Summary
여기서는 인간 만능줄기세포(hPSC) 유래 망막 조직을 대형 동물 모델의 망막하 공간에 이식하는 수술 기법을 제시합니다.
Abstract
연령 관련 황반변성(AMD), 색소성 망막염(RP) 및 Leber 선천성 무암증(LCA)과 같은 광수용체 손실과 관련된 망막 퇴행성(RD) 상태는 진행성 및 쇠약해지는 시력 상실을 유발합니다. 광수용체가 상실되면 시력을 회복할 수 있는 치료법에 대한 충족되지 않은 요구가 있습니다. 진행된 RD를 사용하여 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 유래 망막 조직(오가노이드)을 눈의 망막하 공간에 이식하면 수천 개의 건강한 돌연변이가 없는 광수용체가 있는 망막 조직 시트가 제공되며 하나의 승인된 프로토콜로 광수용체 변성과 관련된 대부분의/모든 실명 질환을 치료할 수 있는 잠재력이 있습니다. 동물 모델과 진행성 RD를 가진 사람들의 망막하 공간에 태아 망막 조직을 이식하는 것이 성공적으로 개발되었지만 윤리적 문제와 제한된 조직 공급으로 인해 일상적인 치료법으로 사용할 수 없습니다. 큰 눈 유전 망막 변성(IRD) 동물 모델은 망막 세포/조직을 망막하 공간에 이식하기 위한 고급 외과적 접근 방식을 활용하여 시력 회복 요법을 개발하는 데 유용합니다. 지구 크기 및 광수용체 분포(예: 황반 유사 영역 중심의 존재) 의 유사성 및 인간 IRD를 밀접하게 요약하는 IRD 모델의 가용성은 유망한 치료법을 클리닉으로 신속하게 번역하는 것을 용이하게 할 것입니다. 여기에 제시된 것은 hPSC 유래 망막 조직을 대형 동물 모델의 망막하 공간에 이식하는 수술 기술로, 동물 모델에서 이 유망한 접근 방식을 평가할 수 있습니다.
Introduction
전 세계 수백만 명의 사람들이 망막 변성(RD)의 영향을 받아 시각 장애 또는 빛 감지 광수용체(PR)의 손실과 관련된 실명을 경험합니다. 연령 관련 황반변성(AMD)은 유전적 위험 요인과 환경/생활 습관 요인의 조합으로 인한 실명의 주요 원인입니다. 또한 200개 이상의 유전자와 유전자좌가 유전된 RD(IRD)1을 유발하는 것으로 밝혀졌습니다. 가장 흔한 IRD인 색소성 망막염(RP)은 유전적으로 이질적이며 약 70개의 유전자에서 3,000개 이상의 유전적 돌연변이가 보고되고 있습니다 2,3,4. 어린 시절에 실명을 유발하는 Leber 선천성 Amaurosis(LCA)도 유전적으로 이질적입니다 5,6. 유전자 확대 요법이 개발되어 소수의 IRD를 치료하기 위한 임상 시험 중에 있다 3,7. 그러나 IRD의 각 뚜렷한 유전적 형태를 치료하고 따라서 소수의 환자만을 치료하기 위해 별도의 치료법을 개발해야 합니다. 또한, 유전자 증강은 구출 가능한 광수용체 집단의 존재에 의존하므로 진행된 변성에는 적용할 수 없습니다.
따라서 진행성 RD와 중증에서 말기 실명을 다루고 치료하는 치료법 개발에 대한 시급하지만 아직 충족되지 않은 임상적 요구가 있습니다. 지난 2 년 동안 신경 인공 임플란트는 인간이 사용하기 전에 고양이와 같은 대형 동물 모델에서 개발되고 테스트되었습니다 8,9,10,11,12,13,14. 마찬가지로, 지난 20년 동안 망막하로 이식된 배아 또는 성숙한 포유류 망막 시트를 활용하는 망막 대체 요법이 개발되었으며 15,16,17,18,19,20,21,22 RD 환자에서도 성공적으로 테스트되었습니다 23,24,25. 두 접근 방식 모두 새로운 센서(신경 보철 장치의 경우 광전지 실리콘 포토다이오드26,27, 망막 시트 이식의 경우 시트로 구성된 건강한 돌연변이 없는 광수용체)를 퇴행성 PR이 있는 망막에 도입하는 아이디어를 활용합니다. 최근 연구에서는 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 유래 망막 전구체28,29, hPSC-광수용체 30 및 hPSC-망막 오가노이드31,32,33의 이식과 같은 줄기 세포 기반 접근법의 사용을 조사했습니다. 망막 오가노이드는 접시에서 망막 조직의 형성을 가능하게 하고 발달 중인 인간 태아 망막의 광수용체 층과 유사한 수천 개의 돌연변이가 없는 PR을 가진 광수용체 시트의 유도를 가능하게 합니다 34,35,36,37,38,39,40. RD 질환 환자의 망막하 공간에 hPSC 유래 망막 조직(오가노이드)을 이식하는 것은 새롭고 유망한 연구용 세포 치료 접근법 중 하나이며 여러 팀(31,32,41,42)에서 추구하고 있습니다. 세포 현탁액(어린 광수용체 또는 망막 전구체)의 이식과 비교하여, 태아 광수용체의 이식 시트는 임상 시험에서 시력 개선을 가져오는 것으로 입증되었습니다23,24.
