Summary
Presentert her er en protokoll for mikroinject og samtidig bilde flere Drosophila embryoer under embryonal utvikling ved hjelp av en plate-basert, høyt innhold imager.
Abstract
Moderne tilnærminger i kvantitativ levende celleavbildning har blitt et viktig verktøy for å utforske cellebiologi, ved å muliggjøre bruk av statistikk og beregningsmodellering for å klassifisere og sammenligne biologiske prosesser. Selv om cellekulturmodellsystemer er gode for høyinnholdsavbildning, tyder studier av cellemorfologi på at ex vivo-kulturer er begrenset til å rekafulere den morfologiske kompleksiteten som finnes i celler i levende organismer. Som sådan er det behov for et skalerbart høyt gjennomstrømningsmodellsystem for å bilde levende celler i en intakt organisme. Beskrevet her er en protokoll for bruk av en høyinnholdsbildeanalysator for samtidig å skaffe flere time-lapse videoer av embryonale Drosophila melanogaster utvikling under syncytial blastoderm scenen. Den syncytial blastoderm har tradisjonelt fungert som en stor in vivo modell for avbildning biologiske hendelser; Men å skaffe et betydelig antall eksperimentelle repliker for kvantitative og høy gjennomstrømming tilnærminger har vært arbeidsintensiv og begrenset av avbildning av et enkelt embryo per eksperimentell gjentakelse. Presentert her er en metode for å tilpasse bildebehandling og mikroinjeksjon tilnærminger for å passe et høyt innhold bildebehandlingssystem, eller et invertert mikroskop i stand til automatisert multipoint oppkjøp. Denne tilnærmingen muliggjør samtidig oppkjøp av 6-12 embryoer, avhengig av ønskede oppkjøpsfaktorer, innen en enkelt bildebehandlingsøkt.
Introduction
I løpet av de siste 30 årene har fremskritt innen bildeteknologi og molekylære sonder for levende celleavbildning avansert vår forståelse av cellens kompleksitet og indre arbeid. Medfølgende dette fremskrittet i teknologi er en større avhengighet av bruk av ex vivo cellekulturmodeller for innhenting av bildedata med høy gjennomstrømning. Cellekulturmodeller gir flere fordeler, inkludert kontroll av mikromiljøet gjennom mikrofluidiske systemer, og evnen til å bilde flere celler samtidig, slik at bruk av kvantitative tilnærminger som er nødvendige for screening med høy gjennomstrømning1,2. Det er imidlertid også betydelige ulemper forbundet med cellekulturmodeller i sammenheng med morfologiske studier, for eksempel todimensjonale glass- eller plastoverflater som produserer forvirrende effekter på cellemorfologi ogdens regulering 3,4,5. Disse effektene kan gi falske eller villedende data med hensyn til studiet av biologiske prosesser som regulerer cellulær morfologi.
Selv om alternativet har vært å studere cellulær morfologi i sammenheng med en intaktorganisme 6, forenkler få egnede intakte organismer høy gjennomstrømning kvantitativ levende celleavbildning på grunn av vanskeligheter med å holde hele organismer i live gjennom utavbildning, og utfordringer forbundet med avbildning inne i en stor flercellet organisme. Som et resultat har cellebiologiske studier i intakte organismer generelt fokusert på å observere en enkelt organisme over tid, noe som i stor grad begrenser prøvestørrelsen. I tillegg gjør denne engangsbegrensningen levende bildebehandling vanskelig og kostbart å ansette i form av en skjerm og begrenser muligheten til å bruke kvantitative analytiske verktøy siden antall prøver generelt er for lite. Dermed oppstår behovet for en flercellet modell organisme som kan brukes til høyinnholdsbaserte kvantitative tilnærminger.
Denne protokollen tilpasser Drosophila-embryoet for platebasert bildebehandling med høyt innhold for å generere eksperimentelle prøvestørrelser som er store nok til kvantitativ analyse. Drosophila melanogaster er kjent som den første modellen organisme. Forskning ved hjelp av Drosophila har ført til gjennombrudd i celle- og molekylærbiologi, inkludert overføring av genetisk informasjon, identifisering av cellesignalveier og genetiske krav til embryoniskutvikling 7,8,9. I tillegg har Drosophila embryoet blitt brukt til å utforske in vivo mikrotubule dynamikk under cellulærdivisjon 10,11,12. Bruken av mikroinjeksjon for å levere små molekyler og molekylære sonder gir timelig kontroll som gjør Drosophila embryonisk utvikling spesielt kraftig for sondering av cellulære prosesser in vivo13,14. Men å generere et betydelig antall eksperimentelle repetisjoner med en tradisjonell bildebehandling tilnærming er ekstremt arbeidskrevende og har begrenset bruk i høy gjennomstrømning bildeskjermer og kvantitativ analyse. Vår tilnærming gjør bruk av en høyinnholdsanalysator som vanligvis er reservert for enkeltcelleanalyse og tilpasser in vivo-bildeanalyse i syncytium av tidlig Drosophila embryo.
