校准用于注射。
- 使用延长的加载尖端用 2 μL 注射剂加载微注射针。只需要一个微注射针，但好有备用加载的针附近，所以准备2或3针。
图3：干燥室图。 （A） 这是干燥室的图。该腔室由一层干燥器上1：1的硅胶珠组成。为了进行干燥，胚胎被放置在一个井板盖的顶部。干燥室关闭 7 分钟 。请点击这里查看这个数字的较大版本。
- 微基因胚胎
- 将胚胎放在微注射针下的立体显微镜舞台上，但不要降低针头。
- 聚焦50倍放大倍率的胚胎。
- 降低针头，直到它进入与胚胎相同的焦点平面。用一只手移动幻灯片，用另一只手操作微注射器，注射一排胚胎。
- 抬起针头，旋转滑梯 180°，将第二排胚胎暴露在微注射针上。放下针头，注射第二排胚胎。
注意：尝试在 10 分钟内进行此工作。留下一些未注射的胚胎作为对子。
图4：微注射针制备。 （A） 在图示 中，针中的洋红色强度对气压具有代表性。将一根加载的针头安装在微注射器上，柱塞延长 50%，以增加针头内部的气压。在安装之前，确保柱塞已完全缩回。（B） 针尖在压力下被切割，柱塞被缩回，以降低气压和流速。 请单击此处查看此图的较大版本。
5. 在高含量分析仪上成像
- 在运行此检测之前，为幻灯片适配器创建板图。使用"板图管理器" 菜单中的板架 编辑器输入自定义板适配器的尺寸。
注：为市售板适配器制作了定制板图（ 参见材料表）。板图包含以下设置;滑动厚度：1000 μm，底部高度：1.607毫米，底部高度变异性：100 μm， 基板材料：玻璃，盖玻厚：150 μm，盖玻片位置：底部 = 行：1 = 间距：56.987 mm，柱：4 = 间距 28.391，大小和形状：矩形，宽度 23.00 mm，高度：73.00 mm，偏移至 A1 21.29 mm = 42.74 mm） - 在显微镜上加载幻灯片适配器，并使用 预览功能 平铺盖玻片的亮场 10 倍图像。
- 从行的顶部或底部选择胚胎，然后选择" 目标" 并切换到 60 倍 （NA 0.95）。确定所需荧光通道的适当曝光。
注：保持激光强度在25%以下进行活细胞成像。 - 在主仪表板上，使用 预览功能 对包含两行胚胎的荧光 60 倍图像进行切片。
- 在主仪表板上，选择 "装箱" 下拉菜单，然后将装箱设置为 1 x 1 以获得最佳分辨率。
- 使用 z 堆栈设置 选项卡定义 z 堆栈的参数。
- 在 z 堆栈设置 选项卡中，使用 向上和向下箭头查找 ，然后定义顶部和底部 z 堆栈限制。定义顶部和底部限制后，选择绿色 铅笔图标以 保存 z 堆栈位置。请注意 z 堆栈位置，因为它将在步骤 5.6.5 中使用。
- 在 z 堆栈设置 选项卡中，使用 z 步进 输入框定义 z 切片之间的间距。
注：切片总数通过调整步骤 5.6.1 和 5.6.2 确定。 - 在主仪表板上，右键单击荧光通道并使用"图像模式"下拉菜单将成像模式设置为 3D。
- 在主仪表板上，选择激光 自动对焦框以 禁用自动对焦。
- 在主仪表板上，使用 步骤 5.6.1 中的 z 堆栈位置定义初始焦点，然后 选择初始对焦框 以禁用"在每个时间点重新聚焦"功能。
- 在" 字段 "选项卡中， 使用"字段放置 " 下拉菜单启用自定义点 ，然后使用箭头 选择用于成像的点。
注：采集之间的时间间隔（步骤 5.8）将确定可以同时成像多少自定义点。 - 在" 时间序列 "选项卡中， 选择"获取时间 序列"框以启用时间序列要素，然后定义时间点总数。
注：6 个自定义点 x 5 z 切片 x 80 个堆栈 = 2，400 个图像、2，400 个图像 x 每个图像 8.2 MB = 19.68 GB 磁盘空间。 - 在主仪表板上，使用名称输入框命名采集设置，然后选择"文件"和"保存"以保存采集设置。
- 在主仪表板上，选择 "扫描 "按钮以运行采集。
6. 后期图像处理
- 将 xdce 文件拖入斐济以打开图像系列作为多维超堆栈。
- 将超堆栈另存为 tif 文件。
- 创建最大强度投影，并将它们保存为 tif 文件。
- 组装最大强度投影库，构建数据提取和分析管道。
Representative Results
本协议中介绍的方法用于研究在果蝇胚胎15的分型中，微管在内质性沉默（ER）重组中的作用。 在线粒体过程中，ER 的结构表现出戏剧性的重组，但是，推动这些变化的力量却知之甚少。最近，一个ER整形蛋白家族被证明促进ER管25，26，27，28的形成，这是众所周知的接近微管28。为了研究ER形态的微管卷，利用协议中提供的方法生成数据，定量比较几种微注射药物治疗对分粒体重组的影响。科尔奇辛，防止新的微管聚合，被发现大大减少ER的重组期间，如图5和图6所示。此外，此处描述的方法为 32 个胚胎生产时间圈成像数据。使用自定义 MATLAB 脚本从 12，800 个感兴趣的区域生成平均强度和最大强度测量，该脚本还生成了对药物治疗进行比较至关重要的描述性和推断性统计数据。由于分子探针的可用性和微注射的易用性，此处描述的方法很容易适应通过荧光强度定量研究各种生物过程。
图5：Rtnl1-GFP和 ReepB-GFP在分粒过程中在主轴极的代表性图像。（A） 细胞周期10的分粒病期间的60x视场。蓝色方块表示用于面板 B-E 的视场。面板 A 使用阈值二进制筛选器进行处理。此筛选器未应用于面板 B-E，因为它从低于设置阈值的像素中排除数据。（B，D）在控制中和在科尔奇辛中保持对地。（C， E）Rtnl1 - Gfp 在控制， 在科尔奇辛。这个数字已经修改了迪亚兹等人15。请单击此处查看此图的较大版本。
图6：在分粒过程中，Rtnl1-GFP和 ReepB-GFP在主轴极的定量。在以下条件下，对10个框架的20个主轴和20个细胞质ROIS进行了分析，用于32个胚胎。（A） Rtnl1-GFP 的 10% DMSO 控制注射显示，与 T210 的所有样品相比，10% 的 DMSO 控制注射表明富集量增加了 0.1 倍（T210 的所有样品的浓缩量为 0.lt;0.001）。（B） ReepB-GFP胚胎注射10%DMSO作为控制。与非注射样品相比，控制胚胎的富集量增加了0.1倍（T210的所有样品的富集量为0<0.001）。图1E;p<0.001，T210的所有样品。（C） Rtnl1-GFP胚胎注射5μM高基辛。在这里，我们测量了 Rtnl1-GFP 浓缩到主轴（P < 0.001，T210 的所有样品）与控制 （A） （p < 0.001）相比，T210 的所有样品的浓缩量减少。（D） 注射5μM高基辛的里普布-GFP胚胎。我们测量了 ReepB-GFP 浓缩到主轴（T210 的所有样品的 p<0.001）与控制 （B） （T210 的所有样品的 p<0.001） 相比的减少。这个数字已经修改了迪亚兹等人15。请单击此处查看此图的较大版本。
| 1. 酵母膏21 | 2. 葡萄板21 | 3. 海坦胶水24 |
| 1.1 将 7 克活性干酵母添加到 50 ml 锥形中。加入9毫升DI水，用金属铲混合，甚至保持。 | 2.1 使溶液 a：在 250ml 烧瓶中加入 6 克 agar 到 140 毫升 DI 水中并进行解菌。 | 3.1 用 50 英寸的双面胶带填充玻璃闪烁小瓶。 |
| 1.1 将 7 克活性干酵母添加到 50 ml 锥形中。加入9毫升DI水，用金属铲混合，甚至保持。 | 2.2 使溶液b：将0.1克甲基对羟基苯甲酸酯混合在2ml乙醇中，然后将溶液加入60ml葡萄柚汁浓缩液中。 | 3.2 加入 20 ml 的海坦，用准膜密封玻璃闪烁小瓶。在室温下旋转过夜。 |
| 2.3 在高压灭管溶液 a 后立即混合溶液 b，将混合物倒入 10 x 35mm perti 盘中。（制作35个葡萄盘） | 3.3 通过将胶水转移到 2 个 15 ml 锥形管中，以 3000 RPM 转速离心 15 分钟，清除塑料胶带碎屑。 | |
| 2.4 允许葡萄板在室温下过夜，并取下板盖。盖上盖上盖子，设置后存放在 4C° 中。 | 3.4 将胶水上一液转移到 1.5 ml 微离心管中进行储存。 |
表1：介质和解决方案的配方。
Discussion
此处描述的协议用途广泛，易于适应，用于研究果蝇胚胎发育中不同阶段的生物事件。该协议非常适合研究长期发生的生物过程。例如，对细胞化29、30或果蝇31、32中异血素域的形成的研究，可能受益于利用本协议中描述的方法，因为这些过程在很长一段时间内发生。此外，可以通过降低放大率来研究需要较少光学分辨率的问题来增加样本大小，例如同步分部 33或胃化34的持续时间之间的时间。 同样，20倍的客观允许两个胚胎在一个成像平面内成像。本协议中的方法为利用胚胎发育作为定量分析的模型系统，提出了一个动态的生物学问题。
此协议有 3 个关键步骤。50% 漂白剂的脱洗后，胚胎必须被大力冲洗和干燥 5 次（2.3.4）。此步骤可删除任何剩余的小块巧克力。在成像胚胎时，剩余的胆小子会阻碍视野。将胚胎安装到玻璃盖玻片（3.5）上时，用均匀的压力将胚胎压在胶水上非常重要。这会把胚胎放在同一个 z 平面上。切开微注射针时，必须立即缩回柱塞以调整针头的流速，否则您将失去所有注射剂。
我们的研究受到两个因素的制约。第一个因素是没有自动分段过程。但是，我们使用 MATLAB 设计了手动分段脚本;使用基因编码的主轴标记，这个过程可以自动化。今后，我们希望生产CNN-RFP21，Rtln1-GFP和CNN-RFP;ReepB-GFP 转基因生产线可实现自动主轴分割。有关我们的 MATLAB 脚本和分析管道的信息，请参阅 Diaz 等人15 的补充材料。其次，我们也受到35秒的采集间隔限制，这只能让我们同时成像6个胚胎。更长的采集间隔将允许我们同时成像更多的胚胎。虽然药物输送的吞吐量可以通过用渗透步骤取代微注射来增加，但我们发现这是不必要的，因为我们的样本量已经受到采集间隔的限制了。
虽然该协议用于成像 果蝇胚 胎发育，但总体方法适用于研究其他多细胞模型系统的胚胎发育， 如C.elegans、海胆和 Xenopus。胚胎对于定量分析非常有用，因为它们很容易通过收集或受精同步。此外，胚胎不会移动或游离视野，因此可以使用简单的多点采集软件生成多个时间推移视频进行定量分析。尽管我们在研究中使用了高含量分析仪，但任何能够多点采集的倒置显微镜系统都可以与本文所述方法配对。
使用能够倒合共体显微镜的多点采集可以获得类似的结果;然而，高含量分析仪的优点是增加样本量，以研究需要较少分辨率的问题。使用高内容分析器的一个明显优势是能够同时成像 4 张单独的幻灯片，而传统系统上的幻灯片为 1 张。每张幻灯片上有 4 张幻灯片和 40 个胚胎，只要采集间隔至少 15 分钟，就可以在几个小时内对 160 个胚胎进行成像。使用高含量分析仪的另一个重要优点是，样品完全与任何外部光源密封，这是基于荧光强度的测量所必需的。最后，我们研究中使用的高含量分析仪具有 550 万像素的 CMOS 摄像机，可在 60 倍的放大倍率下提供 221.87 μm 的视野。这个更大的视野使我们能够成像每个采集点半个胚胎。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
UD、WFM 和 BR 由国家科学基金会 （NSF） 科学和技术中心蜂窝建设中心根据授予协议 DBI-1548297 提供支持。BR 也通过 NSF 职业奖 1553695 获得支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x 35mm Micro Dish | VWR | Cat #: 10799-192 | N/A |
| 100% grape juice concentrate | Welch's, 100% Concentrate Grape Juice | N/A | Purchase at Grocery Store |
| 250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth | VWR | Cat #: 10536-914 | N/A |
| 3" Non-Metallic Sieve No. 140 | Gilson Company | SV-165 #140 | N/A |
| 4 Slide Imaging Tray | Grace Biolabs | SKU: 400104 | N/A |
| ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy | Fisher Scientific | Cat #: AC411255000 | N/A |
| Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof | Fisher Scientific | Cat# : AC615095000 | N/A |
| Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) | Fisher Scientific | Cat#: AC126961000 | N/A |
| Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass | Fisher Scientific | Cat #: 50-143-782 | N/A |
| Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick | Grace Biolabs | SKU: 664273 | N/A |
| DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials | Fisher Scientific | Cat #: 03-341-71A | N/A |
| Embryo Collection Cage-Mini | Genesee Scientific | Cat #: 59-105 | N/A |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | Product Code: 10289651 | N/A |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge | Fisher Scientific | Cat #: 05-527-90 | N/A |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | Cat #: 14-432-22 | N/A |
| Fleischmann's, Active Dry Yeast | Fleischmann's | N/A | Purchase at Grocery Store |
| Grape Plates | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-133 | N/A |
| Halocarbon 700 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-131 | N/A |
| Heptane Glue | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 | VWR | Cat #: 55411-050 | N/A |
| Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll | Fisher Scientific | Cat #: 50-998-944 | N/A |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy | Fisher Scientific | Cat #: NC0879005 | N/A |
| Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm | Millipore Sigma | SKU: 1077351000 | N/A |
| Stainless Steel Spoon/Spatula | VWR | Cat #: 470149-044 | N/A |
| W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents | Fisher Scientific | Cat #: 23-116582 | N/A |
| Yeast Paste | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| EQUIPMENT | |||
| Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts. |
| Autoclave | N/A | N/A | Any autoclave will do fine. |
| Drummond Nanoject II Microinjector. | Drummond Scientific | N/A | This is a mineral oil based injection system. |
| GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
| Refrigerator (4C°) | N/A | N/A | Fly media and yeast paste must be stored at (4C°). |
| Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |
References
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