여기에 제시된 프로토콜은 PR이 있는 온전한 망막 시트를 도입하고 이식편 생존을 증가시키고 시트 보존을 개선하는 잠재적으로 더 나은 방법으로서 전체 망막 오가노이드(오가노이드 테두리33,41이 아닌)의 망막하 전달을 위한 이식 절차를 자세히 설명합니다. 인간 망막의 평평한 조각과 RPE 패치를 도입하는 절차가 개발되었지만43,44,45, 더 큰 3D 이식편의 이식은 조사되지 않았습니다. 줄기 세포 유래 망막 오가노이드는 시력 회복 기술 개발을 위한 광수용체 시트의 무궁무진한 공급원을 제공하고, 윤리적 제한이 없으며, 진행성 RD 및 말기 실명 치료에 중점을 둔 치료법을 위한 인간 망막 조직의 훌륭한 공급원으로 간주됩니다46. 숙주 망막 틈새(신경 망막, 망막 색소 상피 및 망막 및 맥락막 혈관 구조)에 대한 손상을 최소화하면서 망막 오가노이드의 정확한 망막하 이식을 위한 수술 방법의 개발은 이러한 치료법을 임상 적용으로 발전시키기 위한 중요한 단계 중 하나입니다31,32. 고양이, 개, 돼지, 원숭이와 같은 대형 동물 모델은 외과적 전달 방법을 조사하고 이식된 조직 시트(망막 색소 상피(RPE) 세포)의 안전성을 입증하고 오가노이드 41,44,45,47,48,49,50의 사용을 조사하는 데 좋은 모델임이 입증되었습니다. 큰 동물의 눈은 인간의 황반과 유사한 원뿔(중앙 영역)을 포함하여 광수용체 밀도가 높은 영역의 존재를 포함하여 인간과 유사한 지구 크기뿐만 아니라 유사한 해부학적 구조를 가지고 있습니다 6,51,52.
이 원고에서는 hPSC 유래 망막 조직(오가노이드)을 고양이과 대형 동물 모델(야생형 및 CrxRdy/+ 고양이 모두)의 망막하 공간에 이식하는 기술을 설명하며, 이는 유망한 효능 결과와 함께32,53 RD 상태를 치료하기 위한 임상 적용에 대한 이러한 연구 요법의 추가 개발을 위한 기반을 구축합니다.
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Protocol
절차는 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 성명서에 따라 수행되었습니다. 그들은 또한 Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. Michigan State University에서 유지 관리되는 고양이 군체의 야생형 및 CrxRdy/+ 고양이가 이 연구에 사용되었습니다. 동물들은 12시간: 12시간 명암 주기 미만으로 사육되었고 상업적인 완전 고양이 사료를 먹였습니다.
1. 착상 전 절차 및 수술 설정
- 연구 설계에 따라 야생형 또는 CrxRdy/+ 고양이를 선택합니다. 세극등 생체현미경 검사 및 간접 검안경 검사를 포함한 수술 전 안과 검사를 수행합니다. 유전자형과 관련이 없는 안저 이상이 있는 동물은 제외합니다.
- 이식 1주일 전에 이식 거부를 예방하기 위해 경구 사이클로스포린 2mg/kg 및 프레드니솔론 1mg/kg의 면역억제 프로토콜을 하루에 두 번 시작합니다.
- 생후 4 개월 이상의 동물을 하룻밤 (최소 8 시간)에 금식시킵니다. 생후 4 개월 미만의 동물에게 하룻밤 동안 제한된 양의 젖은 음식을 제공 한 다음 수술 전 2 시간 동안 금식하십시오.
- 흉부 청진(청진기 사용)을 포함한 일반적인 신체 검사를 수행합니다. 심장 및 호흡수, 체온, 점막 색상 및 모세혈관 보충 시간을 기록합니다.
- 생후 4개월 미만의 동물에게 부프레노르핀(0.02mg/kg)을 투여하고, 생후 4개월 이상의 동물에게 부프레노르핀(0.02mg/kg)과 아세프로마진(0.02mg/kg)을 병용하여 전신 마취 유도 30-45분 전에 피하 또는 근육주사합니다.
- 국소 1% 트로피카미드 점안액과 10% 페닐에프린 점안액을 안구 표면에 최소 2회 도포하여 동공을 확장합니다. 동공이 잘 확장되지 않은 경우 반복합니다.
- 모든 동물의 두부 정맥에 22G 정맥 카테터를 놓습니다 : 먼저 두부 정맥 위의 2 x 3cm 영역에서 머리카락을 자릅니다. 먼저 70 % 에탄올로 문지른 다음 클로르헥시딘 스크럽으로 피부를 준비하십시오. 카테터를 놓고 의료용 테이프로 고정하고 헤파린 처리 식염수로 씻어냅니다. 4 개월 미만의 동물에서는 마취 유도 후 수행 할 수 있습니다.
- 전처치 후 30-45분 후 전신마취 유도: 생후 4개월 미만의 동물은 마스크로 전달되는 이소플루란으로 유도하고, 생후 4개월 이상의 동물은 프로포폴(4-6mg/kg)을 정맥주사하여 유도합니다.
- 적절한 크기의 기관내관으로 삽관합니다. 검사 조명 또는 후두경으로 후두를 시각화하십시오. 0.1mL의 리도카인 2%를 후두에 뿌리고 몇 초 동안 기다렸다가 삽관합니다.
- Bain 시스템을 통해 산소(300–600mL/kg/min) 중 이소플루란(2%–3.5%)으로 마취를 유지합니다.
- 수건으로 덮인 온수 담요가 놓인 위치 베개에 동물을 등쪽 누운 자세로 놓습니다. 환자 모니터를 부착하고 심박수 및 심전도(ECG), 호흡수, 혈압, 산소 포화도 및 호기말 이산화탄소를 모니터링합니다. 시술 중 체온을 정기적으로 모니터링하십시오. 적절하게 훈련된 사람은 마취의 유지 및 모니터링을 담당합니다.
- 눈이 기본 시선 위치로 회전할 때 각막 표면이 수평이 되도록 위치 지정 베개를 사용하여 동물을 배치합니다. 의료용 테이프를 사용하여 머리를 제자리에 고정합니다.
- 체온을 유지하는 데 도움이되도록 담요로 동물을 덮으십시오.
- 헤파린화 식염수로 정맥 카테터를 세척하고 시술 기간 동안 2-5mL/kg/h로 공급되는 링거 젖산염을 정맥 주입하기 시작합니다.
- 무균 수술을 위한 안구 표면, 결막낭, 눈꺼풀을 0.2% 포비돈 요오드, 멸균 면봉 어플리케이터, 화장솜을 사용하여 준비합니다.
- 접안렌즈도 적절하게 조정된 상태에서 작동 현미경을 배치합니다. 현미경용 발 컨트롤(초점, 줌 및 XY-축 제어)과 유리체 절제술 기계를 외과의가 조작할 수 있도록 배치합니다.
