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Neuroscience

猫大型动物模型中人类胚胎干细胞来源的视网膜组织的视网膜下移植

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/61683
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1
1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

这里介绍的是一种将人多能干细胞（hPSC）衍生的视网膜组织移植到大型动物模型的视网膜下空间的手术技术。

Abstract

与光感受器丧失相关的视网膜退行性 （RD） 疾病，如年龄相关性黄斑变性 （AMD）、色素性视网膜炎 （RP） 和 Leber 先天性黑斑病 （LCA） 会导致进行性和使人衰弱的视力丧失。一旦光感受器丧失，对可以恢复视力的疗法的需求尚未得到满足。将人多能干细胞（hPSC）衍生的视网膜组织（类器官）移植到具有晚期RD的眼睛的视网膜下间隙，使视网膜组织薄片具有数千个健康的无突变光感受器，并且有可能通过一个批准的方案治疗与感光器变性相关的大多数/所有致盲疾病。将胎儿视网膜组织移植到动物模型和晚期RD患者的视网膜下间隙已经开发成功，但由于伦理问题和有限的组织供应，不能用作常规治疗。大眼遗传性视网膜变性（IRD）动物模型对于开发视力恢复疗法很有价值，利用先进的手术方法将视网膜细胞/组织移植到视网膜下空间。眼球大小和光感受器分布（例如，黄斑样区域中心 区域的存在）和IRD模型的可用性的相似性，密切概括了人类IRD，将有助于将有前途的疗法快速转化为临床。这里介绍的是一种将hPSC衍生的视网膜组织移植到大型动物模型的视网膜下空间的手术技术，允许在动物模型中评估这种有前途的方法。

Introduction

全世界有数百万人受到视网膜变性（RD）的影响，导致视力障碍或失明，与光敏光感受器（PRs）的丧失有关。年龄相关性黄斑变性（AMD）是由遗传风险因素和环境/生活方式因素共同导致失明的主要原因。此外，已发现超过200个基因和位点可导致遗传性RD（IRD）1。视网膜色素变性 （RP） 是最常见的 IRD，具有遗传异质性，据报道，大约 70 个基因中有 3,000 多个基因突变 2,3,4。导致儿童失明的Leber先天性黑痢病（LCA）也是遗传异质的5,6。基因增强疗法已经开发出来，并正在临床试验中，用于治疗少量IRDs3,7。然而，必须开发一种单独的疗法来治疗每种不同的遗传形式的IRD，从而只治疗一小部分患者。此外，基因增强依赖于可挽救的光感受器群体的存在，因此不适用于晚期变性。

因此，迫切需要开发治疗晚期RD和严重至终末失明的疗法。在过去的20年中，神经假体植入物已经在人类使用之前在大型动物模型中开发和测试，例如猫8,9,10,11,12,13,14。同样，在过去的20年中，已经开发了利用胚胎甚至成熟的哺乳动物视网膜移植视网膜的视网膜替代疗法15,16,17,18,19,20,21,22，甚至在RD患者中成功测试了23,24,25.这两种方法都利用了将新的传感器（在神经修复装置26,27的情况下为光伏硅光电二极管，在视网膜片植入的情况下，在视网膜片植入的情况下，将健康的无突变光感受器）引入具有退化PR的视网膜的想法。最近的研究调查了基于干细胞的方法的使用，例如移植人多能干细胞（hPSC）衍生的视网膜祖细胞28,29，hPSC光感受器30和hPSC-视网膜类器官31,32,33。视网膜类器官能够在培养皿中形成视网膜组织，并衍生出具有数千个无突变PR的感光器片，类似于发育中的人类胎儿视网膜中的感光层34,35,36,37,38,39,40.将hPSC来源的视网膜组织（类器官）移植到RD患者的视网膜下空间是新的和有前途的研究细胞治疗方法之一，许多团队正在研究31,32,41,42。与移植细胞悬液（年轻感光器或视网膜祖细胞）相比，移植的胎儿光感受器片在临床试验中被证明可以改善视力23,24。

