Summary
Præsenteret her er en protokol til mikroinject og samtidig billede flere Drosophila embryoner under embryonale udvikling ved hjælp af en plade-baseret, højt indhold imager.
Abstract
Moderne tilgange til kvantitativ levende cellebilleddannelse er blevet et vigtigt redskab til at udforske cellebiologi ved at gøre det muligt at anvende statistikker og beregningsmodeller til at klassificere og sammenligne biologiske processer. Selv om cellekultur model systemer er fantastisk til højt indhold billeddannelse, høj gennemløb undersøgelser af celle morfologi tyder på, at ex vivo kulturer er begrænset i recapitulating den morfologiske kompleksitet findes i celler i levende organismer. Som sådan er der behov for en skalerbar høj kapacitet model system til at billedet levende celler i en intakt organisme. Beskrevet her er en protokol for brug af et højt indhold billede analysator til samtidig erhverve flere time-lapse videoer af embryonale Drosophila melanogaster udvikling under syncytial blastoderm fase. Den syncytial blastoderm har traditionelt fungeret som en stor in vivo model for billeddannelse biologiske begivenheder; opnåelse af et betydeligt antal eksperimentelle replikater for kvantitative og høj-gennemløb tilgange har været arbejdskrævende og begrænset af billeddannelse af et enkelt foster pr eksperimentel gentagelse. Præsenteret her er en metode til at tilpasse billedbehandling og microinjection tilgange, der passer til et højt indhold billeddannelse system, eller enhver omvendt mikroskop i stand til automatiseret multipunkt erhvervelse. Denne tilgang gør det muligt samtidig at anskaffe 6-12 embryoner, afhængigt af de ønskede erhvervelsesfaktorer, inden for en enkelt billedbehandlingssession.
Introduction
I løbet af de sidste 30 år har fremskridt inden for billeddannelsesteknologier og molekylære sonder til livecellebilleddannelse fremmet vores forståelse af cellens kompleksitet og indre funktioner. Ledsagende denne fremskridt inden for teknologi er en større afhængighed af brugen af ex vivo celle kultur modeller for erhvervelse af høj gennemløbsscanning data. Cellekulturmodeller giver flere fordele, herunder kontrol af mikromiljøet gennem mikrofluidiske systemer og evnen til at afbilde flere celler samtidigt, hvilket gør det muligt at anvende kvantitative tilgange, der er nødvendige for screening med høj kapacitet1,2. Der er imidlertid også betydelige ulemper forbundet med cellekulturmodeller i forbindelse med morfologiske undersøgelser, såsom todimensionale glas- eller plastoverflader, der har tilhørende virkninger på cellemorfologien ogregulering 3,4,5. Disse virkninger kan give falske eller vildledende data med hensyn til studiet af biologiske processer, der regulerer cellulær morfologi.
Selv om alternativet har været at studere cellulær morfologi i forbindelse med en intakt organisme6, kun få egnede intakte organismer lette høj gennemløb kvantitative levende celle billeddannelse på grund af vanskeligheder med at holde hele organismer i live gennem ud billeddannelse, og udfordringer forbundet med billeddannelse inde i en stor flercellet organisme. Som følge heraf har cellebiologiske undersøgelser i intakte organismer generelt fokuseret på at observere en enkelt organisme over tid, hvilket i høj grad begrænser stikprøvestørrelsen. Desuden gør denne ene dyr-at-a-time-begrænsning levende billeddannelse vanskelig og dyr at anvende i form af en skærm og begrænser evnen til at anvende kvantitative analyseværktøjer, da antallet af prøver generelt er for lille. Således opstår behovet for en multicellulær model organisme, der kan bruges til højt indhold baseret kvantitative tilgange.
Denne protokol tilpasser Drosophila-embryonet til pladebaseret billeddannelse med højt indhold for at generere eksperimentelle stikprøvestørrelser, der er store nok til kvantitativ analyse. Drosophila melanogaster er almindeligt kendt som den første model organisme. Forskning ved hjælp af Drosophila har ført til gennembrud i celle- og molekylærbiologi, herunder overførsel af genetisk information, identifikation af cellesignalveje og genetiske krav til embryonal udvikling7,8,9. Desuden er Drosophila embryo blevet brugt til at udforske in vivo microtubule dynamik under cellulære division10,11,12. Brugen af mikroinjektion til at levere små molekyler og molekylære sonder giver tidsmæssig kontrol, der gør Drosophila embryonale udvikling særligt kraftfuld til sondering cellulære processer in vivo13,14. Men, genererer et betydeligt antal eksperimentelle gentagelser med en traditionel billeddannelse tilgang er yderst arbejdskrævende og har begrænset brug i høj-throughput imaging skærme og kvantitativ analyse. Vores tilgang gør brug af et højt indhold analysator typisk forbeholdt enkelt celle analyse og tilpasser in vivo billeddannelse analyse i syncytium af den tidlige Drosophila embryo.
