Summary
Presentato qui è un protocollo per microiniettare e contemporaneamente immaginire più embrioni di Drosophila durante lo sviluppo embrionale utilizzando un imager a base di piastre e ad alto contenuto.
Abstract
I moderni approcci nell'imaging quantitativo di cellule vive sono diventati uno strumento essenziale per esplorare la biologia cellulare, consentendo l'uso di statistiche e modelli computazionali per classificare e confrontare i processi biologici. Sebbene i sistemi modello di coltura cellulare siano ottimi per l'imaging ad alto contenuto, studi ad alta produttività della morfologia cellulare suggeriscono che le colture ex vivo sono limitate nel riassumere la complessità morfologica che si trova nelle cellule all'interno di organismi viventi. Come tale, è necessario un sistema scalabile di modelli ad alta produttività per immagini le cellule viventi all'interno di un organismo intatto. Descritto qui è un protocollo per l'utilizzo di un analizzatore di immagini ad alto contenuto per acquisire contemporaneamente più video time-lapse di sviluppo embrionale drosophila melanogaster durante lo stadio blastoderma sinciteale. Il blastoderma sincreziale è tradizionalmente servito come un grande modello in vivo per l'imaging di eventi biologici; tuttavia, ottenere un numero significativo di repliche sperimentali per approcci quantitativi e ad alta produttività è stato laborioso e limitato dall'imaging di un singolo embrione per ripetizione sperimentale. Presentato qui è un metodo per adattare gli approcci di imaging e microiniezione per adattarsi a un sistema di imaging ad alto contenuto o a qualsiasi microscopio invertito in grado di acquisizione multipunto automatizzata. Questo approccio consente l'acquisizione simultanea di 6-12 embrioni, a seconda dei fattori di acquisizione desiderati, all'interno di una singola sessione di imaging.
Introduction
Negli ultimi 30 anni, i progressi nelle tecnologie di imaging e nelle sonde molecolari per l'imaging di cellule vive hanno fatto progredire la nostra comprensione della complessità e del funzionamento interno della cellula. Ad accompagnare questo progresso tecnologico c'è una maggiore dipendenza dall'uso di modelli di coltura cellulare ex vivo per l'acquisizione di dati di imaging ad alta produttività. I modelli di coltura cellulare offrono diversi vantaggi, tra cui il controllo del microambiente attraverso sistemi microfluidici e la capacità di immagini simultanee di più cellule, consentendo l'uso di approcci quantitativi necessari per lo screening adalta produttività 1,2. Tuttavia, ci sono anche svantaggi significativi associati ai modelli di coltura cellulare nel contesto di studi morfologici, come superfici bidimensionali in vetro o plastica che producono effetti confondenti sulla morfologia cellulare e la suaregolazione 3,4,5. Questi effetti possono fornire dati falsi o fuorvianti per quanto riguarda lo studio dei processi biologici che regolano la morfologia cellulare.
Sebbene l'alternativa sia stata studiare la morfologia cellulare nel contesto di un organismo intatto6, pochi organismi intatti adatti facilitano l'imaging quantitativo di cellule vive ad alta produttività a causa delle difficoltà nel mantenere in vita interi organismi attraverso l'imaging e delle sfide associate all'imaging all'interno di un grande organismo multicellulare. Di conseguenza, gli studi biologici cellulari su organismi intatti si sono generalmente concentrati sull'osservazione di un singolo organismo nel tempo, il che limita notevolmente la dimensione del campione. Inoltre, questa limitazione di un animale alla volta rende l'imaging dal vivo difficile e costoso da impiegare sotto forma di schermo e limita la capacità di applicare strumenti analitici quantitativi poiché il numero di campioni è generalmente troppo piccolo. Pertanto, sorge la necessità di un organismo modello multicellulare che può essere utilizzato per approcci quantitativi basati su alto contenuto.
Questo protocollo adatta l'embrione Drosophila per l'imaging ad alto contenuto a base di lastre per generare campioni sperimentali abbastanza grandi da essere analisi quantitative. Drosophila melanogaster è comunemente noto come il primo organismo modello. La ricerca sulla Drosophila ha portato a progressi nella biologia cellulare e molecolare, tra cui la trasmissione di informazioni genetiche, l'identificazione delle vie di segnalazione cellulare e i requisiti genetici dello sviluppo embrionale7,8,9. Inoltre, l'embrione di Drosophila è stato utilizzato per esplorare la dinamica dei microtubuli in vivo durante la divisionecellulare 10,11,12. L'uso della microiniezione per fornire piccole molecole e sonde molecolari fornisce un controllo temporale che rende lo sviluppo embrionale di Drosophila particolarmente potente per sondare i processi cellulari in vivo13,14. Tuttavia, generare un numero significativo di ripetizioni sperimentali con un approccio di imaging tradizionale è estremamente laborioso e ha un uso limitato negli schermi di imaging ad alta produttività e nell'analisi quantitativa. Il nostro approccio si avvale di un analizzatore ad alto contenuto tipicamente riservato all'analisi a singola cella e adatta l'analisi di imaging in vivo nel sincrezio della prima Drosophila embryo.