这里介绍的方案详细描述了用于整个视网膜类器官（而不是类器官边缘33,41）的视网膜下递送的移植程序，作为引入带有PR的完整视网膜片的潜在更好方法，以增加移植物存活率并改善片状保存。尽管已经开发了引入一块扁平的人类视网膜和RPE贴片的程序43,44,45，但尚未研究较大的3D移植物的移植。干细胞来源的视网膜类器官为开发视力恢复技术提供了取之不尽的感光片来源，不受伦理限制，被认为是人类视网膜组织的极好来源，用于治疗晚期RD和终末失明46。开发用于精确视网膜下植入视网膜类器官的手术方法，同时对宿主视网膜壁龛（神经视网膜，视网膜色素上皮以及视网膜和脉络膜脉络膜脉管系统）的损伤最小，是将这种疗法推向临床应用的关键步骤之一31,32。猫、狗、猪和猴子等大型动物模型已被证明是研究手术递送方法以及证明植入组织片（视网膜色素上皮 （RPE） 细胞）的安全性和研究类器官使用的良好模型 41,44,45,47,48,49,50.大型动物眼睛具有与人类相似的地球大小以及相似的解剖结构，包括存在高感光器密度的区域，包括视锥细胞（中央区域），类似于人类黄斑6,51,52。

在这篇手稿中，描述了一种将hPSC衍生的视网膜组织（类器官）植入猫科动物大型动物模型（野生型和CrxRdy/+猫）的视网膜下空间的技术，该技术与有希望的疗效结果32,53一起为进一步发展这种研究性疗法以临床应用治疗RD疾病奠定了基础。

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Protocol

程序是根据视觉和眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视力研究中使用动物的声明进行的。它们还得到了密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用了来自密歇根州立大学饲养的猫群的野生型和 CrxRdy/+ 猫。将动物饲养在12小时：12小时明暗循环下，并喂食商业完整的猫饲料。

1. 植入前程序和手术设置

  1. 根据研究设计选择野生型或 CrxRdy/+ 猫。进行术前眼科检查，包括裂隙灯生物显微镜检查和间接眼科检查。排除任何与其基因型无关的眼底异常的动物。
  2. 在植入前一周，开始动物口服环孢素2mg / kg和泼尼松龙1mg / kg的免疫抑制方案，每天两次，以帮助防止移植排斥反应。
  3. 将4个月以上的动物禁食过夜（至少8小时）。向4个月以下的动物提供有限量的湿食物过夜，然后在手术前禁食2小时。
  4. 进行一般体格检查，包括胸部听诊（使用听诊器）。记录心脏和呼吸频率、温度、粘膜颜色和毛细血管再充盈时间。
  5. 在全身麻醉诱导前30-45分钟，用丁丙诺啡（0.02mg / kg）预用4个月大的动物和4个月以上的动物用丁丙诺啡（0.02mg / kg）联合乙酰丙嗪（0.02mg / kg）皮下或肌内。
  6. 将局部 1% 托吡卡胺眼用溶液和 10% 去氧肾上腺素眼用溶液涂抹在眼表至少两次以扩张瞳孔。如果瞳孔散大不良，则重复上述步骤。
  7. 在所有动物的头静脉中放置22G静脉导管：首先从头静脉上的2 x 3cm区域夹住头发;首先用70%乙醇擦洗皮肤，然后用洗必泰磨砂膏擦洗皮肤;放置导管并用医用胶带固定，并用肝素化盐水冲洗。在4个月以下的动物中，这可以在诱导麻醉后完成。
  8. 术前30-45分钟诱导全身麻醉：4个月以下的动物用面罩提供的异氟醚诱导，4个月以上的动物使用静脉注射丙泊酚（4-6mg / kg）诱导。
  9. 用适当大小的气管插管。用检查灯或喉镜观察喉部。将 0.1 mL 2% 利多卡因喷洒在喉部，等待几秒钟，然后插管。
  10. 通过贝恩系统用异氟醚（2%-3.5%）在氧气（300-600 mL/kg/min）中维持麻醉。
  11. 将动物放在背卧上，放在一个定位枕头上，上面铺有毛巾覆盖的热水毯。连接患者监护仪并监测心率和心电图 （ECG）、呼吸频率、血压、血氧饱和度和潮气末二氧化碳。在手术过程中定期监测体温。经过适当培训的人员负责麻醉的维护和监测。
  12. 在定位枕的帮助下定位动物，使当眼睛旋转到主要凝视位置时角膜表面是水平的。使用医用胶带将头部固定到位。
  13. 用毯子盖住动物以帮助保持体温。
  14. 用肝素化盐水冲洗静脉导管，并在手术期间开始静脉输注乳酸林格，剂量为 2-5 mL/kg/h。
  15. 使用 0.2% 聚维酮碘、无菌棉签涂抹器和棉球准备眼表、结膜囊和眼睑进行无菌手术。
  16. 放置手术显微镜，目镜也适当调整。放置显微镜的脚控器（聚焦、变焦和XY轴控制）和玻璃体切除机，以便外科医生可以操作它们。
  17. 准备无菌手术：所有人员必须佩戴手术磨砂膏、手术帽和口罩。确保外科医生和助手像常规无菌手术一样擦洗、穿防护服和戴手套。所有人员都应熟悉无菌技术。
  18. 一旦人员被擦洗，穿上长袍和手套，打开手术包，并摆放器械。将无菌操作旋钮放在显微镜调节旋钮上，以使外科医生或助手在不破坏无菌的情况下进行调整。以常规方式将动物披上以进行眼部手术。
  19. 按照制造商的双端口玻璃体切除术说明准备玻璃体切除机。
    1. 将玻璃体切除隐形眼镜和两个端口 23 G 玻璃体切除术放在助理的桌子上。连接湿场烧灼器。连接并灌注输液管和 23 G 玻璃体切除术手机。
    2. 将玻璃体切除器械和液体管线放在无菌窗帘上，并使用毛巾夹将它们保持在适当的位置。将玻璃体切除机设置为比例真空模式，每分钟 1,500 至 2,500 次切割 （cpm），最大真空度为 500 mmHg。这是通过按下玻璃体切除机前面板上的箭头按钮（向上或向下）来完成的。

