Summary
Presenteras här är ett protokoll till microinject och samtidigt bild flera Drosophila embryon under embryonala utvecklingen med hjälp av en tallrik-baserade, hög innehåll imager.
Abstract
Moderna metoder inom kvantitativ livecellsavbildning har blivit ett viktigt verktyg för att utforska cellbiologi, genom att möjliggöra användning av statistik och beräkningsmodellering för att klassificera och jämföra biologiska processer. Även om cellodling modellsystem är bra för hög halt bildbehandling, högt genomströmning studier av cell morfologi tyder på att ex vivo kulturer är begränsade i recapitulating den morfologiska komplexiteten som finns i celler inom levande organismer. Som sådan, Det finns ett behov av en skalbar hög genomströmning modellsystem för att bilden levande celler inom en intakt organism. Beskrivs här är ett protokoll för att använda en hög innehåll bild analysator att samtidigt förvärva flera time-lapse videor av embryonala Drosophila melanogaster utveckling under syncytial blastoderm scenen. Den syncytial blastoderm har traditionellt fungerat som en stor in vivo modell för bildbehandling biologiska händelser; dock, erhålla ett betydande antal experimentella replikat för kvantitativa och hög genomströmning metoder har varit arbetsintensiva och begränsas av avbildning av ett enda embryo per experimentell upprepa. Presenteras här är en metod för att anpassa bildbehandling och microinjection metoder för att passa en hög halt bildsystem, eller någon inverterad mikroskop kan automatiserad multipunkt förvärv. Detta tillvägagångssätt möjliggör samtidig förvärv av 6-12 embryon, beroende på önskad förvärvsfaktorer, inom en enda bildbehandling session.
Introduction
Under de senaste 30 åren har framsteg inom bildteknik och molekylära sonder för livecellsavbildning fört fram vår förståelse av cellens komplexitet och inre arbete. Medföljande denna framsteg inom teknik är en större tillit till användningen av ex vivo cell kultur modeller för förvärv av hög genomströmning bildframställning data. Cellodlingsmodeller ger flera fördelar, bland annat kontroll av mikroviromen genom mikrofluidiska system, och möjlighet att avbilda flera celler samtidigt, vilket möjliggör användning av kvantitativa metoder som är nödvändiga för screening med höggenomströmning 1,2. Det finns dock också betydande nackdelar som är förknippade med cellodlingsmodeller i samband med morfologiska studier, såsom tvådimensionella glas- eller plastytor som producerar förvirrande effekter på cellmorfologi och dessförordning 3,4,5. Dessa effekter kan ge falska eller vilseledande data när det gäller studier av biologiska processer som reglerar cellulär morfologi.
Även om alternativet har varit att studera cellulära morfologi i samband med en intakt organism6,få lämpliga intakt organismer underlätta hög genomströmning kvantitativa levande cell imaging på grund av svårigheter att hålla hela organismer vid liv genom ut imaging, och utmaningar i samband med avbildning inuti en stor flercelliga organism. Som ett resultat har cellbiologiska studier i intakta organismer i allmänhet fokuserat på att observera en enda organism över tiden, vilket kraftigt begränsar urvalsstorleken. Dessutom gör denna begränsning av en djur-vid-en-tid att det är svårt och kostsamt att använda live-bild av i form av en skärm och begränsar möjligheten att tillämpa kvantitativa analysverktyg eftersom antalet prover i allmänhet är för litet. Således uppstår behovet av en flercellig modellorganism som kan användas för högt innehåll baserade kvantitativa metoder.
Detta protokoll anpassar Drosophila embryot för plattan-baserade hög innehållsbildning för att generera experimentella provstorlekar stora nog för kvantitativ analys. Drosophila melanogaster är allmänt känd som den första modellen organism. Forskning med Drosophila har lett till genombrott inom cell- och molekylärbiologi, inklusive överföring av genetisk information, identifiering av cellsignaleringsvägar, och genetiska krav på embryonal utveckling7,8,9. Dessutom har Drosophila embryot använts för att utforska in vivo mikrotubuli dynamik under celluläradivision 10,11,12. Användningen av mikroinjektion för att leverera små molekyler och molekylära sonder ger tidsstyre som gör Drosophila embryonal utveckling särskilt kraftfull för att sondera cellulära processer in vivo13,14. Men genererar ett betydande antal experimentella upprepningar med en traditionell bildbehandling strategi är extremt arbetsintensiva och har begränsad användning i hög genomströmning bildskärmar och kvantitativ analys. Vår metod använder sig av en hög halt analysator vanligtvis reserverad för encellig analys och anpassar in vivo bildframställning analys i syncytium av den tidiga Drosophila embryo.