Denne protokollen ble brukt til å samle, iscenesette og mikroinjisere Drosophila embryoer for å utforske mekanismene som driver morfologiske endringer i endoplasmatisk retikuulum (ER) under mitosis15. Selv om mange studier har skissert den dynamiske naturen til ER under cellesyklusen16,17,18,19, har det vært vanskelig å sammenligne effekten av flere perturbasjoner over tid på ER morfologi. For å identifisere komponentene som driver endringer i ER morfologi på tvers av celledeling, ble metodene som er oppført i denne protokollen, brukt til å undersøke rollen som mikrotubuli og andre cytoskeletale faktorer på mititotisk ER-omorganisering ved hjelp av den kortikale synkrone delingen i det tidlige Drosophila-embryoet. Samlet sett, tilgjengeligheten av genetisk perturbasjon i Drosophila samfunnet, evnen til å mikroinjisere narkotika og molekylære sonder på nøyaktig tider under utviklingen, og den rimelige kostnaden ved å jobbe med Drosophila gjør denne tilnærmingen svært mottagelig for høy gjennomstrømning bildebasert screening. Metodene som er beskrevet her gjelder for å studere et bredt spekter av cellulære og utviklingsprosesser in vivo ved hjelp av Drosophila embryo20. Spesielt er denne protokollen godt tilpasset for å studere biologiske hendelser som oppstår over en lengre periode og innen 100 mikron av Drosophila embryo cortex.
Protocol
MERK: Se tabell 1 for oppskrifter av medier og oppløsning.
1. Sette opp og vedlikeholde et embryosamlingsbur for live analyse21
- Fyll et friskt embryosamlingsbur med friske fluer.
MERK: Selv om kommersielt tilgjengelige samlingsmerder anbefales, kan samlingsmerder enkelt bygges av tomme flueflasker21.- Kast eller overfør voksne fluer fra flasker når mange pupper begynner mørkere på stadium p14; ved 20 °C skjer dette ca. 14 dager etter at eggene er lagt22.
- La puppene klekkes og fylle flaskene i 12-24 timer.
- Overfør friske fluer til et lite samlingsbur ved hjelp av en liten trakt over samlingsburåpningen for å hindre at fluer rømmer. Kombiner opptil 3 flasker for å produsere et tett befolket bur som inneholder 200 til 500 fluer.
- Overfør fluer inn i samlingsburet ved å trykke en flyflaske mot en hard overflate gjentatte ganger (for å sjokkere fluene). Åpne og inverter deretter flyflasken over oppsamlingsburtrakten. Trykk den åpne flasken på samlingsburet et par ganger for å slippe fluer inn i samlingsburet.
- Lukk den åpne flueflasken ved raskt å sette den ned på pluggen. Mens du overfører den åpne flyflasken fra trakten til pluggen, må du sørge for at flaskeåpningspunktene nedover som fluer har en tendens til å krype opp fra kilden til tappingen.
- Trykk trakten mot flyburåpningen og trykk buret gjentatte ganger på en hard overflate for å lamme fluene inni. Fjern umiddelbart trakten og fest en frisk drueplate til flyburåpningen. Bruk merkebånd for å feste drueplaten. Gjenta denne prosessen for å kombinere opptil 3 flasker for å produsere et tett befolket samlingsbur.
MERK: Alternativt kan fluer bedøves ved hjelp av CO2 eller andre fly sovende midler; Dette vil imidlertid øke akklimatiseringsperioden i trinn 1.2.
- Akklimatisere den nye samlingen bur for 24-48 h. Hvis CO2 eller andre sovemidler ble brukt, akklimatisere innsamlingsburet i minst 48 timer.
- Erstatt drueplaten i oppsamlingsburet med en frisk en som inneholder gjærpasta to ganger om dagen, 8-10 h fra hverandre.
- Sett opp et nytt samlingsbur hver femte dag.
2. Innsamling og klargjøring av embryoer for avbildning
- Oppnå embryoer med synkronisert utvikling
- Byr drueplaten på oppsamlingsburet med en frisk en som inneholder en dab gjærpasta i midten. La fluer legge embryoer i 1 time. Fat den gamle drueplaten.
MERK: Fluer kan befrukte embryoer før de legger dem. Den første oppsamlingsplaten vil inneholde mange av disse forhåndsutviklede embryoene. Tillater fluer å dumpe gamle embryoer først vil forbedre utviklingssynkronisering mellom embryoer. - Byr drueplaten mot en frisk som inneholder en dab gjærpasta i midten og la fluer legge embryoer i 10 min. Fat den gamle drueplaten.
MERK: For å unngå å bremse embryonal utvikling på kalde plater, varm drueplaten og gjærpastaen til romtemperatur før bruk. - Byr drueplaten med en frisk (uten gjærpasta) og lagre den gamle drueplaten, den har embryoene for avbildning. Om nødvendig, fortsett å samle embryoer fra dette buret ved å gjenta trinn 2.1.2 og 2.1.3.
- Byr drueplaten på oppsamlingsburet med en frisk en som inneholder en dab gjærpasta i midten. La fluer legge embryoer i 1 time. Fat den gamle drueplaten.
