Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bir Kedi Büyük Hayvan Modelinde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retinal Dokunun Subretinal Transplantasyonu

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/61683
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1
1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Burada, insan pluripotent kök hücresi (hPSC) kaynaklı retinal dokunun büyük bir hayvan modelinin subretinal boşluğuna nakledilmesi için cerrahi bir teknik sunulmaktadır.

Abstract

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), retinitis pigmentosa (RP) ve Leber Konjenital Amaurosis (LCA) gibi fotoreseptör kaybı ile ilişkili retinal dejeneratif (RD) durumlar ilerleyici ve zayıflatıcı görme kaybına neden olur. Fotoreseptörler kaybolduktan sonra vizyonu geri kazanabilecek tedavilere karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) kaynaklı retina dokusunun (organoidler) gelişmiş RD'li bir gözün subretinal boşluğuna nakledilmesi, retinal doku tabakalarını binlerce sağlıklı mutasyonsuz fotoreseptörle birlikte getirir ve fotoreseptör dejenerasyonu ile ilişkili körleştirici hastalıkların çoğunu / tümünü onaylanmış bir protokolle tedavi etme potansiyeline sahiptir. Fetal retinal dokunun hayvan modellerinin ve ileri RD'li kişilerin subretinal boşluğuna transplantasyonu başarılı bir şekilde geliştirilmiştir, ancak etik kaygılar ve sınırlı doku arzı nedeniyle rutin bir tedavi olarak kullanılamamaktadır. Büyük göz kalıtsal retinal dejenerasyon (IRD) hayvan modelleri, retina hücrelerini / dokusunu subretinal boşluğa nakletmek için gelişmiş cerrahi yaklaşımları kullanan görme restorasyon terapileri geliştirmek için değerlidir. Dünya büyüklüğündeki benzerlikler ve fotoreseptör dağılımı (örneğin, makula benzeri bölge alanı centralis'in varlığı) ve insan IRD'sini yakından özetleyen IRD modellerinin mevcudiyeti, umut verici bir tedavinin kliniğe hızlı bir şekilde çevrilmesini kolaylaştıracaktır. Burada, hPSC kaynaklı retinal dokunun büyük bir hayvan modelinin subretinal boşluğuna nakledilmesinin cerrahi bir tekniği sunulmakta ve hayvan modellerinde bu umut verici yaklaşımın değerlendirilmesine izin verilmektedir.

Introduction

Dünya çapında milyonlarca insan, ışığı algılayan fotoreseptörlerin (PR'ler) kaybıyla ilişkili görme bozukluğu veya körlük ile ortaya çıkan retinal dejenerasyondan (RD) etkilenmektedir. Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), genetik risk faktörleri ile çevresel/yaşam tarzı faktörlerinin birleşiminden kaynaklanan körlüğün önemli bir nedenidir. Ek olarak, 200'den fazla gen ve lokusun kalıtsal RD'ye (IRD)1 neden olduğu bulunmuştur. En yaygın IRD olan Retinitis pigmentosa (RP), genetik olarak heterojendir ve yaklaşık 70 gende 3.000'den fazla genetik mutasyon bildirilmiştir 2,3,4. Çocukluk çağında körlüğe neden olan Leber Konjenital Amaurosis (LCA) da genetik olarak heterojendir 5,6. Gen büyütme tedavisi geliştirilmiştir ve az sayıda IRD'nin tedavisi için klinik çalışmalardadır 3,7. Bununla birlikte, IRD'nin her bir farklı genetik formunun tedavisi için ayrı bir terapi geliştirilmeli ve böylece sadece hastaların küçük bir alt kümesi tedavi edilmelidir. Ayrıca, gen güçlendirme, kurtarılabilir fotoreseptörlerin bir popülasyonunun varlığına dayanır ve bu nedenle ileri dejenerasyon için geçerli değildir.

Bu nedenle, ileri RD'leri ele alan ve tedavi eden ve terminal körlüğe kadar derin tedavilerin geliştirilmesi için acil ve henüz karşılanmamış bir klinik ihtiyaç vardır. Son 2 yılda nöroprotez implantlar, insan kullanımından önce kedi gibi büyük hayvan modellerinde geliştirilmiş ve test edilmiştir 8,9,10,11,12,13,14. Benzer şekilde, son 20 yılda, subretinanal olarak aşılanmış embriyonik veya hatta olgun memeli retina tabakalarını kullanan retina replasman tedavileri 15,16,17,18,19,20,21,22 geliştirilmiş ve hatta RD hastalarında başarıyla test edilmiştir 23,24,25. Her iki yaklaşım da, dejenere PR'lerle retinaya yeni sensörler (nöroprotez cihazları26,27 durumunda fotovoltaik silikon fotodiyotlar ve retina tabakası implantasyonu durumunda tabakalar halinde düzenlenmiş sağlıklı mutasyonsuz fotoreseptörler) ekleme fikrini kullanmaktadır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kaynaklı retinal progenitörlerin28,29, hPSC-fotoreseptörlerin 30 ve hPSC-retinal organoidlerin31,32,33 transplantasyonu gibi kök hücre temelli yaklaşımların kullanımını araştırmıştır. Retinal organoidler, bir çanakta retina dokusunun oluşumunu ve gelişmekte olan insan fetal retinasındaki fotoreseptör tabakasına benzeyen binlerce mutasyonsuz PR ile fotoreseptör tabakalarının türetilmesini sağlar 34,35,36,37,38,39,40 . RD koşulları olan hastaların subretinal boşluğuna hPSC kaynaklı retinal dokunun (organoidler) nakledilmesi, 31,32,41,42 numaralı ekip tarafından takip edilen yeni ve umut verici araştırmacı hücre tedavisi yaklaşımlarından biridir. Hücre süspansiyonunun transplantasyonu ile karşılaştırıldığında (genç fotoreseptörlerin veya retinal progenitörlerin), nakledilen fetal fotoreseptör tabakalarının klinik çalışmalarda görme iyileşmesi sağladığı gösterilmiştir23,24.

Burada sunulan protokol, ayrıntılı olarak, tüm retinal organoidlerin (organoid jantlar33,41 yerine) subretinal verilmesi için bir transplantasyon prosedürünü, sağlam retinal tabakaları PR'lerle tanıtmanın, greft sağkalımını arttırmanın ve tabaka korumasını iyileştirmenin potansiyel olarak daha iyi bir yolu olarak tanımlamaktadır. Düz bir insan retinası parçası ve ayrıca RPE yamaları için prosedürler geliştirilmiş olmasına rağmen43,44,45, daha büyük 3D greftlerin nakli araştırılmamıştır. Kök hücre kaynaklı retinal organoidler, görme restorasyon teknolojilerinin geliştirilmesi için tükenmez bir fotoreseptör tabaka kaynağı sağlar, etik kısıtlamadan arındırılmıştır ve ileri RD ve terminal körlüğün tedavisine odaklanan tedaviler için mükemmel bir insan retina dokusu kaynağı olarak kabul edilir46. Retinal organoidlerin retinal nişine (nöral retina, retina pigment epiteli ve retinal ve koroidal vaskülatür) minimum yaralanma ile hassas subretinal implantasyonu için cerrahi yöntemlerin geliştirilmesi, bu tedavinin klinik uygulamalara doğru ilerletilmesinde kritik adımlardan biridir31,32. Kediler, köpekler, domuzlar ve maymunlar gibi büyük hayvan modellerinin, cerrahi uygulama yöntemlerini araştırmanın yanı sıra implante edilmiş doku tabakalarının (retinal pigment epitel (RPE) hücreleri) güvenliğini göstermek ve organoidlerin kullanımını araştırmak için iyi modeller olduğu kanıtlanmıştır 41,44,45,47,48,49,50. Büyük hayvan gözü, insana benzer bir küre boyutuna ve insan makulasına benzeyen koniler (area centralis) dahil olmak üzere yüksek fotoreseptör yoğunluğuna sahip bir bölgenin varlığı da dahil olmak üzere benzer anatomiye sahiptir6,51,52.