Questo protocollo è stato utilizzato per raccogliere, stadio e microiniettare embrioni di Drosophila per esplorare i meccanismi che guidano i cambiamenti morfologici nel Reticolo Endoplasmatico (ER) durante la mitosi15. Sebbene molti studi abbiano delineato la natura dinamica del TI durante il ciclocellulare 16,17,18,19, è stato difficile confrontare gli effetti delle perturbazioni multiple nel tempo sulla morfologia ER. Per identificare i componenti che guidano i cambiamenti nella morfologia ER attraverso la divisione cellulare, i metodi elencati in questo protocollo sono stati utilizzati per sondare il ruolo dei microtubuli e di altri fattori citoscheletrici sulla riorganizzazione mitotica dell'ER usando la divisione sincrite corticale nel primo embrione di Drosophila. Nel complesso, la disponibilità di perturbazioni genetiche all'interno della comunità Drosophila, la capacità di microiniettare farmaci e sonde molecolari in momenti precisi durante lo sviluppo e il costo economico di lavorare con Drosophila rendono questo approccio altamente suscettibile allo screening basato su immagini ad alta produttività. I metodi qui descritti sono applicabili per lo studio di un'ampia varietà di processi cellulari e di sviluppo in vivo utilizzando l'embrione Drosophila 20. In particolare, questo protocollo è ben adattato per studiare gli eventi biologici che si verificano per un lungo periodo e entro 100 micron dalla corteccia embrionale drosophila.
Protocol
NOTA: Fare riferimento alla tabella 1 per le ricette di media e soluzioni.
1. Creazione e mantenimento di una gabbia per la raccolta degli embrioni per l'analisi dalvivo 21
- Popola una gabbia fresca per la raccolta degli embrioni con mosche fresche.
NOTA: Mentre si raccomandano gabbie di raccolta disponibili in commercio, le gabbie di raccolta possono essere facilmente costruite con bottiglie di moscavuote 21.- Scartare o trasferire mosche adulte dalle bottiglie quando molte pupe iniziano a scurirsi allo stadio p14; a 20 °C questo si verifica circa 14 giorni dopo che le uova sono state deposte22.
- Lasciare schiudere le pupe e popolare le bottiglie per 12-24 ore.
- Trasferisci mosche fresche in una piccola gabbia di raccolta usando un piccolo imbuto sopra l'apertura della gabbia di raccolta per evitare che le mosche scappino. Combina fino a 3 bottiglie per produrre una gabbia densamente popolata contenente da 200 a 500 mosche.
- Trasferisci le mosche nella gabbia di raccolta toccando ripetutamente una bottiglia di mosca contro una superficie dura (per stordire le mosche). Quindi aprire e invertire la bottiglia di mosca sopra l'imbuto della gabbia di raccolta. Tocca la bottiglia aperta sulla gabbia di raccolta alcune volte per far cadere le mosche nella gabbia di raccolta.
- Chiudere il flacone a mosca aperta impostandolo rapidamente sulla spina. Durante il trasferimento della bottiglia di mosca aperta dall'imbuto alla sua spina, assicurarsi che l'apertura della bottiglia punti verso il basso mentre le mosche tendono a strisciare lontano dalla fonte della maschiatura.
- Premere l'imbuto contro l'apertura della gabbia di mosca e toccare ripetutamente la gabbia su una superficie dura per stordire le mosche all'interno. Rimuovere immediatamente l'imbuto e fissare un piatto d'uva fresco all'apertura della gabbia di mosca. Utilizzare il nastro adesivo per fissare il piatto d'uva. Ripeti questo processo per combinare fino a 3 bottiglie per produrre una gabbia di raccolta densamente popolata.
NOTA: In alternativa, le mosche possono essere anestetizzanti usando CO2 o altri agenti dormitori a mosca; tuttavia, ciò aumenterà il periodo di acclimatazione nel passaggio 1.2.
- Acclimata la nuova gabbia di raccolta per 24-48 h. Se sono stati utilizzati CO2 o altri agenti dorminti, acclimatare la gabbia di raccolta per almeno 48 ore.
- Sostituire il piatto d'uva nella gabbia di raccolta con uno fresco contenente pasta di lievito due volte al giorno, distante 8-10 ore.
- Impostare una gabbia di raccolta fresca ogni 5 giorni.
2. Raccolta e preparazione di embrioni per l'imaging
- Ottenere embrioni con sviluppo sincronizzato
- Scambiare il piatto d'uva sulla gabbia di raccolta con uno fresco contenente al centro un tampone di pasta di lievito. Consentire alle mosche di deporre embrioni per 1 h. Toss il vecchio piatto d'uva.
NOTA: Le mosche possono fecondare gli embrioni prima di deporrli. La prima piastra di raccolta conterrà molti di questi embrioni pre-sviluppati. Permettere alle mosche di scaricare prima vecchi embrioni migliorerà la sincronizzazione dello sviluppo tra embrioni. - Scambia il piatto d'uva con uno fresco contenente un tampone di pasta di lievito al centro e lascia che le mosche depongono gli embrioni per 10 minuti. Toss il vecchio piatto d'uva.
NOTA: Per evitare di rallentare lo sviluppo embrionale su piatti freddi, riscaldare il piatto d'uva e la pasta di lievito a temperatura ambiente prima dell'uso. - Scambiare il piatto d'uva con uno fresco (senza pasta di lievito) e salvare il vecchio piatto d'uva, ha gli embrioni per l'imaging. Se necessario, continuare a raccogliere embrioni da questa gabbia ripetendo i punti 2.1.2 e 2.1.3.