Denne protokol blev brugt til at indsamle, fase, og microinject Drosophila embryoner til at udforske de mekanismer, der driver morfologiske ændringer i Endoplasmic Reticulum (ER) under mitose15. Selv om mange undersøgelser har skitseret den dynamiske karakter af ER i løbet af cellecyklus 16,17,18,19, det har været vanskeligt at sammenligne virkningerne af flere mikrens på tværs af tid på ER morfologi. For at identificere de komponenter, der driver ændringer i ER morfologi på tværs af celledeling, blev de metoder, der er anført i denne protokol, brugt til at undersøge mikrotubulis rolle og andre cytoskeletale faktorer på mitotisk ER-reorganisering ved hjælp af den kortikale synkrone division i det tidlige Drosophila-embryo. Samlet set tilgængeligheden af genetiske miks i Drosophila samfund, evnen til at mikroinject narkotika og molekylære sonder på præcise tidspunkter under udviklingen, og de billige omkostninger ved at arbejde med Drosophila gør denne tilgang meget modtagelig for høj-throughput image-baseret screening. De metoder, der er beskrevet her, gælder for at studere en bred vifte af cellulære og udviklingsmæssige processer in vivo ved hjælp af Drosophila embryo20. Specifikt, denne protokol er godt tilpasset til at studere biologiske hændelser, der opstår over en længere periode og inden for 100 mikron af Drosophila embryo cortex.
Protocol
BEMÆRK: Se tabel 1 for opskrifter på medier og opløsning.
1. Etablering og vedligeholdelse af et embryonopsamlingsbur til levende analyse21
- Udfolk et frisk fosteropsamlingsbur med friske fluer.
BEMÆRK: Mens kommercielt tilgængelige opsamlingsbure anbefales, kan opsamlingsbure nemt konstrueres af tomme flueflasker21.- Kassere eller overføre voksne fluer fra flasker, når mange pupper begynder at blive mørkere på scenen p14; ved 20 °C dette sker ca. 14 dage efter, at æggene er lagt22.
- Lad pupperen klækkes og befolke flaskerne i 12-24 timer.
- Overfør friske fluer til et lille opsamlingsbur ved hjælp af en lille tragt over opsamlingsburets åbning for at forhindre fluer i at slippe ud. Kombiner op til 3 flasker til at producere et tætbefolket bur med 200 til 500 fluer.
- Overførsel flyver ind i opsamlingsburet ved at banke en flueflaske mod en hård overflade gentagne gange (for at lamme fluerne). Åbn og inverter derefter flueflasken over opsamlingsburstragten. Bank den åbne flaske på opsamlingsburet et par gange for at slippe fluer ind i opsamlingsburet.
- Luk den åbne flueflaske ved hurtigt at sætte den ned på stikket. Mens du overfører den åbne flueflaske fra tragten til stikket, skal du sørge for, at flaskeåbningen peger nedad, da fluer har tendens til at kravle op fra kilden til tapningen.
- Tryk tragten mod flueburets åbning, og bank buret gentagne gange på en hård overflade for at lamme fluerne indeni. Fjern straks tragten og fastgør en frisk drueplade til flueburets åbning. Brug mærkningstape til at fastgøre druepladen. Gentag denne proces for at kombinere op til 3 flasker til at producere en tætbefolket opsamling bur.
BEMÆRK: Alternativt kan fluer bedøves ved hjælp af CO2 eller andre flue sovemidler; Dette vil dog øge akklimatiseringsperioden i trin 1.2.
- Akklimatisere den nye indsamling bur for 24-48 h. Hvis der blev anvendt CO2 eller andre sovemidler, akklimatiseres opsamlingsburet i mindst 48 timer.
- Udskift druepladen i opsamlingsburet med en frisk, der indeholder gærpande to gange om dagen, 8-10 h fra hinanden.
- Opsætning af en frisk indsamling bur hver 5 dage.
2. Indsamling og klargøring af embryoner til billeddannelse
- Fremskaffelse af embryoner med synkroniseret udvikling
- Byt druepladen på opsamlingsburet med en frisk, der indeholder en dab gærpak i midten. Lad fluer lægge embryoner i 1 time. Sdr. den gamle druetallerken.
BEMÆRK: Fluer kan befrugte embryoner, før de lægges. Den første opsamlingsplade vil indeholde mange af disse forududviklede embryoner. Hvis fluerne får lov til at dumpe gamle embryoner først, vil det forbedre den udviklingsmæssige synkronisering mellem embryoner. - Byt druepladen til en frisk, der indeholder en dab gærpande i midten, og lad fluer lægge embryoner i 10 min. Sdr. den gamle druetallerken.
BEMÆRK: For at undgå at bremse embryonal udvikling på kolde plader, varm druepladen og gærpanden til stuetemperatur før brug. - Byt druepladen med en frisk (uden gærpak) og gem den gamle drueplade, den har embryonerne til billeddannelse. Om nødvendigt fortsættes embryonerne fra dette bur ved at gentage trin 2.1.2 og 2.1.3.
- Byt druepladen på opsamlingsburet med en frisk, der indeholder en dab gærpak i midten. Lad fluer lægge embryoner i 1 time. Sdr. den gamle druetallerken.