- Alder samle embryoer i 30-45 min til bilde syncytial divisjoner23.
MERK: For å se for seg det syncytial blastoderm stadiet i embryonal utvikling, må embryoene monteres og på mikroskopet innen 90 min av samlingen. Når du prøver denne protokollen for første gang, alder embryoer 10-20 min i trinn 2.2 for å gi ekstra tid til å sette opp mellom trinnene. - Dechorionate embryoer med 50% blekemiddel i DI vann.
- Overfør eldre embryoer fra trinn 2,2 til en 140 nm sil ved å fylle drueplaten med DI-vann, forsiktig løsne embryoene med en pensel og helle vannet med embryoer i 140 nm sil (figur 1A).
MERK: Dette kan gjøres over en vask eller 1000 ml beger. - Skyll embryoer kraftig med DI-vann ved hjelp av en sprutflaske. Tørre embryoer ved å blotting silen på et tørt papirhåndkle. Tørk silen til den slutter å etterlate vannmerker på papirhåndkleet (figur 1B).
MERK: Fjern all gjærpasta fra embryoer, da det kan gjøre blekemiddelbehandling ineffektiv i neste trinn. - Fyll en tom 10 cm plate med nylaget 50% blekemiddel fortynnet med DI vann (1:1 blekemiddel: DI vann). Dypp silen i 50% blekemiddel i 2 min 45 s. Start en stoppeklokke så snart silen berører 50% blekemiddel. Blot silen inn og ut av 50% blekemiddel 3-4x i de første 15 s å breakup embryo klumper (Figur 1C).
- Skyll embryoer kraftig med DI-vann ved hjelp av en sprutflaske. Tørk embryoene ved å blotting silen på et tørt papirhåndkle. Gjenta kraftig skylling og tørking av flekker i 5x (figur 1D).
MERK: Dette er det viktigste trinnet for å fjerne venstre over chorion. Bruk en full DI sprutflaske og bruk halvparten av flasken i dette trinnet. - Overfør flekktørkede embryoer fra silen til en 10 cm drueplater ved hjelp av en pensel21 (Figur 1E)
MERK: Manuell diklorering kan brukes som et alternativ til blekemiddeldekoskylling 24.
- Overfør eldre embryoer fra trinn 2,2 til en 140 nm sil ved å fylle drueplaten med DI-vann, forsiktig løsne embryoene med en pensel og helle vannet med embryoer i 140 nm sil (figur 1A).
Figur 1: Embryo dechorionation. (A) Embryoer ble samlet inn ved hjelp av en DI H20 sprutflaske, pensel og 140 nm sil. (B) Embryoer ble skyllet kraftig ved hjelp av en DI H20 sprutflaske og flekk tørr over et papirhåndkle. (C) Dechorionation av embryoer ble utført i 50% blekemiddel i 2 min og 45 s. (D) Embryoer ble skyllet kraftig ved hjelp av en DI H20 spruteflaske og flekk tørr over et papirhåndkle. Dette ble gjentatt 4 ganger for å fjerne overflødig chorion. (E) Embryoer ble deretter overført til 10 cm drueplate ved hjelp av en pensel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Montering av embryoer til dekkglass
- Under et stereomikroskop utstyrt med overhead gås hals belysning, organisere to rader med 15-20 embryoer på en ren del av drueplate ved hjelp av et egg picker verktøy. Juster embryoene på ventral side i samme retning med hensyn til fremre og bakre ender. For å få eggplukkere til å bøye fin spiss rustfritt stål pinsett til 45 ° vinkel. For å gjennomgå D / V embryoer orientering se Campos-Ortega et al.20.
MERK: Det er viktig for ventraloverflaten å sitte på drueplaten, da embryoene vil bli presset på en dekselslipp i trinn 3.5, og eksponerer den dorsale overflaten for avbildning. Siden dorsaloverflaten er mye flatere enn ventraloverflaten, øker avbildningen av den dorsale sideflaten antall kjerner som er tilstede i et enkelt Z-plan. - Forbered 75 mm x 25 mm silikon avstandsslipp.
MERK: Dette kan tilberedes på forhånd. Forbered flere dekkslepper og lagre dem i en lysbildeboks for å holde dem rene.- Spor omrisset av en 75 mm x 25 mm dekslerslip på et 1,6 mm tykt silikon avstandsark og kutt ut silikon avstandssnren ved hjelp av saks (figur 2A).
- Bruk et barberblad til å skjære ut et innskåret 40 mm x 15 mm innløp fra avstandsskranen (figur 2A).
- Fest avstandsslippen på dekkslippen og stripen 10 μL heptantlim ned det eksponerte dekkglassglassinnsatte glassinnsatte (figur 2A).
MERK: Å sette ned og til og med strek vil sikre bildeembryoer på samme z-plan.
- Mens heptanelimet fra trinn 3.2.3 tørker, kutter du ut en rektangulær del av drueplaten som inneholder embryoene fra trinn 3.1.
- Bruk et barberblad til å kutte et rektangel (mindre enn 40 mm x 15 mm) rundt de to radene med embryoer. Ikke fjern rektangelet ennå.