- Scambiare il piatto d'uva sulla gabbia di raccolta con uno fresco contenente al centro un tampone di pasta di lievito. Consentire alle mosche di deporre embrioni per 1 h. Toss il vecchio piatto d'uva.
- L'età raccoglie embrioni per 30-45 minuti alle divisioni sincizialidell'immagine 23.
NOTA: Per immagine dello stadio di blastoderma sincreziale nello sviluppo embrionale, gli embrioni devono essere montati e al microscopio entro 90 minuti dalla raccolta. Quando si tenta questo protocollo per la prima volta, età embrioni 10-20 min nel passaggio 2.2 per fornire tempo extra per impostare tra i passaggi. - Embrioni di dechorionato con candeggina al 50% in acqua DI.
- Trasferire embrioni invecchiati dal passaggio 2.2 in un setaccio di 140 nm riempiendo il piatto d'uva con acqua DI, slogando delicatamente gli embrioni con un pennello e versando l'acqua con embrioni nel setaccio di 140 nm (Figura 1A).
NOTA: Questo può essere fatto su un lavandino o un becher da 1.000 mL. - Risciacquare vigorosamente gli embrioni con acqua DI usando una bottiglia di schizzi. Embrioni secchi gonfiando il setaccio su un tovagliolo di carta asciutto. Tamponare il setaccio fino a quando non smette di lasciare segni d'acqua sull'tovagliolo di carta( Figura 1B).
NOTA: Rimuovere tutta la pasta di lievito dagli embrioni in quanto può rendere inefficace il trattamento della candeggina nel passaggio successivo. - Riempire un piatto vuoto di 10 cm con candeggina al 50% appena preparata diluita con acqua DI (candeggina 1:1: acqua DI). Immergere il setaccio in candeggina al 50% per 2 min 45 s. Inizia un cronometro non appena il setaccio tocca la candeggina al 50%. Cancellare il setaccio in uscita dal 50% di candeggina 3-4x nei primi 15 s per rompere i grumi embrionale(Figura 1C).
- Risciacquare vigorosamente gli embrioni con acqua DI usando una bottiglia di schizzi. Asciugare gli embrioni gonfiando il setaccio su un tovagliolo di carta asciutto. Ripetere il processo di essiccazione vigoroso del risciacquo e della macchia per 5x (Figura 1D).
NOTA: Questo è il passo più importante per rimuovere il coro sinistro. Utilizzare una bottiglia completa di schizzi DI e utilizzare metà della bottiglia in questo passaggio. - Trasferire gli embrioni essiccati dal setaccio a piatti d'uva da 10 cm utilizzando un pennello21 (Figura 1E)
NOTA: La diclorazione manuale può essere utilizzata come alternativa alla decorinazione della candeggina24.
- Trasferire embrioni invecchiati dal passaggio 2.2 in un setaccio di 140 nm riempiendo il piatto d'uva con acqua DI, slogando delicatamente gli embrioni con un pennello e versando l'acqua con embrioni nel setaccio di 140 nm (Figura 1A).
Figura 1: Dechorionation embrionale. (A) Gli embrioni sono stati raccolti utilizzando una bottiglia di schizzi DI H20, un pennello e un setaccio da 140 nm. (B) Gli embrioni sono stati risciacquati vigorosamente utilizzando una bottiglia di schizzi DI H20 e asciugati su un tovagliolo di carta. (C) La dechorionation degli embrioni è stata eseguita in candeggina al 50% per 2 minuti e 45 s.(D)Gli embrioni sono stati risciacquati vigorosamente utilizzando una bottiglia di schizzi DI H20 e asciugati su un tovagliolo di carta. Questo è stato ripetuto 4 volte per rimuovere il coro in eccesso. (E) Gli embrioni sono stati poi trasferiti in un piatto d'uva di 10 cm utilizzando un pennello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Montaggio di embrioni su coverlips
- Sotto uno stereomicroscopio dotato di illuminazione del collo d'oca sopraelevato, organizza due file di 15-20 embrioni su una sezione pulita del piatto d'uva utilizzando uno strumento di selezione delle uova. Allineare gli embrioni sul loro lato ventrale nello stesso orientamento rispetto alle estremità anteriore e posteriore. Per far piegare le pinzette in acciaio inossidabile a punta fine a 45°. Per rivedere l'orientamento degli embrioni D/V si veda Campos-Ortega etal.
NOTA: È importante che la superficie ventrale si sieda sul piatto d'uva poiché gli embrioni verranno premuti su uno slittamento di copertura nel passaggio 3.5, esponendo la superficie dorsale per l'imaging. Poiché la superficie dorsale è molto più piatta della superficie ventrale, l'imaging della superficie laterale dorsale aumenta il numero di nuclei presenti all'interno di un singolo piano Z. - Preparare 75 mm x 25 mm di rivestimento del distanziale in silicone.
NOTA: Questo può essere preparato in anticipo. Preparare diversi coprispazzi e conservarli in una casella di diapositive per mantenerli puliti.- Traccia il contorno di un coverslip da 75 mm x 25 mm su un distanziale in silicone dello spessore di 1,6 mm e ritaglia il distanziale in silicone usando le forbici (Figura 2A).