Bu makalede, hPSC kaynaklı retinal dokunun (organoidler) kedi büyük hayvan modellerinin (hem vahşi tip hem de CrxRdy / + kedileri) subretinal boşluğuna implantasyonu için bir teknik tanımlanmıştır ve umut verici etkinlik sonuçları ile birlikte32,53, RD koşullarını tedavi etmek için klinik uygulamalara yönelik bu tür araştırma terapisinin daha da geliştirilmesi için bir temel oluşturmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedürler, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı bildirisine uygun olarak yürütülmüştür. Ayrıca Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından da onaylandılar. Bu çalışmada Michigan State Üniversitesi'nde tutulan bir kedi kolonisinden vahşi tip ve CrxRdy / + kedileri kullanılmıştır. Hayvanlar 12 saat: 12 saat açık-karanlık döngüleri altında barındırıldı ve ticari bir tam kedi diyeti ile beslendi.

1. Preimplantasyon prosedürleri ve cerrahi kurulum

  1. Etüt tasarımına bağlı olarak vahşi tip veya CrxRdy/+ kedilerini seçin. Yarık lamba biyomikroskobu ve dolaylı oftalmoskopi dahil olmak üzere cerrahi öncesi oftalmik muayene yapın. Genotipleriyle ilgili olmayan fundus anormallikleri olan hayvanları hariç tutun.
  2. İmplantasyondan bir hafta önce, nakil reddini önlemeye yardımcı olmak için hayvanlara günde iki kez oral siklosporin 2 mg / kg ve prednizolon 1 mg / kg'lık immünosüpresif bir protokol uygulayın.
  3. 4 aylıktan büyük hayvanları gece boyunca (en az 8 saat) hızlılaştırın. 4 aylıktan küçük hayvanlara bir gecede sınırlı miktarda ıslak yiyecek sağlayın ve ardından ameliyattan önce 2 saat boyunca oruç tutun.
  4. Göğüs oskültasyonu da dahil olmak üzere genel bir fizik muayene yapın (stetoskop kullanarak). Kalp ve solunum hızını, sıcaklığı, mukoza zarı rengini ve kılcal damar dolum süresini kaydedin.
  5. Genel anestezi indüksiyonundan 30-45 dakika önce 4 aylıktan küçük hayvanlara buprenorfin (0.02 mg / kg) ile buprenorfin (0.02 mg / kg) ile kombine edilmiş asepromazin (0.02 mg / kg) ile kombine edilmiş buprenorfin (0.02 mg / kg) ile genel anestezi indüksiyonundan 30-45 dakika önce ön ilaç verin.
  6. Göz bebeklerini genişletmek için oküler yüzeye en az iki kez topikal % 1 tropikamid oftalmik çözelti ve% 10 fenilefrin oftalmik çözelti uygulayın. Öğrenciler iyi genişlememişse tekrarlayın.
  7. Tüm hayvanlarda sefalik ven içine 22 G intravenöz kateter yerleştirin: ilk önce sefalik ven üzerinde 2 x 3 cm'lik bir alandan saç klipsleyin; cildi önce% 70 etanol ve daha sonra bir klorheksidin ovma ile ovalayarak hazırlayın; Kateteri yerleştirin ve tıbbi bantla sabitleyin ve heparinize salin ile yıkayın. 4 ayın altındaki hayvanlarda, bu anestezi indüksiyonunu takiben yapılabilir.
  8. İlaç tedavisinden 30-45 dakika sonra genel anestezi indükleyin: 4 aylıktan küçük hayvanlar maske ile verilen izofluran ile indüklenir, 4 aylıktan büyükler intravenöz propofol (4-6 mg / kg) kullanılarak indüklenir.
  9. Uygun büyüklükte endotrakeal tüp ile entübat edin. Larinksi bir muayene ışığı veya laringoskop ile görselleştirin. Larinkse 0.1 mL lidokain% 2 püskürtün, birkaç saniye bekleyin ve sonra entübe edin.
  10. Bir Bain sistemi aracılığıyla oksijende (300-600 mL / kg / dak) izofluran (% 2-3.5 arasında) ile anestezi sağlayın.
  11. Hayvanı, üzerine havlularla kaplı ısıtılmış bir su battaniyesinin yerleştirildiği bir konumlandırma yastığına sırt yaslanmasına yerleştirin. Bir hasta monitörü takın ve kalp atış hızını ve elektrokardiyogramı (EKG), solunum hızını, kan basıncını, oksijen doygunluğunu ve son gelgit karbondioksitini izleyin. İşlem sırasında vücut ısısını düzenli olarak izleyin. Uygun şekilde eğitilmiş bir kişi, anestezinin korunmasından ve izlenmesinden sorumludur.
  12. Hayvanı, konumlandırma yastığının yardımıyla, göz birincil bakış pozisyonuna döndürüldüğünde kornea yüzeyi yatay olacak şekilde konumlandırın. Tıbbi bant kullanarak kafayı yerine sabitleyin.
  13. Vücut ısısının korunmasına yardımcı olmak için hayvanı battaniyelerle örtün.
  14. İntravenöz kateteri heparinize salin ile yıkayın ve prosedür süresince 2-5 mL / kg / s'de sağlanan Ringer laktatın intravenöz infüzyonuna başlayın.
  15. Oküler yüzeyi, konjonktiva kesesini ve göz kapaklarını% 0.2 povidon-iyot, steril pamuklu çubuk aplikatörleri ve pamuk topları kullanarak aseptik cerrahi için hazırlayın.
  16. Ameliyat mikroskobunu göz mercekleri de uygun şekilde ayarlanmış olarak konumlandırın. Mikroskop (odak, yakınlaştırma ve XY ekseni kontrolü) ve vitrektomi makinesi için ayak kontrolünü cerrahın çalıştırabileceği şekilde yerleştirin.
  17. Aseptik cerrahiye hazırlanın: Tüm personel cerrahi fırçalama, cerrahi şapka ve maske takmalıdır. Cerrahın ve asistan (lar) ın rutin aseptik cerrahi için fırça, önlük ve eldiven giydiğinden emin olun. Tüm personel aseptik tekniklere aşina olmalıdır.
  18. Personel temizlendikten sonra, önlük giydirildikten ve eldivenlendikten sonra, cerrahi paketleri açın ve aletleri yerleştirin. Cerrahın veya asistanın asepsis kırmadan ayarlamasını sağlamak için mikroskop ayar düğmelerine steril manipülasyon düğmeleri yerleştirin. Oküler cerrahi için hayvanı rutin bir şekilde örtün.
  19. İki portlu vitrektomi için üreticinin talimatlarını izleyerek vitrektomi makinesini hazırlayın.
    1. Asistanın masasına bir vitrektomi kontakt lensi ve iki port 23 G vitrektomi yerleştirin. Islak alan koterini takın. İnfüzyon tüpünü ve 23 G vitrektomi el parçasını takın ve astarlayın.
    2. Vitrektomi aletlerini ve sıvı çizgilerini steril örtünün üzerine yerleştirin ve havlu kelepçeleri kullanarak pozisyonlarında tutun. Vitrektomi makinesini Orantılı Vakum modunda dakikada 1.500 ila 2.500 kesim (cpm) ve maksimum 500 mmHg vakum arasında ayarlayın. Bu, vitrektomi makinesinin ön panelinde bulunan ok düğmelerine (yukarı veya aşağı) basılarak gerçekleştirilir.