- 무균 수술 준비: 모든 직원은 수술용 수술복, 수술용 모자 및 마스크를 착용해야 합니다. 외과의와 조수가 일상적인 무균 수술과 마찬가지로 문지르고, 가운과 장갑을 착용하도록 하십시오. 모든 직원은 무균 기술에 익숙해야 합니다.
- 직원이 문지르고, 가운을 입고, 장갑을 낀 후에는 수술 팩을 열고 기구를 배치합니다. 현미경 조정 손잡이에 멸균 조작 손잡이를 놓아 외과의나 조수가 무균을 깨지 않고 조정할 수 있도록 합니다. 안구 수술을 위해 일상적인 방식으로 동물을 드레이프하십시오.
- 2포트 유리체 절제술에 대한 제조업체의 지침에 따라 유리체 절제술 기계를 준비합니다.
- 유리체 절제술 콘택트 렌즈와 2포트 23G 유리체 절제술을 조수의 테이블에 놓습니다. 습식 필드 소작을 부착하십시오. 주입 튜브와 23G 유리체 절제술 핸드피스를 부착하고 프라이밍합니다.
- 유리체 절제술 기구와 유체 라인을 멸균 드레이프 위에 놓고 수건 cl을 사용하여 제자리에 유지합니다.amps. 유리체 절제술 기계를 비례 진공 모드에서 분당 1,500에서 2,500컷(cpm) 사이로 설정하고 최대 진공을 500mmHg로 설정합니다. 이것은 유리체 절제술 기계의 전면 패널에 있는 화살표 버튼(위쪽 또는 아래쪽)을 눌러 수행됩니다.
2. 망막하 이식을 위한 오가노이드의 제조(그림 1)
- 앞서 설명한 바와 같이 망막 오가노이드를 유도하고,31, 필요한 경우 이전에 보고된 바와 같이 37°C에서 밤새 배송한다54.
- 소독제로 수용 실험실의 조직 배양실 표면을 닦고 안과 수술용 수술실과 동일한 수준의 무균 기술을 유지하여 박테리아 또는 곰팡이 오염을 방지하고 수술 부위 감염을 방지하기 위해 수술실로 이월합니다.
- 안과 수술을 위한 오가노이드 준비를 위해 지정된 조직 배양실 내에서 수술용 신발 커버, 일회용 실험실 코트, 보닛, 수술용 마스크, 슬리브 및 수술용 스크럽을 착용하십시오.
- 조직 배양 배양기(37°C, 5%CO2)에서 1시간 동안 20ng/mL의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 20ng/mL의 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)로 신경 배지를 사전 평형화합니다. 약 1/4 부피의 컨디셔닝 배지(익일 배송)와 3/4 부피의 신선한 배지31,54를 사용하여 초저접착 플레이트의 배지에 오가노이드를 배치합니다. 24-48 시간 동안 유지하십시오.
- 첫 번째 동물을 마취하기 전에 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에서 최소 1시간 동안 신경 배지(단계 2.4에서 제조됨)로 여러 개의 신선한 60mm 플레이트를 준비하고 평형화합니다. 참고로, 이 플레이트는 각 개별 수술에 대한 오가노이드를 옮기는 데 사용되며, pH 조건과CO2 포화도가 최소 20분 동안 배지에서 유지되어 플레이트를 수술실로 이동하고 오가노이드를 캐뉼라에 로딩하기에 충분하다는 가정 하에 사용됩니다.
- 각 이식 사례에 대해 미리 포화된 신경 배지가 있는 신선한 60mm 플레이트를 사용하고 나머지 플레이트를 37°C의 조직 배양 인큐베이터에 보관합니다.
- 6-9개의 오가노이드를 입구가 넓은(~0.7mm) 200μL 멸균 필터 팁이 있는 수동 단일 채널 피펫(20–200μL)으로 피펫팅하여 하나의 60mm 접시(재포화 배지 포함)에 옮깁니다. 이 팁은 미리 또는 절차 중에 한 쌍의 멸균 가위로 팁의 ~3-4mm를 잘라내어 준비할 수 있습니다(오염을 방지하기 위해 조직 배양 후드에서 수행). 60mm 접시를 100mm 조직 배양 접시 안에 넣고(방에서 방으로 이동하는 동안 오염을 방지하기 위해) 수술실로 신속하게 운반합니다.
- 멸균 드레이프로 덮인 37°C 전기 가열 패드에 오가노이드가 있는 플레이트를 놓습니다.
- 오가노이드를 준비하기 전에 새 멸균 장갑으로 갈아입으십시오.
- 오가노이드를 멸균 균형 염 용액(BSS)(선택 사항)으로 헹군 다음 멸균 플라스틱 튜브로 부착된 광택 처리된 뭉툭한 끝이 멸균 BSS로 미리 채워진 멸균 500μL Hamilton 주사기에 부착된 얇은 벽의 붕규산 유리 캐뉼라(외경, OD 1.52mm, 내경, ID 1.12mm)로 구성된 인젝터에 로드합니다.
- 오가노이드를 주사할 준비가 되면 캐뉼라를 멸균 방식으로 수술팀에 전달합니다.
- 전체 절차(조직 배양 배지에서 오가노이드 제거부터 캐뉼라 로딩까지)의 길이를 20분 이하로 유지합니다.
- 오가노이드 이식이 지연되는 경우 접시 내부의 pH/CO2 포화도가 변하지 않도록 조직 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- 사용하지 않은 오가노이드를 동일한 조직 배양 인큐베이터에 1주일 동안 보관하고 오염 증거가 있는지 모니터링합니다.
3. 망막하 오가노이드 이식
- Stevens 건절개술 가위로 0.5-1cm 측면 안절개술을 시행합니다. 눈꺼풀을 열어 두기 위해 적절한 크기의 Barraquer 눈꺼풀 검경을 놓습니다. 수술 보조원이 시술 기간 동안 BSS로 각막을 정기적으로 세척하도록 합니다.
- 4시 및 8시 위치에서 윤부 바로 옆에 있는 결막에 6-0 실크 봉합사의 스테이 봉합사 2개를 배치하여 눈을 1차 시선으로 유지하고 세 번째 눈꺼풀을 후퇴시킵니다. 0.5 Castroviejo 각막 묶음 겸자와 작은 모기 지혈제를 사용하여 윤부 옆의 구근 결막을 부드럽게 잡습니다. 봉합사를 길게두고 작은 모기 지혈제로 끝을 고정하여 조작을 돕습니다.