2.视网膜下植入类器官的制备（图1）

  1. 如前所述31提取视网膜类器官，如果需要，如先前报道的54所示，在37°C下运输过夜。
  2. 用消毒剂擦拭接收实验室组织培养室的表面，并保持与眼科手术室相同的高水平无菌技术，以避免细菌或真菌污染，并带入手术室以避免手术部位感染。
  3. 在分配给眼部手术类器官制备的组织培养室内穿上手术鞋套、一次性实验室外套、帽子、外科口罩、袖子和手术磨砂膏。
  4. 在组织培养箱（37°C，5%CO2）中用20ng / mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和20ng / mL脑源性神经营养因子（BDNF）预平衡神经培养基1小时。使用大约四分之一体积的调节培养基（来自隔夜运输）和四分之三体积的新鲜培养基31,54，将类器官置于超低粘附板中的培养基中。保持24-48小时。
  5. 在麻醉第一只动物之前，在组织培养箱（37°C，5%CO 2）中用神经培养基（如步骤2.4中制备）制备并平衡几个新鲜的60mm板至少1小时。请注意，这些板用于转移每个单独手术的类器官，假设pH条件和CO2 饱和度将在培养基中保持至少20分钟，足以将板移动到手术室并将类器官加载到套管中。
  6. 对于每个移植病例，使用带有预饱和神经培养基的新鲜60mm板，同时将剩余板保持在37°C的组织培养箱中。
  7. 使用手动单通道移液器（20–200 μL）和具有宽（~0.7 mm）开口的200 μL无菌过滤器尖端移液，将6-9个类器官转移到一个60 mm培养皿（带有再饱和培养基）中。这些吸头可以提前准备，也可以在手术过程中用一把无菌剪刀剪掉~3-4毫米的吸头（在组织培养罩中完成以避免污染）。将 60 mm 培养皿放入 100 mm 组织培养皿中（以避免在房间间运输过程中受到污染），并快速运送到手术室。
  8. 将带有类器官的板放在由无菌窗帘覆盖的37°C电加热垫上。
  9. 在制备类器官之前，请换上一副新的无菌手套。
  10. 在无菌平衡盐溶液（BSS）（可选）中冲洗类器官，然后装入进样器，进样器由薄壁硼硅酸盐玻璃插管（外径，外径1.52毫米;内径，内径1.12毫米）组成，抛光钝端通过无菌塑料管连接到预填充无菌BSS的无菌500μL汉密尔顿注射器上。
  11. 当他们准备注射类器官时，以无菌方式将套管传递给手术团队。
  12. 将整个过程（从从组织培养基中取出类器官到加载套管）的长度保持在20分钟或更短。
  13. 如果植入类器官有延迟，请将它们放回组织培养箱中，以避免培养皿内 pH/CO2 饱和度发生变化。
  14. 将未使用的类器官在同一组织培养箱中保留 1 周，并监测是否有任何污染证据。