2. Subretinal implantasyon için organoidlerin hazırlanması (Şekil 1)

  1. Daha önce31'de belirtildiği gibi retinal organoidleri türetin ve gerekirse, daha önce bildirildiği gibi 37 ° C'de bir gecede gönderin54.
  2. Alıcı laboratuvardaki doku kültürü odasındaki yüzeyleri bir dezenfektanla silin ve oküler ameliyatlar için cerrahi bir süitte olduğu gibi aynı yüksek düzeyde aseptik tekniği koruyun, bakteriyel veya fungal kontaminasyonu önlemek için cerrahi odaya taşıyın ve cerrahi alan enfeksiyonunu önlemek için cerrahi odaya taşıyın.
  3. Oküler ameliyatlar için organoid hazırlığı için tahsis edilen doku kültürü odasına cerrahi ayakkabı kılıfları, tek kullanımlık laboratuvar önlükleri, boneler, cerrahi maskeler, manşonlar ve cerrahi keseler giyin.
  4. Bir doku kültürü inkübatöründe 1 saat boyunca 20 ng / mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve 20 ng / mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ile sinir medyasını önceden dengeleyin (37 ° C,% 5 CO2). Organoidleri, yaklaşık dörtte bir hacimli şartlandırılmış ortam (gece sevkiyatından) ve dörtte üç hacimli taze ortam31,54 kullanarak ultra düşük yapışma plakalarına yerleştirin. 24-48 saat boyunca koruyun.
  5. İlk hayvanı uyuşturmadan önce doku kültürü inkübatöründe (37 °C,% 5 CO 2) en az 1 saat boyunca nöral ortam (adım 2.4'te hazırlandığı gibi) ile birkaç taze 60 mm'lik plaka hazırlayın ve dengeleyin. Not, bu plakalar, pH koşullarının ve CO2 doygunluğunun ortamda en az 20 dakika boyunca korunacağı varsayımıyla, her bir ameliyat için organoidlerin aktarılması için kullanılır; bu, plakayı ameliyathaneye taşımak ve organoidleri kanüle yüklemek için yeterlidir.
  6. Her transplantasyon vakası için önceden doymuş nöral ortama sahip 60 mm'lik taze bir plaka kullanın ve kalan plakaları doku kültürü inkübatöründe 37 ° C'de tutun.
  7. 6-9 organoidi, geniş (~0,7 mm) açıklığa sahip 200 μL steril filtre ucuna sahip manuel tek kanallı pipetle (20–200 μL) pipetleyerek 60 mm'lik bir kaba (yeniden doymuş ortamla) aktarın. Bu uçlar, önceden veya işlem sırasında, ucun ~ 3-4 mm'sini bir çift steril makasla (kontaminasyonu önlemek için doku kültürü başlığında yapılır) kesilerek hazırlanabilir. 60 mm'lik kabı 100 mm'lik bir doku kültürü kabının içine yerleştirin (odadan odaya taşıma sırasında kontaminasyonu önlemek için) ve hızlı bir şekilde cerrahi süite taşıyın.
  8. Plakayı organoidlerle birlikte steril bir örtü ile kaplı 37 ° C'lik bir elektrikli ısıtma yastığına yerleştirin.
  9. Organoidleri hazırlamadan önce yeni bir çift steril eldivene geçin.
  10. Organoidleri steril dengeli tuz çözeltisinde (BSS) (isteğe bağlı) durulayın ve daha sonra steril BSS ile önceden doldurulmuş steril bir 500 μL Hamilton şırıngasına steril plastik boru ile tutturulmuş cilalı künt bir ucu olan ince duvarlı bir borosilikat cam kanülden (dış çap, OD 1.52 mm; iç çap, ID 1.12 mm) oluşan enjektöre yükleyin.
  11. Kanülü, organoidleri enjekte etmeye hazır olduklarında cerrahi ekibe steril bir şekilde geçirin.
  12. Tüm prosedürün uzunluğunu (organoidlerin doku kültürü ortamından çıkarılmasından kanülün yüklenmesine kadar) 20 dakika veya daha az tutun.
  13. Organoidlerin implante edilmesinde gecikme olursa, çanak içindeki pH / CO2 doygunluğundaki değişiklikleri önlemek için bunları doku kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.
  14. Kullanılmayan organoidleri aynı doku kültürü inkübatöründe 1 hafta boyunca saklayın ve herhangi bir kontaminasyon kanıtı olup olmadığını izleyin.