Detta protokoll användes för att samla in, skede, och microinject Drosophila embryon att utforska de mekanismer som driver morfologiska förändringar i Endoplasmic Reticulum (ER) under mitos15. Även om många studier har beskrivit den dynamiska karaktären av ER under cellcykeln16,17,18,19, har det varit svårt att jämföra effekterna av flera perturbations över tiden på ER morfologi. För att identifiera de komponenter som driver förändringar i ER morfologi över cell division, de metoder som anges i detta protokoll användes för att avkamma rollen av mikrotubuli och andra cytoskelettal faktorer på mitotiska ER omorganisation med hjälp av den kortikala syncytial division i början Drosophila embryot. Sammantaget tillgången till genetiska perturbation inom Drosophila samhället, förmågan att microinject läkemedel och molekylära sonder vid exakta tidpunkter under utvecklingen, och den billiga kostnaden för att arbeta med Drosophila gör detta tillvägagångssätt mycket mottagliga för hög genomströmning bildbaserad screening. De metoder som beskrivs här är tillämpliga för att studera en mängd olika cellulära och utvecklingsmässiga processer in vivo med hjälp av Drosophila embryot 20. Specifikt är detta protokoll väl anpassat för att studera biologiska händelser som inträffar under en längre period och inom 100 mikrometer från Drosophila embryocortex.
Protocol
OBS: Se tabell 1 för recept på media och lösning.
1. Inrättande och underhåll av en embryosamlingsbur för levande analys21
- Befolka en färsk embryosamlingsbur med färska flugor.
OBS: Medan kommersiellt tillgängliga samlingsburar rekommenderas, kan samlingsburar enkelt konstrueras av tomma flugflaskor21.- Kasta eller överföra vuxna flugor från flaskor när många puppor börjar mörkna i steg p14; vid 20 °C detta sker cirka 14 dagar efter det att äggen har lagts22.
- Låt puppor kläckas och befolka flaskorna i 12-24 h.
- Överför färska flugor till en liten samlingsbur med hjälp av en liten tratt över uppsamlingsburöppningen för att förhindra att flugor flyr. Kombinera upp till 3 flaskor för att producera en tätbefolkad bur som innehåller 200 till 500 flugor.
- Överför flyger in i uppsamlingsburen genom att knacka en flugflaska mot en hård yta upprepade gånger (för att bedöva flugorna). Öppna och invertera sedan flugflaskan över uppsamlingsburstratten. Tryck på den öppna flaskan på uppsamlingsburen några gånger för att släppa flugor i uppsamlingsburen.
- Stäng den öppna flugflaskan genom att snabbt ställa ner den på sin kontakt. Medan du överför den öppna flugan flaskan från tratten till dess plugg, se till att flaskan öppningen pekar nedåt som flugor tenderar att krypa upp bort från källan till avlyssning.
- Tryck tratten mot flugburöppningen och knacka på buren upprepade gånger på en hård yta för att bedöva flugorna inuti. Ta omedelbart bort tratten och säkra en färsk druvplatta till flugbursöppningen. Använd etiketteringstejp för att säkra druvplattan. Upprepa denna process för att kombinera upp till 3 flaskor för att producera en tätbefolkad samlingsbur.
OBS: Alternativt kan flugor vara bedöva med hjälp av CO2 eller andra flyga sovande medel; detta kommer dock att öka acklimatiseringsperioden i steg 1.2.
- Acklimatisera den nya samlingsburen för 24-48 h. Om CO2 eller några andra sovmedel användes, acklimatisera uppsamlingsburen i minst 48 h.
- Byt ut druvplattan i uppsamlingsburen mot en färsk som innehåller jästpasta två gånger om dagen, med 8-10 h från varandra.
- Setup en färsk samling bur var 5 dagar.
2. Samla in och förbereda embryon för bildframställning
- Att få fram embryon med synkroniserad utveckling
- Byt druvplattan på uppsamlingsburen med en färsk som innehåller en klick jästpasta i mitten. Låt flugor lägga embryon i 1 h. Sing den gamla druvplattan.
OBS: Flugor kan befrukta embryon innan de lägger dem. Den första samlingsplattan kommer att innehålla många av dessa förutvecklade embryon. Att låta flugor dumpa gamla embryon först kommer att förbättra utvecklingssynkroniseringen mellan embryon. - Byt druvplattan mot en färsk som innehåller en sandskädda jästpasta i mitten och låt flugor lägga embryon i 10 min. Sing den gamla druvplattan.
OBS: För att undvika att den embryonala utvecklingen på kalla tallrikar saktas ned, värm druvplattan och jästpastan till rumstemperatur före användning. - Byt druvplattan med en färsk (utan jästpasta) och spara den gamla druvplattan, den har embryon för avbildning. Fortsätt vid behov att samla in embryon från denna bur genom att upprepa steg 2.1.2 och 2.1.3.
- Byt druvplattan på uppsamlingsburen med en färsk som innehåller en klick jästpasta i mitten. Låt flugor lägga embryon i 1 h. Sing den gamla druvplattan.
- Ålder samla embryon för 30-45 min till bild syncytial indelningar23.