3. 视网膜下类器官植入

  1. 用史蒂文斯肌腱切开剪刀进行0.5-1厘米的侧眦切开术。放置适当大小的Barraquer眼睑窥器以保持眼睑张开。确保手术助理在手术期间定期用BSS冲洗角膜。
  2. 在紧邻视角膜缘的结膜中放置 2 条 6-0 丝缝合线的 4 点钟和 8 点钟位置，以保持眼睛处于主要凝视状态并缩回第三眼睑。使用0.5个Castroviejo角膜绑钳和一个小蚊子止血器轻轻抓住角膜缘旁边的延髓结膜。将缝合线留长，并用小蚊子止血器夹住末端以帮助操作它们。
    注意：将缝合线放在第三眼睑下更困难;一定要把它放在紧挨着缘的地方。
  3. 在12点钟位置放置另一条缝合线，部分穿过视角膜缘的厚度，注意不要穿透眼睛。松散地打结这条缝合线并缩短末端。这提供了坚固的锚缝合线，在手术过程中用作旋转眼睛的“手柄”，以允许外科医生在手术的不同阶段进入全球的不同部分。
    注意：步骤 3.2 和 3.3 可以反转。留缝线放置的顺序是外科医生的偏好。
  4. 反映10-2点钟之间的延髓结膜（周边）。使用肌腱切开剪刀，从角膜缘切开2-3毫米的结膜。破坏它并清除榫头的囊，以暴露 2 点钟和 10 点钟玻璃体切除术端口部位的巩膜，根据动物的年龄，这些端口将放置在距离角膜缘约 3-5 毫米处。使用手术纤维素矛止血和清除任何血液。
  5. 使用卡尺确定结膜和榫囊反射后的硬化切开部位。选择硬化切开部位（在 2 点钟和 10 点钟位置，旨在通过扁平部），以避免猫可能突出的主要巩膜血管。在计划的巩膜切开部位使用湿场烧蚀以减少巩膜出血，计划在器械端口（右手外科医生的 10 点钟位置）处放置 ~3 mm 区域，因为这将在玻璃体切除术后扩大以允许引入植入套管。
  6. 在放置玻璃体切除口之前，预先放置十字模式缝合线（6-0 或 7-0 聚乳糖缝合线），而不在建议的菌核切除术部位打结。
    注意：这有助于在手术结束时快速闭合菌核切除术。计划器械端口的缝合线需要有更长的巩膜咬合，因为这将是一个长切口。
  7. 缝合线放置后，请助手通过绑扎或使用Bishop-Harmon镊子握住12点钟位置的缝合线来帮助定位地球仪。让外科医生也稳定眼球，使用 0.12 毫米的 Castroviejo 镊子将组织固定在硬化切开部位旁边。
    1. 使用套管器通过巩膜在 2 点钟和 10 点钟位置引入 23 G 玻璃体切除术端口，朝向视神经成一定角度，以避免接触晶状体。
    2. 使用绑钳轻轻推动灌液口，检查冲洗口是否在玻璃体中，以便在玻璃体中可以看到尖端。确认正确定位后，将灌溉管线连接到端口，并使用薄的粘性绷带将其固定到位。通过按下玻璃体切除机前面板上的箭头按钮（向上或向下），将BSS缓冲液的玻璃体切除术输注最初设置为30-35 mmHg。
  8. 让助手将Machemer放大冲洗玻璃体切除术镜片放在角膜上，以便在下一阶段可视化眼睛的后段。将冲洗玻璃体切除术晶状体连接到滴注装置上，提供恒定的液体供应以将晶状体耦合到角膜。
    注意：也可以使用其他形式的接触性玻璃体切除术镜片。调暗或关闭房间灯，以帮助通过手术显微镜进行可视化。
  9. 将 23 G 玻璃体切除术探头/切割器（2,500 cpm）插入器械端口（与外科医生惯用手相邻，即右手外科医生的 10 点钟位置）并进行部分核心玻璃体切除术。
    1. 然后，通过将玻璃体脸与视网膜分离，从将接受移植的区域的视网膜表面完全去除玻璃体（这对手术的成功很重要）。
    2. 将玻璃体切除探头放在视神经头上，端口背对视网膜表面，并施加更高的真空以开始玻璃体面部脱离。
  10. 准备曲安奈德晶体供眼内使用。如果曲安奈德混悬液不是专门用于玻璃体内使用，请清洗晶体，然后在BSS中重新悬浮。
    1. 最初，借助带有PES膜（连接到1mL注射器）的无菌0.22μm孔注射器过滤器过滤悬浮液以捕获晶体。
    2. 然后通过在1mL注射器中吸出BSS并通过过滤器冲洗来洗涤捕获的曲安奈德晶体（晶体仍被捕获在过滤器中）。这样可以去除溶液中的防腐剂。重复洗涤3次，然后将晶体重新悬浮在1 mL BSS中。