3. Subretinal organoidlerin implantasyonu

  1. Stevens tenotomi makası ile 0,5-1 cm'lik lateral kantotomi yapın. Göz kapaklarını açık tutmak için uygun boyutta bir Barraquer göz kapağı spekulumu yerleştirin. Cerrahi asistanın prosedür süresince korneayı düzenli olarak BSS ile suladığından emin olun.
  2. Gözü birincil bakışta tutmak ve üçüncü göz kapağını geri çekmek için 6-0 ipek sütürden oluşan 2 dikişi, limbusun hemen bitişiğindeki konjonktivaya saat 4 ve 8 pozisyonlarında yerleştirin. Limbusun yanındaki bulber konjonktivayı nazikçe kavramak için 0.5 Castroviejo kornea bağlama forseps ve küçük bir sivrisinek hemostatı kullanın. Dikişleri uzun bırakın ve manipülasyonlarına yardımcı olmak için uçları küçük sivrisinek hemostatlarıyla sıkıştırın.
    NOT: Dikişin üçüncü göz kapağının altına yerleştirilmesi daha zordur; Hemen limbusun bitişiğinde yerleştirdiğinizden emin olun.
  3. Göze nüfuz etmemeye özen göstererek limbusun kalınlığından kısmen limbusun kalınlığı boyunca limbusta saat 12 pozisyonunda başka bir dikiş yerleştirin. Bu dikişi gevşek bir şekilde düğümleyin ve uçlarını kısa kesin. Bu, ameliyat sırasında cerrahın prosedürün farklı aşamalarında dünyanın farklı bölgelerine erişmesine izin vermek için gözü döndürmek için bir "tutamak" olarak kullanılan sağlam bir ankraj sütürü sağlar.
    NOT: Adım 3.2 ve 3.3 tersine çevrilebilir. Kalış dikişlerinin yerleştirilme sırası cerrahın tercihidir.
  4. Bulber konjonktivasını saat 10-2 arasında yansıtın (bir perimetri). Tenotomi makası kullanarak, konjonktivayı limbustan 2-3 mm kesin. Bunu baltalayın ve hayvanın yaşına bağlı olarak limbustan yaklaşık 3-5 mm uzağa yerleştirilecek olan saat 2 ve 10 vitrektomi portları için sklerayı açığa çıkarmak için zıvana kapsülünü temizleyin. Hemostaz için ve herhangi bir kanı temizlemek için cerrahi selüloz mızrakları kullanın.
  5. Konjonktiva ve tenon kapsülünün kumpasları kullanarak yansımasını takiben sklerotomi için bölgeleri belirleyin. Kedide belirgin olabilecek ana skleral damarlardan kaçınmak için sklerotomi bölgelerini (saat 2 ve 10'da pars plana'dan geçmeyi hedefleyen) seçin. Skleral kanamayı azaltmak için planlanan sklerotomi bölgelerinde sklera üzerinde ıslak alan koteri kullanın, alet portunda ~ 3 mm'lik bir bölge için planlama yapın (sağ elini kullanan bir cerrah için saat 10 pozisyonunda), çünkü bu, implantasyon kanülünün tanıtılmasına izin vermek için vitrektomiyi takiben genişletilecektir.
  6. Vitrektomi portları yerleştirilmeden önce önerilen sklerotominin bulunduğu yerde düğümü bağlamadan çapraz paternli dikişleri (6-0 veya 7-0 poliglactin sütürü) önceden yerleştirin.
    NOT: Bu, işlem sonunda sklerotominin hızlı bir şekilde kapatılmasını kolaylaştırır. Planlanan alet portu için dikişin daha uzun bir sklera ısırığına sahip olması gerekir, çünkü bu uzun bir insizyon olacaktır.
  7. Dikişler yerleştirildikten sonra, asistandan Bishop-Harmon forsepslerini bağlayarak veya kullanarak saat 12 pozisyonundaki dikişleri tutarak dünyayı konumlandırmaya yardımcı olmasını isteyin. Cerrahın, dokuyu sklerotomi bölgesinin yanında tutmak için 0.12 mm'lik Castroviejo forseps kullanarak dünyayı da stabilize etmesine izin verin.
    1. Lensle temas etmekten kaçınmak için hem saat 2 hem de saat 10 pozisyonlarında sklera boyunca bir trokar kullanarak 23 G vitrektomi portunu tanıtın.
    2. Sulama portunun vitreusta olup olmadığını, ucun vitreusta görselleştirilebilmesi için bağlama forsepsleri kullanarak porta hafifçe iterek kontrol edin. Doğru konumlandırma onaylandıktan sonra, sulama hattını limana takın ve yerine bantlamak için ince yapışkan bandajlar kullanarak hattı konumlandırın. BSS tamponunun vitrektomi infüzyonunu, vitrektomi makinesinin ön panelinde bulunan ok düğmelerine (yukarı veya aşağı) basarak başlangıçta 30-35 mmHg'ye ayarlayın.
  8. Asistanın, sonraki aşamalarda gözün arka segmentinin görselleştirilmesine izin vermek için Machemer büyütücü sulama vitrektomi lensini kornea üzerine tutmasına izin verin. Sulama vitrektomi lensini bir damlama setine takın ve lensi korneaya bağlamak için sürekli sıvı beslemesi sağlayın.
    NOT: Kontakt vitrektomi lensinin diğer formları da kullanılabilir. Ameliyat mikroskobu ile görselleştirmeye yardımcı olmak için oda ışıklarını kısın veya kapatın.
  9. 23 G vitrektomi probu / kesiciyi (2.500 cpm) alet portundan (cerrahın baskın eline bitişik, yani sağ elini kullanan bir cerrah için saat 10 pozisyonundaki porta) yerleştirin ve kısmi çekirdek vitrektomi yapın.
    1. Daha sonra vitreal yüzü retinadan ayırarak nakli yapılacak bölgedeki retina yüzeyinden vitreusu tamamen çıkarın (bu işlemin başarısı için önemlidir).
    2. Vitrektomi probunu optik sinir başının üzerine, port retina yüzeyinden uzağa bakacak şekilde yerleştirin ve vitreal yüz dekolmanı başlatmak için daha yüksek vakum uygulayın.
  10. Göz içi kullanım için triamsinolon kristalleri hazırlayın. Triamsinolon süspansiyonu özellikle intravitreal kullanım için değilse, kristalleri yıkayın ve ardından BSS'de tekrar askıya alın.
    1. Başlangıçta, kristalleri yakalamak için süspansiyonu, PES membranlı (1 mL'lik bir şırıngaya tutturulmuş) steril bir 0.22 μm gözenek şırınga filtresi yardımıyla filtreleyin.
    2. Daha sonra sıkışmış triamsinolon kristallerini 1mL şırıngada BSS'yi aspire ederek ve filtreden geçirerek yıkayın (kristaller filtrede sıkışıp kalır). Bu, çözeltideki koruyucuları uzaklaştırır. Yıkamayı 3 kez tekrarlayın, ardından kristaller 1 mL BSS'de tekrar askıya alınır.
  11. Triamsinolonu tutan şırınganın iğnesini alet portundan geçirin. İğneyi alet portundan sokarken iğnenin ucunu göz bebeğinden izleyerek lense dokunmamaya dikkat edin. 0,25 ila 0,5 mL kristal süspansiyon enjekte edin. Daha sonra vitrektomi probunu alet portundan yerleştirin ve portu retina yüzeyinden uzakta olacak şekilde optik sinir kafasına yakın bir yere ilerletin ve vitreal yüzün retinadan ayrılmasına yardımcı olmak için yüksek vakum kullanın.
    NOT: Triamsinolon kristalleri yapışır ve böylece kalan vitreusu vurgular. Planlı organoid implantasyon bölgesinin üstündeki ve yanındaki vitreusları dikkatlice çıkarın (örneğin, centralis bölgesine yakın merkezi tapetal fundus).
  12. Bir subretinal enjektör kullanarak istenen implantasyon bölgesinde küçük bir fokal retinal dekolmanı bleb'i oluşturun, örneğin, steril BSS ile doldurulmuş steril 250 μL gaz geçirmez Luer kilit şırıngasına tutturulmuş uzatılabilir bir 41 G kanül ile 23 G subretinal enjektör.
    1. Subretinal bleb'i oluşturmadan önce, bleb oluşumunu kolaylaştırmak için infüzyon basıncını 10 mmHg'ye düşürün.
    2. Enjektörü cihaz portundan geçirin ve retinal yüzeye doğru ilerletin. Kanül ucunu ekstrüde edin ve retinal yüzeye hafifçe bastırın. Asistandan, istenen boyuta ulaşana kadar retina dekolmanı yavaş bir şekilde artmasına izin vermek için enjeksiyon basıncını azaltan retina dekolmanı başlatmak için şırınga pistonuna hafif bir hızlı itme yapmasını isteyin (yaklaşık 100 ila 200 μL BSS kullanılır).
  13. Oluşturulan retinotomi uygun bir pozisyondaysa, implantasyon bölgesinden türetilen sinir lifi tabakasının kesitlenmesini önlemek ve majör retinal kan damarlarından kaçınmak için implantasyon bölgesi ile optik sinir başı arasındaki retinanın kesilmesini önler (bu aynı zamanda çalışma tasarımı ile belirlenir, bizim durumumuzda merkezi retina seçilmiştir), daha sonra, retina makaslarının sokulmasını kolaylaştırmak amacıyla enjektörün 41 G kanülünü kullanarak hafifçe büyütün.
  14. Enjektörü gözden çıkarın ve saat 10 pozisyonundaki skleral portu çıkarın. Bu bölgedeki sklerotomiyi, lense dokunmaktan kaçınmak için optik sinire doğru yönlendirilmiş düz bir 2.85 mm yarık bıçak / keratom kullanarak büyütün. İnfüzyon basıncını 10-15 mmHg'de tutun.
  15. Sıkma saplı vitreoretinal dikey 80° makas kullanarak retinotomiyi uzatın, retina kanamasını önlemek için retina damarlarını kesmekten kaçının ve nakil alanındaki retinadan optik sinire giden sinir liflerinin kesilmesini önlemek için blebin kenarındaki retinayı optik sinir kafasından uzaklaştırdığınızdan emin olun. Retinotomi, organoidleri almak için yeterli genişlikte olmalıdır.
  16. Organoidleri içeren önceden yüklenmiş cam kılcal damarı (bkz. adım 2.10) genişlemiş sklerotomi yoluyla yerleştirin ve doğrudan görselleştirme altında retinotomi bölgesine doğru ilerletin.
    1. Subretinal bleb içine açıklığa erişmek için retinotomiyi hafifçe açmak için cam kılcal damarın ucunu kullanın.
    2. Asistandan, mikroskoptan izlerken, organoidleri subretinal bleb'e enjekte ederken enjektörün pistonuna yavaşça basmasını isteyin. BSS organoidlerden önce gelmeli ve retinotomi açık olmalıdır.
    3. Retinotominin kenarındaysa, bleb içindeki organoidleri cam kılcal damarın ucuyla yavaşça itin.
  17. Retinotomiyi kapatmaya çalışmak ve organoidlerin vitreusa kaçmasını önlemek için cam kılcal damarı retinotomide birkaç saniye tutun.
  18. Organoidleri subretinal blebden dışarı atabilecek göz içindeki sıvı hareketini önlemek için gözdeki sıvının ani salınımını önlemek için cam kılcal damarı gözden çok yavaş bir şekilde çıkarın.
  19. İnfüzyon sıvısının doğrudan bleb üzerine yıkanmamasına dikkat ederek göz içi kanamayı önlemeye yardımcı olmak için infüzyon basıncını yavaşça 20-30 mmHg'ye yükseltin. Bu, vitrektomi makinesinin ön panelinde bulunan yukarı ok düğmelerine basılarak gerçekleştirilir.
  20. Önceden yerleştirilmiş sütürü çapraz bir düzende (6-0 veya 7-0 poliglactin) kullanarak sklerotomiyi kapatın. Sklerotomiyi kapatmak için gerektiğinde ek basit kesilmiş dikişler ekleyin.
  21. Asistandan infüzyon portunu çıkarmasını isteyin ve cerrahın sklerotomiyi kapatmak ve göz içi basıncı kaybını önlemek için önceden yerleştirilmiş dikişi hızlı bir şekilde bağlamasına izin verin.
  22. Konjonktiva insizyonunu (peritomi) 6-0 veya 7-0 poliglactin kullanarak basit bir sürekli düzende kapatın.
  23. Fundusu görüntüleyin (örneğin, bir RetCam II video fundus kamerası, Clarity veya benzeri bir şey kullanarak) ve organoidlerin subretinal boşluktaki anlık konumunu kaydedin.
  24. Pamuk ucu aplikatörleri ve pamuk topları yardımıyla %0.2 povidon iyot çözeltisi kullanarak görüntülemeden sonra oküler yüzeyi yeniden hazırlayın. Üç kalan dikişi ve kapak spekulumunu çıkarın.
  25. Lateral kantotomiyi 6-0 poliglactin sütürü ile kapatın. Lateral kantusu reforme etmek için tek bir gömülü sütür ve ardından 8 cilt sütürü figürü yerleştirin ve ardından yaranın geri kalanını kapatmak için basit kesilmiş cilt dikişleri kullanın.
  26. Cerrahi prosedür tamamlandıktan sonra, bir steroid ve antibiyotik kombinasyonunun (2 mg metilprednizolon asetat, 0.1 mg deksametazon ve 1 mg gentamisin) subkonjonktival enjeksiyonunu verin. Korneanın üzerine bir oftalmik kayganlaştırıcı (yapay gözyaşı) yerleştirin.
  27. Hayvanı anesteziden kurtarın ve iyileşme sırasında, belirgin blefarospazm, manipüle edilmek için ciddi isteksizlik, uyuşukluk veya iştah azalması ve artan solunum ve kalp atış hızı gibi ek tedavi gerektirecek herhangi bir ağrı belirtisi olup olmadığını yakından izleyin. Gerektiğinde ameliyat sonrası analjezi sağlayın ve herhangi bir rahatsızlık için yakından izleyin.
    NOT: Ameliyat öncesinde, sırasında ve sonrasında kedi hastalarının anestezi ve izlenmesinden sadece uygun şekilde eğitilmiş personel sorumlu olmalıdır. Ameliyat sonrası bakım için yerel hayvan etik komitesinin tavsiyelerine uyun.