OBS: För att avbilda det synkytala blastoderm-steget i embryonal utveckling måste embryona monteras och på mikroskopet inom 90 min från insamling. När du försöker detta protokoll för första gången, ålder embryon 10-20 min i steg 2,2 för att ge extra tid att ställa upp mellan steg. - Dehorionate embryon med 50% blekmedel i DI vatten.
- Överför lagrade embryon från steg 2.2 till en 140 nm sikt genom att fylla druvplattan med DI-vatten, försiktigt rubba embryona med en färgpensel, och hälla vattnet med embryon i 140 nm sikten (Figur 1A).
OBS: Detta kan göras över en diskbänk eller 1.000 mL bägare. - Skölj kraftigt embryon med ett DI-vatten med hjälp av en spruta flaska. Torra embryon genom att blotta silen på en torr pappershandduk. Blot silen tills det slutar lämna vattenmärken på pappershandduken (Bild 1B).
OBS: Ta bort all jästpasta från embryon eftersom den kan göra blekmedelsbehandling ineffektiv i nästa steg. - Fyll en tom 10 cm platta med nyberedd 50% blekmedel utspädd med DI vatten (1:1 blekmedel: DI vatten). Doppa silen i 50% blekmedel i 2 min 45 s. Starta ett stoppur så fort silen vidrör 50% blekmedel. Blot sikten in och ut av 50% blekmedel 3-4x i de första 15 s till upplösning embryo klumpar (Figur 1C).
- Skölj kraftigt embryon med DI-vatten med hjälp av en spruta flaska. Torka embryona genom att blotta sikten på en torr pappershandduk. Upprepa kraftig skölj- och blottorkningsprocess för 5x (Bild 1D).
OBS: Detta är det viktigaste steget för att ta bort överbjd chorion. Använd en full DI spruta flaska och använda hälften av flaskan i detta steg. - Överför de blot torkade embryona från sikten till en 10 cm druvplattor med hjälp av en pensel21 (Bild 1E)
OBS: Manuell diklorinering kan användas som alternativ till blekmedelsdehydrering24.
- Överför lagrade embryon från steg 2.2 till en 140 nm sikt genom att fylla druvplattan med DI-vatten, försiktigt rubba embryona med en färgpensel, och hälla vattnet med embryon i 140 nm sikten (Figur 1A).
Bild 1: Avsjorionering av embryon. (A) Embryon samlades med hjälp av en DI H20 spruta flaska, pensel, och 140 nm sikt. (B) Embryon sköljdes kraftigt med hjälp av en DI H20 spruta flaska och blot torka över en pappershandduk. (C) Dechorionation av embryon utfördes i 50% blekmedel för 2 min och 45 s. (D) Embryon sköljdes kraftigt med hjälp av en DI H20 spruta flaska och blot torka över en pappershandduk. Detta upprepades 4 gånger för att ta bort överskott chorion. (E) Embryon överfördes sedan till 10 cm druvplatta med hjälp av en pensel. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
3. Montering av embryon till täckslips
- Under ett stereomikroskop utrustad med overhead gås hals belysning, organisera två rader med 15-20 embryon på en ren del av druvplattan med hjälp av ett ägg picker verktyg. Anpassa embryon på deras ventrala sida i samma orientering med avseende på främre och posteriors slutar. För att göra äggplockare böja fin spets rostfritt stål pincett till 45 ° vinkel. Att se över D / V embryon orientering se Campos-Ortega et al.20.
OBS: Det är viktigt för den ventrala ytan att sitta på druvplattan eftersom embryona kommer att pressas på en täckslir i steg 3.5, utsätta ryggytan för avbildning. Eftersom ryggytan är mycket plattare än den ventrala ytan, ökar bildbehandling av ryggsidans yta antalet kärnor som finns inom ett enda Z-plan. - Förbered 75 mm x 25 mm silikon spacer coverslip.
OBS: Detta kan förberedas i förväg. Förbered flera coverslips och förvara dem i en ruta för att hålla dem rena.- Spåra konturen av ett 75 mm x 25 mm täckblad på ett 1,6 mm tjockt silikondirigblad och skär ut silikondiasen med hjälp av sax (bild 2A).
- Skär ut ett 40 mm x 15 mm inset från mellanslag (Bild 2A) med hjälp av ett rakblad .
- Följ distansen på täcket och strimma 10 μL av heptanlim ner det exponerade täckglaset infälld (Bild 2A).
OBS: Sätta ner och även strimma kommer att säkerställa imaging embryon på samma z plan.
- Medan heptanlimet från steg 3.2.3 torkar, skär ut en rektangulär del av druvplattan som innehåller embryona från steg 3.1.
- Använd ett rakblad för att skära en rektangel (mindre än 40 mm x 15 mm) runt de två raderna av embryon. Ta inte bort rektangeln ännu.
- Klipp ut en andra rektangel bredvid den första. Ta bort den andra rektangeln med hjälp av den raka kanten sidan av en rostfri spatel.