  11. 通过仪器端口引入固定曲安奈德的注射器的针头。注意不要触摸镜头，方法是通过瞳孔观察针尖，同时通过仪器端口引入针头。注入 0.25 至 0.5 mL 晶体悬浮液。然后将玻璃体切除探头插入器械端口，并将其推进到靠近视神经头的位置，使端口远离视网膜表面，并使用高真空帮助将玻璃体面部与视网膜分离。
    注意：曲安奈德晶体粘附并因此突出显示剩余的玻璃体。小心地去除计划类器官植入部位上方和旁边的任何玻璃体（例如，靠近中央区域的锥体 中央 底）。
  12. 使用视网膜下注射器在所需的植入部位创建一个小的局灶性视网膜脱离泡，例如，23 G 视网膜下注射器，将可伸缩的 41 G 套管连接到装有无菌 BSS 的无菌 250 μL 气密鲁尔锁注射器上。
    1. 在形成视网膜下水泡之前，将输注压力降低到 10 mmHg 以促进水泡形成。
    2. 将注射器插入仪器端口并将其推进到视网膜表面。挤出套管尖端并将其轻轻按压在视网膜表面。要求助手轻轻快速推动注射器柱塞以启动视网膜脱离，从而降低注射压力以允许视网膜脱离缓慢增加，直到达到所需的尺寸（使用大约 100 至 200 μL BSS）。
  13. 如果创建的视网膜切开术位于合适的位置，这避免在植入部位和视神经头之间切割视网膜，以防止从植入部位衍生的神经纤维层的切片并避免主要的视网膜血管（这也由研究设计决定，在我们的例子中选择了中央视网膜）， 然后，使用注射器的41 G套管将其稍微放大，旨在促进视网膜剪刀的引入。
  14. 从眼睛上取下注射器并取下 10 点钟的巩膜端口。使用面向视神经的 2.85 毫米直缝刀/角膜刀扩大该部位的硬化切开术，以避免接触晶状体。将输注压力保持在 10–15 mmHg。
  15. 使用带挤压手柄的玻璃体视网膜垂直80°剪刀延长视网膜切开术，避免切割视网膜血管以防止视网膜出血，并确保将视网膜边缘的视网膜从视神经头切开，以避免切断从移植区域视网膜到视神经的神经纤维。视网膜切开术应具有足够的宽度以接收类器官。
  16. 将含有类器官的预加载玻璃毛细管（见步骤2.10）插入扩大的硬化切开术，并在直接可视化下将其推进到视网膜切开部位。
    1. 使用玻璃毛细管的尖端稍微打开视网膜切开术，使开口进入视网膜下泡。
    2. 让助手慢慢按下注射器的柱塞，同时通过显微镜观察，将类器官注射到视网膜下泡中。BSS 应先于类器官，并将视网膜切开术冲洗开开。
    3. 如果类器官位于视网膜切开术的边缘，则用玻璃毛细管的尖端轻轻推动气泡内的类器官。
  17. 在视网膜切开处保持玻璃毛细管几秒钟，以尝试关闭视网膜切开术并防止类器官逃逸到玻璃体中。
  18. 非常缓慢地从眼睛中去除玻璃毛细血管，避免任何突然从眼睛释放的液体，以避免眼睛内的液体运动可能会将类器官从视网膜下泡中排出。
  19. 缓慢增加输注压力至20-30 mmHg，以帮助防止眼内出血，注意输液不要直接冲洗到泡上。这是通过按下玻璃体切除机前面板上的向上箭头按钮来完成的。
  20. 使用预先放置的十字图案缝合线（6-0或7-0多乳糖）关闭硬化切开术。根据需要添加额外的简单中断缝合线以密封硬膜切开术。
  21. 请助手移除输液口，让外科医生快速绑好预先放置的缝合线，以密封硬膜切开术并防止眼压下降。
  22. 使用6-0或7-0多乳糖以简单的连续模式关闭结膜切口（围切开术）。
  23. 对眼底进行成像（例如，使用 RetCam II 摄像机、Clarity 或类似设备）并记录类器官在视网膜下间隙内的即时位置。
  24. 成像后，在棉尖涂抹器和棉球的帮助下，使用0.2%聚维酮碘溶液重新准备眼表。取下三条保持缝合线和眼睑窥器。
  25. 用6-0多乳糖缝合线关闭外眦切开术。放置一条埋入的缝合线，然后放置一条由 8 条皮肤缝合线组成的数字以重塑外眦，然后使用简单的中断皮肤缝合线闭合伤口的其余部分。
  26. 手术完成后，结膜下注射类固醇和抗生素组合（2 mg 醋酸甲泼尼龙、0.1 mg 地塞米松和 1 mg 庆大霉素）。将眼科润滑剂（人工泪液）放在角膜上。
  27. 从麻醉中恢复动物，并在恢复期间密切监测任何需要额外治疗的疼痛迹象，例如明显的眼睑痉挛、严重不愿纵、嗜睡或食欲下降以及呼吸和心率加快。根据需要提供术后镇痛，并密切监测是否有任何不适。
    注意：只有经过适当培训的人员才能负责在手术前、手术中和手术后麻醉和监测猫科动物患者。遵循当地动物伦理委员会关于术后护理的建议。