4. İmplantasyon sonrası prosedürler, ameliyat sonrası tedavi ve değerlendirme

  1. Enflamasyonu ve organoidlerin reddedilmesini kontrol etmeye yardımcı olmak için oral immünsüpresif ilaçlarla (günde iki kez oral olarak 1 mg / kg prednizolon ve 2 mg / kg siklosporin) tedaviye devam edin. Sistemik antibiyotik kapsamı sağlayın (örneğin, günde iki kez oral doksisiklin 5 mg / kg – bu antibiyotik, immünsüprese hayvanlarda fırsatçı mikoplazmal enfeksiyon riski nedeniyle seçilmiştir).
  2. Enflamasyonu veya advers olayların gelişimini izlemek için düzenli oftalmik muayeneler yapın. Subretinal boşluğa organoidlerin enjekte edilmesi için gereken büyük retinotomiye rağmen, ameliyattan sonraki ilk birkaç gün içinde meydana gelen düzleşme için retinal bleb'i izleyin. Nakledilen organoidlerin pozisyonunu ve görünümünü kaydetmek için her muayenede fundus görüntülerini kaydedin.
  3. İzleme döneminde ve deneyin sonlandırılmasından önce konfokal taramalı lazer oftalmoskopi (cSLO) ve spektral alan – optik koherens tomografi (SD-OCT)5,31 ile genel anestezi altındaki hayvanları görüntüleyin.
  4. AVMA onaylı bir yöntem kullanarak deneyin sonunda hayvanları insancıl olarak ötenazi yapın, örneğin 85 mg / kg pentobarbitalin intravenöz uygulaması. Sedasyondan sonra, stresi en aza indirmek için pentobarbitalin uygulanması için intravenöz bir kateter yerleştirin. Kalp atışının kesilmesiyle ölümü onaylayın ve bir pnömotoraks oluşturmak için toraks içine bir kesi yapın.
  5. Gözleri standart bir transkonjonktival yaklaşımla çıkarın ve gerektiği gibi sabitleyin. İmmünohistokimya (IHC) için, fiksatif çözeltinin 0.3 mL'si 11 Parker bıçağı (limbustan ~ 3-4 mm) ile pars planadan yapılan 3 yarıktan arka segmente enjekte edildikten sonra gözleri% 4 paraformaldehit çözeltisine hemen daldırın.
  6. 4 °C'de 3,5 saat fiksasyondan sonra vizör kapaklarını diseke edin. Retina ve organoidleri sağlam bir şekilde koruduğunuzdan emin olmak için artık vitreusu çıkarın. 4 ° C'de 30 dakika daha fiksatif olarak tekrar yerleştirin, ardından vizör kaplarını PBS'de 10 dakika boyunca her biri 3 kez durulayın. Vizör adaptörünü 2 saat boyunca% 15 sakaroza, daha sonra 2 saat boyunca% 30 sakaroza aktarın.
  7. Vizör adaptörünü PBS ile iki kez durulayın ve OCT ortamına (optimum kesme sıcaklığı bileşiği) yerleştirin ve flaşla dondurun, ardından histoloji ve immünokimya için kesitlemeye kadar -80 ° C'de saklayın.
  8. Çalışma protokolüne ve amaçlarına göre IHC için antikorları seçin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu prosedür, hPSC kaynaklı retinal organoidlerin büyük bir göz hayvanı modelinin subretinal boşluğuna başarılı ve tekrarlanabilir implantasyonunu sağlar (burada 2 örnek kullanılarak gösterilmiştir: sağlıklı fotoreseptörlere (PR'ler) sahip vahşi tip kediler ve dejenere PR'ler ve retina ile CrxRdy / + kedileri). Şekil 1'de belirtilen adımları kullanarak, hPSC türevli retinal organoidleri, organoidlerin zarar görmemesi için enjeksiyon cihazının borosilikat cam kanülüne hazırlayın ve yükleyin. Bu, organoidlerin yüklenmesi sırasında (adım 2.10) ve ameliyat sırasında (adım 3.16) (Şekil 2A, B) doğrudan görselleştirme ile ve ameliyat sonunda fundus görüntüleme (adım 3.23, Şekil 2C) ile doğrulanabilir. Bu teknik kullanılarak subretinal boşlukta organoidlerin varlığı postoperatif olarak oftalmik muayene ve organoidlerin pozisyonunu ve görünümünü kaydeden fundus görüntüleme (Şekil 3A) ile doğrulanır. Dondurulmuş histoloji ve immünohistokimya için küreleri işlerken naklin konumunu bilmek çok önemlidir ve 12-14 μm'de (kriyokesimin kalınlığı) büyük bir gözün kesitlenmesi zaman aldığından, iş yükünü önemli ölçüde azaltır. Ötanaziden önce, organoidlerin subretinal boşluktaki konumunu değerlendirmek için konfokal taramalı lazer oftalmoskopi (cSLO) ve spektral alan - optik koherens tomografi (SD-OCT) görüntüleme de yapılır (Şekil 3A-D). Bu teknikler retinal organoidlerin alıcı gözün subretinal boşluğunda (nöral retina ve RPE arasında) kalıcılığını göstermektedir (Şekil 3E). Ötanaziden sonra (AVMA tavsiyelerini takiben insancıl bir şekilde yapılır) histoloji ve immünohistokimya (IHC) rutin olarak gerçekleştirilir (daha önce yayınlanmış makale31'deki ayrıntılara bakınız). Histoloji ve IHC, hayvanlar immünsüprese edildiğinde (daha önce tarif edildiği gibi31) büyük bir gözün subretinal boşluğunda ksenojenik greftlerin (hPSC kaynaklı retinal organoidler) hayatta kaldığını göstermektedir, bkz. Şekil 4.