- Skjut försiktigt den raka kanten på en stekspade i rostfritt stål under den första rektangeln och ta bort den (Bild 2B).
- Placera druvskylten utskärning med embryon på den yttre sidan av en 3,5 cm skål (Figur 2C).
- Under ett stereomikroskop, sänk en beredd täckbild över embryona och tryck försiktigt de två raderna av embryon på limmet (Figur 2D).
- Om microinjecting embryon, hoppa till steg 4.1. Om inte microinjecting fortsätta att steg 3.7.
- Täck embryon genom att fylla silikondiploaten (halvvägs till toppen) med 1:1 - halocarbonolja 700: halokarbonolja 27.
- Linje botten kanterna på en 4-slide plattan adapter med dubbelsidig tejp för att förhindra att locket slip från att flytta men se till att inte placera bandet i vägen för objektivet objektivet. Det här bandet är kritiskt. Om coverslip bara sitter på adaptern, kommer det att röra sig under hela förvärvet. Montera luckan på 4-glidplattans adapter.
Bild 2: Coverslip förberedelse och montering. (A) En kontur på 75 mm x 25 mm täckblad spårades på ett 1,6 mm tjockt silikonblad. Använd sax för att klippa ut konturen. 40 mm x 15 mm infällda skars ut från silikondindesteget och monterades sedan på täcket. Strimmig 15 μL ner i mitten av inset. (B) Två rader med 15-20 embryon organiserades på en druvplatta i ett område som var mindre än 40 mm x 15 mm, sedan skars det området ut med hjälp av en rakhyvel och rostfri spatel. (C) Druvstätning utskuren placerades på ovansidan av en tom 3,5 cm maträtt. (D) Under ett stereomikroskop sänktes täckskopet från (A) och embryona fastnade på limstrimmor. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
4. Utdejtande och mikroinjecting embryon
- Placera täckskopet med embryon över ett objektglas för att förhindra att täckbottens botten blir smutsig vid uttorkning och mikroinjektion.
OBS: Omslagsslien kommer att avbildas utan att en bild är fäst vid den. Därför är ett inverterat mikroskop nödvändigt för avbildning. - Desiccate embryon för 5-10 min, beroende på temperaturen i rummet. De embryon som användes för avbildning i de representativa resultaten var uttorkad i 7 min vid 20 °C i en kammare som innehåller ett 1:1-skikt av kiselgelpärlor över ett torkmedel (Figur 3A).
- Omedelbart efter uttorkning, täck embryon med 1:1 - halocarbon olja 700: halocarbon olja 27. Fyll silikondiplodet halvvägs till toppen.
OBS: Det är viktigt att blanda en hög viskositet halocarbon olja med en låg viskositet halocarbon olja. Ren halocarbon olja 700 (hög viskositet) saktar ner cellcykler progression 30 min post ansökan. En 1:1 blandning av halocarbon olja 700 och halocarbon olja 27 fast denna artefakt. - Ladda mikroinjektionsnålar med insprutningsmedel, montera sedan en till mikroinjektorn och skär upp den under tryck.
OBS: Öva steg 4.4 några gånger innan du utför hela analysen med några värdefulla reagenser. Detta är det svåraste steget i mikroinjektionsprocessen.- Ladda mikroinjektionsnålar med 2 μL insprutningsmedel med hjälp av en förlängd lastspets. Endast en mikroinjektionsnål krävs, men det är bra att ha reservladdade nålar i närheten så förbered 2 eller 3 nålar.
OBS: Se tabellen över material för specifikationer om utökade lastningstips. Microinjection nålar kan inte laddas utan utökade lastning tips på grund av den unika karaktären av vår mikroinjektion teknik, som bygger på att bygga lufttryck inuti en förseglad och laddad nål innan du öppnar sin spets. - Montera en nål på mikroinjektorn och tryck ned kolven halvvägs till spetsen. Målet är att öka lufttrycket insidan av glas kapillären (Bild 4A).
OBS: Använd en kolv mineralolja baserad microinjector utan mineralolja. Istället för att bygga tryck med mineralolja, använd kolven för att bygga lufttryck. - Sänk glasnålen på en glasrutschkana och skär upp nålens spets med hjälp av en ny #9 rakhyvel. Skär nålen i 45° vinkel för att få fram en skarp öppen spets. Injektionsmedlet ska rinna ner till botten av spetsen utan att rinna ut ur nålen. Tillsätt försiktigt 20 μL halokarbonolja över nålspetsen och skär upp den igen i 45°. Injektionsmedlet ska börja flöda snabbt.
- Omedelbart sänka lufttrycket genom att dra tillbaka kolven men se till att upprätthålla en kontinuerlig flödeshastighet för att förhindra att nålen täpper igen med embryomembran mellan injektioner. (Figur 4B).