알림: 세 번째 눈꺼풀 아래에 봉합사를 놓는 것이 더 어렵습니다. 윤부 바로 옆에 놓으십시오. - 윤부의 12시 위치에 다른 봉합사를 부분적으로 윤부의 두께를 통해 눈에 침투하지 않도록 주의하면서 놓습니다. 이 봉합사를 느슨하게 매듭짓고 끝을 짧게 자릅니다. 이것은 수술 중에 눈을 회전시키는 "손잡이"로 사용되는 견고한 앵커 봉합사를 제공하여 외과의가 절차의 여러 단계에서 지구의 다른 부분에 접근할 수 있도록 합니다.
참고: 3.2단계와 3.3단계는 반전할 수 있습니다. 스테이 봉합사 배치 순서는 외과의가 선호하는 것입니다. - 10-2시 방향 (시야 측정) 사이의 구근 결막을 반영합니다. 건절개술 가위를 사용하여 윤부에서 결막을 2-3mm 절개합니다. 그것을 훼손하고 장부의 캡슐을 제거하여 동물의 나이에 따라 윤부에서 약 3-5mm 떨어진 곳에 위치하는 2시 및 10시 유리체 절제술 부위의 공막을 노출시킵니다. 지혈을 위해 외과 용 셀룰로오스 창을 사용하고 혈액을 제거하십시오.
- 캘리퍼를 사용하여 결막과 장부 캡슐의 반사 후 경화술 부위를 식별합니다. 고양이에서 두드러질 수있는 주요 공막 혈관을 피하기 위해 경화 절개술 부위 (2시와 10시 방향에서 편평 통과를 목표로)를 선택하십시오. 계획된 경화술 부위의 공막에 습식 소작을 사용하여 공막 출혈을 줄이고, 기구 포트(오른손잡이 외과의의 경우 10시 방향 포트)에서 ~3mm 영역을 계획합니다.
- 유리체 절제술 포트를 배치하기 전에 제안된 경화술 부위에 매듭을 묶지 않고 십자형 패턴 봉합사(6-0 또는 7-0 폴리글락틴 봉합사)를 미리 배치합니다.
참고: 이것은 절차가 끝날 때 경화술의 신속한 폐쇄를 용이하게 합니다. 계획된 기구 포트의 봉합사는 긴 절개가 될 것이기 때문에 공막이 더 오래 물려야 합니다. - 봉합사가 배치되면 조수에게 12시 방향 스테이 봉합사를 묶거나 Bishop-Harmon 집게를 사용하여 지구본의 위치를 잡는 데 도움을 요청하십시오. 외과의가 0.12mm Castroviejo 겸자를 사용하여 경화 절개술 부위 옆에 조직을 고정하여 지구본을 안정화시킵니다.
- 렌즈에 닿지 않도록 시신경을 향한 각도로 향하는 2시 방향과 10시 위치 모두에서 공막을 통해 투관침을 사용하여 23G 유리체 절제술 포트를 삽입합니다.
- 팁이 유리체에서 시각화 될 수 있도록 묶는 집게를 사용하여 포트를 부드럽게 밀어 관개 포트가 유리체에 있는지 확인하십시오. 올바른 위치가 확인되면 관개 라인을 포트에 부착하고 얇은 접착 붕대를 사용하여 라인을 제자리에 테이프로 붙입니다. 유리체 절제술 기계의 전면 패널에 있는 화살표 버튼(위쪽 또는 아래쪽)을 눌러 BSS 버퍼의 유리체 절제술 주입을 초기에 30-35mmHg로 설정합니다.
- 조수가 Machemer 확대 관개 유리체 절제술 렌즈를 각막에 대고 다음 단계에서 눈의 뒤쪽 부분을 시각화할 수 있도록 합니다. 관개 유리체 절제술 렌즈를 점적 세트에 부착하여 렌즈를 각막에 결합하기 위해 일정한 유체 공급을 제공합니다.
참고: 다른 형태의 접촉성 유리체 절제술 렌즈도 사용할 수 있습니다. 실내 조명을 어둡게 하거나 꺼서 작동 현미경을 통해 시각화할 수 있습니다. - 23G 유리체 절제술 프로브/커터(2,500cpm)를 기구 포트(외과의가 주로 사용하는 손, 즉 오른손잡이 외과의의 경우 10시 방향 포트에 인접)를 통해 삽입하고 부분 코어 유리체 절제술을 수행합니다.
- 그런 다음 망막에서 유리체 얼굴을 분리하여 이식을받을 부위의 망막 표면에서 유리체를 완전히 제거합니다 (이것은 절차의 성공에 중요합니다).
- 유리체 절제술 탐침을 포트가 망막 표면에서 반대쪽을 향하도록 시신경두 위에 놓고 더 높은 진공을 적용하여 유리체 얼굴 박리를 시작합니다.
- 안내 사용을 위해 트리암시놀론 결정을 준비하십시오. 트리암시놀론 현탁액이 유리체강내 사용을 위해 특별히 사용되는 것이 아닌 경우 결정을 세척한 다음 BSS에 다시 현탁합니다.
- 처음에는 PES 멤브레인(1mL 주사기에 부착됨)이 있는 멸균 0.22μm 공극 주사기 필터를 사용하여 현탁액을 여과하여 결정을 포획합니다.
- 그런 다음 1mL 주사기에서 BSS를 흡인하고 필터를 통해 플러싱하여 갇힌 트리암시놀론 결정을 세척합니다(결정은 필터에 갇힌 상태로 남아 있음). 이것은 용액에서 방부제를 제거합니다. 세척을 3회 반복한 후 결정을 1mL BSS에 재현탁합니다.
- 기구 포트를 통해 트리암시놀론을 담고 있는 주사기의 바늘을 삽입합니다. 기구 포트를 통해 바늘을 삽입하는 동안 동공을 통해 바늘 끝을 관찰하여 렌즈를 만지지 않도록 주의하십시오. 0.25 내지 0.5 mL의 결정 현탁액을 주입한다. 그런 다음 기구 포트를 통해 유리체 절제술 프로브를 삽입하고 포트를 망막 표면에서 멀리 두고 시신경두에 가깝게 전진시키고 고진공을 사용하여 유리체 표면을 망막에서 분리하는 데 도움을 줍니다.