4. 植入后手术、术后治疗和评估

  1. 继续使用口服免疫抑制药物（1 mg/kg 泼尼松龙和 2 mg/kg 环孢素口服，每日两次）进行治疗，以帮助控制类器官的炎症和排斥反应。提供全身性抗生素覆盖（例如，口服多西环素 5 mg/kg，每日两次 - 选择这种抗生素是因为免疫抑制动物存在机会性支原体感染的风险）。
  2. 定期进行眼科检查，以监测炎症或不良事件的发展。监测视网膜泡是否变平，尽管将类器官注射到视网膜下间隙需要进行大的视网膜切开术，但这种情况发生在手术后的最初几天。在每次检查时记录眼底图像，以记录移植类器官的位置和外观。
  3. 在监测期间和实验终止之前，通过共聚焦扫描激光检眼镜检查（cSLO）和光谱域 - 光学相干断层扫描（SD-OCT）5,31对全身麻醉下的动物进行成像。
  4. 使用AVMA批准的方法在实验结束时对动物实施人道安乐死，例如，静脉内施用85mg / kg戊巴比妥。镇静后，放置静脉导管给予戊巴比妥以尽量减少压力。通过停止心跳确认死亡，并在胸部切开一个切口以形成气胸。
  5. 通过标准的经结膜方法去除眼睛，并根据需要进行修复。对于免疫组织化学 （IHC），将 0.3 mL 固定剂溶液通过 3 个狭缝（距角膜缘 ~3-4 mm）通过扁平部的 3 条缝隙注入后段后，立即将眼睛浸入 4% 多聚甲醛溶液中。
  6. 在4°C下固定3.5小时后解剖眼罩。 去除残留的玻璃体，确保保持视网膜和类器官完好无损。在4°C下放回固定剂中再放置30分钟，然后在PBS中冲洗眼罩3次，每次10分钟。将眼罩转移到15%蔗糖中2小时，然后转移到30%蔗糖中2小时。
  7. 用PBS冲洗眼罩两次，并嵌入OCT培养基（最佳切割温度化合物）中并快速冷冻，然后储存在-80°C直至切片用于组织学和免疫化学。
  8. 根据研究方案和目标选择IHC抗体。

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Representative Results

该程序能够在大型眼动物模型的视网膜下空间成功且可重复地植入hPSC衍生的视网膜类器官（此处使用2个示例进行演示：具有健康光感受器（PR）的野生型猫和具有退化PR和视网膜的 CrxRdy/ + 猫）。使用 图1 所示的步骤制备hPSC衍生的视网膜类器官并将其加载到注射装置的硼硅酸盐玻璃套管中，以使类器官不被损坏。这可以通过类器官上样（步骤2.10）和手术期间（步骤3.16）（图2A，B）以及手术结束时的眼底成像（步骤3.23， 图2C）的直接可视化来确认。使用该技术的视网膜下空间中类器官的存在在术后通过眼科检查和眼底成像（图3A）确认，后者记录了类器官的位置和外观。在处理用于冷冻组织学和免疫组织化学的球体时，了解移植的位置非常重要，并大大减少了工作量，因为以12-14μm（冷冻切片的厚度）切割大眼睛需要时间。在安乐死之前，还进行共聚焦扫描激光检眼镜检查（cSLO）和光谱域-光学相干断层扫描（SD-OCT）成像以评估类器官在视网膜下空间中的位置（图3A-D）。这些技术证明了视网膜类器官在受体眼睛的视网膜下空间（神经视网膜和RPE之间）的持久性（图3E）。安乐死后（按照AVMA建议人道地进行），常规进行组织学和免疫组织化学（IHC）（详见先前发表的论文31）。组织学和IHC证明了当动物免疫抑制时，异源移植物（hPSC来源的视网膜类器官）在大眼睛的视网膜下空间中存活（如前所述31），见 图4。

