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Neuroscience

"एक बिल्ली के बड़े पशु मॉडल में मानव भ्रूण स्टेम सेल-व्युत्पन्न रेटिना ऊतक का सबरेटिनल प्रत्यारोपण

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/61683
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1
1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) -व्युत्पन्न रेटिना ऊतक को एक बड़े पशु मॉडल के सबरेटिनल स्पेस में प्रत्यारोपण के लिए एक सर्जिकल तकनीक है।

Abstract

फोटोरिसेप्टर हानि से जुड़ी रेटिना अपक्षयी (आरडी) स्थितियां जैसे उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी), रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी) और लेबर जन्मजात एमौरोसिस (एलसीए) प्रगतिशील और दुर्बल दृष्टि हानि का कारण बनती हैं। उन उपचारों की एक अपूर्ण आवश्यकता है जो फोटोरिसेप्टर खो जाने के बाद दृष्टि को बहाल कर सकते हैं। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) -व्युत्पन्न रेटिना ऊतक (ऑर्गेनोइड्स) को उन्नत आरडी के साथ एक आंख के सबरेटिनल स्पेस में प्रत्यारोपण हजारों स्वस्थ उत्परिवर्तन-मुक्त फोटोरिसेप्टर के साथ रेटिना ऊतक शीट लाता है और एक अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ फोटोरिसेप्टर अपघटन से जुड़े अधिकांश / सभी अंधा रोगों का इलाज करने की क्षमता रखता है। पशु मॉडल और उन्नत आरडी वाले लोगों के सबरेटिनल स्पेस में भ्रूण रेटिना ऊतक का प्रत्यारोपण सफलतापूर्वक विकसित किया गया है, लेकिन नैतिक चिंताओं और सीमित ऊतक आपूर्ति के कारण नियमित चिकित्सा के रूप में उपयोग नहीं किया जा सकता है। बड़ी आंखों के वंशानुगत रेटिना अपघटन (आईआरडी) पशु मॉडल सबरेटिनल स्पेस में रेटिना कोशिकाओं / ऊतक को प्रत्यारोपण करने के लिए उन्नत सर्जिकल दृष्टिकोण का उपयोग करके दृष्टि बहाली उपचार विकसित करने के लिए मूल्यवान हैं। ग्लोब आकार, और फोटोरिसेप्टर वितरण में समानताएं (उदाहरण के लिए, मैक्यूला जैसे क्षेत्र क्षेत्र सेंट्रलिस की उपस्थिति) और आईआरडी मॉडल की उपलब्धता मानव आईआरडी को बारीकी से पुन: व्यवस्थित करने से क्लिनिक में एक आशाजनक चिकित्सा के तेजी से अनुवाद की सुविधा होगी। यहां प्रस्तुत एक बड़े पशु मॉडल के सबरेटिनल स्पेस में एचपीएससी-व्युत्पन्न रेटिना ऊतक को प्रत्यारोपित करने की एक सर्जिकल तकनीक है जो पशु मॉडल में इस आशाजनक दृष्टिकोण के मूल्यांकन की अनुमति देती है।

Introduction

दुनिया भर में लाखों लोग रेटिना अपघटन (आरडी) से प्रभावित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रकाश-संवेदन फोटोरिसेप्टर (पीआर) के नुकसान से जुड़े दृश्य हानि या अंधापन होता है। उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) अंधापन का एक प्रमुख कारण है जो आनुवंशिक जोखिम कारकों और पर्यावरणीय / जीवन शैली कारकों के संयोजन से उत्पन्न होता है। इसके अलावा, 200 से अधिक जीन और लोकी को विरासत में मिली आरडी (आईआरडी) 1 का कारण पाया गया है। रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी), सबसे आम आईआरडी, आनुवंशिक रूप से हेटरोजेनस है जिसमें लगभग 70 जीनों में 3,000 से अधिक आनुवंशिक उत्परिवर्तन 2,3,4 रिपोर्ट किए गए हैं। लेबर जन्मजात अमौरोसिस (एलसीए), जो बचपन में अंधापन का कारण बनता है, आनुवंशिक रूप से भी हेटरोजेनस 5,6 है। जीन वृद्धि चिकित्सा विकसित की गई है और आईआरडी 3,7 की एक छोटी संख्या के इलाज के लिए नैदानिक परीक्षणों में है। हालांकि, आईआरडी के प्रत्येक विशिष्ट आनुवंशिक रूप के उपचार के लिए एक अलग चिकित्सा विकसित की जानी चाहिए और इस तरह केवल रोगियों के एक छोटे से उप-समूह का इलाज किया जाना चाहिए। इसके अलावा, जीन वृद्धि बचाव योग्य फोटोरिसेप्टर की आबादी की उपस्थिति पर निर्भर करती है और इसलिए, उन्नत अध: पतन के लिए लागू नहीं होती है।

इसलिए, उन्नत आरडी और गहन से टर्मिनल अंधापन को संबोधित करने और इलाज करने वाले उपचारों के विकास के लिए एक तत्काल और अभी तक अपूर्ण नैदानिक आवश्यकता है। पिछले 2 दशकों में न्यूरोप्रोस्थेटिक प्रत्यारोपण विकसित किए गए हैं औरमानव उपयोग 8,9,10,11,12,13,14 से पहले बिल्ली जैसे बड़े पशु मॉडल में परीक्षण किया गया है। इसी तरह, पिछले 20 वर्षों में भ्रूण या यहां तक कि परिपक्व स्तनधारी रेटिना ग्राफ्ट की चादरों का उपयोग करके रेटिना प्रतिस्थापन उपचार 15,16,17,18,19,20,21,22 विकसित किए गए हैं और यहां तक कि आरडी रोगियों 23,24,25 में सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है।. दोनों दृष्टिकोण नए सेंसर (न्यूरोप्रोस्थेटिक उपकरणों26,27 के मामले में फोटोवोल्टिक सिलिकॉन फोटोडायोड, और रेटिना शीट प्रत्यारोपण के मामले में शीट में व्यवस्थित स्वस्थ उत्परिवर्तन-मुक्त फोटोरिसेप्टर) को पेश करने के विचार का उपयोग करते हैं। हाल के अध्ययनों ने स्टेम सेल-आधारित दृष्टिकोणों के उपयोग की जांच की है जैसे कि मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी)-व्युत्पन्न रेटिना पूर्वजों28,29, एचपीएससी-फोटोरिसेप्टर 30, और एचपीएससी-रेटिना ऑर्गेनोइड्स31,32,33 का प्रत्यारोपण। रेटिना ऑर्गेनोइड्स एक डिश में रेटिना ऊतक के गठन और हजारों उत्परिवर्तन-मुक्त पीआर के साथ फोटोरिसेप्टर शीट की व्युत्पत्ति को सक्षम करते हैं, जो विकासशील मानव भ्रूण रेटिना 34,35,36,37,38,39,40 में फोटोरिसेप्टर परत से मिलते जुलते हैं।. आरडी स्थितियों वाले रोगियों के सबरेटिनल स्पेस में एचपीएससी-व्युत्पन्न रेटिना ऊतक (ऑर्गेनोइड्स) को प्रत्यारोपित करना नए और आशाजनक जांच सेल थेरेपी दृष्टिकोणों में से एक है, जिसे 31,32,41,42 टीमों द्वारा पीछा किया जा रहा है। सेल निलंबन (युवा फोटोरिसेप्टर या रेटिना पूर्वजों) के प्रत्यारोपण की तुलना में, भ्रूण फोटोरिसेप्टर की प्रत्यारोपित चादरों को नैदानिक परीक्षणों23,24 में दृष्टि में सुधार के परिणामस्वरूप प्रदर्शित किया गया था।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल विस्तार से, पूरे रेटिना ऑर्गेनोइड्स (ऑर्गनॉइड रिम्स33,41 के बजाय) के सबरेटिनल डिलीवरी के लिए एक प्रत्यारोपण प्रक्रिया का वर्णन करता है, जो पीआर के साथ बरकरार रेटिना शीट पेश करने का एक संभावित बेहतर तरीका है, ताकि ग्राफ्ट अस्तित्व को बढ़ाया जा सके और शीट संरक्षण में सुधार किया जा सके। हालांकि मानव रेटिना के एक सपाट टुकड़े और आरपीई पैच को पेश करने की प्रक्रिया 43,44,45 विकसित की गई है, लेकिन बड़े 3 डी ग्राफ्ट के प्रत्यारोपण की जांच नहीं की गई है। स्टेम सेल-व्युत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड्स दृष्टि बहाली प्रौद्योगिकियों के विकास के लिए फोटोरिसेप्टर शीट का एक अटूट स्रोत प्रदान करते हैं, नैतिक प्रतिबंध से मुक्त होते हैं, और उन्नत आरडी और टर्मिनल अंधापन के इलाज पर केंद्रित उपचारोंके लिए मानव रेटिना ऊतक का एक उत्कृष्ट स्रोत माना जाता है। मेजबान रेटिना आला (तंत्रिका रेटिना, रेटिना वर्णक उपकला और रेटिना और कोरॉयडल वाहिका) को न्यूनतम चोट के साथ रेटिना ऑर्गेनोइड्स के सटीक सबरेटिनल प्रत्यारोपण के लिए शल्य चिकित्सा विधियों का विकासनैदानिक अनुप्रयोगों की ओर ऐसी चिकित्सा को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। बिल्लियों, कुत्तों, सूअरों और बंदरों जैसे बड़े पशु मॉडल सर्जिकल वितरण विधियों की जांच के साथ-साथ ऊतक (रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) कोशिकाओं) की प्रत्यारोपित चादरों की सुरक्षा का प्रदर्शन करने और ऑर्गेनोइड्स 41,44,45,47,48,49,50 के उपयोग की जांच करने के लिए अच्छे मॉडल साबित हुए हैं।. बड़े जानवरों की आंख में मानव के समान ग्लोब आकार के साथ-साथ समान शरीर रचना विज्ञान भी होता है, जिसमें शंकु (क्षेत्र केंद्रीय) सहित उच्च फोटोरिसेप्टर घनत्व के क्षेत्र की उपस्थिति शामिल है, जो मानव मैक्यूला 6,51,52 जैसा दिखता है।

इस पांडुलिपि में, एचपीएससी-व्युत्पन्न रेटिना ऊतक (ऑर्गेनोइड्स) को बिल्ली के बड़े जानवरों के मॉडल (जंगली-प्रकार और सीआरएक्सआरडीवाई / + बिल्लियों दोनों) के सबरेटिनल स्पेस में आरोपण के लिए एक तकनीक का वर्णन किया गया है, जो आशाजनक प्रभावकारिता परिणामों के साथ मिलकरआरडी स्थितियों के इलाज के लिए नैदानिक अनुप्रयोगों की ओर इस तरह के जांच चिकित्सा के आगे के विकास के लिए एक नींव बनाता है।

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Protocol

ऑप्थेल्मिक और विजन रिसर्च में जानवरों के उपयोग के लिए एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) बयान के अनुपालन में प्रक्रियाएं आयोजित की गईं। उन्हें मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा भी अनुमोदित किया गया था। मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी में बनाए गए बिल्लियों की एक कॉलोनी से जंगली-प्रकार और सीआरएक्सआरडीवाई / + बिल्लियों का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था। जानवरों को 12 घंटे: 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्रों के तहत रखा गया था और एक वाणिज्यिक पूर्ण बिल्ली आहार खिलाया गया था।

1. प्री-इम्प्लांटेशन प्रक्रियाएं और सर्जिकल सेट-अप

  1. अध्ययन डिजाइन के आधार पर जंगली प्रकार या CrxRdy / + बिल्लियों का चयन करें। स्लिट लैंप बायोमाइक्रोस्कोपी और अप्रत्यक्ष नेत्ररोग सहित एक पूर्व-शल्य चिकित्सा नेत्र परीक्षा करें। फंडस असामान्यताओं वाले किसी भी जानवर को बाहर करें जो उनके जीनोटाइप से संबंधित नहीं हैं।
  2. प्रत्यारोपण से एक सप्ताह पहले, प्रत्यारोपण अस्वीकृति को रोकने में मदद करने के लिए जानवरों को मौखिक साइक्लोस्पोरिन 2 मिलीग्राम / किलोग्राम और प्रेडनिसोलोन 1 मिलीग्राम / किलोग्राम दोनों के इम्यूनोसप्रेसिव प्रोटोकॉल पर शुरू करें।
  3. 4 महीने से अधिक उम्र के जानवरों को रात भर (कम से कम 8 घंटे) उपवास करें। 4 महीने से कम उम्र के जानवरों को रात भर सीमित मात्रा में गीला भोजन प्रदान करें, और फिर, सर्जरी से पहले उन्हें 2 घंटे तक उपवास करें।
  4. एक सामान्य शारीरिक परीक्षा करें, जिसमें छाती का फैलाव (स्टेथोस्कोप का उपयोग करके) शामिल है। हृदय और श्वसन दर, तापमान, श्लेष्म झिल्ली रंग और केशिका रिफिल समय रिकॉर्ड करें।
  5. 4 महीने से कम उम्र के जानवरों को ब्यूप्रेनोर्फिन (0.02 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ प्री-मेडिकेशन करें, और 4 महीने से अधिक उम्र के लोगों को ब्यूप्रेनोर्फिन (0.02 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ एसेप्रोमाज़िन (0.02 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ संयुक्त रूप से या इंट्रामस्क्युलर रूप से सामान्य संज्ञाहरण प्रेरण से 30-45 मिनट पहले।
  6. पुतली को पतला करने के लिए ओकुलर सतह पर कम से कम दो बार सामयिक 1% ट्रॉपिकामाइड नेत्र समाधान और 10% फेनिलफ्राइन नेत्र समाधान लागू करें। यदि विद्यार्थियों को अच्छी तरह से पतला नहीं किया जाता है तो दोहराएं।
  7. सभी जानवरों में सेफेलिक नस में 22 ग्राम अंतःशिरा कैथेटर रखें: सेफलिक नस के ऊपर 2 x 3 सेमी क्षेत्र से पहली क्लिप बाल; पहले इसे 70% इथेनॉल के साथ और फिर क्लोरहेक्सिडाइन स्क्रब के साथ स्क्रब करके त्वचा तैयार करें; कैथेटर रखें और मेडिकल टेप के साथ सुरक्षित रखें और हेपरिनाइज्ड सेलाइन के साथ फ्लश करें। 4 महीने से कम उम्र के जानवरों में, यह संज्ञाहरण के प्रेरण के बाद किया जा सकता है।
  8. प्रीमेडिकेशन के 30-45 मिनट बाद सामान्य संज्ञाहरण को प्रेरित करें: 4 महीने से कम उम्र के जानवरों को मास्क द्वारा वितरित आइसोफ्लुरेन के साथ प्रेरित किया जाता है, 4 महीने से अधिक उम्र के लोगों को अंतःशिरा प्रोपोफोल (4-6 मिलीग्राम / किग्रा) का उपयोग करके प्रेरित किया जाता है।
  9. एंडोट्रेकियल ट्यूब के उपयुक्त आकार के साथ इंटुबेट। एक परीक्षा प्रकाश या लैरींगोस्कोप के साथ स्वरयंत्र की कल्पना करें। स्वरयंत्र पर 0.1 एमएल लिडोकेन 2% स्प्रे करें, कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें और फिर इंटुबेट करें।
  10. बैन सिस्टम के माध्यम से ऑक्सीजन (300-600 एमएल / किग्रा / मिनट) में आइसोफ्लुरेन (2% -3.5% के बीच) के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
  11. जानवर को पृष्ठीय स्थिरता में एक पोजिशनिंग तकिए पर रखें, जिस पर तौलिए से ढका गर्म पानी का कंबल रखा जाता है। एक रोगी की निगरानी और हृदय गति और इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईसीजी), श्वसन दर, रक्तचाप, ऑक्सीजन संतृप्ति और अंत-ज्वारीय कार्बन डाइऑक्साइड की निगरानी और निगरानी करें। प्रक्रिया के दौरान नियमित रूप से शरीर के तापमान की निगरानी करें। एक उपयुक्त रूप से प्रशिक्षित व्यक्ति संज्ञाहरण के रखरखाव और निगरानी के लिए जिम्मेदार है।
  12. पोजिशनिंग तकिए की मदद से जानवर को इस तरह रखें कि आंख को प्राथमिक गेज स्थिति में घुमाने पर कॉर्नियल सतह क्षैतिज हो। मेडिकल टेप का उपयोग करके सिर को सुरक्षित रखें।
  13. शरीर के तापमान को बनाए रखने में मदद करने के लिए जानवर को कंबल से ढक दें।
  14. हेपरिनाइज्ड सेलाइन के साथ अंतःशिरा कैथेटर को फ्लश करें और प्रक्रिया की अवधि के लिए 2-5 एमएल / किग्रा / घंटा पर आपूर्ति की जाने वाली रिंगर लैक्टेट का अंतःशिरा जलसेक शुरू करें।
  15. 0.2% पोविडोन-आयोडीन, बाँझ कपास स्वैब एप्लिकेटर और कपास गेंदों का उपयोग करके सड़न रोकनेवाला सर्जरी के लिए ओकुलर सतह, नेत्रश्लेष्मला थैली और पलकें तैयार करें।
  16. ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप को आंखों के टुकड़ों के साथ रखें और उचित रूप से समायोजित करें। माइक्रोस्कोप (फोकस, ज़ूम और एक्सवाई-अक्ष नियंत्रण) और विट्रोक्टॉमी मशीन के लिए पैर नियंत्रण रखें ताकि सर्जन उन्हें संचालित कर सके।
  17. सड़न रोकनेवाला सर्जरी के लिए तैयार रहें: सभी कर्मियों को सर्जिकल स्क्रब, एक सर्जिकल टोपी और एक मास्क पहनना चाहिए। सुनिश्चित करें कि सर्जन और सहायक नियमित सड़न रोकनेवाला सर्जरी के लिए स्क्रब, गाउन और दस्ताने पहनें। सभी कर्मियों को सड़न रोकनेवाली तकनीक ों से परिचित होना चाहिए।
  18. एक बार जब कर्मियों को स्क्रब किया जाता है, गाउन किया जाता है, और दावत दी जाती है, तो सर्जिकल पैक खोलें, और उपकरणों को बिछाएं। माइक्रोस्कोप समायोजन नॉब्स पर बाँझ हेरफेर नॉब्स रखें ताकि सर्जन या सहायक को एसेप्सिस को तोड़ने के बिना समायोजित करने की अनुमति मिल सके। ओकुलर सर्जरी के लिए जानवर को एक नियमित फैशन में लपेटें।
  19. दो-पोर्ट विट्रोक्टॉमी के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए विट्रोक्टॉमी मशीन तैयार करें।
    1. सहायक की मेज पर एक विट्रोक्टॉमी संपर्क लेंस और दो पोर्ट 23 जी विट्रोक्टॉमी रखें। गीले खेत की छत संलग्न करें। जलसेक ट्यूबिंग और 23 जी विट्रोक्टॉमी हैंडपीस को संलग्न और प्राइम करें।
    2. बाँझ ड्रेप के ऊपर विट्रोक्टॉमी उपकरणों और द्रव रेखाओं को रखें और तौलिया क्लैंप का उपयोग करके उन्हें स्थिति में बनाए रखें। विट्रोक्टॉमी मशीन को आनुपातिक वैक्यूम मोड में 1,500 और 2,500 कट प्रति मिनट (सीपीएम) और 500 मिमीएचजी के अधिकतम वैक्यूम के बीच सेट करें। यह विट्रोक्टॉमी मशीन के फ्रंट पैनल पर मौजूद तीर बटन (ऊपर या नीचे) पर दबाकर किया जाता है।

2. सबरेटिनल आरोपण के लिए ऑर्गेनोइड्स की तैयारी (चित्रा 1)।

  1. पहले31 के रूप में उल्लिखित रेटिना ऑर्गेनोइड्स प्राप्त करें, और, यदि आवश्यक हो, तो 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जहाज करें जैसा कि पहले बताया गयाथा 54।
  2. एक कीटाणुनाशक के साथ प्राप्त प्रयोगशाला में ऊतक संवर्धन कक्ष में सतहों को पोंछें और बैक्टीरिया या फंगल संदूषण से बचने के लिए, ओकुलर सर्जरी के लिए सर्जिकल सूट के समान उच्च स्तर की सड़न रोकनेवाली तकनीक को बनाए रखें, और सर्जिकल साइट संक्रमण से बचने के लिए सर्जिकल रूम में ले जाएं।
  3. ओकुलर सर्जरी के लिए ऑर्गनॉइड तैयारी के लिए सौंपे गए टिशू कल्चर रूम के अंदर सर्जिकल शू कवर, डिस्पोजेबल लैब कोट, बोनट, सर्जिकल मास्क, आस्तीन और सर्जिकल स्क्रब पहनें।
  4. एक ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में 1 घंटे के लिए मूल फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (बीएफजीएफ) के 20 एनजी / एमएल और मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (बीडीएनएफ) के 20 एनजी / एमएल के साथ पूर्व-संतुलन तंत्रिका मीडिया। वातानुकूलित माध्यम (रातोंरात शिपमेंट से) की लगभग एक-चौथाई मात्रा और ताजा माध्यम31,54 की तीन-चौथाई मात्रा का उपयोग करके अल्ट्रा-कम आसंजन प्लेटों में मीडिया में ऑर्गेनोइड्स रखें। 24-48 घंटे तक बनाए रखें।
  5. पहले जानवर को एनेस्थेटाइज करने से पहले ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में कम से कम 1 घंटे के लिए तंत्रिका माध्यम (चरण2.4 में तैयार) के साथ कई ताजा 60 मिमी प्लेटें तैयार और समतुल्य करें। ध्यान दें, इन प्लेटों का उपयोग प्रत्येक व्यक्तिगत सर्जरी के लिए ऑर्गेनोइड ्स को स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है, इस धारणा के साथ कि पीएच की स्थिति और सीओ2 संतृप्ति को कम से कम 20 मिनट के लिए मीडिया में बनाए रखा जाएगा, जो प्लेट को सर्जिकल रूम में ले जाने और ऑर्गेनोइड्स को कैनुला में लोड करने के लिए पर्याप्त है।
  6. प्रत्येक प्रत्यारोपण मामले के लिए पूर्व-संतृप्त तंत्रिका मीडिया के साथ एक ताजा 60 मिमी प्लेट का उपयोग करें, जबकि ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में शेष प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. 6-9 ऑर्गेनोइड्स को एक 60 मिमी डिश (पुन: संतृप्त मीडिया के साथ) में स्थानांतरित करें, उन्हें मैन्युअल सिंगल-चैनल पिपेट (20-200 μL) के साथ 200 μL बाँझ फ़िल्टर टिप के साथ एक विस्तृत (~ 0.7 मिमी) खोलने के साथ बाहर निकालें। इन युक्तियों को पहले से या प्रक्रिया के दौरान बाँझ कैंची की एक जोड़ी के साथ ~ 3-4 मिमी नोक को डुबोकर तैयार किया जा सकता है (संदूषण से बचने के लिए ऊतक संस्कृति हुड में किया जाता है)। 60 मिमी डिश को 100 मिमी ऊतक संस्कृति डिश के अंदर रखें (कमरे से कमरे के परिवहन के दौरान संदूषण से बचने के लिए) और जल्दी से सर्जिकल सूट में परिवहन करें।
  8. एक बाँझ ड्रेप द्वारा कवर किए गए 37 डिग्री सेल्सियस इलेक्ट्रिक हीटिंग पैड पर ऑर्गेनोइड्स के साथ प्लेट रखें।
  9. ऑर्गेनोइड्स को तैयार करने से पहले बाँझ दस्ताने की एक ताजा जोड़ी में बदलें।
  10. ऑर्गेनोइड्स को बाँझ संतुलित नमक समाधान (बीएसएस) (वैकल्पिक) में कुल्ला करें, और फिर इंजेक्टर में लोड करें, जिसमें एक पतली दीवार वाली बोरोसिलिकेट ग्लास कैनुला (बाहरी व्यास, ओडी 1.52 मिमी; आंतरिक व्यास, आईडी 1.12 मिमी) होती है, जिसमें बाँझ प्लास्टिक टयूबिंग द्वारा बाँझ 500 μL हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ा एक पॉलिश कुंद छोर होता है।
  11. सर्जिकल टीम को एक बाँझ फैशन में कैनुला पास करें जब वे ऑर्गेनोइड्स को इंजेक्ट करने के लिए तैयार हों।
  12. पूरी प्रक्रिया की लंबाई (ऊतक संवर्धन मीडिया से ऑर्गेनोइड को हटाने से लेकर कैनुला लोड करने तक) 20 मिनट या उससे कम रखें।
  13. यदि ऑर्गेनोइड्स को प्रत्यारोपित करने में देरी होती है, तो उन्हें डिश के अंदर पीएच / सीओ2 संतृप्ति में परिवर्तन से बचने के लिए ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  14. एक ही ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में 1 सप्ताह के लिए अप्रयुक्त ऑर्गेनोइड ्स को बनाए रखें और संदूषण के किसी भी सबूत के लिए निगरानी करें।

3. सबरेटिनल ऑर्गेनोइड्स प्रत्यारोपण।

  1. स्टीवंस टेनोटॉमी कैंची के साथ 0.5-1 सेमी पार्श्व कैंथोटॉमी करें। पलकें खुली रखने के लिए उचित आकार का बैराकर पलक स्पेकुलम रखें। सुनिश्चित करें कि सर्जिकल सहायक प्रक्रिया की अवधि के लिए बीएसएस के साथ नियमित रूप से कॉर्निया की सिंचाई करता है।
  2. 4 और 8 बजे की स्थिति में लिम्बस के ठीक बगल में 6-0 रेशम सीवन के 2 स्टे सीवन रखें ताकि आंख को प्राथमिक दृष्टि में रखा जा सके और तीसरी पलक को पीछे हटाया जा सके। लिम्बस के बगल में बुलबार कंजंक्टिवा को धीरे से पकड़ने के लिए 0.5 कैस्ट्रोविएजो कॉर्नियल बाइंडिंग फोर्स और एक छोटे मच्छर हेमोस्टैट का उपयोग करें। सीवन को लंबा छोड़ दें और उनके हेरफेर में मदद करने के लिए छोटे मच्छर हेमोस्टैट्स के साथ सिरों को दबाएं।
    नोट: तीसरी पलक के नीचे सीवन रखना अधिक कठिन है; इसे तुरंत लिम्बस से सटे रखना सुनिश्चित करें।
  3. 12 बजे की स्थिति में एक और सीवन को लिम्बस पर आंशिक रूप से लिम्बस की मोटाई के माध्यम से रखें, इस बात का ध्यान रखें कि आंख में प्रवेश न हो। इस सीवन को शिथिल रूप से बांधें और सिरों को छोटा कर लें। यह एक मजबूत लंगर सीवन प्रदान करता है, जिसका उपयोग सर्जरी के दौरान "हैंडल" के रूप में आंख को घुमाने के लिए किया जाता है ताकि सर्जन को प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के दौरान दुनिया के विभिन्न हिस्सों तक पहुंच मिल सके।
    नोट: चरण 3.2 और 3.3 उलटा किया जा सकता है। रहने के सीवन प्लेसमेंट का अनुक्रम सर्जन की प्राथमिकता है।
  4. 10-2 बजे (एक पेरीमेट्री) के बीच बुलबार कंजंक्टिवा को प्रतिबिंबित करें। टेनोटॉमी कैंची का उपयोग करके, लिम्बस से 2-3 मिमी नेत्रश्लेष्मला को संक्रमित करें। इसे कमजोर करें और 2 और 10 बजे के विट्रोक्टॉमी बंदरगाहों के लिए साइटों पर श्वेतपटल को उजागर करने के लिए टेनन के कैप्सूल को साफ करें, जिसे जानवर की उम्र के आधार पर लिम्बस से लगभग 3-5 मिमी रखा जाएगा। हेमोस्टेसिस के लिए और किसी भी रक्त को साफ करने के लिए सर्जिकल सेल्यूलोज भाले का उपयोग करें।
  5. कैलिपर्स का उपयोग करके नेत्रश्लेष्मला और टेनन कैप्सूल के प्रतिबिंब के बाद स्क्लेरोटॉमी के लिए साइटों की पहचान करें। बिल्ली में प्रमुख होने वाले प्रमुख स्क्लेरल वाहिकाओं से बचने के लिए स्क्लेरोटॉमी साइटों (2 और 10 बजे पार्स प्लाना से गुजरने का लक्ष्य) चुनें। स्क्लेरल रक्तस्राव को कम करने के लिए नियोजित स्क्लेरोटॉमी साइटों पर स्क्लेरा पर वेट-फील्ड कॉटरी का उपयोग करें, इंस्ट्रूमेंट पोर्ट पर ~ 3 मिमी क्षेत्र की योजना बनाएं (दाएं हाथ के सर्जन के लिए 10 बजे का बंदरगाह) क्योंकि यह विट्रोक्टॉमी के बाद बढ़ाया जाएगा ताकि प्रत्यारोपण प्रवेशनी शुरू की जा सके।
  6. विट्रोक्टॉमी बंदरगाहों को रखने से पहले प्रस्तावित स्क्लेरोटोमी ज़ की साइट पर गाँठ बांधे बिना प्री-प्लेस क्रूसिएट पैटर्न सीवन (6-0 या 7-0 पॉलीग्लाक्टिन सीवन)।
    नोट: यह प्रक्रिया के अंत में स्क्लेरोडोमी के तेजी से बंद होने की सुविधा प्रदान करता है। नियोजित उपकरण पोर्ट के लिए सीवन को श्वेतपटल के लंबे समय तक काटने की आवश्यकता होती है क्योंकि यह एक लंबा चीरा होगा।
  7. एक बार सीवन लगाए जाने के बाद, सहायक को बिशप-हार्मन फोर्सप्स को बांधकर या उपयोग करके 12 बजे के स्टे सीवन को पकड़कर ग्लोब को स्थिति में रखने में मदद करने के लिए कहें। सर्जन को ग्लोब को भी स्थिर करने दें, स्क्लेरोटॉमी साइट के बगल में ऊतक को पकड़ने के लिए 0.12 मिमी कास्त्रोविएजो बल का उपयोग करें।
    1. लेंस से संपर्क करने से बचने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका की ओर एक कोण पर निर्देशित 2 बजे और 10 बजे दोनों स्थितियों में श्वेतपटल के माध्यम से एक ट्रोकार का उपयोग करके 23 जी विट्रोक्टॉमी पोर्ट पेश करें।
    2. जाँचें कि सिंचाई बंदरगाह बांधने वाले बल का उपयोग करके बंदरगाह पर धीरे से धक्का देकर विट्रस में है ताकि टिप को विट्रस में देखा जा सके। एक बार सही स्थिति की पुष्टि हो जाने के बाद, सिंचाई लाइन को बंदरगाह से संलग्न करें और इसे टेप करने के लिए पतली चिपकने वाली पट्टियों का उपयोग करके लाइन को स्थिति दें। विट्रोक्टॉमी मशीन के फ्रंट पैनल पर मौजूद तीर बटन (ऊपर या नीचे) दबाकर शुरू में 30-35 मिमीएचजी पर बीएसएस बफर के विट्रोक्टॉमी इन्फ्यूजन को सेट करें।
  8. सहायक को कॉर्निया पर एक मैकेमर मैग्नीफाइंग इरिचिंग विट्रोक्टॉमी लेंस रखने दें ताकि अगले चरणों के दौरान आंख के पीछे के खंड के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिल सके। सिंचाई विट्रोक्टॉमी लेंस को एक ड्रिप सेट से संलग्न करें जो लेंस को कॉर्निया से जोड़ने के लिए निरंतर तरल आपूर्ति प्रदान करता है।
    नोट: संपर्क विट्रोक्टॉमी लेंस के अन्य रूपों का भी उपयोग किया जा सकता है। ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के माध्यम से विज़ुअलाइज़ेशन में मदद करने के लिए कमरे की रोशनी को मंद या बंद करें।
  9. उपकरण पोर्ट (सर्जन के प्रमुख हाथ से सटे, यानी, दाएं हाथ के सर्जन के लिए 10 बजे का पोर्ट) के माध्यम से 23 जी विट्रोक्टॉमी प्रोब/कटर (2,500 सीपीएम) डालें और आंशिक कोर विट्रोक्टॉमी करें।
    1. फिर, रेटिना से विट्रल चेहरे को अलग करके प्रत्यारोपण प्राप्त करने वाले क्षेत्र में रेटिना सतह से विट्रस को पूरी तरह से हटा दें (यह प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है)।
    2. रेटिना सतह से दूर पोर्ट के साथ ऑप्टिक तंत्रिका सिर पर विट्रोक्टॉमी जांच रखें और विट्रल फेस डिटेचमेंट शुरू करने के लिए उच्च वैक्यूम लागू करें।
  10. इंट्राओकुलर उपयोग के लिए ट्रायमसिनोलोन क्रिस्टल तैयार करें। यदि ट्रायमसिनोलोन निलंबन विशेष रूप से इंट्राविट्रल उपयोग के लिए नहीं है, तो क्रिस्टल को धो लें और फिर बीएसएस में फिर से निलंबित करें।
    1. प्रारंभ में, क्रिस्टल को फंसाने के लिए पीईएस झिल्ली (1 एमएल सिरिंज से जुड़े) के साथ बाँझ 0.22 μm पोर सिरिंज फ़िल्टर की सहायता से निलंबन को फ़िल्टर करें।
    2. फिर 1 एमएल सिरिंज में बीएसएस को दबाकर और फिल्टर के माध्यम से फ्लश करके फंसे हुए ट्रायमसिनोलोन क्रिस्टल को धो लें (क्रिस्टल फिल्टर में फंसे रहते हैं)। यह घोल में परिरक्षकों को हटा देता है। धोने को 3 बार दोहराएं जिसके बाद क्रिस्टल को 1 एमएल बीएसएस में फिर से निलंबित कर दिया जाता है।
  11. उपकरण पोर्ट के माध्यम से ट्रायमसिनोलोन को पकड़ने वाली सिरिंज की सुई का परिचय दें। इंस्ट्रूमेंट पोर्ट के माध्यम से सुई पेश करते समय पुतली के माध्यम से सुई की नोक को देखकर लेंस को न छूने के लिए सावधान रहें। क्रिस्टल सस्पेंशन के 0.25 से 0.5 एमएल इंजेक्ट करें। फिर उपकरण पोर्ट के माध्यम से विट्रोक्टॉमी जांच डालें और इसे रेटिना की सतह से दूर पोर्ट के साथ ऑप्टिक तंत्रिका सिर के करीब आगे बढ़ाएं और रेटिना से विट्रल चेहरे को अलग करने में मदद करने के लिए उच्च वैक्यूम का उपयोग करें।
    नोट: ट्रायमसिनोलोन क्रिस्टल चिपक जाते हैं और इस प्रकार शेष विट्रस को उजागर करते हैं। नियोजित ऑर्गेनॉइड प्रत्यारोपण की साइट के ऊपर और बगल में किसी भी विट्रस को सावधानीपूर्वक हटा दें (उदाहरण के लिए, क्षेत्र के केंद्रीय क्षेत्र के करीब केंद्रीय टेपल फंडस)।
  12. सबरेटिनल इंजेक्टर का उपयोग करके वांछित आरोपण स्थल पर एक छोटा फोकल रेटिना डिटेचमेंट ब्लीब बनाएं, उदाहरण के लिए, बाँझ बीएसएस से भरे बाँझ 250 μL गैस टाइट ल्यूर लॉक सिरिंज से जुड़े एक विस्तारयोग्य 41 जी कैनुला के साथ 23 जी सबरेटिनल इंजेक्टर।
    1. सबरेटिनल ब्लीब बनाने से पहले, ब्लीब गठन की सुविधा के लिए जलसेक दबाव को 10 मिमीएचजी तक कम करें।
    2. इंस्ट्रूमेंट पोर्ट के माध्यम से इंजेक्टर डालें और इसे रेटिना सतह की ओर आगे बढ़ाएं। कैनुला टिप को बाहर निकालें और धीरे से इसे रेटिना सतह पर दबाएं। रेटिना डिटेचमेंट शुरू करने के लिए सहायक को सिरिंज प्लंजर पर थोड़ा त्वरित धक्का देने के लिए कहें जो वांछित आकार प्राप्त होने तक रेटिना डिटेचमेंट की धीमी वृद्धि की अनुमति देने के लिए इंजेक्शन के दबाव को कम करता है (बीएसएस के लगभग 100 से 200 μL का उपयोग किया जाता है)।
  13. यदि बनाया गया रेटिनोटॉमी एक उपयुक्त स्थिति में है, जो आरोपण स्थल से प्राप्त तंत्रिका फाइबर परत के विभाजन को रोकने और प्रमुख रेटिना रक्त वाहिकाओं से बचने के लिए प्रत्यारोपण स्थल और ऑप्टिक तंत्रिका सिर के बीच रेटिना को काटने से बचता है (यह अध्ययन डिजाइन द्वारा भी निर्धारित किया जाता है, हमारे मामले में केंद्रीय रेटिना चुना गया था), फिर, इंजेक्टर के 41 जी कैनुला का उपयोग करके इसे थोड़ा बड़ा करें, जिसका उद्देश्य रेटिना कैंची की शुरूआत को सुविधाजनक बनाना है।
  14. इंजेक्टर को आंख से निकालें और 10 बजे के स्क्लरल पोर्ट को हटा दें। लेंस को छूने से बचने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका की ओर उन्मुख सीधे 2.85 मिमी स्लिट चाकू / केराटोम का उपयोग करके इस साइट पर स्क्लेरोटॉमी को बड़ा करें। जलसेक दबाव को 10-15 मिमीएचजी पर बनाए रखें।
  15. निचोड़ के हैंडल के साथ विट्रियोरेटिनल ऊर्ध्वाधर 80 ° कैंची का उपयोग करके रेटिनोटॉमी का विस्तार करें, रेटिना रक्तस्राव को रोकने के लिए रेटिना वाहिकाओं को काटने से बचें और प्रत्यारोपण क्षेत्र में रेटिना से ऑप्टिक तंत्रिका तक जाने वाले तंत्रिका तंतुओं को काटने से बचने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका सिर से दूर ब्लीब के किनारे पर रेटिना को काटना सुनिश्चित करें। ऑर्गेनोइड्स प्राप्त करने के लिए रेटिनोटॉमी पर्याप्त चौड़ाई का होना चाहिए।
  16. बढ़े हुए स्क्लेरोटॉमी के माध्यम से ऑर्गेनोइड्स युक्त प्री-लोडेड ग्लास केशिका डालें (चरण 2.10 देखें) और इसे प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन के तहत रेटिनोटॉमी साइट की ओर आगे बढ़ाएं।
    1. सबरेटिनल ब्लीब में उद्घाटन तक पहुंचने के लिए रेटिनोटॉमी को थोड़ा खोलने के लिए ग्लास केशिका की नोक का उपयोग करें।
    2. माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखते हुए, सहायक को इंजेक्टर के प्लंजर को धीरे-धीरे दबाने के लिए कहें, ऑर्गेनोइड्स को सबरेटिनल ब्लीब में इंजेक्ट करें। बीएसएस को ऑर्गेनोइड्स से पहले होना चाहिए और रेटिनोटॉमी को खोलना चाहिए।
    3. यदि वे रेटिनोटॉमी के किनारे पर हैं, तो ग्लास केशिका की नोक के साथ ब्लीब के भीतर ऑर्गेनोइड्स को धीरे से धक्का दें।
  17. रेटिनोटॉमी को बंद करने की कोशिश करने और ऑर्गेनोइड्स को विट्रस में भागने से रोकने के लिए कुछ सेकंड के लिए रेटिनोटॉमी पर ग्लास केशिका को पकड़ें।
  18. आंख के भीतर द्रव आंदोलन से बचने के लिए आंख से तरल पदार्थ की किसी भी अचानक रिहाई से बचने के लिए आंख से ग्लास केशिका को बहुत धीरे-धीरे हटा दें जो सबरेटिनल ब्लीब से ऑर्गेनोइड्स को निष्कासित कर सकता है।
  19. इंट्राओकुलर रक्तस्राव को रोकने में मदद करने के लिए धीरे-धीरे जलसेक दबाव को 20-30 मिमीएचजी तक बढ़ाएं, यह ध्यान रखते हुए कि जलसेक द्रव सीधे ब्लीब पर न धोए। यह विट्रोक्टॉमी मशीन के फ्रंट पैनल पर मौजूद ऊपर की ओर तीर बटन पर दबाकर किया जाता है।
  20. एक क्रूसिएट पैटर्न (6-0 या 7-0 पॉलीग्लाक्टिन) में पूर्व-रखे गए सीवन का उपयोग करके स्क्लेरोटॉमी को बंद करें। स्क्लेरोटॉमी को सील करने के लिए आवश्यकतानुसार अतिरिक्त सरल बाधित सीवन जोड़ें।
  21. सहायक को जलसेक पोर्ट को हटाने के लिए कहें और सर्जन को स्क्लेरोटॉमी को सील करने और इंट्राओकुलर दबाव के नुकसान को रोकने के लिए पूर्व-रखे सीवन को जल्दी से बांधने दें।
  22. एक सरल निरंतर पैटर्न में 6-0 या 7-0 पॉलीग्लाक्टिन का उपयोग करके नेत्रश्लेष्मला चीरा (पेरिटोमी) को बंद करें।
  23. फंडस की छवि बनाएं (उदाहरण के लिए, एक रेटकैम II वीडियो फंडस कैमरा, स्पष्टता या इसी तरह का उपयोग करके) और सबरेटिनल स्पेस के भीतर ऑर्गेनोइड्स की तत्काल स्थिति रिकॉर्ड करें।
  24. कॉटन टिप एप्लीकेटर्स और कॉटन बॉल्स की सहायता से 0.2% पोविडोन आयोडीन समाधान का उपयोग करके इमेजिंग के बाद ओकुलर सतह को फिर से तैयार करें। तीन स्टे सीवन और ढक्कन स्पेकुलम को हटा दें।
  25. 6-0 पॉलीग्लाक्टिन सीवन के साथ पार्श्व कैंथोटॉमी को बंद करें। पार्श्व कैंथस को सुधारने के लिए एक एकल दफन सीवन रखें, जिसके बाद 8 त्वचा सीवन की एक आकृति हो, और फिर घाव के बाकी हिस्सों को बंद करने के लिए सरल बाधित त्वचा सीवन का उपयोग करें।
  26. सर्जिकल प्रक्रिया पूरी होने के बाद, एक स्टेरॉयड और एंटीबायोटिक संयोजन (2 मिलीग्राम मेथिलप्रेडनिसोलोन एसीटेट, 0.1 मिलीग्राम डेक्सामेथासोन, और 1 मिलीग्राम जेंटामाइसिन) का एक उपनेत्रश्लेष्मला इंजेक्शन दें। कॉर्निया पर एक नेत्र स्नेहक (कृत्रिम आँसू) रखें।
  27. एनेस्थीसिया से जानवर को पुनर्प्राप्त करें और दर्द के किसी भी संकेत के लिए वसूली के दौरान बारीकी से निगरानी करें, जिसके लिए अतिरिक्त उपचार की आवश्यकता होगी, जैसे कि चिह्नित ब्लीफेरोस्पाज्म, हेरफेर करने की गंभीर अनिच्छा, सुस्ती या भूख में कमी, और श्वसन और हृदय गति में वृद्धि। आवश्यकतानुसार पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया प्रदान करें और किसी भी असुविधा के लिए बारीकी से निगरानी करें।
    नोट: केवल ठीक से प्रशिक्षित कर्मियों को सर्जरी से पहले, दौरान और बाद में बिल्ली के रोगियों को एनेस्थेटाइज करने और निगरानी करने का प्रभारी होना चाहिए। पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल के लिए स्थानीय पशु नैतिकता समिति की सिफारिशों का पालन करें।

4. पोस्ट-इम्प्लांटेशन प्रक्रियाएं, पोस्ट-ऑपरेटिव उपचार और मूल्यांकन

  1. ऑर्गेनोइड्स की सूजन और अस्वीकृति को नियंत्रित करने में मदद करने के लिए मौखिक इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं (1 मिलीग्राम / किग्रा प्रेडनिसोलोन और 2 मिलीग्राम / किलोग्राम साइक्लोस्पोरिन मौखिक रूप से दिन में दो बार) के साथ इलाज करना जारी रखें। प्रणालीगत एंटीबायोटिक कवरेज प्रदान करें (उदाहरण के लिए, मौखिक डॉक्सीसाइक्लिन 5 मिलीग्राम / किग्रा दैनिक दो बार - इस एंटीबायोटिक को इम्यूनोसप्रेस्ड जानवरों में अवसरवादी माइकोप्लास्मल संक्रमण के जोखिम के कारण चुना गया था)।
  2. सूजन या प्रतिकूल घटनाओं के विकास की निगरानी के लिए नियमित नेत्र परीक्षाएं करें। चपटेपन के लिए रेटिना ब्लीब की निगरानी करें, जो सर्जरी के बाद पहले कुछ दिनों में होता है, ऑर्गेनोइड्स को सबरेटिनल स्पेस में इंजेक्ट करने के लिए आवश्यक बड़े रेटिनोटॉमी के बावजूद। प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स की स्थिति और उपस्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए प्रत्येक परीक्षा में फंडस छवियों को रिकॉर्ड करें।
  3. निगरानी अवधि के दौरान और प्रयोग की समाप्ति से पहले कॉन्फोकल स्कैनिंग लेजर ऑप्थेल्मोस्कोपी (सीएसएलओ) और स्पेक्ट्रल डोमेन - ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (एसडी-ओसीटी) 5,31 द्वारा सामान्य संज्ञाहरण के तहत जानवरों की छवि बनाएं।
  4. एवीएमए अनुमोदित विधि का उपयोग करके प्रयोग की समाप्ति पर जानवरों को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु करें, उदाहरण के लिए, 85 मिलीग्राम / किग्रा पेंटोबार्बिटल का अंतःशिरा प्रशासन। बेहोश करने के बाद, तनाव को कम करने के लिए पेंटोबार्बिटल के प्रशासन के लिए एक अंतःशिरा कैथेटर रखें। दिल की धड़कन की समाप्ति से मृत्यु की पुष्टि करें और न्यूमोथोरैक्स बनाने के लिए वक्ष में चीरा लगाएं।
  5. एक मानक ट्रांसकंजंक्टिवल दृष्टिकोण के माध्यम से आंखों को हटा दें और आवश्यकतानुसार ठीक करें। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) के लिए, 11 पार्कर ब्लेड (लिम्बस से ~ 3-4 मिमी) के साथ पार्स प्लाना के माध्यम से बनाए गए 3 स्लिट्स के माध्यम से फिक्सेटिव समाधान के 0.3 मिलीलीटर के बाद आंखों को तुरंत 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान में डुबोएं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3.5 घंटे के निर्धारण के बाद आंखों के कप को विच्छेदित करें। रेटिना और ऑर्गेनोइड ्स को बरकरार रखने के लिए अवशिष्ट विट्रियस को हटा दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 30 मिनट के लिए फिक्सेटिव में वापस रखें, फिर पीबीएस में 10 मिनट के लिए प्रत्येक 3 बार आईकप कुल्ला करें। आईकप को 2 घंटे के लिए 15% सुक्रोज में स्थानांतरित करें, फिर 2 घंटे के लिए 30% सुक्रोज तक।
  7. पीबीएस के साथ दो बार आईकप कुल्ला करें और ओसीटी माध्यम (इष्टतम काटने के तापमान यौगिक) में एम्बेड करें और फ्लैश फ्रीज करें फिर हिस्टोलॉजी और इम्यूनोकैमिस्ट्री के लिए सेक्शनिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. अध्ययन प्रोटोकॉल और उद्देश्यों के आधार पर आईएचसी के लिए एंटीबॉडी का चयन करें।

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Representative Results

यह प्रक्रिया एक बड़े आंख पशु मॉडल के सबरेटिनल स्पेस में एचपीएससी-व्युत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड्स के सफल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रत्यारोपण को सक्षम करती है (2 उदाहरणों का उपयोग करके यहां प्रदर्शित किया गया है: स्वस्थ फोटोरिसेप्टर (पीआर) के साथ जंगली प्रकार की बिल्लियां और सीआरएक्सआरडीवाई / + बिल्लियों के साथ डीजेनरेटिंग पीआर और रेटिना)। चित्रा 1 में इंगित चरणों का उपयोग करते हुए, एचपीएससी-व्युत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड्स को इंजेक्शन डिवाइस के बोरोसिलिकेट ग्लास कैनुला में तैयार और लोड करें ताकि ऑर्गेनोइड क्षतिग्रस्त न हों। इसकी पुष्टि ऑर्गेनोइड्स (चरण 2.10) के लोडिंग के दौरान और सर्जरी (चरण 3.16) (चित्रा 2 ए, बी) के दौरान प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन के साथ-साथ सर्जरी के अंत में फंडस इमेजिंग (चरण 3.23, चित्रा 2 सी) द्वारा की जा सकती है। इस तकनीक का उपयोग करके सबरेटिनल स्पेस में ऑर्गेनोइड्स की उपस्थिति की पुष्टि नेत्र परीक्षा और फंडस इमेजिंग (चित्रा 3 ए) द्वारा की जाती है, जो ऑर्गेनोइड्स की स्थिति और उपस्थिति को रिकॉर्ड करता है। जमे हुए हिस्टोलॉजी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए ग्लोब को संसाधित करते समय प्रत्यारोपण की स्थिति को जानना बहुत महत्वपूर्ण है और काम के बोझ को काफी हद तक कम करता है, क्योंकि 12-14 μm (क्रायोसेक्शन की मोटाई) पर एक बड़ी आंख को विभाजित करने में समय लगता है। इच्छामृत्यु से पहले, सबरेटिनल स्पेस (चित्रा 3ए-डी) में ऑर्गेनोइड्स की स्थिति का आकलन करने के लिए कॉन्फोकल स्कैनिंग लेजर ऑप्थेल्मोस्कोपी (सीएसएलओ) और स्पेक्ट्रल डोमेन - ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (एसडी-ओसीटी) इमेजिंग भी की जाती है। ये तकनीक प्राप्तकर्ता आंख (चित्रा 3 ई) के सबरेटिनल स्पेस (तंत्रिका रेटिना और आरपीई के बीच) में रेटिना ऑर्गेनोइड्स की दृढ़ता को प्रदर्शित करती है। इच्छामृत्यु के बाद (एवीएमए सिफारिशों के बाद मानवीय रूप से किया जाता है) हिस्टोलॉजी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) नियमित रूप से किया जाता है (पहले प्रकाशित पेपर31 में विवरण देखें)। हिस्टोलॉजी और आईएचसी एक बड़ी आंख के सबरेटिनल स्पेस में ज़ेनोजेनिक ग्राफ्ट (एचपीएससी-व्युत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड्स) के अस्तित्व को प्रदर्शित करते हैं जब जानवरों को इम्यूनोसप्रेस्ड (जैसा कि पहले वर्णित31) किया गया था, चित्रा 4 देखें।

Figure 1
चित्रा 1: आरोपण से पहले ऑर्गेनोइड ्स की तैयारी के लिए चरणों का योजनाबद्ध।
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Figure 2
चित्रा 2: ऑर्गेनोइड्स के सर्जिकल सबरेटिनल आरोपण। (ए) क्षतिग्रस्त हुए बिना ग्लास कैनुला के माध्यम से सबरेटिनल स्पेस में वितरित किए जा रहे ऑर्गेनोइड्स का प्रत्यक्ष दृश्य, (बी) सबरेटिनल ब्लीब में ऑर्गेनोइड्स का प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन, (सी) सर्जरी के तुरंत बाद सबरेटिनल रूप से प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स की वाइड-एंगल फंडस कलर छवि। ब्लीब किनारों को काले तीर के निशान और रेटिनोटॉमी साइट को काले सितारों द्वारा इंगित किया जाता है।
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Figure 3
चित्रा 3: एक सीआरएक्सआरडीवाई / + बिल्ली में प्रत्यारोपण के 3 महीने बाद सबरेटिनल रूप से प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स का पोस्ट-ऑपरेटिव मूल्यांकन। (ए) सबरेटिनल रूप से प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स की फंडस रंग छवि, (बी) सबरेटिनल रूप से प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स की सीएसएलओ फंडस छवि, (सी) ऑर्गेनोइड्स वाले क्षेत्र का 3 डी वॉल्यूम स्कैन पुनर्निर्माण, (डी) सबरेटिनल ऑर्गेनोइड्स वाले क्षेत्र की सीएसएलओ छवि, (ई) एसडी-ओसीटी उच्च-रिज़ॉल्यूशन, सबरेटिनल रूप से प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स की क्रॉस-सेक्शन छवि। रेटिनोटॉमी साइट काले सितारों द्वारा इंगित की जाती है।
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Figure 4
चित्रा 4: ग्राफ्टिंग के 3 महीने बाद सीआरएक्सआरडीवाई / + बिल्ली के सबरेटिनल स्पेस में मानव रेटिना ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर शीट (पीआर मार्कर आरसीवीआरएन)।  * बिल्ली की आंतरिक परमाणु परत (आईएनएल) में सिनैप्टिक बाउटन (एचएसवाईपी = सिनैप्टोफिसिन)।
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Discussion

सबरेटिनल स्पेस में एचपीएससी-व्युत्पन्न रेटिना ऊतक (रेटिना ऑर्गेनोइड्स) का आरोपण पीआर सेल मृत्यु (गहन या टर्मिनल अंधापन) के कारण देर से चरण रेटिना अपक्षयी रोगों के लिए दृष्टि बहाल करने के लिए एक आशाजनक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है। प्रस्तुत दृष्टिकोण मानव भ्रूण रेटिना ऊतक23,24,25 के एक टुकड़े के सबरेटिनल ग्राफ्टिंग के आधार पर पहले विकसित और सफलतापूर्वक परीक्षण किए गए प्रयोगात्मक चिकित्सा पर आधारित है। यह एचपीएससी से प्राप्त एक वैकल्पिक, पुनर्भरणीय और नैतिक रूप से स्वीकार्य रेटिना ऊतक स्रोत का उपयोग प्रस्तुत करता है। नैदानिक अनुप्रयोगों की ओर इस आशाजनक दृष्टिकोण की प्रगति के लिए बड़े आंख पशु मॉडल 51,55 में चिकित्सा की शल्य चिकित्सा व्यवहार्यता और ओकुलर सुरक्षा का प्रदर्शन करना आवश्यक है। यह पांडुलिपि सामान्य और विघटनकारी रेटिना (एलसीए के सीआरएक्सआरडीवाई / + बिल्लियों मॉडल का मॉडल) दोनों के साथ एक बड़े पशु मॉडल में एचपीएससी -3 डी रेटिना ऊतक (रेटिना ऑर्गेनोइड्स) के सबरेटिनल प्रत्यारोपण के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करती है। यद्यपि मानव रेटिना के एक सपाट टुकड़े और आरपीई पैच को पेश करने की प्रक्रियाओं को 43,44,45 विकसित किया गया है, लेकिन बड़े 3 डी ग्राफ्ट (उन्नत आरडी के साथ स्थितियों में दृष्टि बहाल करने के लिए आवश्यक) के प्रत्यारोपण की जांच नहीं की गई है। यहां विस्तार से वर्णित प्रोटोकॉल पूरे रेटिना ऑर्गेनोइड्स (ऑर्गनॉइड रिम्स33,41 के बजाय) के सबरेटिनल वितरण के लिए एक प्रत्यारोपण प्रक्रिया के लिए है, जिसमें कुछ आरपीई को पीआर के साथ बरकरार रेटिना शीट पेश करने के संभावित बेहतर तरीके के रूप में ले जाया जाता है, ताकि ग्राफ्ट अस्तित्व को बढ़ाया जा सके और शीट संरक्षण में सुधार किया जा सके। ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल के विभिन्न भाग अच्छी तरह से स्थापित हैं। उदाहरण के लिए, रेटिना रीअटैचमेंट सर्जरी 56,57,58,59,60 के दौरान विट्रोरेटिनल सर्जनों द्वारा विट्रोरेटिनल सर्जनों द्वारा विट्रोक्टॉमी का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। सबरेटिनल इंजेक्शन आमतौर पर उपयोग किए जा रहे हैं, उदाहरण के लिए, जीन वृद्धि चिकित्सा 3,7,61,62,63,64 में। एक पर्याप्त रेटिनोटॉमी के निर्माण और सबरेटिनल स्पेस में अपेक्षाकृत बड़े ऑर्गेनोइड्स के इंजेक्शन के सीमित विवरण हैं।

महत्वपूर्ण चरणों में लेंस से बचने के लिए स्क्लेरोटॉमी की सावधानीपूर्वक स्थिति और प्रदर्शन, प्रत्यारोपण स्थल पर रेटिना सतह से विट्रस कॉर्टेक्स को पूरी तरह से हटाना, सबरेटिनल ब्लीब का नियंत्रित गठन, प्रत्यारोपण प्रवेशनी की चौड़ाई को समायोजित करने के लिए इष्टतम आकार का रेटिनोटॉमी उत्पन्न करना, विभिन्न चरणों के दौरान परिभाषित जलसेक दबाव को बनाए रखना, और कैनुला वापसी। अनुकूलित आंतरिक और बाहरी व्यास (आईडी और ओडी) और लंबाई के साथ सही प्रत्यारोपण प्रवेशनी का चयन करना, इंट्राओकुलर रक्तस्राव को नियंत्रित करना, ऑर्गेनोइड्स से सर्जिकल रूम और उपकरणों तक पूरी प्रक्रिया की बाँझपन, और इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करने के लिए सर्जरी की अवधि (30-45 मिनट / पशु)। लेखकों ने पाया कि बिल्ली विट्रस की मोटाई / चिपचिपाहट के कारण 23 जी विट्रोक्टॉमी के साथ सबसे अच्छे परिणाम प्राप्त किए जाते हैं, 41 ग्राम कैनुला के साथ इंजेक्टर के साथ एक ब्लीब बनाते हैं, और फिर, 80 डिग्री कोण रेटिना कैंची का उपयोग करके ब्लीब के किनारे पर रेटिनोटॉमी का विस्तार करते हैं। अन्य महत्वपूर्ण कारकों में बोरोसिलिकेट ग्लास कैनुला (बाहरी व्यास ओडी 1.52 मिमी; आंतरिक व्यास, आईडी 1.12 मिमी; और लंबाई 10.16 सेमी) को फिट करने के लिए 2.85 मिमी केराटोम का उपयोग करके स्क्लेरोटॉमी का विस्तार करना और लगभग 20.5 मिमी (20.91 मिमी ± 0.53 मिमी) 55 अक्षीय लंबाई के साथ एक बड़ी आंख में बड़े ऑर्गेनोइड के आरोपण की अनुमति देना शामिल है। एक ग्लास केशिका का उपयोग प्रत्यारोपण प्रक्रिया के दौरान उन्हें नुकसान पहुंचाए बिना वंश आकार के ऑर्गेनोइड को लोड करने और वितरित करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध था। यह पाया गया कि ब्लीब गठन चरण के दौरान विट्रोक्टॉमी के दौरान 20-30 मिमीएचजी से 10 मिमीएचजी तक जलसेक दबाव को कम करना रेटिना डिटेचमेंट उत्पन्न करने के लिए इष्टतम है, जो रेटिना ऑर्गेनोइड्स के लिए जगह बनाने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, लंबी दूरी के शिपमेंट के दौरान एचपीएससी -3 डी रेटिना ऊतक (ऑर्गेनोइड्स) की व्यवहार्यता और क्सीनोजेनिक मानव ग्राफ्ट के रखरखाव के लिए अनुकूलित इम्यूनोसप्रेशन आहार चुनना महत्वपूर्ण है जैसा कि हाल ही में31,54 बताया गया है।

लेखकों ने पाया कि अत्यधिक प्रतिबिंबित बिल्ली टेपेटम एंडो-रोशनी के कारण सर्जरी करने की आवश्यकता नहीं थी। एक एटापेटल प्रजाति (जैसे, सुअर, गैर-मानव प्राइमेट) में प्रत्यारोपण के लिए 3-पोर्ट विट्रोक्टॉमी की आवश्यकता होगी जिसमें एंडो-रोशनी शामिल है। नियमित रेटिना डिटेचमेंट सर्जरी में किए गए टैम्पोनैड (उदाहरण के लिए, पेरफ्लोरोकार्बन के साथ सिलिकॉन तेल) नहीं किया गया था क्योंकि ब्लीब पर दबाव से ऑर्गेनोइड्स को विट्रस में बाहर निकालने का खतरा होगा। भविष्य के विकास में रेटिना छेद को सील करने के लिए वर्तमान में जांच की जा रही सामग्रियों का उपयोग शामिल हो सकता है। इसका उपयोग विट्रस में ऑर्गेनोइड्स के किसी भी पोस्ट-इम्प्लांटेशन नुकसान को रोकने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, ट्राइसेंस, जो केनालॉग -40 के समान है, लेकिन इसमें संरक्षक-मुक्त ट्रायमसिनोलोन शामिल है, का उपयोग विट्रस की कल्पना करने के विकल्प के रूप में किया जा सकता है।

छोटे जानवरों (जैसे, 1-2 महीने) में छोटे ग्लोब आकार ने बड़ी आंखों (वयस्क जानवरों) की तुलना में अधिक शल्य चिकित्सा चुनौतियां प्रस्तुत कीं। फिर भी, यहां वर्णित विधि का उपयोग करके, सबरेटिनल ग्राफ्ट वितरित करना संभव है। CrxRdy / + LCA मॉडल में, बड़े रेटिना ब्लीब्स को हमेशा पुन: संलग्न नहीं पाया गया। रेटिना ऑर्गेनोइड्स को इंजेक्शन देने की अनुमति देने के लिए आवश्यक ब्लीब को न्यूनतम आकार में रखने से यह जटिलता कम हो गई। आरडी रेटिना में जल्द से जल्द प्रत्यारोपण (पीआर के पूर्ण नुकसान से पहले जब तंत्रिका रेटिना स्पष्ट रूप से पतली हो जाती है) एक और दिशानिर्देश है, जो मानव भ्रूण रेटिना ग्राफ्ट20 के साथ पहले के काम के अनुरूप है। एक और नोट - विस्तृत तकनीक रेटिना शीट को सही अभिविन्यास में रखने पर निर्भर नहीं करती है क्योंकि पूरे रेटिना ऑर्गेनोइड ्स को प्रत्यारोपित किया जाता है। फ्लैट एचईएससी-रेटिना शीट के विकास के साथ, यह महत्वपूर्ण होगा। हालांकि, यह इस प्रोटोकॉल का फोकस नहीं है, जिसका उद्देश्य बरकरार एचईएससी-रेटिना ऊतक शीट प्रदान करना और पीआर शीट्स के सबरेटिनल संरक्षण को अनुकूलित करना है। एक बार तकनीक विकसित होने के बाद, यह सामान्य और आरडी रेटिना दोनों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य था।

इस शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के लिए कई संभावित जटिलताएं हैं। केवल विट्रियोरेटिनल सर्जरी में कुशल लोग (उदाहरण के लिए, प्रशिक्षित पशु चिकित्सा नेत्र रोग विशेषज्ञ या मानव आंख की तुलना में बिल्ली की आंख में प्रजातियों के अंतर से परिचित विट्रियोरेटिनल सर्जन) को प्रक्रिया शुरू करनी चाहिए। संभावित जटिलताओं में ट्रोकार प्लेसमेंट के दौरान लेंस स्पर्श, स्क्लेरोटॉमी वृद्धि के दौरान स्क्लेरल रक्तस्राव और सबरेटिनल या रेटिना रक्तस्राव शामिल हैं। अन्य जटिलताओं जैसे कि ज़ेनोजेनिक मानव ऑर्गनॉइड ग्राफ्ट के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जो समय के साथ ग्राफ्ट के विनाश या एंडोफथाल्मिटिस के कारण संभव है; मौखिक इम्यूनोसप्रेसेन्ट और एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग इन्हें होने से रोकने में मदद करता है। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वाइल्डटाइप और सीआरएक्सआरडीवाई / + बिल्लियों में आरोपण के बीच अंतर है। जब उन्नत रेटिना अपघटन होता है, तो रेटिना ब्लीब वाइल्डटाइप की तुलना में व्यापक रूप से फैलता है, और, कुछ उदाहरणों में, यह सर्जरी के बाद पूर्ण रेटिना रीअटैचमेंट को रोक सकता है। यहां प्रस्तुत तकनीक आईआरडी के बड़े पशु मॉडल की आंखों में ऑर्गेनोइड्स के आरोपण के लिए लागू है। क्लिनिक में अनुवाद के लिए प्रत्यारोपण तैयार होने के बाद आगे के शोधन की आवश्यकता होगी।

बड़े आंख मॉडल में जटिल विट्रियोरेटिनल सर्जिकल प्रक्रियाओं को करने के साथ लेखकों के अनुभव के आधार पर, इस पांडुलिपि में प्रस्तुत तकनीक अन्य बड़े पशु मॉडल (एटापेटल प्रजातियों में एंडो-रोशनी को शामिल करने के साथ) पर लागू होनी चाहिए, जिनका उपयोग क्लिनिक43,44,45 में विट्रियोरेटिनल सर्जिकल तकनीकों का अनुवाद करने के लिए किया जाता है।

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Disclosures

रत्नेश के. सिंह, पीएच.डी., फ्रेंकोइस बिनेट, पीएच.डी., और इगोर ओ. नासोनकिन पीएच.डी. वंशावली सेल थेरेप्यूटिक्स, इंक के कर्मचारी हैं। लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को एनईआई फास्ट-ट्रैक एसबीआईआर अनुदान आर 44-EY027654-01 ए 1 और एसबीआईआर अनुदान 3 आर 44 ईवाई 027654 - 02 एस 1 (आईओएन, वंशावली सेल थेरेप्यूटिक्स; डॉ पीटरसन-जोन्स एक सह-पीआई है) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक सुश्री जेनिस क्वेरुबिन (एमएसयू आरएटीटीएस) को इस अध्ययन में शामिल जानवरों के लिए संज्ञाहरण और सामान्य देखभाल के साथ-साथ सर्जिकल सेटिंग और उपकरणों की तैयारी / नसबंदी में मदद करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। पैगे विंकलर को ऑर्गेनोइड्स प्राप्त करने और उन्हें आरोपण से पहले दिन मीडिया में रखने और प्रत्यारोपण के दिन मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक रेटिना ऑर्गेनोइड्स की मेहनती शिपिंग, शिपर को इकट्ठा करने और प्रत्येक शिपमेंट के बाद तापमान और जी-तनाव-रिकॉर्ड डाउनलोड करने के लिए श्री रैंडी गार्चर (एलसीटीएक्स) के भी आभारी हैं। यह काम तब किया गया था जब लेखक इगोर नासोनकिन बायोटाइम (अब वंश) द्वारा नियोजित थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore syringe filter with PES membrane Cameo NA can be found through various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula DORC 1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe Hamilton NA can be found through various suppliers
6-0 Silk suture Ethicon 707G
6-0/7-0 polyglactin suture Ethicon J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) Henry Schein Animal Health NA can be found through various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL Par Pharmaceutical NA can be found through various suppliers
cSLO + SD-OCT Heidelberg Engineering Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine Novartis NA can be found through various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium) Vetone NA can be found through various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL Cipla NA can be found through various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarbital solution) Vortech NA can be found through various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL Hospira NA can be found through various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing World Precision Instruments TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL Pfizer NA can be found through various suppliers
Microscope Zeiss NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) Sakura 4583
Olympic Vac-Pac Size 23 Natus NA can be found through various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution EMS 15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution Akorn NA can be found through various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL Akorn NA can be found through various suppliers
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) Zoetis NA can be found through various suppliers
RetCam II video fundus camera Clarity Medical Systems NA can be found through various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) Bristol -Myers Squibb Company NA can be found through various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution Akorn NA can be found through various suppliers
Vitrectomy 23G port Alcon Accurus systems
Vitrectomy machine Alcon Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle Frimen FT170206T

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Occelli, L. M., Marinho, F., Singh, R. K., Binette, F., Nasonkin, I. O., Petersen-Jones, S. M. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model. J. Vis. Exp. (174), e61683, doi:10.3791/61683 (2021).

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