OBS: Om insprutningsmedlet är klart, visa insprutningsflödeshastigheten genom att lyfta mikroinjektionsnålen in och ut ur halokarbonolja och observera bildningshastigheten för insprutningsmedelsdroppar under ett stereomikroskop. Justera lufttrycket genom att trycka ned kolven några klick i taget, doppa sedan mikroinjektionsspetsen in och ut ur halokarbonolja för att visa bildningshastigheten för nya droppar efter justering. - Använd mikromanipulatorn för att placera nålen i mitten av synfältet, lyft sedan nålen med hjälp av mikromanipulatorn och ta bort glasrutschkanan under den. Nålen är nu kalibrerad för injektion.
- Ladda mikroinjektionsnålar med 2 μL insprutningsmedel med hjälp av en förlängd lastspets. Endast en mikroinjektionsnål krävs, men det är bra att ha reservladdade nålar i närheten så förbered 2 eller 3 nålar.
Bild 3: Utsödningskammarens diagram. (A) Detta är ett diagram över en desiccation kammare. Kammaren består av ett 1:1-skikt av kiselgelpärlor över ett lager av torrierit. För att utföra uttorkning placerades embryon ovanpå ett enda brunnsplattalock. Desiccation kammaren var stängd 7 min. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
- Mikroinject embryon
- Placera embryona på stereomikroskopet scenen under microinjection nål men inte sänka nålen.
- Fokusera på embryon vid 50x förstoring.
- Sänk nålen tills den kommer in i samma fokus plan som embryon. Flytta bilden med en hand och driva mikroinjektor med den andra, injicera en rad av embryon.
- Höj nålen och rotera bilden 180° för att exponera den andra raden av embryon för mikroinjektionsnålen. Sänk nålen och injicera den andra raden av embryon.
OBS: Försök att göra detta på under 10 min. Låt några icke-injicerade embryon användas som kontroller.
Bild 4: Mikroinjektionsnålpreparat. (A) I denna illustration, intensiteten av magenta i nål är representativ för lufttryck. En laddad nål var monterad på microinjector och kolven förlängdes 50% för att öka lufttrycket insidan av nålen. Se till att kolven är maximalt indragen före montering. (B) Nålspetsen skars under tryck och kolven drogs in för att minska lufttrycket och flödeshastigheten. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
5. Bildframställning på en analysator med högt innehåll
- Innan du kör denna analys skapa en plattan karta för en bildadapter. Använd plattan innehavaren redaktör finns i Plate Map Manager menyn för att ange dimensionen för en anpassad platta adapter.
OBS: En anpassad plåtkarta gjordes för den i kommersiellt sett tillgängliga plattadaptern (se Table of Materials). Plattan kartan innehåller följande inställningar; Glidtjocklek: 1000 μm, Bottenhöjd: 1,607 mm, bottenhöjd variabilitet: 100 μm, substratmaterial: glas, täckkollajtjocklek: 150 μm, täckbreddsläge: botten – rader: 1 – avstånd: 56,987 mm, kolumner: 4 – avstånd 28,391, storlek och form: rektangel, bredd 23,00 mm, höjd: 73,00 mm, förskjutning till A1 21,29 mm – 42,74 mm) - Ladda bildadaptern i mikroskopet och använd funktionen Förhandsgranska för att kakel en brightfield 10x bild av coverslip.
- Välj ett embryo från över- eller underkanten av en rad och välj sedan Objective och växla till 60x (NA 0.95). Bestäm en lämplig exponering för önskad fluorescenskanal.
OBS: Bibehåll laserintensiteten under 25% för avbildning av levande celler. - På huvudinstrumentpanelen använder du funktionen Förhandsgranska för att kakel en fluorescerande 60x bild som innehåller båda raderna av embryon.
- På huvudinstrumentpanelen väljer du rullgardinsmenyn Binning och anger binningen till 1 x 1 för optimal upplösning.
- Använd fliken z Stack setup för att definiera parametrar för z-stackar.
- I fliken z Stack setup använder du pilarna Upp och Ned för att hitta sedan definiera övre och nedre z stack gränser. När övre och nedre gränserna har definierats väljer du ikonen grön penna för att spara z-stackpositionen. Notera z stack-positionen som den kommer att användas i steg 5.6.5.
- I fliken z Stackinställning använder du inmatningsrutan z Steg definiera mellanrum mellan z-segment.
OBS: Det totala antalet skivor bestäms genom att modulera steg 5.6.1 och 5.6.2. - På huvudinstrumentpanelen högerklickar du på Lysrörskanalen och använder rullgardinsmenyn Bildläge för att ställa in bildläget på 3D.
- På huvudinstrumentpanelen väljer du rutan Laser Autofokus för att inaktivera autofokus.
- På huvudinstrumentpanelen definierar du Initial Focus med z-stackpositionen från steg 5.6.1 och välj sedan den Inledande fokusrutan för att inaktivera funktionen " Fokusera om vid varjeTidspunkt" - funktion.