- Klipp ut et nytt rektangel ved siden av det første. Fjern det andre rektangelet ved hjelp av den rette kanten av en slikkepott i rustfritt stål.
- Skyv forsiktig den rette kanten av en slikkepott i rustfritt stål under det første rektangelet og fjern den (figur 2B).
- Plasser drueplatens utskjæring med embryoer på utsiden av en 3,5 cm tallerken (figur 2C).
- Under et stereomikroskop senker du en forberedt dekkslipp over embryoene og trykker forsiktig de to radene med embryoer på limet (figur 2D).
- Hvis mikroinjisering av embryoer, hopp til trinn 4.1. Hvis ikke mikroinjisering fortsetter å trinn 3.7.
- Dekk embryoer ved å fylle silikon avstandssnør (halvveis til toppen) med 1:1 - halokarbonolje 700: halokarbonolje 27.
- Linje de nederste kantene på en 4-slide plate adapter med dobbeltsidig tape for å hindre dekselet slip fra å bevege seg, men sørg for ikke å plassere båndet i banen til objektivet objektivet. Dette båndet er kritisk. Hvis dekkslippen bare sitter på adapteren, vil den bevege seg gjennom hele oppkjøpet. Monter dekselet på 4 glideplateadapteren.
Figur 2: Tilberedning og montering av dekkglass. (A)En omriss av 75 mm x 25 mm dekkslips ble sporet på et 1,6 mm tykt silikonark. Bruk saks til å kutte ut omrisset. 40 mm x 15 mm innfelt ble kuttet ut fra silikon avstandsslips og deretter montert på dekkslippen. Stripete 15 μL ned midten av innsetter. (B)To rader med 15-20 embryoer ble organisert på en drueplate i et område mindre enn 40 mm x 15 mm, så ble det området kuttet ut ved hjelp av en barberhøvel og rustfritt stål slikkepott. Drueplateble plassert på toppen av en tom 3,5 cm fat. Underet stereomikroskop ble dekkglasset fra (A) senket og embryoene ble sittende fast på limstripen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Uttørking og mikroinjisering av embryoer
- Plasser dekkslippen med embryoer over et lysbilde for å hindre at bunnen av dekkglasset blir skittent under utsication og mikroinjeksjon.
MERK: Følgeseddelen vil bli avbildet uten at et lysbilde er festet til den. Derfor er et omvendt mikroskop nødvendig for avbildning. - Desiccate embryoer i 5-10 min, avhengig av temperaturen i rommet. Embryoene som ble brukt til avbildning i de representative resultatene ble uttørket i 7 min ved 20 °C i et kammer som inneholder et 1:1 lag silikagelperler over et tørkemiddel (figur 3A).
- Umiddelbart etter utskalking, dekk embryoer med 1:1 - halokarbonolje 700: halokarbonolje 27. Fyll silikonspacer halvveis til toppen.
MERK: Det er viktig å blande en halokarbonolje med lav viskositet halokarbonolje. Ren halokarbonolje 700 (høy viskositet) bremser ned cellesykluser progresjon 30 min etter søknad. En 1:1 blanding av halokarbonolje 700 og halokarbonolje 27 fikset denne artefakten. - Last mikroinjeksjonsnåler med injektor, monter deretter en til mikroinjektoren og kutt den åpen under trykk.
MERK: Øv trinn 4.4 noen ganger før du utfører hele analysen med verdifulle reagenser. Dette er det vanskeligste trinnet i mikroinjeksjonsprosessen.- Last mikroinjeksjonsnåler med 2 μL injektor ved hjelp av en utvidet lastspiss. Bare en mikroinjeksjonsnål er nødvendig, men det er godt å ha reservebelastede nåler i nærheten, så forbered 2 eller 3 nåler.
MERK: Se materialstabellen for spesifikasjoner på utvidede lastspisser. Mikroinjeksjonsnåler kan ikke lastes uten utvidede lastespisser på grunn av vår unike natur vår mikroinjeksjonsteknikk, som er avhengig av å bygge lufttrykk inne i en forseglet og lastet nål før den åpnes. - Monter en nål på mikroinjektoren og trykk stempelet halvveis ned til spissen. Målet er å øke lufttrykket inne i glasskapillæren (figur 4A).
MERK: Bruk et stempel mineraloljebasert mikroinjektor uten mineralolje. I stedet for å bygge trykk med mineralolje, bruk stempelet til å bygge lufttrykk. - Senk glassnålen på en glasssklie og kutt tuppen av nålen åpen ved hjelp av en ny #9 barberhøvel. Klipp nålen i en 45° vinkel for å produsere en skarp åpen spiss. Injektoren skal strømme ned til bunnen av spissen uten å strømme ut av nålen. Tilsett forsiktig 20 μL halokarbonolje over spissen av nålen og kutt den opp igjen ved 45°. Injektoren skal begynne å strømme raskt.
- Senk umiddelbart lufttrykket ved å trekke stempelet tilbake, men sørg for å opprettholde en kontinuerlig strømningshastighet for å hindre at nålen tetter seg med embryomembran mellom injeksjonene. (Figur 4B).