- Alder indsamle embryoner i 30-45 min til billedet syncytial divisioner23.
BEMÆRK: For at afbilde den synytiale blastoderm fase i embryonale udvikling, embryoner skal monteres og på mikroskopet inden for 90 min af indsamling. Når du forsøger denne protokol for første gang, alder embryoner 10-20 min i trin 2,2 for at give ekstra tid til at oprette mellem trin. - Dechorionate embryoner med 50% blegemiddel i DI vand.
- Embryoner, der er lagret fra trin 2.2, overføres til en sigte på 140 nm ved at fylde druepladen med DI-vand, forsigtigt løsne embryonerne med en pensel og hælde vandet med embryoner i 140 nm sigte (Figur 1A).
BEMÆRK: Dette kan gøres over en vask eller 1.000 ml bægerglas. - Skyl embryonerne kraftigt med et DI-vand ved hjælp af en sprøjteflaske. Tør embryoner ved blotting sien på en tør køkkenrulle. Blot sien, indtil den holder op med at efterlade vandmærker på køkkenrullen (Figur 1B).
BEMÆRK: Fjern alle gær pasta fra embryoner, da det kan gøre blegemiddel behandling ineffektiv i næste trin. - Fyld en tom 10 cm plade med frisklavet 50% blegemiddel fortyndet med DI vand (1:1 blegemiddel: DI vand). Dyp sien i 50% blegemiddel i 2 min 45 s. Start et stopur, så snart si rører 50% blegemiddel. Blot sien ind og ud af 50% blegemiddel 3-4x i de første 15 s at bryde op embryo klumper (Figur 1C).
- Skyl embryonerne kraftigt med DI-vand ved hjælp af en sprøjteflaske. Tør embryonerne ved at blotting sien på en tør køkkenrulle. Gentag kraftig skylning og blot tørring proces for 5x (Figur 1D).
BEMÆRK: Dette er det vigtigste skridt for at fjerne tilovers chorion. Brug en fuld DI sprøjteflaske og brug halvdelen af flasken i dette trin. - Overfør de tørrede embryoner fra sien til en 10 cm drueplader med en pensel21 (Figur 1E)
BEMÆRK: Manuel dichlorination kan bruges som et alternativ til blegemiddeldemning24.
- Embryoner, der er lagret fra trin 2.2, overføres til en sigte på 140 nm ved at fylde druepladen med DI-vand, forsigtigt løsne embryonerne med en pensel og hælde vandet med embryoner i 140 nm sigte (Figur 1A).
Figur 1: Embryodechorionation. (A) Embryoner blev indsamlet ved hjælp af en DI H20 sprøjteflaske, pensel, og 140 nm sigte. (B) Embryoner blev skyllet kraftigt ved hjælp af en DI H20 sprøjteflaske og skamplet tørre over en køkkenrulle. C) Dechorionation af embryoner blev udført i 50% blegemiddel i 2 min og 45 s. (D) Embryoner blev skyllet kraftigt ved hjælp af en DI H20 sprøjte flaske og skamplet tør over en køkkenrulle. Dette blev gentaget 4 gange for at fjerne overskydende chorion. (E) Embryoner blev derefter overført til 10 cm drueplade ved hjælp af en pensel. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Montering af embryoner til dækslæber
- Under et stereomikroskop udstyret med overhead gåsehals belysning, organisere to rækker af 15-20 embryoner på en ren del af drueplade ved hjælp af et æg picker værktøj. Juster embryonerne på deres ventrale side i samme retning med hensyn til forreste og bageste ender. For at gøre æg plukkere bøje fine spids rustfrit stål pincet til 45 ° vinkel. For at gennemgå D / V embryoner orientering se Campos-Ortega et al.20.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at den ventrale overflade sidder på druepladen, da embryonerne trykkes på en dæksel i trin 3.5, hvilket udsætter dorsaloverfladen for billeddannelse. Da dorsale overflade er meget fladere end den ventrale overflade, billeddannelse den dorsale sideoverflade øger antallet af kerner til stede inden for en enkelt Z plan. - Forbered 75 mm x 25 mm silikone afstandsfjerne.
BEMÆRK: Dette kan forberedes på et tidspunkt. Forbered flere coverslips og gemme dem i en slide boks for at holde dem rene.- Omrids af en 75 mm x 25 mm dækslæb på et 1,6 mm tykt silikonerumsark og skær silikone afstandsuderen ud ved hjælp af en saks (Figur 2A).
- Ved hjælp af et barberblad skæres en 40 mm x 15 mm indsat ud fra afstandsuddelende(Figur 2A).
- Hold afstandsklippen på dækslæbet og stregen 10 μL heptanlim ned ad det eksponerede dækslædeglas indsat (Figur 2A).
BEMÆRK: At sætte ned og endda streak vil sikre billeddannelse embryoner på samme z plan.
- Mens heptane lim fra trin 3.2.3 tørrer, udskæring en rektangulær del af druepladen indeholder embryoner fra trin 3.1.
- Brug et barberblad til at skære et rektangel (mindre end 40 mm x 15 mm) omkring de to rækker af embryoner. Fjern ikke rektanglet endnu.