주: triamcinolone 결정은 달라붙어서 나머지 유리체를 강조합니다. 계획된 오가노이드 이식 부위 위와 옆에 있는 유리체를 조심스럽게 제거합니다(예: 중앙 영역에 가까운 중앙 태엽 안저). - 망막하 주사기(예: 멸균 BSS로 채워진 멸균 250μL 기밀 루어 잠금 주사기에 확장 가능한 41G 캐뉼라가 부착된 23G 망막하 주사기)를 사용하여 원하는 이식 부위에 작은 국소 망막 박리 블랩을 만듭니다.
- 망막하 안검을 만들기 전에 안검 형성을 촉진하기 위해 주입 압력을 10mmHg로 줄입니다.
- 기구 포트를 통해 인젝터를 삽입하고 망막 표면을 향해 전진시킵니다. 캐뉼라 팁을 밀어내고 망막 표면에 부드럽게 누릅니다. 어시스턴트에게 주사기 플런저를 약간 빠르게 눌러 원하는 크기에 도달할 때까지 망막 박리를 천천히 증가시킬 수 있도록 주입 압력을 줄이는 망막 박리를 시작하도록 요청하십시오(약 100-200μL의 BSS 사용).
- 생성 된 망막 절개술이 적절한 위치에 있으면 이식 부위와 시신경 머리 사이의 망막 절단을 피하여 이식 부위에서 파생 된 신경 섬유층의 절단을 방지하고 주요 망막 혈관을 피할 수 있습니다 (이것은 또한 연구 설계에 의해 결정되며, 우리의 경우 중심 망막이 선택되었습니다), 그런 다음 망막 가위의 도입을 용이하게 하기 위해 인젝터의 41G 캐뉼라를 사용하여 약간 확대합니다.
- 눈에서 인젝터를 제거하고 10시 방향 공막 포트를 제거합니다. 렌즈를 만지지 않도록 시신경을 향하는 직선 2.85mm 슬릿 나이프/각막 절개술을 사용하여 이 부위의 경화술을 확대합니다. 주입 압력을 10-15 mmHg로 유지하십시오.
- 망막 출혈을 예방하기 위해 망막 혈관 절단을 피하고 망막 출혈을 방지하기 위해 망막 가장자리의 망막을 시신경두에서 멀리 떨어진 유리체 망막 수직 80° 가위를 사용하여 망막 절개술을 확장합니다. 망막 절개술은 오가노이드를 수용하기에 충분한 너비여야 합니다.
- 확대된 경화술을 통해 오가노이드가 포함된 사전 로드된 유리 모세관(2.10단계 참조)을 삽입하고 직접 시각화하여 망막 절개술 부위를 향해 전진시킵니다.
- 유리 모세관의 끝을 사용하여 망막 절개술을 약간 열어 망막하 안검으로 들어가는 구멍에 접근합니다.
- 조수에게 인젝터의 플런저를 천천히 누르고 현미경을 통해 관찰하면서 오가노이드를 망막하 안검에 주입하도록 요청하십시오. BSS는 오가노이드보다 먼저 나타나야 하며 망막 절개술을 플러시해야 합니다.
- 망막 절개술의 가장자리에 있는 경우 유리 모세관의 끝으로 안개 내의 오가노이드를 부드럽게 밀어 넣습니다.
- 망막 절개술에서 유리 모세관을 몇 초 동안 잡고 망막 절개술을 닫고 오가노이드가 유리체로 빠져나가는 것을 방지합니다.
- 망막하 안개에서 오가노이드를 배출할 수 있는 눈 안의 체액 움직임을 피하기 위해 눈에서 체액이 갑자기 방출되는 것을 피하면서 눈에서 유리 모세혈관을 매우 천천히 제거합니다.
- 주입 압력을 20-30 mmHg로 천천히 증가시켜 안구 내 출혈을 예방하고 주입액이 안검으로 직접 씻겨 나가지 않도록주의하십시오. 이것은 유리체 절제술 기계의 전면 패널에 있는 위쪽 화살표 버튼을 눌러 수행됩니다.
- 십자 패턴 (6-0 또는 7-0 polyglactin)으로 미리 배치 된 봉합사를 사용하여 경화술을 닫습니다. 경화술을 봉합하기 위해 필요에 따라 단순 중단 봉합사를 추가합니다.
- 조수에게 주입 포트를 제거하고 외과의가 미리 배치 된 봉합사를 신속하게 묶어 경화술을 봉인하고 안압 손실을 방지하도록하십시오.
- 간단한 연속 패턴으로 6-0 또는 7-0 polyglactin을 사용하여 결막 절개 (peritomy)를 닫습니다.
- 안저를 이미지화하고(예: RetCam II 비디오 안저 카메라, Clarity 또는 이와 유사한 것을 사용하여) 망막하 공간 내에서 오가노이드의 즉각적인 위치를 기록합니다.
- 면봉 어플리케이터와 면봉을 사용하여 0.2% 포비돈 요오드 용액을 사용하여 이미징 후 안구 표면을 다시 준비합니다. 3개의 스테이 봉합사와 뚜껑 검경을 제거합니다.
- 6-0 polyglactin 봉합사로 측면 안과 절개술을 닫습니다. 단일 매설 봉합사를 놓고 8개의 피부 봉합사를 배치하여 측면 안각을 개질한 다음 단순 중단된 피부 봉합사를 사용하여 나머지 상처를 봉합합니다.
- 수술이 완료된 후 스테로이드와 항생제 조합(메틸프레드니솔론 아세테이트 2mg, 덱사메타손 0.1mg, 겐타마이신 1mg)을 결막하 주사합니다. 각막에 안과용 윤활제(인공 눈물)를 바르십시오.
- 동물을 마취에서 회복시키고 회복 중에 현저한 안검 경련, 조작에 대한 심한 거부감, 혼수 또는 식욕 감소, 호흡 및 심박수 증가와 같은 추가 치료가 필요한 통증 징후가 있는지 면밀히 모니터링합니다. 필요에 따라 수술 후 진통제를 제공하고 불편함이 있는지 면밀히 모니터링합니다.
알림: 적절하게 훈련된 직원만이 수술 전, 수술 중 및 수술 후에 고양이 환자를 마취 및 모니터링해야 합니다. 수술 후 관리에 대한 지역 동물 윤리 위원회의 권장 사항을 따르십시오.
4. 착상 후 절차, 수술 후 치료 및 평가
- 오가노이드의 염증 및 거부 반응을 조절하는 데 도움이 되는 경구 면역억제제(프레드니솔론 1mg/kg 및 사이클로스포린 2mg/kg 1일 2회 경구)로 계속 치료하십시오. 전신 항생제 적용 범위 제공(예: 경구용 독시사이클린 5mg/kg 1일 2회 – 이 항생제는 면역억제 동물에서 기회주의적 마이코플라스마 감염의 위험 때문에 선택됨).
- 염증이나 부작용의 발생을 모니터링하기 위해 정기적인 안과 검사를 수행합니다. 오가노이드를 망막하 공간에 주입하는 데 필요한 큰 망막 절개술에도 불구하고 수술 후 처음 며칠 동안 발생하는 평평함을 위해 망막 안검을 모니터링합니다. 이식된 오가노이드의 위치와 모양을 기록하기 위해 각 검사에서 안저 이미지를 기록합니다.
- 모니터링 기간 동안 및 실험 종료 전에 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경(cSLO) 및 스펙트럼 영역 – 광간섭 단층촬영(SD-OCT)5,31을 사용하여 전신 마취 하에 있는 동물을 이미지화합니다.
- AVMA 승인 방법(예: 펜토바르비탈 85mg/kg의 정맥 투여)을 사용하여 실험 종료 시 동물을 인도적으로 안락사시킵니다. 진정 후 스트레스를 최소화하기 위해 펜토바르비탈 투여를 위한 정맥 카테터를 놓습니다. 심장 박동을 멈추고 흉부를 절개하여 기흉을 만들어 사망을 확인합니다.
- 표준 결막 접근법을 통해 눈을 제거하고 필요에 따라 고정합니다. 면역조직화학(IHC)의 경우, 0.3mL의 고정 용액을 11개의 Parker 블레이드(윤부에서 ~3-4mm)로 편평 파를 통해 만든 3개의 슬릿을 통해 후방 분절에 주입한 후 즉시 4% 파라포름알데히드 용액에 눈을 담그십시오.
- 4°C에서 3.5시간 고정 후 아이컵을 해부합니다. 잔류 유리체를 제거하고 망막과 오가노이드를 온전하게 보존하십시오. 4°C에서 추가로 30분 동안 고정액에 다시 넣은 다음 PBS에서 10분 동안 아이컵을 각각 3번 헹굽니다. 아이컵을 15% 자당에 2시간 동안 옮긴 다음 30% 자당에 2시간 더 옮깁니다.
- PBS로 아이컵을 두 번 헹구고 OCT 배지(최적 절단 온도 화합물)에 삽입하고 급속 동결한 다음 조직학 및 면역화학을 위해 절개할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
- 연구 프로토콜 및 목표에 따라 IHC에 대한 항체를 선택하십시오.
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Representative Results
이 절차를 통해 큰 눈 동물 모델의 망막하 공간에 hPSC 유래 망막 오가노이드를 성공적이고 재현 가능하게 이식할 수 있습니다(여기서는 건강한 광수용체(PR)가 있는 야생형 고양이와 퇴행성 PR 및 망막이 있는 CrxRdy/+ 고양이의 2가지 예를 사용하여 시연됨). 그림 1에 표시된 단계를 사용하여 hPSC 유래 망막 오가노이드를 준비하고 오가노이드가 손상되지 않도록 주입 장치의 붕규산 유리 캐뉼라에 로드합니다. 이는 오가노이드 로딩 중(단계 2.10) 및 수술 중(단계 3.16)(그림 2A, B)과 수술 종료 시 안저 영상(단계 3.23, 그림 2C)을 통해 직접 시각화하여 확인할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 망막하 공간에 오가노이드의 존재는 오가노이드의 위치와 모양을 기록하는 안과 검사 및 안저 영상(그림 3A)을 통해 수술 후 확인됩니다. 냉동 조직학 및 면역조직화학을 위해 글로브를 처리할 때 이식의 위치를 아는 것이 매우 중요하며 12-14μm(극저온 절개 두께)의 큰 눈을 절개하는 데 시간이 걸리기 때문에 작업량을 크게 줄입니다. 안락사 전에 공초점 주사 레이저 검안경(cSLO) 및 스펙트럼 영역 – 광간섭 단층촬영(SD-OCT) 이미징도 수행하여 망막하 공간에서 오가노이드의 위치를 평가합니다(그림 3A-D). 이러한 기술은 수용자 눈의 망막하 공간(신경 망막과 RPE 사이)에서 망막 오가노이드의 지속성을 보여줍니다(그림 3E). 안락사(AVMA 권장 사항에 따라 인도적으로 수행됨) 후 조직학 및 면역조직화학(IHC)이 일상적으로 수행됩니다(이전에 발표된 논문31의 세부 사항 참조). 조직학 및 IHC는 동물이 면역억제되었을 때 큰 눈의 망막하 공간에서 이종 이식편(hPSC 유래 망막 오가노이드)의 생존을 입증합니다(이전에 설명된바와 같이 31).
그림 1: 이식 전 오가노이드 준비 단계의 개략도.
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그림 2: 오가노이드의 외과적 망막하 이식. (A) 손상 없이 유리 캐뉼라를 통해 망막하 공간으로 전달되는 오가노이드의 직접 시각화, (B) 망막하 안검에서 오가노이드의 직접 시각화, (C) 수술 직후 망막하 이식된 오가노이드의 광각 안저 컬러 이미지. 블랩 가장자리는 검은색 화살촉으로, 망막 절개술 부위는 검은색 별으로 표시됩니다.
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그림 3: CrxRdy/+ 고양이에서 이식 3개월 후 망막하 오가노이드의 수술 후 평가. (A) 망막하 오가노이드의 안저 컬러 이미지, (B) 망막하 이식된 오가노이드의 cSLO 안저 이미지, (C) 오가노이드를 포함하는 영역의 3D 볼륨 스캔 재구성, (D) 망막하 오가노이드를 포함하는 영역의 cSLO 이미지, (E) 망막하 오가노이드의 SD-OCT 고해상도, 단면 이미지. 망막 절개술 부위는 검은 별들로 표시됩니다.