- På fliken Fält använder du listmenyn Fältplacering för att aktivera Anpassade poäng, sedan med hjälp av pilarna för att välja punkter för avbildning.
OBS: Tidsintervallet mellan förvärv (steg 5.8) kommer att avgöra hur många anpassade punkter som kan avbildas samtidigt. - I fliken Tidsserie väljer du rutan Anska tidsserie för att aktivera tidsseriefunktionen, definiera sedan det totala antalet tidspoäng.
OBS: 6 anpassade punkter x 5 z skivor x 80 stackar = 2.400 bilder, 2.400 bilder x 8,2 MB per bild = 19,68 GB diskutrymme. - På huvudinstrumentpanelen använder du rutan För namninmatning för att namnge förvärvsinställningarna och välj sedan Arkiv och Spara för att spara förvärvsinställningarna.
- På huvudinstrumentpanelen väljer du knappen Skanna för att köra förvärvet.
6. Post bildbehandling
- Dra och släpp xdce-filen i Fiji för att öppna bildserien som en flerdimensionell hyperstack.
- Spara hyperstacken som en tif-fil.
- Skapa max intensitet prognoser och spara dem som en tif-filer.
- Montera ett bibliotek med projektioner med max intensitet och bygg en pipeline för datautvinning och analys.
Representative Results
Det tillvägagångssätt som presenteras i detta protokoll användes för att undersöka mikrotubulis roll i Omorganisationen av Endoplasmatiska Reticulum (ER) under mitos i Drosophila embryot 15. Under mitos visar strukturen på ER en dramatisk omorganisation, men de krafter som driver dessa förändringar är dåligt förstådda. Nyligen visades en familj av ER forma proteiner för att främja bildandet av ER tubule25,26,27,28, som är kända för sin närhet med mikrotubuli28. För att studera rulle av microtubules på ER morfologi, de metoder som tillhandahålls i protokollet användes för att generera data för att kvantitativt jämföra effekterna av flera microinjected läkemedelsbehandlingar på ER omorganisation under mitos. Kolkicin, som förhindrar ny mikrotubulipolymerisering, befanns drastiskt minska omorganiseringen av ER under mitos enligt figur 5 och figur 6. Vidare, det tillvägagångssätt som beskrivs här möjliggjorde produktion av tid varv imaging data för 32 embryon. Medel- och maxintensitetsmätningar producerades från 12 800 intresseregioner med hjälp av ett anpassat MATLAB-skript, vilket också genererade beskrivande och inferential statistik som är avgörande för att göra jämförelser mellan läkemedelsbehandlingar. På grund av tillgången på molekylära sonder och den lätthet av mikroinjektioner, de metoder som beskrivs här är lätt anpassningsbara för att studera en mängd olika biologiska processer via fluorescens intensitet kvantifiering.
Figur 5: Representativa Bilder av Rtnl1-GFP och ReepB-GFP-anrikning vid spindelpolerna under mitos. (A) 60x synfält av ReepB-GFP under mitos i cellcykel 10. Den blå fyrkanten representerar synfältet som används för panelerna B-E. Panel A bearbetas med ett tröskelbindfilter. Det här filtret tillämpades inte på panelerna B-E eftersom det utesluter data från pixlar under det inställda tröskelvärdet. (B,D) ReepB-GFP i kontroll, och i kolkicin. (C,E) Rtnl1-GFP i kontroll, och i kolchicin. Denna siffra har modifierats från Diaz et al.15. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Kvantisering av Rtnl1-GFP och ReepB-GFP-anrikning vid spindelpolerna under mitos. 20 spindlar och 20 cytoplasman ROIs över 10 ramar analyserades för 32 embryon i följande villkor. (A) 10% DMSO kontroll injektioner för Rtnl1-GFP. Kontroll embryon visade en 0,1-faldig ökning av anrikning (p<0,001 för alla prover vid T210) jämfört med icke-injicerade prover (p < 0,001 för alla prover på T210). (B) ReepB-GFP embryon som injiceras med 10% DMSO att tjäna som kontroll. Kontrollembryon visade en 0,1-faldig ökning av anrikningen (p<0.001 för alla prover vid T210) jämfört med icke-injicerade prover (Figur 1E; p < 0.001 för alla prover vid T210). (C) Rtnl1-GFP embryon som injiceras med 5 μM Kolchicin. Här mätte vi en reduktion av Rtnl1-GFP-anrikning till spindlar (p < 0,001 för alla prover på T210) jämfört med kontroller (A) (p < 0,001 för alla prover på T210). (D) ReepB-GFP embryon som injiceras med 5 μM Kolchicin. Vi mätte en minskning av ReepB-GFP anrikning till spindlar (p<0,001 för alla prover på T210) jämfört med kontroller (B) (p<0.001 för alla prover på T210). Denna siffra har modifierats från Diaz et al.15. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| 1. Jäst Pasta21 | 2. Druvplattor21 | 3. Heptane Lim24 |