Figure 1
图 1：植入前类器官制备步骤示意图。
请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2：类器官的手术视网膜下植入。 （A）通过玻璃套管直接可视化类器官进入视网膜下空间而不会损坏，（B）视网膜下泡中类器官的直接可视化，（C）手术后立即植入视网膜下器官的广角眼底彩色图像。起泡边缘由黑色箭头表示，视网膜切开部位由黑色星星表示。
请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图 3： 在 CrxRdy/+ 猫植入 3 个月后视网膜下植入类器官的术后评估。（A）视网膜下植入类器官的眼底彩色图像，（B）视网膜下植入类器官的cSLO眼底图像，（C）包含类器官的区域的3D体积扫描重建，（D）含有视网膜下类器官的区域的cSLO图像，（E）视网膜下植入类器官的SD-OCT高分辨率横截面图像。视网膜切开部位由黑色星星表示。
请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4：移植后 3 个月， CrxRdy/+ 猫视网膜下空间中的人视网膜类器官衍生的感光器片（PR 标记 RCVRN）。 *猫内核层（INL）中的突触体（hSYP=突触素）。
请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

将hPSC衍生的视网膜组织（视网膜类器官）植入视网膜下间隙是一种有前途的实验方法，用于恢复由PR细胞死亡（严重或终末失明）引起的晚期视网膜退行性疾病的视力。所提出的方法建立在早期开发和成功测试的实验疗法的基础上，该疗法基于一块人胎儿视网膜组织的视网膜下移植23,24,25。它介绍了使用源自 hPSC 的替代、可补充和伦理上可接受的视网膜组织来源。在大型眼科动物模型51,55中证明治疗的手术可行性和眼安全性是推进这种有前途的临床应用方法所必需的。本手稿提供了在具有正常和退化视网膜的大型动物模型中将hPSC-3D视网膜组织（视网膜类器官）植入视网膜下的详细方法（LCA的CrxRdy/+猫模型）。尽管已经开发了引入一块扁平的人类视网膜和RPE贴片的程序43,44,45，但尚未研究更大的3D移植物（在高级RD条件下恢复视力所需的）。这里详细描述的方案是用于整个视网膜下类器官（而不是类器官边缘33,41）的移植程序，也携带一些 RPE，作为引入带有 PR 的完整视网膜片的潜在更好方法，以增加移植物存活率并改善片状保存。请注意，该协议的不同部分已建立。例如，玻璃体视网膜外科医生在视网膜复位手术中广泛使用玻璃体切除术56,57,58,59,60。视网膜下注射正变得越来越常用，例如，在基因增强疗法3,7,61,62,63,64中。关于创建足够的视网膜切开术和将相对较大的类器官注射到视网膜下间隙的描述有限。

关键步骤包括仔细定位和实施硬膜切开术以避免晶状体，从移植部位的视网膜表面完全去除玻璃体皮层，控制视网膜下泡的形成，产生最佳尺寸的视网膜切开术以适应移植套管的宽度，在不同步骤中保持定义的输注压力， 和套管退出。选择合适的移植套管，优化内径和外径（ID和OD）和长度，控制眼内出血，从类器官到手术室和器械的整个过程的无菌性，以及手术持续时间（30-45分钟/动物），以确保最佳效果。作者发现，由于猫玻璃体的厚度/粘度，23 G 玻璃体切除术获得最佳结果，用带有 41 G 套管的注射器产生一个气泡，然后使用 80° 角视网膜剪刀在泡边缘延伸视网膜切开术。其他重要因素包括使用2.85毫米角膜刀延长硬体切开术以适合硼硅酸盐玻璃插管（外径1.52毫米;内径，内径1.12毫米;长度10.16厘米），并允许在轴向长度约为20.5毫米（20.91毫米±0.53毫米）55的大眼中植入较大的类器官。玻璃毛细管的使用是目前最适合装载和输送下降大小的类器官，而不会在植入过程中损坏它们。结果发现，将输注压力从玻璃体切除术期间的 20-30 mmHg 降低到泡形成步骤中的 10 mmHg 是产生视网膜脱离的最佳选择，这是为视网膜类器官创造空间所必需的。此外，hPSC-3D视网膜组织（类器官）在长距离运输过程中的活力以及选择优化的免疫抑制方案以维持异种人类移植物至关重要，最近报道了31,54。

作者发现，由于猫挂毯的高反射性，不需要内窥照明来进行手术。在速断期物种（例如，猪、非人灵长类动物）中进行移植需要包括内照射在内的 3 端口玻璃体切除术。在常规视网膜脱离手术中没有进行填塞（例如，用全氟化碳，然后使用硅油），因为对泡的压力可能会将类器官挤出到玻璃体中。未来的发展可能包括使用目前正在研究的用于密封视网膜孔的材料。这可用于防止类器官植入玻璃体的任何植入后损失。此外，Triescence与Kenalog-40相似，但含有不含防腐剂的曲安奈德，可用作可视化玻璃体的替代方法。

与大眼睛（成年动物）相比，年轻动物的眼球较小（例如，1-2个月）带来了更多的手术挑战。然而，使用这里描述的方法，可以输送视网膜下移植物。在 CrxRdy/+ LCA模型中，发现较大的视网膜泡并不总是重新附着。将泡泡保持在允许注射视网膜类器官所需的最小尺寸，减少了这种并发症。在RD视网膜中更早地移植（当神经视网膜明显变薄时PR完全丧失之前）是另一个指导方针，与早期使用人类胎儿视网膜移植物的工作一致20。另一个注意事项 - 详细的技术不依赖于将视网膜片放置在正确的方向，因为整个视网膜类器官都是移植的。随着扁平hESC-视网膜片的发展，这将很重要。然而，这不是该协议的重点，该协议旨在提供完整的hESC-视网膜组织片并优化PR片的视网膜下保存。一旦该技术开发出来，它就可以在正常视网膜和RD视网膜中重现。

这种外科手术有许多潜在的并发症。只有那些精通玻璃体视网膜手术的人（例如，训练有素的兽医眼科医生或熟悉猫眼与人眼物种差异的玻璃体视网膜外科医生）才能进行手术。可能的并发症包括套管植入期间的晶状体触摸、巩膜切开术扩大期间的巩膜出血以及视网膜下或视网膜出血。其他并发症，例如宿主对异源人类器官移植物的免疫反应导致移植物随时间推移而破坏或眼内炎;使用口服免疫抑制剂和抗生素药物有助于防止这些情况的发生。同样重要的是要注意，在野生型和 CrxRdy/+ 猫中植入之间存在差异。当存在晚期视网膜变性时，视网膜泡往往比野生型更宽，在某些情况下，这可以防止手术后完全的视网膜重新附着。这里介绍的技术适用于在大型IRD动物模型的眼睛中植入类器官。一旦移植准备好翻译成诊所，就需要进一步完善。

根据作者在大眼模型中进行复杂玻璃体视网膜外科手术的经验，本手稿中介绍的技术应适用于其他大型动物模型（在速袹体物种中包括内照射），这些模型用于将玻璃体视网膜手术技术转化为临床43,44,45。

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Disclosures

Ratnesh K. Singh博士，Francois Binette博士和Igor O. Nasonkin博士是Lineage Cell Therapeutics，Inc.的员工。作者声明不存在利益冲突。

Acknowledgments

这项工作由NEI Fast-track SBIR拨款R44-EY027654-01A1和SBIR拨款3 R44 EY 027654 - 02 S1（I.O.N.，Lineage Cell Therapeutics; Petersen-Jones博士是联合PI）资助。作者要感谢Janice Querbin女士（MSU RATTS）对本研究中包含的动物的麻醉和一般护理的帮助，以及在手术设置和器械制备/灭菌方面的帮助。作者要感谢Paige Winkler博士在植入前一天接受类器官并将其放入培养基中的帮助，以及在植入当天的帮助。作者还感谢Randy Garchar先生（LCTX）勤奋地运输视网膜类器官，组装托运人，并在每次装运后下载温度和G应力记录。这项工作是在作者伊戈尔·纳松金（Igor Nasonkin）受雇于Biotime（现为Lineage）时完成的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore syringe filter with PES membrane Cameo NA can be found through various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula DORC 1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe Hamilton NA can be found through various suppliers
6-0 Silk suture Ethicon 707G
6-0/7-0 polyglactin suture Ethicon J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) Henry Schein Animal Health NA can be found through various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL Par Pharmaceutical NA can be found through various suppliers
cSLO + SD-OCT Heidelberg Engineering Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine Novartis NA can be found through various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium) Vetone NA can be found through various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL Cipla NA can be found through various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarbital solution) Vortech NA can be found through various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL Hospira NA can be found through various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing World Precision Instruments TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL Pfizer NA can be found through various suppliers
Microscope Zeiss NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) Sakura 4583
Olympic Vac-Pac Size 23 Natus NA can be found through various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution EMS 15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution Akorn NA can be found through various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL Akorn NA can be found through various suppliers
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) Zoetis NA can be found through various suppliers
RetCam II video fundus camera Clarity Medical Systems NA can be found through various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) Bristol -Myers Squibb Company NA can be found through various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution Akorn NA can be found through various suppliers
Vitrectomy 23G port Alcon Accurus systems
Vitrectomy machine Alcon Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle Frimen FT170206T

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