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그림 4: 이식 3개월 후 CrxRdy/+ 고양이의 망막하 공간에서 인간 망막 오가노이드 유래 광수용체 시트(PR 마커 RCVRN). *고양이 내부 핵층(INL)의 시냅스 부톤(hSYP=Synaptophysin).
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Discussion
hPSC 유래 망막 조직(망막 오가노이드)을 망막하 공간에 이식하는 것은 PR 세포 사멸(심도 또는 말기 실명)로 인한 말기 망막 퇴행성 질환의 시력 회복을 위한 유망한 실험적 접근 방식입니다. 제시된 접근법은 인간 태아 망막 조직 23,24,25 조각의 망막하 이식을 기반으로 이전에 개발되고 성공적으로 테스트된 실험적 치료법을 기반으로 합니다. 이는 hPSC로부터 유래된 대체적이고 보충 가능하며 윤리적으로 수용 가능한 망막 조직 공급원의 사용을 제시한다. 큰 눈 동물 모델에서 치료의 외과적 타당성과 안구 안전성을 입증하는 것은 임상 적용에 대한 이 유망한 접근 방식의 발전을 위해51,55가 필요합니다. 이 원고는 정상 망막과 퇴행성 망막이 모두 있는 대형 동물 모델(LCA의 CrxRdy/+ 고양이 모델)에서 hPSC-3D 망막 조직(망막 오가노이드)의 망막하 이식에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 인간 망막의 평평한 조각과 RPE 패치를 도입하는 절차가 개발되었지만43,44,45, 더 큰 3D 이식편(진행된 RD 조건에서 시력을 회복하는 데 필요함)의 이식은 조사되지 않았습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 전체 망막 오가노이드(오가노이드 테두리가 아닌)의 망막하 전달을 위한 이식 절차를 위한 것이며, 또한 PR이 있는 온전한 망막 시트를 도입하는 잠재적으로 더 나은 방법으로서 일부 RPE를 운반하여 이식편 생존을 증가시키고 시트 보존을 개선합니다. 이 프로토콜의 다른 부분은 잘 설정되어 있습니다. 예를 들어, 유리체 절제술은 망막 재 부착 수술 동안 유리체 망막 외과 의사에 의해 널리 사용된다 (56,57,58,59,60). 망막하 주사는 예를 들어 유전자 증강 요법 3,7,61,62,63,64에서 더욱 일반적으로 사용되고 있다. 적절한 망막 절개술의 생성과 상대적으로 큰 오가노이드를 망막하 공간에 주입하는 것에 대한 설명은 제한적입니다.
중요한 단계에는 수정체를 피하기 위한 경화술의 신중한 위치 지정 및 수행, 이식 부위의 망막 표면에서 유리체 피질의 완전한 제거, 망막하 안검의 형성 제어, 이식 캐뉼라의 너비를 수용할 수 있는 최적의 크기의 망막 절개술 생성, 다른 단계 동안 정의된 주입 압력 유지, 및 캐뉼라 철수. 최적의 결과를 보장하기 위해 최적화된 내경 및 외경(ID 및 OD)과 길이를 가진 올바른 이식 캐뉼라를 선택하고, 안구 내 출혈을 제어하고, 오가노이드에서 수술실 및 기구에 이르는 전체 절차의 무균성, 수술 기간(30-45분/동물)을 선택합니다. 저자는 고양이 유리체의 두께/점도로 인해 23G 유리체 절제술로 최상의 결과를 얻을 수 있으며, 41G 캐뉼라가 있는 주입기로 기절체를 만든 다음 80° 각도의 망막 가위를 사용하여 안개 가장자리에서 망막 절제술을 확장합니다. 다른 중요한 요소로는 붕규산 유리 캐뉼라(외경 OD 1.52mm, 내경, 내경 1.12mm, 길이 10.16cm)에 맞게 2.85mm 각막 절개술을 사용하여 경화 절제술을 연장하고 축 길이가 약 20.5mm(20.91mm ± 0.53mm)55인 큰 눈에 더 큰 오가노이드를 이식할 수 있습니다. 유리 모세관의 사용은 이식 과정에서 손상 없이 하강 크기의 오가노이드를 로딩하고 전달하는 데 현재 가장 적합했습니다. 유리체 절제술 중 주입 압력을 20-30mmHg에서 안검 형성 단계 동안 10mmHg로 줄이는 것이 망막 오가노이드를 위한 공간을 만드는 데 필요한 망막 박리를 생성하는 데 최적이라는 것이 밝혀졌습니다. 또한, 최근 보고된 바와 같이 장거리 운송 동안 hPSC-3D 망막 조직(오가노이드)의 생존력과 이종계 인간 이식편의 유지를 위한 최적화된 면역억제 요법을 선택하는 것이 중요합니다31,54.
저자들은 반사율이 높은 고양이 tapetum으로 인해 수술을 수행하는 데 엔도 조명이 필요하지 않다는 것을 발견했습니다. 아타페탈 종(예: 돼지, 비인간 영장류)에 이식하려면 내부 조명을 포함하는 3포트 유리체 절제술이 필요합니다. 일상적인 망막 박리 수술에서 수행되는 탐포네이드(예: 과불화탄소 후 실리콘 오일 사용)는 블렙에 대한 압력이 오가노이드를 유리체로 압출시킬 위험이 있기 때문에 수행되지 않았습니다. 향후 개발에는 망막 구멍을 밀봉하기 위해 현재 조사되고 있는 재료의 사용이 포함될 수 있습니다. 이것은 유리체에 오가노이드가 이식 후 손실되는 것을 방지하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 Kenalog-40과 유사하지만 방부제가 없는 트리암시놀론을 함유한 Triescence는 유리체를 시각화하는 대안으로 사용할 수 있습니다.