- Skær et andet rektangel ud for det første. Fjern det andet rektangel ved hjælp af den lige kant side af en rustfrit stål spatel.
- Skub forsigtigt den lige kant af en spatel i rustfrit stål under det første rektangel, og fjern det (Figur 2B).
- Udskåret drueplade med embryoner på den udvendige side af en 3,5 cm høj (Figur 2C).
- Under et stereomikroskop skal du sænke en forberedt dækslæd over embryonerne og forsigtigt trykke de to rækker af embryoner på limen (Figur 2D).
- Hvis mikroinjecting embryoner, springe til trin 4.1. Hvis ikke microinjecting fortsætte til trin 3.7.
- Dæk embryoner ved at fylde silikone afstandsuder (halvvejs til toppen) med 1:1 - halocarbon olie 700: halocarbon olie 27.
- Line de nederste kanter af en 4-dias plade adapter med dobbeltsidet tape for at forhindre dækslet glide i bevægelse, men sørg for ikke at placere båndet i stien til objektivet linse. Dette bånd er kritisk. Hvis dækslæbet kun sidder på adapteren, vil den bevæge sig gennem hele anskaffelsen. Monter dækslet på 4-glidepladeadapteren.
Figur 2: Klargøringsseddel forberedelse og montering. A) En omridsning på 75 mm x 25 mm dækslæb blev sporet på et 1,6 mm tykt silikoneark. Brug en saks til at klippe omridset ud. 40 mm x 15 mm indsat blev skåret ud fra silikone afstandsklip og derefter monteret på coverslip. Stribet 15 μL ned i midten af indsat. B) To rækker med 15-20 embryoner blev organiseret på en drueplade i et område, der var mindre end 40 mm x 15 mm, og derefter blev dette område skåret ud med en barbermaskine og spatel i rustfrit stål. (C) Drueplade skåret ud blev placeret på toppen af en tom 3,5 cm skål. D) Under et stereomikroskop blev dækslen fra (A) sænket, og embryonerne blev hængende på limstrien. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Udtørring og mikroinjekterende embryoner
- Placer dækslædden med embryoner over et dias for at forhindre, at bunden af dæksækken bliver snavset under udiskring og mikroinjektion.
BEMÆRK: Coveret slip vil blive afbildet uden en slide knyttet til det. Derfor er et omvendt mikroskop nødvendigt for billeddannelse. - Udtørre embryoner i 5-10 min, afhængigt af temperaturen i rummet. Embryonerne til billeddannelse i de repræsentative resultater blev udtørret i 7 min ved 20 °C i et kammer, der indeholder et 1:1 lag silicagelperler over et tørremiddel (figur 3A).
- Umiddelbart efter udningen skal embryoner dækkes med 1:1 - halocarbonolie 700: halocarbonolie 27. Fyld silikone afstandsbror halvvejs til toppen.
BEMÆRK: Det er vigtigt at blande en høj viskositet halocarbon olie med en lav viskositet halocarbon olie. Ren halocarbon olie 700 (høj viskositet) bremser celle cyklusser progression 30 min post ansøgning. En 1:1 blanding af halocarbon olie 700 og halocarbon olie 27 fast denne artefakt. - Læg mikroinjektionsnåle med injeant, og monter derefter en til mikroinjektoren og skær den åben under tryk.
BEMÆRK: Øv trin 4.4 et par gange, før du udfører den fulde analyse med eventuelle værdifulde reagenser. Dette er det sværeste skridt i mikroinjektionsprocessen.- Der skal vejes mikroinjektionsnåle med 2 μL injektorvæske ved hjælp af en forlænget læssetip. Kun én mikroinjektionsnål er påkrævet, men det er godt at have ekstra lastede nåle tæt ved, så forbered 2 eller 3 nåle.
BEMÆRK: Se materialetabellen for specifikationer for udvidede læssetips. Microinjection nåle kan ikke indlæses uden udvidede læssetips på grund af den unikke karakter af vores microinjection teknik, som er afhængig af bygning lufttryk inde i en forseglet og lastet nål før åbning af sin spids. - Monter en nål på mikroinjektoren og tryk stemplet halvt ned til spidsen. Målet er at øge lufttrykket inde i glaskapillær (Figur 4A).
BEMÆRK: Brug et stempel mineralolie baseret mikroinjektor uden mineralsk olie. I stedet for at bygge tryk med mineralsk olie, skal du bruge stemplet til at opbygge lufttryk. - Sænk glasnålen på et glasdias og skær spidsen af nålen op med en ny #9 barbermaskine. Skær nålen i en vinkel på 45° for at frembringe en skarp åben spids. Injektoren skal flyde ned til bunden af spidsen uden at strømme ud af nålen. Tilsæt forsigtigt 20 μL halocarbonolie over spidsen af nålen og skær den åben igen ved 45°. Injektoren skal begynde at flyde hurtigt.
- Sænk straks lufttrykket ved at trække stemplet tilbage, men sørg for at opretholde en kontinuerlig strømningshastighed for at forhindre nålen i at tilstople med embryomembranen mellem injektionerne. (Figur 4B).