Figure 1
Şekil 1: İmplantasyondan önce organoid hazırlama adımlarının şeması.
Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Organoidlerin cerrahi subretinal implantasyonları. (A) Bir cam kanül aracılığıyla subretinal boşluğa verilen organoidlerin zarar görmeden doğrudan görselleştirilmesi, (B) Subretinal blebdeki organoidlerin doğrudan görselleştirilmesi, (C) Subretinal implante edilen organoidlerin ameliyattan hemen sonra geniş açılı fundus renkli görüntüsü. Bleb kenarları siyah ok uçları ve retinotomi bölgesi siyah yıldızlarla gösterilir.
Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Bir CrxRdy / + kedisinde implantasyondan 3 ay sonra subretinal implante organoidlerin postoperatif değerlendirmesi. (A) Subretinal implante edilen organoidlerin fundus renkli görüntüsü, (B) subretinalinal implante edilen organoidlerin cSLO fundus görüntüsü, (C) organoidleri içeren alanın 3D hacim tarama rekonstrüksiyonu, (D) subretinal organoidleri içeren alanın cSLO görüntüsü, (E) Subretinal implante edilen organoidlerin SD-OCT yüksek çözünürlüklü, kesit görüntüsü. Retinotomi bölgesi siyah yıldızlarla gösterilir.
Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: CrxRdy/+ kedisinin subretinal boşluğunda, aşılamadan 3 ay sonra, insan retinal organoid kaynaklı fotoreseptör tabakaları (PR marker RCVRN).  * Kedi iç nükleer tabakasında (INL) sinaptik butonlar (hSYP=Synaptophysin).
Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

hPSC kaynaklı retina dokusunun (retinal organoidler) subretinal boşluğa implantasyonu, PR hücre ölümünün (derin veya terminal körlük) neden olduğu geç evre retinal dejeneratif hastalıklar için vizyonun geri kazanılması için umut verici bir deneysel yaklaşımdır. Sunulan yaklaşım, insan fetal retinal dokusunun bir parçasının subretinal greftlenmesine dayanan daha önce geliştirilmiş ve başarılı bir şekilde test edilmiş deneysel bir tedaviye dayanmaktadır23,24,25. hPSC'lerden türetilen alternatif, yenilenebilir ve etik olarak kabul edilebilir bir retina dokusu kaynağının kullanımını sunar. Büyük gözlü hayvan modellerinde tedavinin cerrahi fizibilitesini ve oküler güvenliğini göstermek51,55, klinik uygulamalara yönelik bu umut verici yaklaşımın ilerlemesi için gereklidir. Bu makalede, hPSC-3D retina dokusunun (retinal organoidler) hem normal hem de dejenere retina ile büyük bir hayvan modelinde subretinal implantasyonu için ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır (LCA'nın CrxRdy / + kedi modeli). Düz bir insan retinası parçası ve ayrıca RPE yamaları için prosedürler geliştirilmiş olmasına rağmen43,44,45, daha büyük 3D greftlerin transplantasyonu (ileri RD koşullarında görmeyi geri kazanmak için gerekli) araştırılmamıştır. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, greft sağkalımını arttırmak ve tabaka korumasını iyileştirmek için PR'lerle bozulmamış retinal tabakaları tanıtmanın potansiyel olarak daha iyi bir yolu olarak bazı RPE'leri taşıyan, tüm retinal organoidlerin (organoid jantlar33,41 yerine) subretinal verilmesi için bir transplantasyon prosedürü içindir. Bu protokolün farklı bölümlerinin iyi kurulmuş olduğunu unutmayın. Örneğin vitrektomi retina reataşman cerrahisi sırasında vitreoretinal cerrahlar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır 56,57,58,59,60. Subretinal enjeksiyonlar, örneğin genbüyütme terapisinde 3,7,61,62,63,64 daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Yeterli bir retinotominin yaratılması ve nispeten büyük organoidlerin subretinal boşluğa enjekte edilmesinin sınırlı açıklamaları vardır.

Kritik adımlar arasında lensten kaçınmak için sklerotominin dikkatli bir şekilde konumlandırılması ve performansı, vitreus korteksinin nakil bölgesi üzerindeki retina yüzeyinden tamamen çıkarılması, subretinal blebin kontrollü oluşumu, transplantasyon kanülünün genişliğine uyacak şekilde en uygun boyutta retinotomi oluşturulması, farklı adımlarda tanımlanmış infüzyon basıncının korunması, ve kanül çekilmesi. Optimize edilmiş iç ve dış çap (ID ve OD) ve uzunluğu ile doğru transplantasyon kanülünün seçilmesi, göz içi kanamanın kontrol edilmesi, organoidlerden ameliyathaneye ve aletlere kadar tüm prosedürün sterilitesi ve ameliyat süresinin (30-45 dakika / hayvan) optimal sonuçlar elde edilmesi. Yazarlar, kedi vitreusunun kalınlığı / viskozitesi nedeniyle 23 G vitrektomi ile en iyi sonuçların elde edildiğini, 41 G kanüllü bir enjektörle bir bleb oluşturduğunu ve daha sonra 80 ° açılı retina makası kullanarak blebin kenarındaki retinotomiyi uzattığını bulmuşlardır. Diğer önemli faktörler arasında sklerotominin borosilikat cam kanüle uyacak şekilde 2.85 mm'lik bir keratom kullanılarak uzatılması (dış çap OD 1.52 mm; iç çap, ID 1.12 mm; ve uzunluk 10.16 cm) ve aksiyel uzunluğu yaklaşık 20.5 mm (20.91 mm ± 0.53 mm) olan büyük bir göze daha büyük organoidlerin implantasyonuna izin verilmesi sayılabilir55. Bir cam kılcal damarın kullanılması, implantasyon işlemi sırasında iniş boyutundaki organoidlerin yüklenmesi ve teslim edilmesi için mevcut en iyisiydi. Vitrektomi sırasında infüzyon basıncının 20-30 mmHg'den bleb oluşum basamağında 10 mmHg'ye düşürülmesinin, retinal organoidler için alan yaratmak için gerekli olan retina dekolmanları oluşturmak için en uygun olduğu bulunmuştur. Ek olarak, uzun mesafeli sevkiyat sırasında hPSC-3D retina dokusunun (organoidler) yaşayabilirliği ve ksenojenik insan greftlerinin bakımı için optimize edilmiş immünsüpresyon rejiminin seçilmesi, yakın zamanda bildirildiği gibi kritik öneme sahiptir31,54.