- Utilizzando una lama di rasoio, ritagliare un inserto di 40 mm x 15 mm dal distanziale (Figura 2A).
- Aderire al distanziale sul coperchio e sulla striscia 10 μL di colla di eptano lungo l'inserto in vetro per coverslip esposto (Figura 2A).
NOTA: La messa a terra e la striscia uniforme garantiranno l'imaging di embrioni sullo stesso piano z.
- Mentre la colla di eptano del passo 3.2.3 si asciuga, ritaglia una sezione rettangolare di piatto d'uva contenente gli embrioni del passo 3.1.
- Utilizzare una lama di rasoio per tagliare un rettangolo (più piccolo di 40 mm x 15 mm) attorno alle due file di embrioni. Non rimuovere ancora il rettangolo.
- Ritaglia un secondo rettangolo accanto al primo. Rimuovere il secondo rettangolo utilizzando il lato dritto di una spatola in acciaio inossidabile.
- Far scorrere con cura il bordo dritto di una spatola in acciaio inossidabile sotto il primo rettangolo e rimuoverlo (Figura 2B).
- Posizionare il ritaglio del piatto d'uva con embrioni sul lato esterno di un piatto di 3,5 cm(Figura 2C).
- Sotto uno stereomicroscopio, abbassare un coverslip preparato sugli embrioni e premere delicatamente le due file di embrioni sulla colla (Figura 2D).
- Se si iniettano embrioni, passare al passaggio 4.1. Se non la microiniezione continua al passaggio 3.7.
- Coprire gli embrioni riempiendo il distanziale in silicone (a metà strada verso l'alto) con 1:1 - olio di alocarbonio 700: olio di alocarbonio 27.
- Allineare i bordi inferiori di un adattatore a piastra a 4 diapositive con nastro a doppia fronte per evitare che lo slittamento del coperchio si muovi, ma assicurarsi di non posizionare il nastro nel percorso dell'obiettivo. Questo nastro è fondamentale. Se il coverslip è seduto solo sull'adattatore, si sposterà durante l'acquisizione. Montare lo slittamento del coperchio sull'adattatore a 4 piastre scorrevole.
Figura 2: Preparazione e montaggio delle labbra. (A) Un contorno di 75 mm x 25 mm di coverslip è stato tracciato su un foglio di silicone dello spessore di 1,6 mm. Usa le forbici per ritagliare il contorno. L'inserto di 40 mm x 15 mm è stato ritagliato dal distanziale in silicone e quindi montato sul coperchio. Striato 15 μL lungo il centro dell'interno. (B) Due file di 15-20 embrioni sono state organizzate su un piatto d'uva in una superficie inferiore a 40 mm x 15 mm, poi quella zona è stata tagliata utilizzando un rasoio e una spatola in acciaio inossidabile. (C) Il piatto d'uva tagliato è stato posto sulla parte superiore di un piatto vuoto di 3,5 cm. (D) Sotto uno stereomicroscopio, il coverslip della lettera A è stato abbassato e gli embrioni sono stati bloccati sulla striscia di colla. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Embrioni essiccanti e microiniettori
- Posizionare la coverlip con embrioni su uno scivolo per evitare che il fondo del coverslip si sporchi durante l'essiccazione e la microiniezione.
NOTA: il foglietto di copertina verrà immaginato senza una diapositiva ad esso collegata. Pertanto, è necessario un microscopio invertito per l'imaging. - Essiccare gli embrioni per 5-10 minuti, a seconda della temperatura della stanza. Gli embrioni utilizzati per l'imaging nei risultati rappresentativi sono stati essiccati per 7 minuti a 20 °C in una camera contenente uno strato 1:1 di perline di gel di silice su un agente essiccante(figura 3A).
- Subito dopo l'essiccazione, coprire gli embrioni con 1:1 - olio di alocarbonio 700: olio di alocarbonio 27. Riempire il distanziale in silicone a metà strada verso l'alto.
NOTA: È importante mescolare un olio alocarbonio ad alta viscosità con un olio alocarbonio a bassa viscosità. L'olio di alocarbonio puro 700 (alta viscosità) rallenta la progressione dei cicli cellulari 30 minuti dopo l'applicazione. Una miscela 1:1 di olio di alocarbonio 700 e olio di alocarbonio 27 ha risolto questo manufatto. - Caricare aghi di microiniezione con iniettore, quindi montarne uno al microiniettore e tagliarlo aperto sotto pressione.
NOTA: Pratica il passaggio 4.4 alcune volte prima di eseguire il test completo con eventuali reagenti preziosi. Questo è il passo più difficile nel processo di microiniezione.- Caricare aghi di microiniezione con 2 μL di iniettore utilizzando una punta di carico estesa. È necessario un solo ago di microiniezione, ma è bene avere aghi carichi di ricambio nelle vicinanze, quindi preparare 2 o 3 aghi.
NOTA: fare riferimento alla tabella dei materiali per le specifiche sulle punte di carico estese. Gli aghi di microiniezione non possono essere caricati senza punte di carico estese a causa della natura unica della nostra tecnica di microiniezione, che si basa sulla costruzione della pressione dell'aria all'interno di un ago sigillato e caricato prima di aprire la punta. - Montare un ago sul microiniettore e deprimere lo stantuffo a metà della punta. L'obiettivo è aumentare la pressione dell'aria all'interno del capillare di vetro (Figura 4A).