| 1,1 Tillsätt 7 gram aktiv torrjäst till en 50 ml konisk. Tillsätt 9 milliliter DI vatten och blanda till jämn beständighet med en metallspatel. | 2.1 Gör lösning a: Tillsätt 6 gram agar till 140 ml DI-vatten i en 250 ml kolv och autoklavera den. | 3.1 Fyll en glasscintillationsflaska med 50 tum dubbelsidig tejp. |
| 1,1 Tillsätt 7 gram aktiv torrjäst till en 50 ml konisk. Tillsätt 9 milliliter DI vatten och blanda till jämn beständighet med en metallspatel. | 2.2 Gör lösning b: Blanda 0,1 gram metylparaben i 2 ml etanol och tillsätt sedan denna lösning till 60 ml grapefruktjuicekoncentrat. | 3.2 Tillsätt 20 ml heptan och tätningsglasscintillationsflaska med parafilm. Rotera över natten i rumstemperatur. |
| 2.3 Omedelbart efter autoklavering lösning a, blanda i lösning b och häll blandningen i 10 x 35mm perti rätter. (gör 35 druvplattor) | 3.3 Avlägsna plastbandsskräp genom att överföra lim till 2 15 ml koniska rör och centrifugera vid 3000 RPM i 15 minuter. | |
| 2.4 Låt druvplattor ställas in i rumstemperatur över natten med tallrikslock av. Täckplattor med lock och förvara i 4C° efter att de satts. | 3.4 Överför limsuptant till 1,5 ml mikrocentrifugrör för förvaring. |
Tabell 1: Recept på media och lösningar.
Discussion
Det protokoll som beskrivs här är mycket mångsidig och lätt att anpassa för att studera biologiska händelser i en mängd olika stadier i Drosophila embryonala utveckling. Detta protokoll är väl lämt för att studera biologiska processer som sker under långa tidsperioder. Till exempel, studier av cellularization29,30 eller bildandet av heterokromatin domäner i Drosophila31,32 kunde dra nytta av att utnyttja de metoder som beskrivs i detta protokoll eftersom dessa processer sker under en längre tid. Dessutom kan provstorlek ökas genom att minska förstoringen för att studera frågor som kräver mindre optisk upplösning, såsom tidpunkten mellan syncytial divisioner33 eller gastrulationens varaktighet34. På samma sätt tillåter ett 20x-mål två embryon att avbildas inom ett bildplan. Metoderna i detta protokoll ger en dynamisk plattform för att ställa biologiska frågor med hjälp av embryonal utveckling som ett modellsystem för kvantitativ analys.
Det finns 3 kritiska steg i det här protokollet. Post avchorionation i 50% blekmedel är det absolut nödvändigt att embryon sköljs och torkas kraftigt 5 gånger (2.3.4). Detta steg tar bort alla överblivna små bitar av chorion. Överbliven chorion kommer att hindra synfältet när avbildning embryot. När man monterar embryona på glasöverdrag (3.5) är det viktigt att man trycker fast embryona på limmet med ett enhetligt tryck. Detta kommer att placera embryona på samma z plan. När du skär öppna mikroinjektionsnålen är det viktigt att dra tillbaka kolven omedelbart för att justera nålens flödeshastighet eller så förlorar du allt ditt injektionsmedel.
Vår studie begränsades av två faktorer. Den första faktorn var att inte ha en automatiserad segmenteringsprocess. Vi utformade en manuell segmentering skript med hjälp av MATLAB, dock; med en genetiskt kodad spindelmarkör skulle denna process kunna automatiseras. I framtiden vill vi producera CNN-RFP21, Rtln1-GFP och CNN-RFP; ReepB-GFP transgena linjer för att möjliggöra automatiserad spindel segmentering. För mer information angående vår MATLAB script och analyspipeline, se kompletterande material av Diaz et al.15. För det andra var vi också begränsas av vår förvärvsintervall på 35 s, vilket endast tillät oss att bild 6 embryon samtidigt. Ett längre förvärvsintervall skulle göra det möjligt för oss att avbilda fler embryon samtidigt. Även om drug delivery genomströmning kan öka genom att ersätta microinjection med ett permeation steg, fann vi detta vara onödigt eftersom vår provstorlek var redan begränsad av förvärv intervall.
Medan detta protokoll användes för att avbilda Drosophila embryonala utveckling, är den övergripande metoden anpassningsbar för att studera embryonal utveckling i andra flercelliga modellsystem, såsom C. elegans, Sjöborrar, och Xenopus. Embryon är extremt användbara för kvantitativ analys eftersom de enkelt synkroniseras via insamling eller befruktning. Dessutom flyttar embryon inte eller simmar bort från ett synfält, vilket gör det möjligt att använda en enkel multipunkt förvärv kapabel programvara för att producera flera videor tid förfaller för kvantitativ analys. Även om vi använde en analysator med hög halt i vår studie, kan alla inverterade mikroskop system som kan multipoint förvärv paras ihop med de metoder som avses häri.
Liknande resultat kan erhållas med hjälp av en multipoint förvärv kan inverterad confocal mikroskop; dock, fördelarna med en hög halt analysator fram som en ökar provstorlek för att studera frågor som kräver mindre upplösning i tid. En uppenbar fördel med att använda en analysator med högt innehåll är möjligheten att bild 4 separata diabilder samtidigt jämfört med 1 slide på traditionella system. Med en fullständig uppsättning av 4 diabilder och 40 embryon på varje objektglas kan 160 embryon avbildas under flera timmar, så länge förvärvsintervallet är minst 15 min mellan ramarna. En annan viktig fördel med att använda en analysator med hög halt är att proverna är helt avspärrade från eventuella externa ljuskällor, vilket är nödvändigt för fluorescensintensitetsbaserade mätningar. Slutligen, den höga innehållet analysator som används i vår studie har en 5,5-megapixel CMOS kamera som ger en generös 221,87 μm synfält vid 60x förstoring. Detta större synfält gjorde det möjligt för oss att avbilda ett halvt embryo per förvärvspunkt.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
UD, WFM och BR stöds av Center for Cellular Construction, en National Science Foundation (NSF) Science and Technology Center, enligt bidragsavtalet DBI-1548297. BR stöds också genom en NSF CAREER award, 1553695.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x 35mm Micro Dish | VWR | Cat #: 10799-192 | N/A |
| 100% grape juice concentrate | Welch's, 100% Concentrate Grape Juice | N/A | Purchase at Grocery Store |
| 250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth | VWR | Cat #: 10536-914 | N/A |
| 3" Non-Metallic Sieve No. 140 | Gilson Company | SV-165 #140 | N/A |
| 4 Slide Imaging Tray | Grace Biolabs | SKU: 400104 | N/A |
| ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy | Fisher Scientific | Cat #: AC411255000 | N/A |
| Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof | Fisher Scientific | Cat# : AC615095000 | N/A |
| Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) | Fisher Scientific | Cat#: AC126961000 | N/A |
| Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass | Fisher Scientific | Cat #: 50-143-782 | N/A |
| Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick | Grace Biolabs | SKU: 664273 | N/A |
| DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials | Fisher Scientific | Cat #: 03-341-71A | N/A |
| Embryo Collection Cage-Mini | Genesee Scientific | Cat #: 59-105 | N/A |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | Product Code: 10289651 | N/A |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge | Fisher Scientific | Cat #: 05-527-90 | N/A |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | Cat #: 14-432-22 | N/A |
| Fleischmann's, Active Dry Yeast | Fleischmann's | N/A | Purchase at Grocery Store |
| Grape Plates | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-133 | N/A |
| Halocarbon 700 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-131 | N/A |
| Heptane Glue | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 | VWR | Cat #: 55411-050 | N/A |
| Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll | Fisher Scientific | Cat #: 50-998-944 | N/A |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy | Fisher Scientific | Cat #: NC0879005 | N/A |
| Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm | Millipore Sigma | SKU: 1077351000 | N/A |
| Stainless Steel Spoon/Spatula | VWR | Cat #: 470149-044 | N/A |
| W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents | Fisher Scientific | Cat #: 23-116582 | N/A |
| Yeast Paste | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| EQUIPMENT | |||
| Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts. |
| Autoclave | N/A | N/A | Any autoclave will do fine. |
| Drummond Nanoject II Microinjector. | Drummond Scientific | N/A | This is a mineral oil based injection system. |
| GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
| Refrigerator (4C°) | N/A | N/A | Fly media and yeast paste must be stored at (4C°). |
| Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |
References
- Zanella, F., Lorens, J., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).
- Jennings, B. Drosophila-a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).
- Bickle, M. The beautiful cell: high-content screening in drug discovery. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy based high content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
- Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).
- Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Letsou, A., Bohmann, D. Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).
- Sullivan, W., Theurkauf, W. The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo. Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).
- Schejter, E., Wieschaus, E. Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo. Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).
- Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos. Development. 103 (4), 675-686 (1988).
- Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development. Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).
- Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).
- Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis. PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).
- Shibata, Y., et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).
- Bergman, Z., et al. Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo. PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).
- Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
- Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells. The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer Science & Business Media. eBook ISBN 978-3-662-22489-2 (2013).
- Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-087969827-0 (2000).
- Bainbridge, S., Bownes, M.
- Bate, M., et al. Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. Chapter 3. ISBN 978-087969899-7 (1993).
- Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, Academic Press. 113-123 (2001).
- Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules. Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).
- Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).
- Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network. The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).
- Loncar, D., Singer, S. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Mazumdar, A., Mazumdar, M. How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster. Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).
- Yuan, K., O'Farrell, P. TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos. Genes & Development. 30 (5), 579-593 (2016).
- Walther, M., et al. Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis. Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).
- McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos. Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).
- Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos. Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).