MERK: Hvis injektoratet er klart, må du se injektorstrømmen ved å løfte mikroinjeksjonsnålen inn og ut av halokarbonolje og observere formasjonshastigheten for injektoratdråper under et stereomikroskop. Juster lufttrykket ved å trykke ned stempelet noen få klikk om gangen, og dypp deretter mikroinjeksjonsspissen inn og ut av halokarbonolje for å se formasjonshastigheten for nye dråper etter justering. - Bruk mikromanipulatoren til å plassere nålen i midten av synsfeltet, løft deretter nålen ved hjelp av mikromanipulatoren og fjern glasssklien fra under den. Nå kalibrert nå til injeksjon.
- Last mikroinjeksjonsnåler med 2 μL injektor ved hjelp av en utvidet lastspiss. Bare en mikroinjeksjonsnål er nødvendig, men det er godt å ha reservebelastede nåler i nærheten, så forbered 2 eller 3 nåler.
Figur 3: Aviccation kammer diagram. (A)Dette er et diagram av et uticcation kammer. Kammeret består av et 1:1 lag silikagelperler over et lag med tørrere. For å utføre utskalking ble embryoer plassert på toppen av et enkelt brønnplatelokk. Uticcation kammeret ble stengt 7 min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Mikroinject embryoer
- Plasser embryoene på stereomikroskopstadiet under mikroinjeksjonsnålen, men ikke senk nålen.
- Fokuser på embryoer ved 50x forstørrelse.
- Senk nålen til den kommer inn i samme fokusplan som embryoene. Flytte lysbildet med den ene hånden og betjene mikroinjektoren med den andre, injisere en rad med embryoer.
- Hev nålen og roter lysbildet 180° for å utsette den andre raden med embryoer for mikroinjeksjonsnålen. Senk nålen og injiser den andre raden med embryoer.
MERK: Prøv å gjøre dette på under 10 min. La noen uinjiserte embryoer brukes som kontroller.
Figur 4: Mikroinjeksjonskanylepreparat. (A) I denneillustrasjonen er intensiteten av magenta i nålen representativ for lufttrykk. En ladd nål ble montert på mikroinjektoren og stempelet ble utvidet 50% for å øke lufttrykket inne i nålen. Pass på at stempelet er maksimalt trukket inn før montering. (B) Nålespissen ble kuttet under trykk og stempelet ble trukket tilbake for å redusere lufttrykket og strømningshastigheten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Bildebehandling på en analyse av høyt innhold
- Før du kjører denne analysen, må du opprette et platekart for et lysbildekort. Bruk plateholdereditoren som finnes i Plate Map Manager-menyen, til å angi dimensjonen for en tilpasset plateadapter.
MERK: Det ble laget et tilpasset platekart for den kommersielt tilgjengelige plateadapteren (se Materialse tabell). Platekartet inneholder følgende innstillinger; Glidetykkelse: 1000 μm, Bunnhøyde: 1,607 mm, variabilitet i bunnhøyde: 100 μm, substratmateriale: glass, coverslip tykkelse: 150 μm, coverslip posisjon: bunn - rader: 1 - avstand: 56.987 mm, kolonner: 4 - avstand 28.391, størrelse og form: rektangel, bredde 23.00 mm, høyde: 73.00 mm, motvirket til A1 21.29 mm - 42.74 mm) - Last inn lysbildeadapteren på mikroskopet, og bruk forhåndsvisningsfunksjonen til å flislegge et brightfield 10x bilde av dekkslippen.
- Velg et embryo fra toppen eller bunnen av en rad, velg deretter Mål og bytt til 60x (NA 0,95). Bestem en passende eksponering for ønsket fluorescenskanal.
MERK: Oppretthold laserintensiteten under 25 % for levende celleavbildning. - På hoveddashbordet bruker du Forhåndsvisning-funksjonen til å flislegge et fluorescerende 60x-bilde som inneholder begge radene med embryoer.
- Velg rullegardinmenyen Binning på hovedinstrumentbordet, og sett binning til 1 x 1 for optimal oppløsning.
- Bruk kategorien z Stack Setup til å definere parametere for z-stabler.
- I kategorien z Stack Setup bruker du pil opp- og nedpilene til å finne og deretter definere topp- og bunnstabelgrenser. Når de øverste og nederste grensene er definert, velger du Det grønne blyantikonet for å lagre z stack-posisjonen. Legg merke til z stack posisjon som den vil bli brukt i trinn 5.6.5.
- I kategorien z Stack Setup bruker du z Trinninndata-boksen definere avstand mellom z-skiver.
MERK: Det totale antallet skiver bestemmes ved å modulere trinn 5.6.1 og 5.6.2. - På hoveddashbordet høyreklikker du på Fluorescerende Kanal og bruker bildemodus nedtrekksmenyen for å sette bildemodus til 3D.
- Velg Laser Autofokus-boksen på hovedinstrumentbordet for å deaktivere autofokus.
- På hovedinstrumentbordet definerer du startfokus med z-stack-posisjonen fra trinn 5.6.1, og deretter velger du Startfokus-boksen for å deaktivere funksjonen "Refokus på hvert tidspunkt".