NOTA: Utilizzare un microiniettore a base di olio minerale plunger senza olio minerale. Invece di costruire pressione con olio minerale, utilizzare lo stantuffo per costruire la pressione dell'aria. - Abbassare l'ago di vetro su uno scivolo di vetro e tagliare la punta dell'ago aperta utilizzando un nuovo #9 rasoio. Tagliare l'ago con un angolo di 45° per produrre una punta aperta e affilata. L'iniettore dovrebbe scorrere verso il basso della punta senza scorrere fuori dall'ago. Aggiungere con cura 20 μL di olio di alocarbonio sulla punta dell'ago e ritagliare aperto a 45°. L'iniettore dovrebbe iniziare a fluire rapidamente.
- Abbassare immediatamente la pressione dell'aria ritraendo lo stantuffo, ma assicurarsi di mantenere una portata continua per evitare che l'ago si intasa con membrana embrionale tra le iniezioni. (Figura 4B).
NOTA: Se l'iniettore è chiaro, visualizzare la portata dell'iniettore sollevando l'ago di microiniezione in uscita dall'olio di alocarbonio e osservando la velocità di formazione per le goccioline di iniettori sotto uno stereomicroscopio. Regolare la pressione dell'aria deprimendo lo stantuffo alcuni clic alla volta, quindi immergere la punta di microiniezione in uscita e fuori dall'olio di alocarbonio per visualizzare la velocità di formazione per le nuove goccioline dopo la regolazione. - Utilizzare il micromanipolatore per posizionare l'ago al centro del campo visivo, quindi sollevare l'ago utilizzando il micromanipolatore e rimuovere lo scivolo di vetro da sotto di esso. L'ago è ora calibrato per l'iniezione.
- Caricare aghi di microiniezione con 2 μL di iniettore utilizzando una punta di carico estesa. È necessario un solo ago di microiniezione, ma è bene avere aghi carichi di ricambio nelle vicinanze, quindi preparare 2 o 3 aghi.
Figura 3: Diagramma della camera di essiccazione. (A) Questo è un diagramma di una camera di essiccazione. La camera è costituita da uno strato 1:1 di perline di gel di silice su uno strato di drierite. Per eseguire l'essiccazione, gli embrioni sono stati posizionati sopra un singolo coperchio della piastra del pozzo. La camera di essiccazione è stata chiusa 7 min. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Embrioni di microiniezione
- Posizionare gli embrioni sullo stadio stereomicroscopio sotto l'ago di microiniezione ma non abbassare l'ago.
- Concentrati sugli embrioni con ingrandimento 50x.
- Abbassare l'ago fino a quando non entra nello stesso piano di messa a fuoco degli embrioni. Spostando la diapositiva con una mano e operando il microiniettore con l'altra, iniettare una fila di embrioni.
- Sollevare l'ago e ruotare lo scivolo di 180° per esporre la seconda fila di embrioni all'ago di microiniezione. Abbassare l'ago e iniettare la seconda fila di embrioni.
NOTA: Prova a farlo in meno di 10 minuti. Lasciare alcuni embrioni non iniettati da utilizzare come controlli.
Figura 4: Preparazione dell'ago di microiniezione. (A) In questa illustrazione, l'intensità del magenta nell'ago è rappresentativa della pressione dell'aria. Un ago caricato è stato montato sul microiniettore e lo stantuffo è stato esteso del 50% per aumentare la pressione dell'aria all'interno dell'ago. Assicurarsi che lo stantuffo sia retratto al massimo prima del montaggio. (B) La punta dell'ago è stata tagliata sotto pressione e lo stantuffo è stato retratto per ridurre la pressione dell'aria e la portata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
5. Imaging su un analizzatore ad alto contenuto
- Prima di eseguire questo test, creare una mappa della piastra per un adattatore di scorrimento. Utilizzate l'editor di porta lamiere disponibile nel menu Gestione mappe piastra (Plate Map Manager) per immettere la quota per un adattatore di piastra personalizzato.
NOTA: è stata realizzata una mappa della piastra personalizzata per l'adattatore di piastra disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). La mappa della piastra contiene le seguenti impostazioni; Spessore scorrimento: 1000 μm, Altezza inferiore: 1,607 mm, variabilità dell'altezza inferiore: 100 μm, materiale del substrato: vetro, spessore delle copertine: 150 μm, posizione delle copertine: fondo – file: 1 – spaziatura: 56.987 mm, colonne: 4 – spaziatura 28.391, dimensioni e forma: rettangolo, larghezza 23,00 mm, altezza: 73,00 mm, offset a A1 21,29 mm – 42,74 mm) - Caricare l'adattatore diapositiva al microscopio e usare la funzione Anteprima per affiancare un'immagine 10x del coverslip.
- Selezionare un embrione dall'alto o dal basso di una riga, quindi selezionare Obiettivo e passare a 60x (NA 0,95). Determinare un'esposizione appropriata per il canale di fluorescenza desiderato.
NOTA: Mantenere l'intensità del laser inferiore al 25% per l'imaging a cellule vive. - Nel dashboard principale, usa la funzione Anteprima per affiancare un'immagine fluorescente 60x contenente entrambe le righe di embrioni.