BEMÆRK: Hvis injemidlet er klart, skal du se injemidlets strømningshastighed ved at løfte mikroinfektionsnålen ind og ud af halocarbonolie og observere dannelseshastigheden for injicerende dråber under et stereomikroskop. Juster lufttrykket ved at trykke stemplet et par klik ad gangen, og dyp derefter mikroinjektionsspidsen ind og ud af halocarbonolie for at se dannelseshastigheden for nye dråber efter justering. - Brug mikromanipulatoren til at placere nålen i midten af synsfeltet, løft derefter nålen ved hjælp af mikromanipulatoren, og fjern glasrutsjebanen under den. Nålen er nu kalibreret til injektion.
- Der skal vejes mikroinjektionsnåle med 2 μL injektorvæske ved hjælp af en forlænget læssetip. Kun én mikroinjektionsnål er påkrævet, men det er godt at have ekstra lastede nåle tæt ved, så forbered 2 eller 3 nåle.
Figur 3: Udsiskende kammerdiagram. (A) Dette er et diagram over et udsivningskammer. Kammeret består af et 1:1 lag silicagelperler over et lag tørre. For at udføre udsivning blev embryoner placeret oven på et enkelt brøndpladelåg. Udsiskekammeret blev lukket 7 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Mikroinject-embryoner
- Anbring embryonerne på stereomåoskopstadiet under mikroinjektionsnålen, men sænk ikke nålen.
- Fokus på embryoner ved 50x forstørrelse.
- Sænk nålen, indtil den kommer ind i samme fokusplan som embryonerne. Hvis du flytter diaset med den ene hånd og betjener mikroinjektoren med den anden, skal du injicere den ene række embryoner.
- Hæv nålen, og drej rutsjebanen 180° for at udsætte den anden række af embryoner for mikroindtålen. Sænk nålen og injicer den anden række af embryoner.
BEMÆRK: Prøv at gøre dette på under 10 min. Lad nogle ikke-injicerede embryoner anvendes som kontrol.
Figur 4: Fremstilling af mikroinfektionsnåle. (A) I denne illustrationer intensiteten af magenta i nålen repræsentativ for lufttrykket. En lastet nål blev monteret på mikroinjektoren og stemplet blev forlænget 50% for at øge lufttrykket inde i nålen. Sørg for, at stemplet er maksimalt trukket tilbage før montering. (B) Nålespidsen blev skåret under tryk, og stemplet blev trukket tilbage for at sænke lufttrykket og strømningshastigheden. Klik her for at se en større version af dette tal.
5. Billeddannelse på en høj indhold analysator
- Før du kører denne analyse oprette en plade kort for en slide adapter. Brug pladeholdereditoren i menuen Pladekortstyring til at angive dimensionen for en brugerdefineret pladeadapter.
BEMÆRK: Der blev lavet et brugerdefineret pladekort til den kommercielt tilgængelige pladeadapter (se Materialetabel). Pladekortet indeholder følgende indstillinger. Rutsjebanetykkelse: 1000 μm, Bundhøjde: 1,607 mm, variabilitet i bundhøjde: 100 μm, substratmateriale: glas, dækslet tykkelse: 150 μm, dækslet position: bund – rækker: 1 – afstand: 56.987 mm, kolonner: 4 – afstand 28.391, størrelse og form: rektangel, bredde 23,00 mm, højde: 73,00 mm, forskydning til A1 21,29 mm – 42,74 mm) - Ilægge slideadapteren på mikroskopet, og brug funktionen Eksempel til at placere et brightfield 10x-billede af dækslæbet.
- Vælg et embryon fra toppen eller bunden af en række, vælg derefter Målsætning, og skift til 60x (NA 0,95). Bestem en passende eksponering for den ønskede fluorescenskanal.
BEMÆRK: Hold laserintensiteten under 25 % for levende cellebilleder. - På hoveddashboardet skal du bruge eksempelfunktionen til at placere et fluorescerende 60x-billede, der indeholder begge rækker af embryoner.
- På hoveddashboardet skal du vælge rullemenuen Placering og indstille placering til 1 x 1 for at opnå optimal opløsning.
- Brug fanen z Stack Setup til at definere parametre for z stacks.
- Brug pil op og pil ned under fanen z Stack Setup til at finde derefter de øverste og nederste z-stakgrænser. Når de øverste og nederste grænser er defineret, skal du vælge ikonet Forgrøn blyant for at gemme z-stakpositionen. Bemærk z stak position, som det vil blive brugt i trin 5.6.5.
- Brug z Trin-inputfeltet under fanen z Stack Setup, der definerer afstanden mellem z-udsnit.
BEMÆRK: Det samlede antal udsnit bestemmes ved at modulere trin 5.6.1 og 5.6.2. - På hoveddashboardet skal du højreklikke på fluorescerende kanal og bruge rullemenuen Billedtilstand til at indstille billedtilstanden til 3D.
- Vælg feltet Automatisk fokus på hoveddashboardet for at deaktivere autofokus.
- På hoveddashboardet skal du definere startfokus med z-stack positionen fra trin 5.6.1 og derefter vælge den oprindelige fokusboks for at deaktivere funktionen "Refocus at each Time Point" .
- Brug rullemenuen Feltplacering under fanen Felter til at aktivere brugerdefinerede punkterog derefter bruge pilene til at vælge punkter til billeddannelse.
BEMÆRK: Tidsintervallet mellem anskaffelser (trin 5.8) bestemmer, hvor mange brugerdefinerede punkter der kan afbildes samtidigt. - Vælg feltet Hent tidsserie under fanen Tidsserie for at aktivere tidsseriefunktionen og derefter definere det samlede antal tidspunkter.
BEMÆRK: 6 brugerdefinerede punkter x 5 z udsnit x 80 stakke = 2.400 billeder, 2.400 billeder x 8,2 MB pr billede = 19,68 GB diskplads. - På hoveddashboardet skal du bruge feltet Navn på input til at navngive anskaffelsesindstillingerne og derefter vælge Filer og Gem for at gemme anskaffelsesindstillingerne.
- Vælg knappen Scan på hoveddashboardet for at køre anskaffelsen.
6. Efterbehandling af efterbildning
- Træk og slip xdce-filen til Fiji for at åbne billedserien som en flerdimensional hyperstack.
- Gem hyperstack som en tif-fil.
- Opret max intensitet fremskrivninger og gemme dem som en tif filer.
- Saml et bibliotek med maksimale intensitetsprojektioner, og byg en pipeline til dataudtræk og -analyse.
Representative Results
Den fremgangsmåde, der præsenteres i denne protokol, blev anvendt til at undersøge mikrotubulis rolle i endoplasmatisk reorganisering (ER) under mitose i Drosophila embryo15. Under mitose, strukturen af ER viser en dramatisk reorganisering, men de kræfter, der driver disse ændringer er dårligt forstået. For nylig, en familie af ER forme proteiner blev vist sig at fremme dannelsen af ER tubul25,26,27,28, som er kendt for deres nærhed med mikrotubuli28. For at studere rulle mikrotubuli på ER morfologi, de metoder, der er fastsat i protokollen blev brugt til at generere data til kvantitativt sammenligne virkningerne af flere microinjected lægemiddelbehandlinger på ER reorganisering under mitose. Colchicin, som forhindrer ny mikrotubule polymerisering, viste sig at drastisk reducere reorganiseringen af ER under mitose som vist i figur 5 og figur 6. Desuden gjorde den fremgangsmåde, der er beskrevet her, det muligt at få til at indsamle data om tidsomgange for 32 embryoner. Middelværdi- og max intensitetsmålinger blev fremstillet fra 12.800 interesseområder ved hjælp af et brugerdefineret MATLAB-script, som også genererede beskrivende og inferential statistik, der var afgørende for sammenligninger mellem lægemiddelbehandlinger. På grund af tilgængeligheden af molekylære sonder og den lethed af mikroinjektioner, de metoder, der er beskrevet her er let kan tilpasses til at studere en række biologiske processer via fluorescens intensitet kvantificering.
Figur 5: Repræsentative billeder af Rtnl1-GFP og ReepB-GFP-berigelse ved spindelstængerne under mitose. a) 60x synsfelt af ReepB-GFP under mitose i cellecyklus 10. Den blå firkant repræsenterer det synsfelt, der bruges til paneler B-E. Panel A behandles med et binært tærskelfilter. Dette filter blev ikke anvendt på paneler B-E, da det udelukker data fra pixel under den fastsatte grænse. (B,D) ReepB-GFP i kontrol, og i colchicin. (C,E) Rtnl1-GFP i kontrol, og i colchicin. Dette tal er blevet ændret fra Diaz et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kvantisering af Rtnl1-GFP og ReepB-GFP-berigelse ved spindelstængerne under mitose. 20 spindler og 20 cytoplasma-RO'er på tværs af 10 rammer blev analyseret for 32 embryoner under følgende forhold. a) 10 % DMSO-kontrolinjekt injektioner for Rtnl1-GFP. Kontrolembryoner viste en 0,1 gange stigning i tilsætningen (p<0,001 for alle prøver på T210) sammenlignet med ikke-injicerede prøver (p < 0,001 for alle prøver på T210). b) ReepB-GFP-embryoner, der injiceres med 10 % DMSO, som skal fungere som kontrol. Kontrolembryoner viste en 0,1 gange større tilsætning (p<0,001 for alle prøver ved T210) sammenlignet med ikke-injicerede prøver (figur 1E; p < 0,001 for alle prøver på T210). c) Rtnl1-GFP-embryoner, der injiceres med 5 μM colchicin. Her målte vi en reduktion i Rtnl1-GFP berigelse til spindler (p < 0,001 for alle prøver på T210) sammenlignet med kontrol (A) (p < 0,001 for alle prøver på T210). d) ReepB-GFP-embryoner, der injiceres med 5 μM colchicin. Vi målte en reduktion i ReepB-GFP-berigelse til spindler (p<0,001 for alle prøver på T210) sammenlignet med kontrol (B) (p<0,001 for alle prøver på T210). Dette tal er blevet ændret fra Diaz et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.