- I kategorien Felt bruker du feltplasserings rullegardinmenyen til å aktivere egendefinerte punkter, og deretter bruker du pilene til å velge punkter for bildebehandling.
MERK: Tidsintervallet mellom anskaffelsene (trinn 5.8) bestemmer hvor mange egendefinerte punkter som kan avbildes samtidig. - I kategorien Time series velger du Hent tidsserie-boksen for å aktivere tidsseriefunksjonen, og deretter definerer du totalt antall tidspunkter.
MERK: 6 egendefinerte punkter x 5 z skiver x 80 stabler = 2400 bilder, 2400 bilder x 8,2 MB per bilde = 19,68 GB diskplass. - På hovedinstrumentbordet bruker du inndataboksen Navn til å gi navn til anskaffelsesinnstillingene, og deretter velger du Fil og Lagre for å lagre anskaffelsesinnstillingene.
- Velg Skann-knappen på hovedinstrumentbordet for å kjøre anskaffelsen.
6. Etter bildebehandling
- Dra og slipp xdce-filen i Fiji for å åpne bildeserien som en flerdimensjonal hyperstakk.
- Lagre hyperstakken som en tif-fil.
- Opprett anslag for maksimal intensitet og lagre dem som en tif-fil.
- Sett sammen et bibliotek med anslag med maksimal intensitet og bygg et datasamlebånd for datautvinning og analyse.
Representative Results
Tilnærmingen som presenteres i denne protokollen ble brukt til å undersøke rollen som mikrotubuli i endoplasmaisk reticulum (ER) omorganisering under mitose i Drosophila embryo15. Under mitose viser strukturen til ER en dramatisk omorganisering, men kreftene som driver disse endringene, er dårlig forstått. Nylig ble en familie av ER-forming proteiner vist å fremme dannelsen av ER tubule25,26,27,28, som er kjent for sin nærhet med mikrotubuli28. For å studere rull med mikrotubuli på ER morfologi, ble metodene i protokollen brukt til å generere data for å kvantitativt sammenligne effekten av flere mikroinjiserte medikamentbehandlinger på ER-omorganisering under mitose. Kolkisin, som forhindrer ny mikrotubulimerisering, ble funnet å drastisk redusere omorganiseringen av ER under mitose som vist i figur 5 og figur 6. Videre, tilnærmingen beskrevet her aktivert produksjon av tidsavløp bildedata for 32 embryoer. Målinger av gjennomsnitt og maks intensitet ble produsert fra 12 800 interesseregioner ved hjelp av et tilpasset MATLAB-skript, som også genererte beskrivende og inferential statistikk som var avgjørende for sammenligninger mellom narkotikabehandlinger. På grunn av tilgjengeligheten av molekylære sonder og enkel mikroinjeksjoner, er metodene som er beskrevet her lett tilpasningsdyktige for å studere en rekke biologiske prosesser via fluorescensintensitetskvantifisering.
Figur 5: Representative bilder av Rtnl1-GFP og ReepB-GFP berikelse på spindelpolene under mitose. (A) 60x synsfelt av ReepB-GFP under mitose i cellesyklus 10. Den blå firkanten representerer synsfeltet som brukes til paneler B-E. Panel A behandles med et terskelbinært filter. Dette filteret ble ikke brukt på panel B-E siden det utelater data fra piksler under den angitte terskelen. (B, D) ReepB-GFP i kontroll, og i kolkisin. (C, E) Rtnl1-GFP i kontroll, og i kolkisin. Dette tallet er endret fra Diaz et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kvantisering av Rtnl1-GFP og ReepB-GFP-berikelse på spindelpolene under mitose. 20 spindler og 20 cytoplasma-ROIer over 10 rammer ble analysert for 32 embryoer under følgende forhold. (A) 10% DMSO kontrollinjeksjoner for Rtnl1-GFP. Kontrollembryoer viste en 0,1 ganger økning i berikelse (p<0,001 for alle prøver ved T210) sammenlignet med ikke-injiserte prøver (p < 0,001 for alle prøver ved T210). (B)ReepB-GFP embryoer injisert med 10% DMSO for å tjene som kontroll. Kontrollembryoer viste en 0,1 ganger økning i berikelse (p<0,001 for alle prøver ved T210) sammenlignet med ikke-injiserte prøver (figur 1E; p < 0,001 for alle prøver ved T210). (C) Rtnl1-GFP embryoer injisert med 5 μM kolkisin. Her målte vi en reduksjon i Rtnl1-GFP-berikelse til spindler (p < 0,001 for alle prøver ved T210) sammenlignet med kontroller (A) (p < 0,001 for alle prøver ved T210). (D)ReepB-GFP embryoer injisert med 5 μM kolkisin. Vi målte en reduksjon i ReepB-GFP-berikelse til spindler (p<0,001 for alle prøver ved T210) sammenlignet med kontroller (B) (p<0,001 for alle prøver ved T210). Dette tallet er endret fra Diaz et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| 1. Gjær Pasta21 | 2. Drueplater21 | 3. Heptane Lim24 |