Yazarlar, yüksek oranda yansıtıcı kedi tapetum nedeniyle, ameliyatı gerçekleştirmek için endo-aydınlatmanın gerekli olmadığını bulmuşlardır. Bir atapetal türde (örneğin, domuz, insan olmayan primat) transplantasyon, endo-aydınlatma içeren 3 portlu bir vitrektomi gerektirecektir. Rutin retina dekolmanı cerrahisinde uygulanan tamponad (örneğin, perflorokarbon ve ardından silikon yağı ile) yapılmadı, çünkü bleb üzerindeki basınç organoidleri vitreusa ekstrüzyon riski taşıyacaktı. Gelecekteki gelişmeler, retina deliklerinin kapatılması için şu anda araştırılmakta olan malzemelerin kullanımını içerebilir. Bu, implantasyon sonrası organoidlerin vitreus içine kaybını önlemek için kullanılabilir. Ek olarak, Kenalog-40'a benzeyen ancak koruyucu içermeyen triamsinolon içeren Triescence, vitreusu görselleştirmek için alternatif olarak kullanılabilir.

Genç hayvanlarda (örneğin, 1-2 ay) daha küçük küre boyutu, büyük göze (yetişkin hayvanlar) kıyasla daha fazla cerrahi zorluk ortaya çıkardı. Bununla birlikte, burada açıklanan yöntemi kullanarak, subretinal greftleri vermek mümkündür. CrxRdy / + LCA modelinde, daha büyük retinal bleblerin her zaman yeniden bağlanmadığı bulunmuştur. Bleb'i retinal organoidlerin enjekte edilmesine izin vermek için gereken minimum boyutta tutmak, bu komplikasyonu azalttı. RD retinada daha erken transplantasyon (nöral retina belirgin şekilde inceldiğinde PR'ların tamamen kaybedilmesinden önce), insan fetal retina greftleri20 ile yapılan daha önceki çalışmalara paralel olarak başka bir kılavuzdur. Başka bir not - ayrıntılı teknik, retina tabakasının doğru yönde yerleştirilmesine bağlı değildir, çünkü tüm retinal organoidler nakledilir. Düz hESC-retinal tabakaların gelişmesiyle birlikte, bu önemli olacaktır. Bununla birlikte, bozulmamış hESC-retinal doku tabakaları sunmayı ve PR tabakalarının subretinal korunmasını optimize etmeyi amaçlayan bu protokolün odak noktası değildir. Teknik geliştirildikten sonra, hem normal hem de RD retinada tekrarlanabilirdi.

Bu cerrahi işlemin birçok potansiyel komplikasyonu vardır. Sadece vitreoretinal cerrahide yetenekli olanlar (örneğin, eğitimli veteriner oftalmologlar veya insan gözüne kıyasla kedi gözündeki tür farklılıklarına aşina olan vitreoretinal cerrahlar) prosedürü üstlenmelidir. Olası komplikasyonlar arasında trokar yerleştirme sırasında lens dokunuşu, sklerotomi büyümesi sırasında skleral kanama ve subretinal veya retinal kanamalar sayılabilir. Konakçının ksenojenik insan organoid greftlerine karşı immün yanıtı, zamanla greftin tahrip olmasına veya endoftalmiye yol açan diğer komplikasyonlar mümkündür; Oral immünsüpresan ve antibiyotik ilaçların kullanımı bunların oluşmasını önlemeye yardımcı olur. Yaban tipi ve CrxRdy / + kedilerinde implantasyon arasında bir fark olduğunu not etmek de önemlidir. İleri retinal dejenerasyon olduğunda, retinal bleb vahşi tipten daha geniş yayılma eğilimindedir ve bazı durumlarda bu, ameliyattan sonra retinal yeniden bağlanmayı önleyebilir. Burada sunulan teknik, IRD'lerin büyük hayvan modellerinin gözlerine organoidlerin implantasyonu için geçerlidir. Transplantasyon kliniğe tercüme edilmeye hazır olduğunda daha fazla arıtmaya ihtiyaç duyulacaktır.