- Nel quadro comandi principale, selezionate il menu a discesa Binning e impostate l'binning su 1 x 1 per una risoluzione ottimale.
- Utilizzate la scheda imposta stack z per definire i parametri per gli stack z.
- Nella scheda imposta stack z usare le frecce Su e Giù per trovare, quindi definire i limiti dello stack z superiore e inferiore. Una volta definiti i limiti superiore e inferiore, selezionare l'icona Matita verde per salvare la posizione della pila z. Si noti la posizione della pila z in quanto verrà utilizzata nel passaggio 5.6.5.
- Nella scheda Imposta stack z usare la casella di input passo z per definire la spaziatura tra le sezioni z.
NOTA: Il numero totale di fette è determinato modulando i gradini 5.6.1 e 5.6.2. - Nella dashboard principale, fare clic con il pulsante destro del mouse sul canale fluorescente e utilizzare il menu a discesa Modalità immagine per impostare la modalità di imaging su 3D.
- Nel dashboard principale, selezionare la casella di messa a fuoco automatica laser per disabilitare la messa a fuoco automatica.
- Nel quadro comandi principale, definite lo stato attivo iniziale con la posizione z-stack dal passaggio 5.6.1, quindi selezionate la casella messa a fuoco iniziale per disattivare la funzione "Rifocalizzain ogni punto di tempo ".
- Nella scheda Campi utilizzare il menu a discesa Posizionamento campo per abilitare i punti personalizzati, quindi utilizzare le frecce per selezionare i punti per l'imaging.
NOTA: l'intervallo di tempo tra le acquisizioni (passaggio 5.8) determinerà quanti punti personalizzati possono essere contemporaneamente. - Nella scheda Serie temporali selezionare la casella Acquisisci serie temporali per abilitare la feature di serie temporali, quindi definire il numero totale di punti temporali.
NOTA: 6 punti personalizzati x 5 z slice x 80 stack = 2.400 immagini, 2.400 immagini x 8,2 MB per immagine = 19,68 GB di spazio su disco. - Nel dashboard principale usare la casella di input nome per assegnare un nome alle impostazioni di acquisizione, quindi selezionare File e Salva per salvare le impostazioni di acquisizione.
- Nel dashboard principale selezionare il pulsante Digitalizza per eseguire l'acquisizione.
6. Elaborazione post-immagine
- Trascinare il file xdce nelle Fiji per aprire la serie di immagini come iperstack multidimensionale.
- Salvare l'hyperstack come file tif.
- Crea proiezioni di intensità massima e salvale come file tif.
- Assemblare una libreria di proiezioni di intensità massima e creare una pipeline per l'estrazione e l'analisi dei dati.
Representative Results
L'approccio presentato in questo protocollo è stato utilizzato per esaminare il ruolo dei microtubuli nella riorganizzazione del reticolo endoplasmatico (ER) durante la mitosi nell'embrione Drosophila 15. Durante la mitosi, la struttura del ER mostra una drammatica riorganizzazione, tuttavia, le forze che guidano questi cambiamenti sono poco comprese. Recentemente, una famiglia di proteine modellanti ER ha dimostrato di promuovere la formazione di ER tubule25,26,27,28, che sono noti per la loro vicinanza con i microtubuli28. Per studiare il rotolo di microtubuli sulla morfologia ER, i metodi previsti dal protocollo sono stati utilizzati per generare dati per confrontare quantitativamente gli effetti di diversi trattamenti farmacologici microiniettati sulla riorganizzazione dell'E.E. durante la mitosi. La colchicina, che impedisce la nuova polimerizzazione dei microtubuli, è stata trovata per ridurre drasticamente la riorganizzazione del ER durante la mitosi, come mostrato nella figura 5 e nella figura 6. Inoltre, l'approccio qui descritto ha permesso la produzione di dati di imaging time laps per 32 embrioni. Misurazioni di intensità media e massima sono state prodotte da 12.800 regioni di interesse utilizzando uno script MATLAB personalizzato, che ha anche generato statistiche descrittive e inferenziali vitali per effettuare confronti tra trattamenti farmacologici. A causa della disponibilità di sonde molecolari e della facilità delle microiniezioni, i metodi qui descritti sono facilmente adattabili per studiare una varietà di processi biologici attraverso la quantificazione dell'intensità della fluorescenza.
Figura 5: Immagini rappresentative dell'arricchimento rtnl1-GFP e ReepB-GFP ai poli del mandrino durante la mitosi. (A) campo visivo 60x di ReepB-GFP durante la mitosi nel ciclo cellulare 10. Il quadrato blu rappresenta il campo visivo utilizzato per i pannelli B-E. Il pannello A viene elaborato con un filtro binario di soglia. Questo filtro non è stato applicato ai pannelli B-E poiché esclude i dati dai pixel al di sotto della soglia impostata. (B,D) ReepB-GFP in controllo e in colchicina. (C,E) Rtnl1-GFP in controllo e in colchicina. Questa cifra è stata modificata da Diaz etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Quantificazione dell'arricchimento rtnl1-GFP e ReepB-GFP ai poli del mandrino durante la mitosi. 20 mandrini e 20 ROM di citoplasma su 10 fotogrammi sono stati analizzati per 32 embrioni nelle seguenti condizioni. (A) Le iniezioni di controllo DMSO al 10% per rtnl1-GFP. (B) Embrioni ReepB-GFP iniettati con il 10% di DMSO per fungere da controllo. Gli embrioni di controllo hanno mostrato un aumento di 0,1 volte dell'arricchimento (p<0,001 per tutti i campioni a T210) rispetto ai campioni non iniettati(figura 1E; p < 0,001 per tutti i campioni a T210). (C) Embrioni di Rtnl1-GFP iniettati con 5 μM di colchicina. Qui abbiamo misurato una riduzione dell'arricchimento Rtnl1-GFP in mandrini (p < 0,001 per tutti i campioni a T210) rispetto ai controlli (A) (p < 0,001 per tutti i campioni a T210). (D) Embrioni reepB-GFP iniettati con colchicina da 5 μM. Abbiamo misurato una riduzione dell'arricchimento ReepB-GFP in mandrini (p<0,001 per tutti i campioni a T210) rispetto ai controlli (B) (p<0.001 per tutti i campioni a T210). Questa cifra è stata modificata da Diaz etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 1. Pasta dilievito 21 | 2. Piattid'uva 21 | 3. Colla epta24 |
| 1.1 Aggiungere 7 grammi di lievito secco attivo a un conico da 50 ml. Aggiungere 9 millilitri di acqua DI e mescolare anche alla costanza con una spatola metallica. | 2.1 Rendere la soluzione a: Aggiungere 6 grammi di agar a 140 ml di acqua DI in un pallone da 250 ml e autoclave. | 3.1 Riempire una fiala a scintillazione in vetro con 50 pollici di nastro a doppia parte. |
| 1.1 Aggiungere 7 grammi di lievito secco attivo a un conico da 50 ml. Aggiungere 9 millilitri di acqua DI e mescolare anche alla costanza con una spatola metallica. | 2.2 Rendere la soluzione b: Mescolare 0,1 grammi di parabeni metile in 2 ml di etanolo, quindi aggiungere questa soluzione a 60 ml di concentrato di succo di pompelmo. | 3.2 Aggiungere 20 ml di eptano e sigillare la flaconcino a scintillazione del vetro con parafilm. Ruotare durante la notte a temperatura ambiente. |
| 2.3 Subito dopo la soluzione di autoclave a, mescolare nella soluzione b e versare la miscela in piatti perti da 10 x 35 mm. (produce 35 piatti d'uva) | 3.3 Rimuovere i detriti di nastro di plastica trasferendo la colla in 2 tubi conici da 15 ml e centrifugando a 3000 giri/min per 15 minuti. | |
| 2.4 Lasciare che i piatti d'uva si mettano a temperatura ambiente durante la notte con i coperchi del piatto spenti. Coprire le piastre con coperchi e conservare in 4C° dopo il set. | 3.4 Trasferire il supernatante colla in tubi microcentrifuge da 1,5 ml per lo stoccaggio. |
Tabella 1: Ricette di media e soluzioni.
Discussion
Il protocollo qui descritto è altamente versatile e facilmente adattabile per lo studio di eventi biologici in una varietà di fasi dello sviluppo embrionale di Drosophila. Questo protocollo è adatto per lo studio di processi biologici che si verificano per lunghi periodi di tempo. Ad esempio, gli studi sulla cellularizzazione29,30 o sulla formazione di domini di eterocromatina in Drosophila31,32 potrebbero trarre vantaggio dall'utilizzo dei metodi descritti in questo protocollo poiché questi processi si verificano per un lungo periodo di tempo. Inoltre, la dimensione del campione può essere aumentata diminuendo l'ingrandimento per studiare domande che richiedono meno risoluzione ottica, come la tempistica tra le divisioni sinciziali33 o la durata della gastrulazione34. Allo stesso modo, un obiettivo 20x consente di immaginare due embrioni all'interno di un piano di imaging. I metodi di questo protocollo forniscono una piattaforma dinamica per porre domande biologiche utilizzando lo sviluppo embrionale come sistema modello per l'analisi quantitativa.
Ci sono 3 passaggi critici in questo protocollo. Dopo la dechorionation nella candeggina al 50% è imperativo che gli embrioni siano risciacquati e asciugati vigorosamente 5 volte (2.3.4). Questo passaggio rimuove tutti i piccoli pezzi rimanenti di chorion. Il chorion avanzi ostacolerà il campo visivo quando si imaging l'embrione. Quando si montano gli embrioni sul coperchio del vetro (3.5), è importante premere gli embrioni sulla colla con pressione uniforme. Questo posizionerà gli embrioni sullo stesso piano z. Quando si apre l'ago di microiniezione, è importante ritrarre immediatamente lo stantuffo per regolare la portata dell'ago o si perderà tutto l'iniettore.
Il nostro studio è stato limitato da due fattori. Il primo fattore non era avere un processo di segmentazione automatizzato. Tuttavia, abbiamo progettato uno script di segmentazione manuale utilizzando MATLAB; con un marcatore del mandrino geneticamente codificato questo processo potrebbe essere automatizzato. In futuro vorremmo produrre CNN-RFP21, Rtln1-GFP e CNN-RFP; Linee transgeniche ReepB-GFP per consentire la segmentazione automatica del mandrino. Per ulteriori informazioni sulla nostra pipeline di script e analisi MATLAB, fare riferimento ai materiali supplementari di Diaz etal. In secondo luogo, siamo stati limitati anche dal nostro intervallo di acquisizione di 35 s, che ci ha permesso di immagine di 6 embrioni solo contemporaneamente. Un intervallo di acquisizione più lungo ci permetterebbe di immagine di più embrioni contemporaneamente. Sebbene la produttività della somministrazione di farmaci possa essere incrementata sostituendo la microiniezione con una fase di permeazione, abbiamo riscontrato che ciò non era necessario poiché la nostra dimensione del campione era già limitata dall'intervallo di acquisizione.
Mentre questo protocollo è stato utilizzato per immaginare lo sviluppo embrionale di Drosophila, l'approccio generale è adattabile per studiare lo sviluppo embrionale in altri sistemi modello multicellulari, come C. elegans,Sea Urchins e Xenopus. Gli embrioni sono estremamente utili per l'analisi quantitativa poiché sono facilmente sincronizzati tramite raccolta o fecondazione. Inoltre, gli embrioni non si allontanano o nuotano lontano da un campo visivo, consentendo l'uso di un semplice software in grado di acquisizione multipunto per produrre più video time lapse per l'analisi quantitativa. Sebbene abbiamo utilizzato un analizzatore ad alto contenuto nel nostro studio, qualsiasi sistema di microscopio invertito in grado di acquisizione multipunto può essere abbinato ai metodi di cui al presente documento.
Risultati simili possono essere ottenuti utilizzando un microscopio confocale invertito in grado di acquisizione multipunto; tuttavia, i vantaggi di un analizzatore ad alto contenuto emergono man mano che si aumentano le dimensioni del campione per studiare domande che richiedono meno risoluzione nel tempo. Un ovvio vantaggio nell'utilizzo di un analizzatore ad alto contenuto è la possibilità di immagini di 4 diapositive separate contemporaneamente rispetto a 1 diapositiva su sistemi tradizionali. Con un set completo di 4 diapositive e 40 embrioni su ogni diapositiva, 160 embrioni possono essere imageati in diverse ore, purché l'intervallo di acquisizione sia di almeno 15 minuti tra i fotogrammi. Un altro importante vantaggio dell'utilizzo di un analizzatore ad alto contenuto è che i campioni sono completamente sigillati da qualsiasi fonte di luce esterna, necessaria per misurazioni basate sull'intensità della fluorescenza. Infine, l'analizzatore ad alto contenuto utilizzato nel nostro studio ha una fotocamera CMOS da 5,5 megapixel che fornisce un generoso campo visivo di 221,87 μm con ingrandimento 60x. Questo campo visivo più ampio ci ha permesso di immagine di mezzo embrione per punto di acquisizione.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
UD, WFM e BR sono supportati dal Center for Cellular Construction, un Centro scientifico e tecnologico della National Science Foundation (NSF), in base alla licenza di sovvenzione DBI-1548297. BR è anche supportato attraverso un premio NSF CAREER, 1553695.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x 35mm Micro Dish | VWR | Cat #: 10799-192 | N/A |
| 100% grape juice concentrate | Welch's, 100% Concentrate Grape Juice | N/A | Purchase at Grocery Store |
| 250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth | VWR | Cat #: 10536-914 | N/A |
| 3" Non-Metallic Sieve No. 140 | Gilson Company | SV-165 #140 | N/A |
| 4 Slide Imaging Tray | Grace Biolabs | SKU: 400104 | N/A |
| ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy | Fisher Scientific | Cat #: AC411255000 | N/A |
| Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof | Fisher Scientific | Cat# : AC615095000 | N/A |
| Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) | Fisher Scientific | Cat#: AC126961000 | N/A |
| Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass | Fisher Scientific | Cat #: 50-143-782 | N/A |
| Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick | Grace Biolabs | SKU: 664273 | N/A |
| DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials | Fisher Scientific | Cat #: 03-341-71A | N/A |
| Embryo Collection Cage-Mini | Genesee Scientific | Cat #: 59-105 | N/A |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | Product Code: 10289651 | N/A |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge | Fisher Scientific | Cat #: 05-527-90 | N/A |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | Cat #: 14-432-22 | N/A |
| Fleischmann's, Active Dry Yeast | Fleischmann's | N/A | Purchase at Grocery Store |
| Grape Plates | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-133 | N/A |
| Halocarbon 700 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-131 | N/A |
| Heptane Glue | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 | VWR | Cat #: 55411-050 | N/A |
| Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll | Fisher Scientific | Cat #: 50-998-944 | N/A |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy | Fisher Scientific | Cat #: NC0879005 | N/A |
| Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm | Millipore Sigma | SKU: 1077351000 | N/A |
| Stainless Steel Spoon/Spatula | VWR | Cat #: 470149-044 | N/A |
| W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents | Fisher Scientific | Cat #: 23-116582 | N/A |
| Yeast Paste | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| EQUIPMENT | |||
| Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts. |
| Autoclave | N/A | N/A | Any autoclave will do fine. |
| Drummond Nanoject II Microinjector. | Drummond Scientific | N/A | This is a mineral oil based injection system. |
| GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
| Refrigerator (4C°) | N/A | N/A | Fly media and yeast paste must be stored at (4C°). |
| Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |
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