| 1,1 Tilsett 7 gram aktiv tørr gjær til en 50 ml konisk. Tilsett 9 milliliter DI vann og bland til jevn utholdenhet med en metallspatel. | 2.1 Gjør løsningen a: Tilsett 6 gram agar til 140 ml DI-vann i en 250 ml kolbe og autoklav den. | 3.1 Fyll et hetteglass med glassscintillation med 50 tommer dobbeltsidig tape. |
| 1,1 Tilsett 7 gram aktiv tørr gjær til en 50 ml konisk. Tilsett 9 milliliter DI vann og bland til jevn utholdenhet med en metallspatel. | 2.2 Lag løsning b: Bland 0,1 gram metylparaben i 2 ml etanol, og tilsett deretter denne løsningen til 60 ml grapefruktjuicekonsentrat. | 3.2 Tilsett 20 ml heptane og forsegle glass scintillation hetteglass med parafilm. Roter over natten ved romtemperatur. |
| 2.3 Umiddelbart etter autoklaveringsoppløsning a, bland i løsning b og hell blandingen i 10 x 35mm pertiretter. (lager 35 drueplater) | 3.3 Fjern plasttapeavfall ved å overføre lim til 2 15 ml koniske rør og sentrifugering ved 3000 o/min i 15 minutter. | |
| 2.4 La drueplatene stilles inn ved romtemperatur over natten med avplatelokk. Dekkplater med lokk og oppbevares i 4C° etter at de er innstilt. | 3.4 Overfør limsupernatant til 1,5 ml mikrocentrifugerør for oppbevaring. |
Tabell 1: Oppskrifter av medier og løsninger.
Discussion
Protokollen som er beskrevet her er svært allsidig og lett tilpasningsdyktig for å studere biologiske hendelser i en rekke stadier i Drosophila embryonal utvikling. Denne protokollen er godt egnet for å studere biologiske prosesser som oppstår over lange perioder. For eksempel kan studier avcellulærisering 29,30 eller dannelsen av heterochromatindomener i Drosophila31,32 ha nytte av å bruke metodene som er beskrevet i denne protokollen, siden disse prosessene oppstår over en lengre periode. I tillegg kan utvalgsstørrelsen økes ved å redusere forstørrelsen for å studere spørsmål som krever mindre optisk oppløsning, for eksempel tidspunktet mellom synkronedivisjoner 33 eller varigheten av gastrulation34. På samme måte gjør et 20x mål at to embryoer kan avbildes i ett bildeplan. Metodene i denne protokollen gir en dynamisk plattform for å stille biologiske spørsmål ved hjelp av embryonal utvikling som modellsystem for kvantitativ analyse.
Det er tre kritiske trinn i denne protokollen. Etter dechorionation i 50% blekemiddel er det viktig at embryoer skylles og tørkes kraftig 5 ganger (2.3.4). Dette trinnet fjerner eventuelle rester små biter av chorion. Rester av chorion vil hindre synsfeltet når man avbilde embryoet. Når embryoene monteres på glassdeksleglasset (3,5), er det viktig å trykke embryoene på limet med jevnt trykk. Dette vil plassere embryoene på samme z-plan. Når du kutter opp mikroinjeksjonsnålen, er det viktig å trekke stempelet umiddelbart tilbake for å justere strømningshastigheten på nålen, ellers mister du alt injektor.
Vår studie var begrenset av to faktorer. Den første faktoren var ikke å ha en automatisert segmenteringsprosess. Vi designet imidlertid et manuelt segmenteringsskript ved hjelp av MATLAB; med en genetisk kodet spindelmarkør kan denne prosessen automatiseres. I fremtiden ønsker vi å produsere CNN-RFP21,Rtln1-GFP og CNN-RFP; ReepB-GFP transgene linjer for å muliggjøre automatisert spindelsegmentering. For mer informasjon om vår MATLAB script og analyse pipeline, se supplerende materialer av Diaz et al.15. For det andre var vi også begrenset av vårt oppkjøpsintervall på 35 s, som bare tillot oss å bilde 6 embryoer samtidig. Et lengre oppkjøpsintervall ville tillate oss å bilde flere embryoer samtidig. Selv om gjennomstrømningen av legemiddellevering kan øke ved å erstatte mikroinjeksjon med et gjennomdatatrinn, fant vi at dette var unødvendig siden vår prøvestørrelse allerede var begrenset av oppkjøpsintervall.
Mens denne protokollen ble brukt til å bilde Drosophila embryonic utvikling, den generelle tilnærmingen er tilpasningsdyktig for å studere embryonal utvikling i andre flercellede modellsystemer, som C. elegans,Kråkeboller, og Xenopus. Embryoer er svært nyttige for kvantitativ analyse siden de lett synkroniseres via innsamling eller befruktning. I tillegg beveger embryoer seg ikke eller svømmer bort fra et synsfelt, slik at bruk av en enkel flerpunktsanskaffelseskompatibel programvare for å produsere flere tidsforløpsvideoer for kvantitativ analyse. Selv om vi brukte en høyinnholdsanalysator i studien vår, kan ethvert omvendt mikroskopsystem som er i stand til flerpunktsoppkjøp, pares med metodene det refereres til her.
Lignende resultater kan oppnås ved hjelp av et flerpunktsoppkjøp som er i stand til omvendt konfokal mikroskop; Fordelene med en høyinnholdsanalysator dukker imidlertid opp når man øker utvalgsstørrelsen for å studere spørsmål som krever mindre oppløsning i tide. En åpenbar fordel med å bruke en høyinnholdsanalysator er muligheten til å bilde 4 separate lysbilder samtidig sammenlignet med 1 lysbilde på tradisjonelle systemer. Med et komplett sett med 4 lysbilder og 40 embryoer på hvert lysbilde, kan 160 embryoer avbildes over flere timer, så lenge oppkjøpsintervallet er minst 15 min mellom rammer. En annen viktig fordel med å bruke en høyinnholdsanalysator er at prøvene er helt forseglet fra eksterne lyskilder, noe som er nødvendig for fluorescensintensitetsbaserte målinger. Til slutt har høyinnholdsanalysatoren som brukes i studien vår et 5,5 megapikslers CMOS-kamera som gir et sjenerøst 221,87 μm synsfelt ved 60x forstørrelse. Dette større synsfeltet gjorde oss i stand til å bilde et halvt embryo per oppkjøpspunkt.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
UD, WFM og BR støttes av Center for Cellular Construction, et nasjonalt vitenskapsstiftelsessenter (NSF), under tilskuddsavtale DBI-1548297. BR støttes også gjennom en NSF CAREER-pris, 1553695.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x 35mm Micro Dish | VWR | Cat #: 10799-192 | N/A |
| 100% grape juice concentrate | Welch's, 100% Concentrate Grape Juice | N/A | Purchase at Grocery Store |
| 250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth | VWR | Cat #: 10536-914 | N/A |
| 3" Non-Metallic Sieve No. 140 | Gilson Company | SV-165 #140 | N/A |
| 4 Slide Imaging Tray | Grace Biolabs | SKU: 400104 | N/A |
| ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy | Fisher Scientific | Cat #: AC411255000 | N/A |
| Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof | Fisher Scientific | Cat# : AC615095000 | N/A |
| Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) | Fisher Scientific | Cat#: AC126961000 | N/A |
| Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass | Fisher Scientific | Cat #: 50-143-782 | N/A |
| Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick | Grace Biolabs | SKU: 664273 | N/A |
| DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials | Fisher Scientific | Cat #: 03-341-71A | N/A |
| Embryo Collection Cage-Mini | Genesee Scientific | Cat #: 59-105 | N/A |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | Product Code: 10289651 | N/A |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge | Fisher Scientific | Cat #: 05-527-90 | N/A |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | Cat #: 14-432-22 | N/A |
| Fleischmann's, Active Dry Yeast | Fleischmann's | N/A | Purchase at Grocery Store |
| Grape Plates | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-133 | N/A |
| Halocarbon 700 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-131 | N/A |
| Heptane Glue | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 | VWR | Cat #: 55411-050 | N/A |
| Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll | Fisher Scientific | Cat #: 50-998-944 | N/A |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy | Fisher Scientific | Cat #: NC0879005 | N/A |
| Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm | Millipore Sigma | SKU: 1077351000 | N/A |
| Stainless Steel Spoon/Spatula | VWR | Cat #: 470149-044 | N/A |
| W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents | Fisher Scientific | Cat #: 23-116582 | N/A |
| Yeast Paste | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| EQUIPMENT | |||
| Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts. |
| Autoclave | N/A | N/A | Any autoclave will do fine. |
| Drummond Nanoject II Microinjector. | Drummond Scientific | N/A | This is a mineral oil based injection system. |
| GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
| Refrigerator (4C°) | N/A | N/A | Fly media and yeast paste must be stored at (4C°). |
| Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |
References
- Zanella, F., Lorens, J., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).
- Jennings, B. Drosophila-a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).
- Bickle, M. The beautiful cell: high-content screening in drug discovery. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy based high content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
- Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).
- Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Letsou, A., Bohmann, D. Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).
- Sullivan, W., Theurkauf, W. The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo. Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).
- Schejter, E., Wieschaus, E. Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo. Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).
- Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos. Development. 103 (4), 675-686 (1988).
- Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development. Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).
- Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).
- Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis. PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).
- Shibata, Y., et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).
- Bergman, Z., et al. Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo. PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).
- Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
- Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells. The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer Science & Business Media. eBook ISBN 978-3-662-22489-2 (2013).
- Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-087969827-0 (2000).
- Bainbridge, S., Bownes, M.
- Bate, M., et al. Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. Chapter 3. ISBN 978-087969899-7 (1993).
- Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, Academic Press. 113-123 (2001).
- Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules. Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).
- Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).
- Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network. The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).
- Loncar, D., Singer, S. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Mazumdar, A., Mazumdar, M. How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster. Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).
- Yuan, K., O'Farrell, P. TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos. Genes & Development. 30 (5), 579-593 (2016).
- Walther, M., et al. Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis. Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).
- McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos. Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).
- Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos. Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).