어린 동물(예: 1-2개월)의 작은 지구 크기는 큰 눈(성인 동물)에 비해 더 많은 외과적 어려움을 나타냈습니다. 그럼에도 불구하고, 여기에 기술된 방법을 사용하여, 망막하 이식편을 전달할 수 있다. CrxRdy/+ LCA 모델에서 더 큰 망막 얼룩이 항상 다시 부착되는 것은 아닌 것으로 나타났습니다. 망막 오가노이드를 주입하는 데 필요한 최소 크기로 안검을 유지하면 이 합병증이 감소합니다. RD 망막에 더 빨리 이식하는 것(신경 망막이 현저하게 얇아질 때 PR이 완전히 손실되기 전)은 인간 태아 망막 이식편에 대한 초기 연구와 일치하는 또 다른 지침이다20. 또 다른 참고 사항 – 자세한 기술은 전체 망막 오가노이드가 이식되기 때문에 망막 시트를 올바른 방향으로 배치하는 데 의존하지 않습니다. 편평한 hESC-망막 시트의 개발과 함께 이것은 중요할 것입니다. 그러나 손상되지 않은 hESC-망막 조직 시트를 전달하고 PR 시트의 망막하 보존을 최적화하는 것을 목표로 하는 이 프로토콜의 초점은 아닙니다. 일단 기술이 개발되면 정상 망막과 RD 망막 모두에서 재현 가능했습니다.
이 수술 절차에는 많은 잠재적인 합병증이 있습니다. 유리체망막 수술에 숙련된 사람(예: 훈련된 수의사 안과 의사 또는 인간 눈과 비교하여 고양이 눈의 종 차이에 대해 잘 알고 있는 유리체 망막 외과 의사)만 절차를 수행해야 합니다. 가능한 합병증으로는 투관침 배치 중 수정체 접촉, 경화 절개술 확대 중 공막 출혈, 망막하 또는 망막 출혈이 있습니다. 시간 경과에 따른 이식편의 파괴 또는 안내염으로 이어지는 이종계 인간 오가노이드 이식편에 대한 숙주 면역 반응과 같은 다른 합병증이 가능합니다. 경구 면역 억제제 및 항생제를 사용하면 이러한 발생을 예방하는 데 도움이됩니다. 야생형과 CrxRdy/+ 고양이의 이식 사이에 차이가 있다는 점에 유의하는 것도 중요합니다. 진행성 망막 변성이 있는 경우 망막 안검이 야생형보다 더 넓게 퍼지는 경향이 있으며 경우에 따라 수술 후 완전한 망막 재부착을 방지할 수 있습니다. 여기에 제시된 기술은 IRD의 대형 동물 모델의 눈에 오가노이드를 이식하는 데 적용할 수 있습니다. 이식이 클리닉으로 번역 될 준비가되면 더 많은 개선이 필요할 것입니다.
큰 눈 모델에서 복잡한 유리체 망막 수술 절차를 수행한 저자의 경험을 바탕으로, 이 원고에 제시된 기술은 유리체 망막 수술 기술을 클리닉으로 번역하는 데 사용되는 다른 대형 동물 모델(아타페탈 종에 엔도 조명 포함)에 적용할 수 있어야 합니다43,44,45.
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Disclosures
Ratnesh K. Singh, Ph.D., Francois Binette, Ph.D. 및 Igor O. Nasonkin Ph.D.는 Lineage Cell Therapeutics, Inc.의 직원입니다. 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NEI Fast-track SBIR 보조금 R44-EY027654-01A1 및 SBIR 보조금 3 R44 EY 027654 - 02 S1(I.O.N., Lineage Cell Therapeutics, Dr. Petersen-Jones는 공동 PI)의 지원을 받았습니다. 저자는 이 연구에 포함된 동물에 대한 마취 및 일반적인 관리와 수술 환경 및 기구 준비/살균에 도움을 준 Ms. Janice Querubin(MSU RATTS)에게 감사드립니다. 저자는 이식 전날 오가노이드를 받아 배지에 삽입하는 데 도움을 준 Paige Winkler 박사와 이식 당일에 도움을 준 Paige Winkler 박사에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 망막 오가노이드의 부지런한 배송, 배송업체 조립, 각 배송 후 온도 및 G-스트레스 기록 다운로드에 대해 Mr. Randy Garchar(LCTX)에게 감사드립니다. 이 작업은 작가 Igor Nasonkin이 Biotime(현재 Lineage)에 고용되어 있는 동안 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore syringe filter with PES membrane | Cameo | NA | can be found through various suppliers |
| 23G subretinal injector with extendable 41 G cannula | DORC | 1270.EXT | |
| 250 µL hamilton gas tight luer lock syringe | Hamilton | NA | can be found through various suppliers |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | 707G | |
| 6-0/7-0 polyglactin suture | Ethicon | J570G | |
| Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) | Henry Schein Animal Health | NA | can be found through various suppliers |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NA | can be found through various suppliers |
| cSLO + SD-OCT | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+ OCT | |
| Cyclosporine | Novartis | NA | can be found through various suppliers |
| Dexamethasone 2mg/mL (Azium) | Vetone | NA | can be found through various suppliers |
| Doxycyline 25mg/5mL | Cipla | NA | can be found through various suppliers |
| Fatal Plus solution (pentobarbital solution) | Vortech | NA | can be found through various suppliers |
| Gentamicin 20mg/2mL | Hospira | NA | can be found through various suppliers |
| Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing | World Precision Instruments | TW150-4 | |
| Methylprednisolone actetate 40 mg/mL | Pfizer | NA | can be found through various suppliers |
| Microscope | Zeiss | NA | |
| OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) | Sakura | 4583 | |
| Olympic Vac-Pac Size 23 | Natus | NA | can be found through various suppliers |
| Paraformaldehyde 16% solution | EMS | 15719 | |
| Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution | Akorn | NA | can be found through various suppliers |
| Prednisolone 15mg/5mL | Akorn | NA | can be found through various suppliers |
| Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) | Zoetis | NA | can be found through various suppliers |
| RetCam II video fundus camera | Clarity Medical Systems | NA | can be found through various suppliers |
| Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) | Bristol -Myers Squibb Company | NA | can be found through various suppliers |
| Tropicamide 1% ophthalmic solution | Akorn | NA | can be found through various suppliers |
| Vitrectomy 23G port | Alcon | Accurus systems | |
| Vitrectomy machine | Alcon | Accurus systems | |
| Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle | Frimen | FT170206T |
References
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