| 1. Gær Sæt21 | 2. Drueplader21 | 3. Heptane Lim24 |
| 1.1 Tilsæt 7 gram aktiv tørgær til en 50 ml konisk. Tilsæt 9 milliliter DI vand og bland til selv konstans med en metal spatel. | 2.1 Gør opløsning a: Tilsæt 6 gram agar til 140 ml DI-vand i en 250 ml kolbe og autoklave det. | 3.1 Fyld et glasscintillationshætteglas med 50 tommer dobbeltsidet tape. |
| 1.1 Tilsæt 7 gram aktiv tørgær til en 50 ml konisk. Tilsæt 9 milliliter DI vand og bland til selv konstans med en metal spatel. | 2.2 Gør opløsning b: Bland 0,1 gram methylparaben i 2 ml ethanol, og tilsæt derefter denne opløsning til 60 ml grapefrugtsaftkoncentrat. | 3.2 Der tilsættes 20 ml heptan og tætningsglasscintillationshætteglas med parafilm. Drej natten over ved stuetemperatur. |
| 2.3 Umiddelbart efter autoclavingsopløsningen blandes opløsning b, og blandingen hældes i 10 x 35 mm pertiretter. (fremstiller 35 drueplader) | 3.3 Fjern plasttaperester ved at overføre lim til 2 15 ml koniske rør og centrifugering ved 3000 omdr./min. i 15 minutter. | |
| 2.4 Lad druepladerne indstilles ved stuetemperatur natten over med pladelåg af. Dækplader med låg og opbevares i 4C°, når de er indstillet. | 3.4 Limsupernatant overføres til 1,5 ml mikrocentrifugerør til opbevaring. |
Tabel 1: Opskrifter på medier og løsninger.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet her, er meget alsidig og let kan tilpasses til at studere biologiske hændelser i en række forskellige faser i Drosophila embryonale udvikling. Denne protokol er velegnet til at studere biologiske processer, der forekommer over lange perioder. For eksempel, undersøgelser af cellulalisering29,30 eller dannelsen af heterochromatin domæner i Drosophila31,32 kunne drage fordel af at udnytte demetoder,der er beskrevet i denne protokol, da disse processer opstår over en længere periode. Desuden kan stikprøvestørrelsen øges ved at mindske forstørrelsen for at undersøge spørgsmål, der kræver mindre optisk opløsning,f.eks. På samme måde giver et mål på 20x mulighed for, at to embryoner afbildes inden for et billedplan. Metoderne i denne protokol udgør en dynamisk platform til at stille biologiske spørgsmål ved hjælp af embryonal udvikling som modelsystem til kvantitativ analyse.
Der er 3 kritiske trin i denne protokol. Post dechorionation i 50% blegemiddel er det bydende nødvendigt, at embryoner skylles og tørres kraftigt 5 gange (2.3.4). Dette trin fjerner eventuelle rester små stykker af chorion. Sidesten chorion vil hindre synsfeltet, når billeddannelse fosteret. Ved montering af embryonerne på glasdækslipset (3.5) er det vigtigt at trykke embryonerne på limen med ensartet tryk. Dette vil placere embryoner på samme z fly. Når du skærer mikroinfektionsnålen op, er det vigtigt straks at trække stemplet tilbage for at justere nålens strømningshastighed, eller du mister alt dit injektormiddel.
Vores undersøgelse var begrænset af to faktorer. Den første faktor var ikke at have en automatiseret segmentering proces. Vi har designet et manuelt segmenteringsscript ved hjælp af MATLAB, dog; med en genetisk kodet spindel markør denne proces kunne automatiseres. I fremtiden vil vi gerne producere CNN-RFP21, Rtln1-GFP og CNN-RFP; ReepB-GFP transgene linjer for at muliggøre automatiseret spindelsegmentering. For mere information om vores MATLAB script og analyse pipeline, henvises til supplerende materialer af Diaz et al.15. For det andet var vi også begrænset af vores erhvervelse interval på 35 s, som kun tillod os at billedet 6 embryoner samtidigt. En længere erhvervelse interval ville give os mulighed for at billedet flere embryoner samtidigt. Selv om lægemiddelleveringsoverførselshastigheden kan øges ved at erstatte mikroinjektion med et gennemtrængende trin, fandt vi, at dette var unødvendigt, da vores stikprøvestørrelse allerede var begrænset af anskaffelsesintervallet.
Mens denne protokol blev brugt til at billedet Drosophila embryonale udvikling, den overordnede tilgang er fleksibel til at studere embryonale udvikling i andre multicellulære model systemer, såsom C. elegans, Søpindsvin, og Xenopus. Embryoner er yderst nyttige til kvantitativ analyse, da de let synkroniseres via indsamling eller befrugtning. Desuden bevæger embryoner sig ikke eller svømmer væk fra et synsfelt, hvilket gør det muligt at bruge en simpel multipunktsopkøbssoftware til at producere videoer med flere tidsforfald til kvantitativ analyse. Selv om vi brugte et højt indhold analysator i vores undersøgelse, enhver omvendt mikroskop system i stand til multipoint erhvervelse kan parres med de metoder, der henvises til heri.
Lignende resultater kan opnås ved hjælp af en multipoint erhvervelse i stand inverteret konfokal mikroskop; Men fordelene ved et højt indhold analysator fremstå som en øger stikprøvestørrelsen for at studere spørgsmål, der kræver mindre opløsning i tide. En indlysende fordel ved at bruge en høj indhold analysator er evnen til at billedet 4 separate dias samtidigt i forhold til 1 dias på traditionelle systemer. Med et komplet sæt på 4 dias og 40 embryoner på hvert dias kan 160 embryoner afbildes over flere timer, så længe anskaffelsesintervallet er mindst 15 min mellem rammerne. En anden vigtig fordel ved at bruge en høj indhold analysator er, at prøverne er helt afspærret fra eventuelle eksterne lyskilder, som er nødvendig for fluorescens intensitet-baserede målinger. Endelig har det høje indhold analysator, der anvendes i vores undersøgelse har en 5,5-megapixel CMOS kamera, som giver en generøs 221.87 μm synsfelt på 60x forstørrelse. Dette større synsfelt gjorde det muligt for os at afbilde et halvt embryon pr. anskaffelsespunkt.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
UD, WFM og BR støttes af Center for Cellular Construction, en National Science Foundation (NSF) Science and Technology Center, under tilskudsaftale DBI-1548297. BR er også støttet gennem en NSF CAREER pris, 1553695.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x 35mm Micro Dish | VWR | Cat #: 10799-192 | N/A |
| 100% grape juice concentrate | Welch's, 100% Concentrate Grape Juice | N/A | Purchase at Grocery Store |
| 250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth | VWR | Cat #: 10536-914 | N/A |
| 3" Non-Metallic Sieve No. 140 | Gilson Company | SV-165 #140 | N/A |
| 4 Slide Imaging Tray | Grace Biolabs | SKU: 400104 | N/A |
| ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy | Fisher Scientific | Cat #: AC411255000 | N/A |
| Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof | Fisher Scientific | Cat# : AC615095000 | N/A |
| Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) | Fisher Scientific | Cat#: AC126961000 | N/A |
| Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass | Fisher Scientific | Cat #: 50-143-782 | N/A |
| Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick | Grace Biolabs | SKU: 664273 | N/A |
| DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials | Fisher Scientific | Cat #: 03-341-71A | N/A |
| Embryo Collection Cage-Mini | Genesee Scientific | Cat #: 59-105 | N/A |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | Product Code: 10289651 | N/A |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge | Fisher Scientific | Cat #: 05-527-90 | N/A |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | Cat #: 14-432-22 | N/A |
| Fleischmann's, Active Dry Yeast | Fleischmann's | N/A | Purchase at Grocery Store |
| Grape Plates | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-133 | N/A |
| Halocarbon 700 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-131 | N/A |
| Heptane Glue | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 | VWR | Cat #: 55411-050 | N/A |
| Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll | Fisher Scientific | Cat #: 50-998-944 | N/A |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy | Fisher Scientific | Cat #: NC0879005 | N/A |
| Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm | Millipore Sigma | SKU: 1077351000 | N/A |
| Stainless Steel Spoon/Spatula | VWR | Cat #: 470149-044 | N/A |
| W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents | Fisher Scientific | Cat #: 23-116582 | N/A |
| Yeast Paste | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| EQUIPMENT | |||
| Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts. |
| Autoclave | N/A | N/A | Any autoclave will do fine. |
| Drummond Nanoject II Microinjector. | Drummond Scientific | N/A | This is a mineral oil based injection system. |
| GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
| Refrigerator (4C°) | N/A | N/A | Fly media and yeast paste must be stored at (4C°). |
| Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |
References
- Zanella, F., Lorens, J., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).
- Jennings, B. Drosophila-a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).
- Bickle, M. The beautiful cell: high-content screening in drug discovery. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy based high content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
- Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).
- Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Letsou, A., Bohmann, D. Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).
- Sullivan, W., Theurkauf, W. The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo. Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).
- Schejter, E., Wieschaus, E. Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo. Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).
- Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos. Development. 103 (4), 675-686 (1988).
- Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development. Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).
- Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).
- Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis. PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).
- Shibata, Y., et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).
- Bergman, Z., et al. Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo. PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).
- Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
- Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells. The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer Science & Business Media. eBook ISBN 978-3-662-22489-2 (2013).
- Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-087969827-0 (2000).
- Bainbridge, S., Bownes, M.
- Bate, M., et al. Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. Chapter 3. ISBN 978-087969899-7 (1993).
- Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, Academic Press. 113-123 (2001).
- Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules. Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).
- Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).
- Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network. The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).
- Loncar, D., Singer, S. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Mazumdar, A., Mazumdar, M. How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster. Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).
- Yuan, K., O'Farrell, P. TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos. Genes & Development. 30 (5), 579-593 (2016).
- Walther, M., et al. Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis. Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).
- McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos. Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).
- Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos. Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).