Yazarların büyük göz modellerinde karmaşık vitreoretinal cerrahi prosedürlerin uygulanması konusundaki deneyimlerine dayanarak, bu makalede sunulan teknik, vitreoretinal cerrahi tekniklerin kliniğe çevrilmesinde kullanılan diğer büyük hayvan modellerine (atapetal türlerde endo-aydınlatmanın dahil edilmesiyle) uygulanabilir olmalıdır43,44,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ratnesh K. Singh, Ph.D., Francois Binette, Ph.D. ve Igor O. Nasonkin Ph.D., Lineage Cell Therapeutics, Inc.'in çalışanlarıdır. Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma NEI Fast-track SBIR hibesi R44-EY027654-01A1 ve SBIR hibe 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones bir ortak PI'dir) tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, Bayan Janice Querubin'e (MSU RATTS) bu çalışmaya dahil edilen hayvanlar için anestezi ve genel bakım konusundaki yardımlarının yanı sıra cerrahi ayar ve alet hazırlama / sterilizasyon konusundaki yardımları için teşekkür eder. Yazarlar, organoidlerin implantasyondan önceki gün alınması ve medyaya yerleştirilmesindeki yardımı ve implantasyon günündeki yardımı için Dr. Paige Winkler'e teşekkür eder. Yazarlar ayrıca, retinal organoidlerin özenle nakliyesi, göndericinin montajı ve her sevkiyattan sonra sıcaklık ve G-stres kayıtlarının indirilmesi için Bay Randy Garchar'a (LCTX) minnettardır. Bu çalışma, yazar Igor Nasonkin'in Biotime (şimdi Lineage) tarafından istihdam edildiği sırada gerçekleştirildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore syringe filter with PES membrane Cameo NA can be found through various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula DORC 1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe Hamilton NA can be found through various suppliers
6-0 Silk suture Ethicon 707G
6-0/7-0 polyglactin suture Ethicon J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) Henry Schein Animal Health NA can be found through various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL Par Pharmaceutical NA can be found through various suppliers
cSLO + SD-OCT Heidelberg Engineering Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine Novartis NA can be found through various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium) Vetone NA can be found through various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL Cipla NA can be found through various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarbital solution) Vortech NA can be found through various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL Hospira NA can be found through various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing World Precision Instruments TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL Pfizer NA can be found through various suppliers
Microscope Zeiss NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) Sakura 4583
Olympic Vac-Pac Size 23 Natus NA can be found through various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution EMS 15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution Akorn NA can be found through various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL Akorn NA can be found through various suppliers
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) Zoetis NA can be found through various suppliers
RetCam II video fundus camera Clarity Medical Systems NA can be found through various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) Bristol -Myers Squibb Company NA can be found through various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution Akorn NA can be found through various suppliers
Vitrectomy 23G port Alcon Accurus systems
Vitrectomy machine Alcon Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle Frimen FT170206T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veleri, S., et al. Biology and therapy of inherited retinal degenerative disease: insights from mouse models. Disease Models and Mechanisms. 8 (2), 109-129 (2015).
  2. Dias, M. F., et al. Molecular genetics and emerging therapies for retinitis pigmentosa: Basic research and clinical perspectives. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 107-131 (2018).
  3. Petersen-Jones, S. M., et al. Patients and animal models of CNGbeta1-deficient retinitis pigmentosa support gene augmentation approach. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 190-206 (2018).
  4. Winkler, P. A., et al. A large animal model for CNGB1 autosomal recessive retinitis pigmentosa. PLoS One. 8 (8), 72229 (2013).
  5. Occelli, L. M., Tran, N. M., Narfstrom, K., Chen, S., Petersen-Jones, S. M. CrxRdy Cat: A large animal model for CRX-associated leber congenital amaurosis. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (8), 3780-3792 (2016).
  6. Mowat, F. M., et al. Early-onset progressive degeneration of the area centralis in RPE65-deficient dogs. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (7), 3268-3277 (2017).
  7. Occelli, L. M., et al. Gene supplementation rescues rod function and preserves photoreceptor and retinal morphology in dogs, leading the way towards treating human PDE6A-retinitis pigmentosa. Human Gene Therapy. 28 (12), 1189-1201 (2017).
  8. Eckhorn, R., et al. Visual resolution with retinal implants estimated from recordings in cat visual cortex. Vision Research. 46 (17), 2675-2690 (2006).
  9. Pardue, M. T., et al. Status of the feline retina 5 years after subretinal implantation. Journal of Rehabilitation Research and Development. 43 (6), 723-732 (2006).
  10. Chow, A. Y., et al. Subretinal implantation of semiconductor-based photodiodes: durability of novel implant designs. Journal of Rehabilitation Research and Development. 39 (3), 313-321 (2002).
  11. Volker, M., et al. In vivo assessment of subretinally implanted microphotodiode arrays in cats by optical coherence tomography and fluorescein angiography. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 242 (9), 792-799 (2004).
  12. Chow, A. Y., et al. Implantation of silicon chip microphotodiode arrays into the cat subretinal space. Institute of Electrical and Electronics Engineering Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 9 (1), 86-95 (2001).
  13. Sachs, H. G., et al. Subretinal implantation and testing of polyimide film electrodes in cats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 464-468 (2005).
  14. Villalobos, J., et al. A wide-field suprachoroidal retinal prosthesis is stable and well tolerated following chronic implantation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (5), 3751-3762 (2013).
  15. Bragadottir, R., Narfstrom, K. Lens sparing pars plana vitrectomy and retinal transplantation in cats. Veterinary Ophthalmology. 6 (2), 135-139 (2003).
  16. Narfstrom, K., Holland Deckman, K., Menotti-Raymond, M. The domestic cat as a large animal model for characterization of disease and therapeutic intervention in hereditary retinal blindness. Journal of Ophthalmology. , 906943 (2011).
  17. Seiler, M. J., et al. Functional and structural assessment of retinal sheet allograft transplantation in feline hereditary retinal degeneration. Veterinary Ophthalmology. 12 (3), 158-169 (2009).
  18. Aramant, R. B., Seiler, M. J. Transplanted sheets of human retina and retinal pigment epithelium develop normally in nude rats. Experimental Eye Research. 75 (2), 115-125 (2002).
  19. Lin, B., McLelland, B. T., Mathur, A., Aramant, R. B., Seiler, M. J. Sheets of human retinal progenitor transplants improve vision in rats with severe retinal degeneration. Experimental Eye Research. 174, 13-28 (2018).
  20. Seiler, M. J., Aramant, R. B. Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (6), 661-687 (2012).
  21. Seiler, M. J., et al. Vision recovery and connectivity by fetal retinal sheet transplantation in an immunodeficient retinal degenerate rat model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (1), 614-630 (2017).
  22. Lorach, H., et al. Transplantation of mature photoreceptors in rodents with retinal degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 30 (2019).
  23. Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
  24. Radtke, N. D., Aramant, R. B., Seiler, M. J., Petry, H. M., Pidwell, D. Vision change after sheet transplant of fetal retina with retinal pigment epithelium to a patient with retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 122 (8), 1159-1165 (2004).
  25. Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
  26. Lorach, H., Palanker, E. Retinal prostheses: High-resolution photovoltaic implants. Medical Science (Paris). 31 (10), 830-831 (2015).
  27. Mathieson, K., et al. Photovoltaic retinal prosthesis with high pixel density. Nature Photonics. 6 (6), 391-397 (2012).
  28. Banin, E., et al. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24 (2), 246-257 (2006).
  29. Hambright, D., et al. Long-term survival and differentiation of retinal neurons derived from human embryonic stem cell lines in un-immunosuppressed mouse retina. Molecular Vision. 18, 920-936 (2012).
  30. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  31. Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells and Development. 28 (17), 1151-1166 (2019).
  32. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  33. Assawachananont, J., et al. Transplantation of embryonic and induced pluripotent stem cell-derived 3D retinal sheets into retinal degenerative mice. Stem Cell Reports. 2 (5), 662-674 (2014).
  34. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  35. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  36. Singh, R. K., et al. Characterization of three-dimensional retinal tissue derived from human embryonic stem cells in adherent monolayer cultures. Stem Cells and Development. 24 (23), 2778-2795 (2015).
  37. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  38. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  39. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  40. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  41. Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 81-90 (2016).
  42. Mandai, M., et al. iPSC-derived retina transplants improve vision in rd1 end-stage retinal-degeneration mice. Stem Cell Reports. 8 (4), 1112-1113 (2017).
  43. Scruggs, B. A., et al. Optimizing donor cellular dissociation and subretinal injection parameters for stem cell-based treatments. Stem Cells Translational Medicine. 8 (8), 797-809 (2019).
  44. Singh, R., et al. Pluripotent stem cells for retinal tissue engineering: Current status and future prospects. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (4), 463-483 (2018).
  45. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11, 475 (2019).
  46. Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (6), 835-846 (2007).
  47. Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (8), 1553-1565 (2016).
  48. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  49. Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
  50. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a Phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  51. Petersen-Jones, S. M., Komaromy, A. M. Dog models for blinding inherited retinal dystrophies. Human Gene Therapy. Clinical Development. 26 (1), 15-26 (2015).
  52. Beltran, W. A., et al. Canine retina has a primate fovea-like bouquet of cone photoreceptors which is affected by inherited macular degenerations. PLoS One. 9 (3), 90390 (2014).
  53. Nasonkin, I. O., et al. Transplantation of human embryonic stem cell derived retinal tissue in the subretinal space of immunodeficient rats with retinal degeneration (RD). Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (9), 3109 (2019).
  54. Singh, R. K., et al. Development of a protocol for maintaining viability while shipping organoid-derived retinal tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (2), 388-394 (2020).
  55. Petersen-Jones, S. M. Drug and gene therapy of hereditary retinal disease in dog and cat models. Drug Discovery Today. Disease Models. 10 (4), 215-223 (2013).
  56. Machemer, R., Buettner, H., Norton, E., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1972).
  57. Machemer, R., Norton, E. W. Vitrectomy, a pars plana approach. II. Clinical experience. Modern Problems in Ophthalmology. 10, 178-185 (1972).
  58. Machemer, R., Parel, J., Norton, E. Vitrectomy: a pars plana approach. Technical improvements and further results. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 76 (2), 462-466 (1972).
  59. O'Malley, C., Heintz, R. M. Vitrectomy with an alternative instrument system. Annals of Ophthalmology. 7 (4), 585-588 (1975).
  60. Machemer, R., Hickingbotham, D. The three-port microcannular system for closed vitrectomy. American Journal of Ophthalmology. 100 (4), 590-592 (1985).
  61. Petersen-Jones, S. M., et al. AAV retinal transduction in a large animal model species: comparison of a self-complementary AAV2/5 with a single-stranded AAV2/5 vector. Molecular Vision. 15, 1835-1842 (2009).
  62. Annear, M. J., et al. Successful gene therapy in older Rpe65-deficient dogs following subretinal injection of an adeno-associated vector expressing RPE65. Human Gene Therapy. 24 (10), 883-893 (2013).
  63. Beltran, W. A., et al. Optimization of retinal gene therapy for X-linked retinitis pigmentosa due to RPGR mutations. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1866-1880 (2017).
  64. Bainbridge, J. W. B., et al. Long-term effect of gene therapy on Leber's Congenital Amaurosis. The New England Journal of Medicine. 372 (20), 1887-1897 (2015).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 174 retinal organoidler kedi büyük gözlü hayvan modeli subretinal transplantasyon retina dejenerasyonu cerrahi teknik
Bir Kedi Büyük Hayvan Modelinde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retinal Dokunun Subretinal Transplantasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh,… More

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh, R. K., Binette, F., Nasonkin, I. O., Petersen-Jones, S. M. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model. J. Vis. Exp. (174), e61683, doi:10.3791/61683 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter