Summary
Hier wird eine Operationstechnik zur Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnenem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum eines Großtiermodells vorgestellt.
Abstract
Degenerative (RD) Netzhauterkrankungen, die mit dem Verlust von Photorezeptoren einhergehen, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Retinitis pigmentosa (RP) und Leber-kongenitale Amaurose (LCA), verursachen einen fortschreitenden und schwächenden Sehverlust. Es besteht ein ungedeckter Bedarf an Therapien, die das Sehvermögen wiederherstellen können, wenn die Photorezeptoren verloren gegangen sind. Die Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnenem Netzhautgewebe (Organoiden) in den subretinalen Raum eines Auges mit fortgeschrittener RD bringt Netzhautgewebeblätter mit Tausenden von gesunden, mutationsfreien Photorezeptoren und hat das Potenzial, die meisten/alle Erblindungskrankheiten, die mit Photorezeptordegeneration verbunden sind, mit einem zugelassenen Protokoll zu behandeln. Die Transplantation von fetalem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum von Tiermodellen und Menschen mit fortgeschrittener RD wurde erfolgreich entwickelt, kann aber aufgrund ethischer Bedenken und begrenzter Gewebeversorgung nicht als Routinetherapie eingesetzt werden. Tiermodelle für große, am Auge vererbte Netzhautdegeneration (IRD) sind wertvoll für die Entwicklung von Therapien zur Wiederherstellung des Sehvermögens, bei denen fortschrittliche chirurgische Ansätze zur Transplantation von Netzhautzellen/-gewebe in den subretinalen Raum verwendet werden. Die Ähnlichkeiten in der Größe des Bulbus und der Verteilung der Photorezeptoren (z. B. das Vorhandensein einer Makula-ähnlichen Region Area centralis) und die Verfügbarkeit von IRD-Modellen, die die menschliche IRD genau rekapitulieren, würden eine schnelle Translation einer vielversprechenden Therapie in die Klinik erleichtern. Hier wird eine chirurgische Technik zur Transplantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum eines Großtiermodells vorgestellt, die es ermöglicht, diesen vielversprechenden Ansatz in Tiermodellen zu bewerten.
Introduction
Millionen von Menschen auf der ganzen Welt sind von Netzhautdegeneration (RD) betroffen, was zu einer Sehbehinderung oder Blindheit führt, die mit dem Verlust der lichtempfindlichen Photorezeptoren (PRs) einhergeht. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen für Erblindung, die auf eine Kombination aus genetischen Risikofaktoren und Umwelt-/Lebensstilfaktoren zurückzuführen ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass über 200 Gene und Loci vererbte RD (IRD) verursachen1. Retinitis pigmentosa (RP), die häufigste IRD, ist genetisch heterogen mit mehr als 3.000 genetischen Mutationen in etwa 70 Genen, die berichtet wurden 2,3,4. Die Leber-Kongenitale Amaurose (LCA), die im Kindesalter zur Erblindung führt, ist ebenfalls genetisch heterogen 5,6. Die Genaugmentationstherapie wurde entwickelt und befindet sich in klinischen Studien zur Behandlung einer kleinen Anzahl von IRDs 3,7. Für die Behandlung jeder einzelnen genetischen Form der IRD muss jedoch eine eigene Therapie entwickelt werden, wobei nur eine kleine Untergruppe von Patienten behandelt werden kann. Darüber hinaus beruht die Genaugmentation auf dem Vorhandensein einer Population von rettbaren Photorezeptoren und ist daher bei fortgeschrittener Degeneration nicht anwendbar.
Es besteht daher ein dringender und noch ungedeckter klinischer Bedarf an der Entwicklung von Therapien zur Behandlung fortgeschrittener RDs und hochgradiger Blindheit bis zum Endstadium. In den letzten 2 Jahrzehnten wurden neuroprothetische Implantate entwickelt und in Großtiermodellen, wie z.B. der Katze, vordem Einsatz beim Menschen getestet 8,9,10,11,12,13,14. Ebenso wurden in den letzten 20 Jahren Netzhautersatztherapien entwickelt, bei denen Schichten aus embryonaler oder sogar reifer Säugetiernetzhaut subretinal transplantiert wurden 15,16,17,18,19,20,21,22 und sogar erfolgreich an RD-Patienten getestet wurden 23,24,25. Beide Ansätze nutzen die Idee, neue Sensoren (photovoltaische Silizium-Fotodioden im Falle von Neuroprothesen26,27 und gesunde mutationsfreie Photorezeptoren, die in Schichten organisiert sind, im Falle der Implantation von Netzhautblättern) in die Netzhaut mit degenerierten PRs einzuführen. Neuere Studien haben die Verwendung stammzellbasierter Ansätze untersucht, wie z. B. die Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnenen Netzhautvorläuferzellen28,29, hPSC-Photorezeptoren 30 und hPSC-Netzhautorganoiden31,32,33. Retinale Organoide ermöglichen die Bildung von Netzhautgewebe in einer Schale und die Ableitung von Photorezeptorblättern mit Tausenden von mutationsfreien PRs, die der Photorezeptorschicht in der sich entwickelnden menschlichen fetalen Netzhaut ähneln 34,35,36,37,38,39,40 . Die Transplantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe (Organoide) in den subretinalen Raum von Patienten mit RD-Erkrankungen ist einer der neuen und vielversprechenden Ansätze für die Zelltherapie, der von einer Reihe von Teams verfolgtwird 31,32,41,42. Im Vergleich zur Transplantation der Zellsuspension (von jungen Photorezeptoren oder retinalen Vorläuferzellen) konnte in klinischen Studien gezeigt werden, dass transplantierte Schichten fetaler Photorezeptoren zu einer Verbesserung des Sehvermögens führen23,24.
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt detailliert ein Transplantationsverfahren zur subretinalen Verabreichung der gesamten Netzhaut-Organoide (anstelle von Organoid-Rändern33,41) als eine potenziell bessere Möglichkeit, intakte Netzhautblätter mit PRs einzuführen, um das Transplantatüberleben zu erhöhen und die Blattkonservierung zu verbessern. Obwohl Verfahren zum Einbringen eines flachen Stücks menschlicher Netzhaut und auch RPE-Pflaster entwickelt wurden43,44,45, wurde die Transplantation größerer 3D-Transplantate nicht untersucht. Aus Stammzellen gewonnene Netzhautorganoide bieten eine unerschöpfliche Quelle von Photorezeptorblättern für die Entwicklung von Technologien zur Wiederherstellung des Sehvermögens, sind frei von ethischen Einschränkungen und gelten als hervorragende Quelle für menschliches Netzhautgewebe für Therapien, die sich auf die Behandlung von fortgeschrittener RD und terminaler Blindheit konzentrieren46. Die Entwicklung chirurgischer Methoden zur präzisen subretinalen Implantation von retinalen Organoiden mit minimaler Schädigung der retinalen Wirtsnische (neuronale Netzhaut, retinales Pigmentepithel sowie retinale und choroidale Gefäße) ist einer der entscheidenden Schritte, um eine solche Therapie in Richtung klinischer Anwendungen voranzutreiben31,32. Großtiermodelle wie Katzen, Hunde, Schweine und Affen haben sich als gute Modelle erwiesen, um chirurgische Verabreichungsmethoden zu untersuchen sowie die Sicherheit von implantierten Gewebeschichten (retinale Pigmentepithelzellen (RPE) zu demonstrieren und die Verwendung von Organoiden zu untersuchen 41,44,45,47,48,49,50. Das große Tierauge hat eine ähnliche Kugelgröße wie der Mensch sowie eine ähnliche Anatomie, einschließlich des Vorhandenseins einer Region mit hoher Photorezeptordichte, einschließlich Zapfen (der Area centralis), die der menschlichen Makula ähnelt 6,51,52.
In diesem Manuskript wird eine Technik zur Implantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe (Organoiden) in den subretinalen Raum von felinen Großtiermodellen (sowohl Wildtyp- als auch CrxRdy/+-Katzen) beschrieben, die zusammen mit vielversprechenden Wirksamkeitsergebnissen32,53 eine Grundlage für die weitere Entwicklung einer solchen Prüftherapie in Richtung klinischer Anwendungen zur Behandlung von RD-Erkrankungen bildet.
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Protocol
Die Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Sie wurden auch vom Institutional Animal Care and Use Committee der Michigan State University genehmigt. In dieser Studie wurden Wildtyp- und CrxRdy/+ -Katzen aus einer Katzenkolonie verwendet, die an der Michigan State University gehalten wurde. Die Tiere wurden unter 12 h : 12 h Hell-Dunkel-Zyklen untergebracht und mit einer handelsüblichen Alleinfutter für Katzen gefüttert.
1. Präimplantationsverfahren und chirurgische Einrichtung
- Wählen Sie je nach Studiendesign Wildtyp- oder Crx-Rdy/+ -Katzen aus. Führen Sie eine präoperative ophthalmologische Untersuchung durch, einschließlich Spaltlampen-Biomikroskopie und indirekter Ophthalmoskopie. Schließen Sie alle Tiere mit Fundusanomalien aus, die nicht mit ihrem Genotyp zusammenhängen.
- Beginnen Sie die Tiere eine Woche vor der Implantation mit einem immunsuppressiven Protokoll aus oralem Ciclosporin 2 mg/kg und Prednisolon 1 mg/kg, jeweils zweimal täglich, um eine Abstoßung des Transplantats zu verhindern.
- Fasten Sie die Tiere, die älter als 4 Monate sind, über Nacht (mindestens 8 h). Geben Sie den Tieren unter 4 Monaten über Nacht eine begrenzte Menge Nassfutter und fasten Sie sie dann 2 Stunden vor der Operation.
- Führen Sie eine allgemeine körperliche Untersuchung durch, einschließlich einer Auskultation des Brustkorbs (mit einem Stethoskop). Notieren Sie die Herz- und Atemfrequenz, die Temperatur, die Schleimhautfarbe und die Nachfüllzeit der Kapillaren.
- 30–45 Minuten vor der Vollnarkoseeinleitung werden die Tiere unter 4 Monaten subkutan oder intramuskulär mit Buprenorphin (0,02 mg/kg) und die Tiere über 4 Monate mit Buprenorphin (0,02 mg/kg) in Kombination mit Aceppromazin (0,02 mg/kg) subkutan oder intramuskulär behandelt.
- Tragen Sie topische 1%ige Tropicamid-Augenlösung und 10%ige Phenylephthalmin-Augenlösung mindestens zweimal auf die Augenoberfläche auf, um die Pupillen zu erweitern. Wiederholen Sie den Vorgang, wenn die Pupillen nicht gut geweitet sind.
- Legen Sie bei allen Tieren einen 22 g intravenösen Katheter in die Kopfvene: Schneiden Sie zuerst Haare aus einem Bereich von 2 x 3 cm über die Kopfvene; Bereiten Sie die Haut vor, indem Sie sie zuerst mit 70% Ethanol und dann mit einem Chlorhexidin-Peeling schrubben. Legen Sie den Katheter und befestigen Sie ihn mit medizinischem Klebeband und spülen Sie mit heparinisierter Kochsalzlösung. Bei Tieren unter 4 Monaten kann dies nach Einleitung einer Narkose erfolgen.
- 30–45 Minuten nach der Prämedikation eine Vollnarkose einleiten: Tiere unter 4 Monaten werden mit Isofluran über eine Maske induziert, Tiere über 4 Monate werden mit intravenösem Propofol (4–6 mg/kg) induziert.
- Intubieren Sie mit einem Endotrachealtubus in geeigneter Größe. Visualisieren Sie den Kehlkopf mit einer Untersuchungslampe oder einem Laryngoskop. Sprühen Sie 0,1 ml Lidocain 2% auf den Kehlkopf, warten Sie einige Sekunden und intubieren Sie dann.
- Halten Sie die Anästhesie mit Isofluran (zwischen 2 % und 3,5 %) in Sauerstoff (300 bis 600 ml/kg/min) über ein Bain-System aufrecht.
- Legen Sie das Tier in Rückenlage auf ein Lagerkissen, auf dem eine beheizte, mit Handtüchern bedeckte Wasserdecke liegt. Bringen Sie einen Patientenmonitor an und überwachen Sie die Herzfrequenz und das Elektrokardiogramm (EKG), die Atemfrequenz, den Blutdruck, die Sauerstoffsättigung und das endtidale Kohlendioxid. Überwachen Sie während des Eingriffs regelmäßig die Körpertemperatur. Eine entsprechend geschulte Person ist für die Aufrechterhaltung und Überwachung der Anästhesie verantwortlich.
- Positionieren Sie das Tier mit Hilfe des Lagerungskissens so, dass die Hornhautoberfläche horizontal ist, wenn das Auge in eine primäre Blickposition gedreht wird. Befestigen Sie den Kopf mit medizinischem Klebeband.
- Decken Sie das Tier mit Decken zu, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
- Spülen Sie den intravenösen Katheter mit heparinisierter Kochsalzlösung und beginnen Sie mit einer intravenösen Infusion von Ringer-Laktat, das für die Dauer des Eingriffs mit 2–5 ml/kg/h zugeführt wird.
- Bereiten Sie die Augenoberfläche, den Bindehautsack und die Augenlider mit 0,2 % Povidon-Jod, sterilen Wattestäbchenapplikatoren und Wattebällchen für die aseptische Operation vor.
- Positionieren Sie das Operationsmikroskop mit ebenfalls entsprechend eingestellten Okularen. Platzieren Sie den Fußschalter für das Mikroskop (Fokus-, Zoom- und XY-Achsensteuerung) und das Vitrektomiegerät so, dass der Chirurg sie bedienen kann.
- Bereiten Sie sich auf aseptische Eingriffe vor: Alle Mitarbeiter müssen OP-Peelings, einen OP-Hut und eine Maske tragen. Stellen Sie sicher, dass der Chirurg und der/die Assistent(en) wie bei der routinemäßigen aseptischen Operation schrubben, kittel und handschuhen. Alle Mitarbeiter sollten mit aseptischen Techniken vertraut sein.
- Sobald das Personal geschrubbt, gekleidet und behandschuht ist, öffnen Sie die OP-Packungen und legen Sie die Instrumente aus. Platzieren Sie sterile Manipulationsknöpfe auf den Einstellknöpfen des Mikroskops, damit der Chirurg oder der Assistent die Einstellungen vornehmen kann, ohne die Asepsis zu unterbrechen. Drapieren Sie das Tier routinemäßig für Augenoperationen.
- Bereiten Sie das Vitrektomiegerät gemäß den Anweisungen des Herstellers für eine Vitrektomie mit zwei Anschlüssen vor.
- Legen Sie eine Vitrektomie-Kontaktlinse und eine 23-G-Vitrektomie mit zwei Anschlüssen auf den Tisch des Assistenten. Befestigen Sie den Nassfeldkauter. Bringen Sie den Infusionsschlauch und das 23-G-Vitrektomie-Handstück an und grundieren Sie es.
- Legen Sie die Vitrektomieinstrumente und Flüssigkeitsleitungen über das sterile Tuch und halten Sie sie mit Handtuchklammern in Position. Stellen Sie das Vitrektomiegerät in den proportionalen Vakuummodus zwischen 1.500 und 2.500 Schnitte pro Minute (cpm) und ein maximales Vakuum von 500 mmHg. Dies geschieht durch Drücken der Pfeiltasten (nach oben oder unten) auf der Vorderseite des Vitrektomiegeräts.
2. Vorbereitung der Organoide für die subretinale Implantation (Abbildung 1)
- Ableitung von Netzhaut-Organoiden wie zuvor beschrieben 31 und bei Bedarf Versand über Nacht bei37 °C, wie zuvor berichtet54.
- Wischen Sie die Oberflächen im Gewebekulturraum im aufnehmenden Labor mit einem Desinfektionsmittel ab und halten Sie das gleiche hohe Maß an aseptischer Technik wie in einem Operationssaal für Augenoperationen aufrecht, um eine bakterielle oder pilzliche Kontamination zu vermeiden, und übertragen Sie sie in den Operationssaal, um Infektionen an der Operationsstelle zu vermeiden.
- Tragen Sie chirurgische Schuhüberzieher, Einweg-Laborkittel, Hauben, chirurgische Masken, Ärmel und chirurgische Peelings in dem Gewebekulturraum, der für die organoide Vorbereitung für Augenoperationen vorgesehen ist.
- Neuronale Medien mit 20 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und 20 ng/ml hirnabgeleitetem neurotrophem Faktor (BDNF) für 1 h in einem Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2) voräquilibrieren. Platzieren Sie Organoide in Medien in Platten mit extrem niedriger Adhäsion, wobei etwa ein Viertel des Volumens des konditionierten Mediums (aus dem Versand über Nacht) und drei Viertel des Volumens des frischen Mediums verwendetwerden 31,54. 24–48 h haltbar machen.
- Vor der Betäubung des ersten Tieres werden mehrere frische 60-mm-Platten mit neuronalem Medium (wie in Schritt 2.4 hergestellt) vorbereitet und mindestens 1 h im Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2) äquilibriert. Beachten Sie, dass diese Platten für den Transfer der Organoide für jede einzelne Operation verwendet werden, wobei davon ausgegangen wird, dass die pH-Bedingungen und die CO2 - Sättigung mindestens 20 Minuten lang im Medium aufrechterhalten werden, was ausreicht, um die Platte in den Operationssaal zu bringen und Organoide in die Kanüle zu laden.
- Verwenden Sie für jeden Transplantationsfall eine frische 60-mm-Platte mit vorgesättigten neuronalen Medien, während Sie die restlichen Platten im Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C aufbewahren.
- Übertragen Sie 6–9 Organoide in eine 60-mm-Schale (mit wiedergesättigten Medien), indem Sie sie mit einer manuellen Einkanalpipette (20–200 μl) mit einer sterilen 200-μl-Filterspitze mit einer breiten Öffnung (~0,7 mm) herauspipettieren. Diese Spitzen können im Voraus oder während des Eingriffs vorbereitet werden, indem ~3-4 mm der Spitze mit einer sterilen Schere abgeschnitten werden (in der Gewebekulturhaube, um eine Kontamination zu vermeiden). Legen Sie die 60-mm-Schale in eine 100-mm-Gewebekulturschale (um eine Kontamination beim Transport von Raum zu Raum zu vermeiden) und transportieren Sie sie schnell in den Operationssaal.
- Legen Sie die Platte mit den Organoiden auf ein elektrisches Heizkissen mit 37 °C, das mit einem sterilen Tuch bedeckt ist.
- Ziehen Sie ein frisches Paar sterile Handschuhe an, bevor Sie die Organoide vorbereiten.
- Spülen Sie die Organoide in steriler balancierter Salzlösung (BSS) (optional) und füllen Sie sie dann in den Injektor, der aus einer dünnwandigen Borosilikatglaskanüle (Außendurchmesser, Außendurchmesser, Außendurchmesser, ID 1,12 mm) mit einem polierten, stumpfen Ende besteht, das durch einen sterilen Kunststoffschlauch an einer sterilen 500-μl-Hamilton-Spritze befestigt ist, die mit sterilem BSS vorgefüllt ist.
- Geben Sie die Kanüle steril an das Operationsteam weiter, wenn es bereit ist, die Organoide zu injizieren.
- Beschränken Sie die Dauer des gesamten Verfahrens (von der Entnahme der Organoide aus den Gewebekulturmedien bis zum Beladen der Kanüle) auf 20 Minuten oder weniger.
- Wenn es zu einer Verzögerung bei der Implantation der Organoide kommt, legen Sie sie wieder in den Gewebekultur-Inkubator, um Änderungen der pH/CO2 - Sättigung in der Schale zu vermeiden.
- Bewahren Sie unbenutzte Organoide 1 Woche lang im selben Gewebekultur-Inkubator auf und überwachen Sie sie auf Anzeichen einer Kontamination.
3. Implantation subretinaler Organoide
- Führen Sie eine 0,5–1 cm lange laterale Kanthotomie mit einer Stevens-Tenotomieschere durch. Platzieren Sie ein Barraquer-Augenlidspekulum in angemessener Größe, um die Augenlider offen zu halten. Stellen Sie sicher, dass der OP-Assistent die Hornhaut für die Dauer des Eingriffs regelmäßig mit BSS spült.
- Platzieren Sie 2 Haltenähte mit 6–0 Seidennaht in der Bindehaut unmittelbar neben dem Limbus an der 4- und 8-Uhr-Position, um das Auge im primären Blick zu halten und das dritte Augenlid zurückzuziehen. Verwenden Sie 0,5 Castroviejo Hornhautbindezangen und ein kleines Mückenhämostat, um die bulbäre Bindehaut neben dem Limbus sanft zu greifen. Lassen Sie die Nähte lang und klemmen Sie die Enden mit kleinen Mückenhämostaten ein, um ihre Manipulation zu erleichtern.
HINWEIS: Das Platzieren der Naht unter dem dritten Augenlid ist schwieriger. Achten Sie darauf, es direkt neben dem Limbus zu platzieren. - Platzieren Sie eine weitere Naht in der 12-Uhr-Position am Limbus teilweise durch die Dicke des Limbus und achten Sie darauf, nicht in das Auge einzudringen. Verknoten Sie diese Naht locker und schneiden Sie die Enden kurz ab. Dies bietet eine robuste Ankernaht, die während der Operation als "Griff" verwendet wird, um das Auge zu drehen, um dem Chirurgen in verschiedenen Phasen des Eingriffs den Zugang zu verschiedenen Teilen des Globus zu ermöglichen.
HINWEIS: Die Schritte 3.2 und 3.3 können invertiert werden. Die Reihenfolge der Platzierung der Haltenähte ist die Präferenz des Chirurgen. - Reflektieren Sie die bulbäre Bindehaut zwischen 10–2 Uhr (die Perimetrie). Mit einer Tenotomieschere die Bindehaut 2–3 mm vom Limbus entfernt einschneiden. Untergraben Sie es und reinigen Sie die Zapfenkapsel, um die Sklera an den Stellen für die 2- und 10-Uhr-Vitrektomieports freizulegen, die je nach Alter des Tieres etwa 3–5 mm vom Limbus entfernt platziert werden. Verwenden Sie chirurgische Zellulosespeere zur Hämostase und zur Reinigung von Blut.
- Identifizieren Sie die Stellen für eine Sklerotomie nach der Reflexion der Bindehaut und der Zapfenkapsel mit Messschiebern. Wählen Sie Sklerotomiestellen (bei 2 und 10 Uhr mit dem Ziel, Pars plana zu passieren), um die großen Skleragefäße zu vermeiden, die bei der Katze hervortreten können. Verwenden Sie eine Wet-Field-Kauterisation an der Sklera an den geplanten Sklerotomiestellen, um Sklerablutungen zu reduzieren, und planen Sie einen Bereich von ~3 mm am Instrumentenanschluss (10-Uhr-Port für einen rechtshändigen Chirurgen) ein, da dieser nach der Vitrektomie vergrößert wird, um die Einführung der Implantationskanüle zu ermöglichen.
- Kreuzbandnähte (6-0 oder 7-0 Polyglactin-Naht) werden vor dem Einsetzen der Vitrektomieports platziert, ohne den Knoten an der Stelle der vorgeschlagenen Sklerotomien zu binden.
HINWEIS: Dies erleichtert einen schnellen Verschluss der Sklerotomien am Ende des Eingriffs. Die Naht für den geplanten Instrumentenport muss einen längeren Sklerabiss haben, da es sich um einen langen Schnitt handelt. - Sobald die Nähte platziert sind, bitten Sie den Assistenten, bei der Positionierung des Globus zu helfen, indem Sie die 12-Uhr-Scherennähte halten, indem Sie sie binden oder eine Bishop-Harmon-Pinzette verwenden. Lassen Sie den Chirurgen auch den Bulbus stabilisieren, indem Sie eine 0,12 mm Castroviejo-Pinzette verwenden, um das Gewebe neben der Sklerotomiestelle zu halten.
- Führen Sie einen 23-G-Vitrektomieanschluss mit einem Trokar durch die Sklera sowohl an der 2-Uhr- als auch an der 10-Uhr-Position ein, der in einem Winkel zum Sehnerv gerichtet ist, um einen Kontakt mit der Linse zu vermeiden.
- Überprüfen Sie, ob sich der Spülanschluss im Glaskörper befindet, indem Sie mit einer Bindezange vorsichtig auf den Anschluss drücken, damit die Spitze im Glaskörper sichtbar ist. Sobald die korrekte Positionierung bestätigt ist, befestigen Sie die Bewässerungsleitung am Anschluss und positionieren Sie die Leitung mit dünnen Klebebinden, um sie festzukleben. Stellen Sie die Vitrektomieinfusion des BSS-Puffers zunächst auf 30–35 mmHg ein, indem Sie auf die Pfeiltasten (nach oben oder unten) auf der Vorderseite des Vitrektomiegeräts drücken.
- Lassen Sie den Assistenten eine Machemer-Lupenlinse auf die Hornhaut halten, um den hinteren Augenabschnitt in den nächsten Schritten sichtbar zu machen. Befestigen Sie die Spüllinse für die Vitrektomie an einem Tropfset, das eine konstante Flüssigkeitszufuhr gewährleistet, um die Linse an die Hornhaut anzukoppeln.
HINWEIS: Es können auch andere Formen der Vitrektomielinse verwendet werden. Dimmen oder schalten Sie die Raumbeleuchtung aus, um die Visualisierung durch das Operationsmikroskop zu erleichtern. - Führen Sie die 23-G-Vitrektomiesonde/-fräser (2.500 cpm) durch den Instrumentenanschluss (neben der dominanten Hand des Chirurgen, d. h. dem 10-Uhr-Anschluss für einen rechtshändigen Chirurgen) ein und führen Sie eine partielle Vitrektomie durch.
- Entfernen Sie dann den Glaskörper vollständig von der Netzhautoberfläche in der Region, in der das Transplantat empfangen wird (dies ist wichtig für den Erfolg des Eingriffs), indem Sie das Glaskörpergesicht von der Netzhaut ablösen.
- Platzieren Sie die Vitrektomiesonde mit dem von der Netzhautoberfläche abgewandten Port über dem Sehnervenkopf und wenden Sie ein höheres Vakuum an, um mit der Glaskörperablösung zu beginnen.
- Bereiten Sie Triamcinolonkristalle für die intraokulare Anwendung vor. Wenn die Triamcinolon-Suspension nicht speziell für die intravitreale Anwendung bestimmt ist, waschen Sie die Kristalle und suspendieren Sie sie dann erneut in BSS.
- Zunächst wird die Suspension mit Hilfe eines sterilen 0,22 μm Porenspritzenfilters mit PES-Membran (an einer 1 mL Spritze befestigt) filtriert, um die Kristalle einzufangen.
- Waschen Sie dann die eingeschlossenen Triamcinolonkristalle, indem Sie BSS in der 1-ml-Spritze absaugen und durch den Filter spülen (die Kristalle bleiben im Filter eingeschlossen). Dadurch werden die Konservierungsstoffe in der Lösung entfernt. Wiederholen Sie das Waschen 3 Mal, danach werden die Kristalle in 1 ml BSS wieder suspendiert.
- Führen Sie die Nadel der Spritze, die das Triamcinolon hält, durch den Instrumentenanschluss ein. Achten Sie darauf, die Linse nicht zu berühren, indem Sie die Nadelspitze durch die Pupille beobachten, während Sie die Nadel durch die Instrumentenöffnung einführen. Injizieren Sie 0,25 bis 0,5 ml Kristallsuspension. Führen Sie dann die Vitrektomiesonde durch den Instrumentenanschluss ein und schieben Sie sie in die Nähe des Sehnervenkopfes, wobei der Port von der Netzhautoberfläche weg ist, und verwenden Sie Hochvakuum, um das vitreale Gesicht von der Netzhaut zu lösen.
HINWEIS: Die Triamcinolon-Kristalle haften und heben so den verbleibenden Glaskörper hervor. Entfernen Sie vorsichtig alle Glaskörper oberhalb und neben der Stelle der geplanten Organoidimplantation (z. B. des zentralen tapetalen Fundus in der Nähe der Area centralis-Region ). - Erzeugen Sie eine kleine fokale Netzhautablösungsblase an der gewünschten Implantationsstelle mit einem subretinalen Injektor, z. B. einem 23 g subretinalen Injektor mit einer ausziehbaren 41 G-Kanüle, die an einer sterilen, gasdichten 250-μl-Luer-Lock-Spritze befestigt ist, die mit sterilem BSS gefüllt ist.
- Reduzieren Sie vor der Herstellung der subretinalen Blase den Infusionsdruck auf 10 mmHg, um die Bildung von Blasen zu erleichtern.
- Führen Sie den Injektor durch den Instrumentenanschluss ein und schieben Sie ihn in Richtung der Netzhautoberfläche. Extrudieren Sie die Kanülenspitze und drücken Sie sie vorsichtig auf die Netzhautoberfläche. Bitten Sie den Assistenten, einen leichten schnellen Druck auf den Spritzenkolben zu geben, um die Netzhautablösung zu starten, die den Injektionsdruck verringert, um eine langsame Zunahme der Netzhautablösung zu ermöglichen, bis die gewünschte Größe erreicht ist (ca. 100 bis 200 μl BSS werden verwendet).
- Wenn sich die durchgeführte Retinotomie an einer geeigneten Stelle befindet, die ein Durchtrennen der Netzhaut zwischen der Implantationsstelle und dem Sehnervenkopf vermeidet, um die Durchtrennung der von der Implantationsstelle abgeleiteten Nervenfaserschicht zu verhindern und große retinale Blutgefäße zu vermeiden (dies wird auch durch das Studiendesign bestimmt, in unserem Fall wurde die zentrale Netzhaut gewählt), Vergrößern Sie es dann leicht mit der 41-G-Kanüle des Injektors, um das Einführen der Netzhautschere zu erleichtern.
- Entfernen Sie den Injektor aus dem Auge und entfernen Sie den 10-Uhr-Skleraanschluss. Vergrößern Sie die Sklerotomie an dieser Stelle mit einem geraden 2,85 mm Schlitzmesser/Keratom, das auf den Sehnerv ausgerichtet ist, um eine Berührung der Linse zu vermeiden. Halten Sie den Infusionsdruck bei 10–15 mmHg.
- Verlängern Sie die Retinotomie mit einer vertikalen 80°-Schere mit Quetschgriff, vermeiden Sie das Durchschneiden von Netzhautgefäßen, um Netzhautblutungen zu vermeiden, und achten Sie darauf, die Netzhaut am Rand der Blase vom Sehnervenkopf weg zu schneiden, um zu vermeiden, dass Nervenfasern durchtrennt werden, die von der Netzhaut im Transplantationsbereich zum Sehnerv führen. Die Retinotomie sollte breit genug sein, um die Organoide aufzunehmen.
- Die vorgeladene Glaskapillare mit den Organoiden (siehe Schritt 2.10) wird durch die vergrößerte Sklerotomie eingeführt und unter direkter Visualisierung in Richtung Retinotomiestelle vorgeschoben.
- Verwenden Sie die Spitze der Glaskapillare, um die Retinotomie leicht zu öffnen, um Zugang zur Öffnung in der subretinalen Blase zu erhalten.
- Bitten Sie den Assistenten, langsam auf den Kolben des Injektors zu drücken, während er durch das Mikroskop beobachtet und die Organoide in die subretinale Blase injiziert. Die BSS sollte den Organoiden vorangehen und die Retinotomie aufspülen.
- Schieben Sie die Organoide vorsichtig mit der Spitze der Glaskapillare in die Bläsche, wenn sie sich am Rand der Retinotomie befinden.
- Halten Sie die Glaskapillare bei der Retinotomie einige Sekunden lang fest, um zu versuchen, die Retinotomie zu schließen und zu verhindern, dass die Organoide in den Glaskörper entweichen.
- Entfernen Sie die Glaskapillare sehr langsam aus dem Auge, um eine plötzliche Freisetzung von Flüssigkeit aus dem Auge zu vermeiden, um Flüssigkeitsbewegungen im Auge zu vermeiden, die die Organoide aus dem subretinalen Bläschen ausstoßen könnten.
- Erhöhen Sie den Infusionsdruck langsam auf 20–30 mmHg, um intraokulare Blutungen zu vermeiden, und achten Sie darauf, dass die Infusionsflüssigkeit nicht direkt auf die Blase gespült wird. Dies geschieht durch Drücken der nach oben gerichteten Pfeiltasten auf der Vorderseite des Vitrektomiegeräts.
- Verschluss der Sklerotomie mit der vorplatzierten Naht im Kreuzmuster (6–0 oder 7–0 Polyglactin). Fügen Sie bei Bedarf zusätzliche einfache unterbrochene Nähte hinzu, um die Sklerotomie zu versiegeln.
- Bitten Sie den Assistenten, den Infusionsanschluss zu entfernen, und lassen Sie den Chirurgen die vorplatzierte Naht schnell binden, um die Sklerotomie abzudichten und einen Verlust des Augeninnendrucks zu verhindern.
- Verschließen Sie den Bindehautschnitt (Peritomie) mit 6–0 oder 7–0 Polyglactin in einem einfachen, kontinuierlichen Muster.
- Stellen Sie den Fundus dar (z. B. mit einer RetCam II-Videofunduskamera, Clarity oder ähnlichem) und zeichnen Sie die unmittelbare Position der Organoide im subretinalen Raum auf.
- Bereiten Sie die Augenoberfläche nach der Bildgebung mit 0,2%iger Povidon-Jodlösung mit Hilfe von Wattespitzenapplikatoren und Wattebällchen erneut vor. Entfernen Sie die drei Scherennähte und das Deckelspekulum.
- Schließen Sie die laterale Kanthotomie mit 6-0 Polyglactin-Naht. Platzieren Sie eine einzelne vergrabene Naht, gefolgt von einer Zahl von 8 Hautnähten, um den lateralen Canthus zu reformieren, und verwenden Sie dann einfache unterbrochene Hautnähte, um den Rest der Wunde zu schließen.
- Nach Abschluss des chirurgischen Eingriffs wird eine Kombination aus Steroid und Antibiotikum (2 mg Methylprednisolonacetat, 0,1 mg Dexamethason und 1 mg Gentamicin) subkonjunktival injiziert. Tragen Sie ein ophthalmologisches Gleitmittel (künstliche Tränen) auf die Hornhaut auf.
- Erholen Sie das Tier aus der Narkose und überwachen Sie es während der Genesung engmaschig auf Anzeichen von Schmerzen, die eine zusätzliche Behandlung erfordern würden, wie z. B. ausgeprägter Blepharospasmus, starker Widerwille gegen Manipulation, Lethargie oder verminderter Appetit sowie erhöhte Atem- und Herzfrequenz. Führen Sie bei Bedarf eine postoperative Analgesie durch und überwachen Sie engmaschig auf Beschwerden.
HINWEIS: Nur ordnungsgemäß geschultes Personal sollte für die Anästhesie und Überwachung der Katzenpatienten vor, während und nach der Operation verantwortlich sein. Befolgen Sie die Empfehlungen der örtlichen Tierethikkommission für die postoperative Versorgung.
4. Postimplantationsverfahren, postoperative Behandlung und Beurteilung
- Setzen Sie die Behandlung mit oralen Immunsuppressiva (1 mg/kg Prednisolon und 2 mg/kg Ciclosporin oral zweimal täglich) fort, um die Entzündung und Abstoßung der Organoide zu kontrollieren. Bereitstellung einer systemischen Antibiotikaabdeckung (z. B. orales Doxycyclin 5 mg/kg zweimal täglich – dieses Antibiotikum wurde wegen des Risikos einer opportunistischen Mykoplasmeninfektion bei immunsupprimierten Tieren ausgewählt).
- Führen Sie regelmäßige augenärztliche Untersuchungen durch, um Entzündungen oder die Entwicklung unerwünschter Ereignisse zu überwachen. Überwachen Sie die Netzhautblase auf Abflachungen, die in den ersten Tagen nach der Operation auftreten, trotz der großen Retinotomie, die für die Injektion von Organoiden in den subretinalen Raum erforderlich ist. Nehmen Sie bei jeder Untersuchung Fundusbilder auf, um die Position und das Aussehen der transplantierten Organoide zu erfassen.
- Bildgebung der Tiere unter Vollnarkose mittels konfokaler Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (cSLO) und Spektralbereichs-optischer Kohärenztomographie (SD-OCT)5,31 während des Beobachtungszeitraums und vor Beendigung des Versuchs.
- Die Tiere werden am Ende des Versuchs mit einer von der AVMA zugelassenen Methode, z. B. intravenöse Verabreichung von 85 mg/kg Pentobarbital, auf humane Weise eingeschläfert. Legen Sie nach der Sedierung einen intravenösen Katheter zur Verabreichung des Pentobarbitals, um Stress zu minimieren. Bestätigen Sie den Tod durch Herzstillstand und machen Sie einen Schnitt in den Brustkorb, um einen Pneumothorax zu erzeugen.
- Entfernen Sie die Augen mit einem standardmäßigen transkonjunktivalen Zugang und fixieren Sie sie nach Bedarf. Für die Immunhistochemie (IHC) werden die Augen sofort in 4%ige Paraformaldehydlösung getaucht, nachdem 0,3 ml der Fixierlösung durch 3 Schlitze durch Pars plana mit einer 11-Parker-Klinge (~3-4 mm vom Limbus entfernt) in den hinteren Augenabschnitt injiziert wurden.
- Präparieren Sie die Augenmuscheln nach 3,5 h Fixierung bei 4 °C. Entfernen Sie Glaskörperreste und achten Sie darauf, dass die Netzhaut und die Organoide intakt bleiben. Wieder für weitere 30 min bei 4 °C in das Fixiermittel legen, dann spülen Sie die Augenmuscheln 3 mal für jeweils 10 min in PBS. Übertragen Sie die Augenmuschel für 2 h auf 15 % Saccharose, dann für weitere 2 h auf 30 % Saccharose.
- Spülen Sie die Augenmuschel zweimal mit PBS und betten Sie sie in OCT-Medium (optimale Schnitttemperaturverbindung) und Schockfrost ein, dann lagern Sie sie bei -80 °C bis zur Schnittung für Histologie und Immunchemie.
- Auswahl der Antikörper für IHC auf der Grundlage des Studienprotokolls und der Ziele.
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Representative Results
Dieses Verfahren ermöglicht die erfolgreiche und reproduzierbare Implantation von hPSC-abgeleiteten Netzhautorganoiden in den subretinalen Raum eines Tiermodells mit großen Augen (hier demonstriert anhand von 2 Beispielen: Wildtyp-Katzen mit gesunden Photorezeptoren (PRs) und CrxRdy/+ -Katzen mit degenerierenden PRs und Netzhaut). Bereiten Sie die aus hPSC gewonnenen Netzhautorganoide mit den in Abbildung 1 angegebenen Schritten vor und laden Sie sie in die Borosilikatglaskanüle des Injektionsgeräts, damit die Organoide nicht beschädigt werden. Dies kann durch direkte Visualisierung während der Beladung der Organoide (Schritt 2.10) und während der Operation (Schritt 3.16) (Abbildung 2A,B) sowie durch die Fundusbildgebung am Ende der Operation (Schritt 3.23, Abbildung 2C) bestätigt werden. Das Vorhandensein der Organoide im subretinalen Raum mit dieser Technik wird postoperativ durch eine ophthalmologische Untersuchung und eine Fundusbildgebung bestätigt (Abbildung 3A), die die Position und das Aussehen der Organoide aufzeichnet. Die Kenntnis der Position des Transplantats ist bei der Verarbeitung der Globen für die gefrorene Histologie und Immunhistochemie sehr wichtig und reduziert den Arbeitsaufwand erheblich, da das Schneiden eines großen Auges bei 12–14 μm (Dicke eines Kryoschnitts) Zeit in Anspruch nimmt. Vor der Euthanasie werden auch eine konfokale Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (cSLO) und eine optische Kohärenztomographie (SD-OCT) durchgeführt, um die Position der Organoide im subretinalen Raum zu beurteilen (Abbildung 3A-D). Diese Techniken demonstrieren die Persistenz von retinalen Organoiden im subretinalen Raum (zwischen der neuralen Netzhaut und RPE) des Empfängerauges (Abbildung 3E). Im Anschluss an die Euthanasie (die auf humane Weise gemäß den Empfehlungen der AVMA durchgeführt wird) wird die Histologie und Immunhistochemie (IHC) routinemäßig durchgeführt (siehe Details in der zuvor veröffentlichten Arbeit31). Die Histologie und die IHC zeigen das Überleben von xenogenen Transplantaten (hPSC-abgeleitete Netzhautorganoide) im subretinalen Raum eines großen Auges, wenn die Tiere immunsupprimiert waren (wie zuvor beschrieben31), siehe Abbildung 4.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Schritte zur Herstellung von Organoiden vor der Implantation.
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Abbildung 2: Chirurgische subretinale Implantationen von Organoiden. (A) Direkte Visualisierung von Organoiden, die durch eine Glaskanüle in den subretinalen Raum abgegeben werden, ohne beschädigt zu werden, (B) Direkte Visualisierung von Organoiden in der subretinalen Blase, (C) Weitwinkel-Fundusfarbbild der subretinal implantierten Organoide unmittelbar nach der Operation. Die Bläschenränder sind durch die schwarzen Pfeilspitzen und die Retinotomiestelle durch die schwarzen Sterne gekennzeichnet.
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Abbildung 3: Postoperative Beurteilung von subretinal implantierten Organoiden 3 Monate nach der Implantation in einer CrxRdy/+ Kat. (A) Fundus-Farbbild der subretinal implantierten Organoide, (B) cSLO-Fundusbild der subretinal implantierten Organoide, (C) 3D-Volumenscan-Rekonstruktion des Bereichs mit den Organoiden, (D) cSLO-Bild des Bereichs mit subretinalen Organoiden, (E) SD-OCT-hochauflösendes Querschnittsbild der subretinal implantierten Organoide. Die Retinotomiestelle ist durch die schwarzen Sterne gekennzeichnet.
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Abbildung 4: Humane retinale Organoid-abgeleitete Photorezeptorblätter (PR-Marker RCVRN) im subretinalen Raum der CrxRdy/+ Katze, 3 Monate nach der Transplantation. *Synaptische Boutons (hSYP=Synaptophysin) in der inneren Kernschicht (INL) der Katze.
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Discussion
Die Implantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe (Netzhautorganoide) in den subretinalen Raum ist ein vielversprechender experimenteller Ansatz zur Wiederherstellung des Sehvermögens bei degenerativen Netzhauterkrankungen im Spätstadium, die durch den Tod von PR-Zellen (hochgradige oder terminale Blindheit) verursacht werden. Der vorgestellte Ansatz baut auf einer zuvor entwickelten und erfolgreich getesteten experimentellen Therapie auf, die auf der subretinalen Transplantation eines Stücks menschlichen fetalen Netzhautgewebes basiert23,24,25. Es stellt die Verwendung einer alternativen, nachwachsenden und ethisch vertretbaren Netzhautgewebequelle dar, die aus hPS-Zellen gewonnen wird. Der Nachweis der chirurgischen Machbarkeit und der okulären Sicherheit der Therapie in Tiermodellen mit großen Augen51,55 ist erforderlich, um diesen vielversprechenden Ansatz in die klinische Anwendung zu bringen. Dieses Manuskript stellt eine detaillierte Methode zur subretinalen Implantation von hPSC-3D-Netzhautgewebe (Netzhaut-Organoide) in einem Großtiermodell mit normaler und degenerierender Netzhaut (Modell von CrxRdy/+ Katzenmodell von LCA) vor. Obwohl Verfahren zur Einführung eines flachen Stücks menschlicher Netzhaut und auch RPE-Patches entwickelt wurden43,44,45, wurde die Transplantation größerer 3D-Transplantate (die zur Wiederherstellung des Sehvermögens bei fortgeschrittener RD erforderlich sind) nicht untersucht. Das hier im Detail beschriebene Protokoll ist für ein Transplantationsverfahren zur subretinalen Verabreichung der gesamten Netzhaut-Organoide (anstelle von Organoid-Rändern33,41), die auch etwas RPE tragen, als potenziell bessere Möglichkeit, intakte Netzhautblätter mit PRs einzuführen, um das Überleben des Transplantats zu verlängern und die Blattkonservierung zu verbessern. Beachten Sie, dass verschiedene Teile dieses Protokolls gut etabliert sind. Zum Beispiel wird die Vitrektomie häufig von vitreoretinalen Chirurgen bei Netzhaut-Reattachment-Operationen eingesetzt 56,57,58,59,60. Subretinale Injektionen werden immer häufiger eingesetzt, z. B. in der Genaugmentationstherapie 3,7,61,62,63,64. Es gibt nur wenige Beschreibungen für die Erstellung einer adäquaten Retinotomie und die Injektion relativ großer Organoide in den subretinalen Raum.
Zu den kritischen Schritten gehören die sorgfältige Positionierung und Durchführung der Sklerotomie, um die Linse zu vermeiden, die vollständige Entfernung der Glaskörperrinde von der Netzhautoberfläche über der Transplantationsstelle, die kontrollierte Bildung der subretinalen Blase, die Erzeugung einer Retinotomie in optimaler Größe, um die Breite der Transplantationskanüle aufzunehmen, die Aufrechterhaltung des definierten Infusionsdrucks während verschiedener Schritte, und Kanülenentnahme. Auswahl der richtigen Transplantationskanüle mit optimiertem Innen- und Außendurchmesser (ID und OD) und Länge, Kontrolle intraokularer Blutungen, Sterilität des gesamten Verfahrens von den Organoiden über den Operationssaal bis hin zu den Instrumenten und die Dauer der Operation (30–45 Minuten/Tier), um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die Autoren stellen fest, dass die besten Ergebnisse mit einer 23-G-Vitrektomie aufgrund der Dicke/Viskosität des Glaskörpers der Katze erzielt werden, wobei eine Blase mit einem Injektor mit einer 41-G-Kanüle erzeugt und dann die Retinotomie am Rand der Blase mit einer Netzhautschere mit einem 80°-Winkel verlängert wird. Weitere wichtige Faktoren sind die Erweiterung der Sklerotomie mit einem 2,85 mm großen Keratom auf die Borosilikatglaskanüle (Außendurchmesser Außendurchmesser 1,52 mm, Innendurchmesser 1,12 mm und Länge 10,16 cm) und die Implantation größerer Organoide in ein großes Auge mit einer Achslänge von ca. 20,5 mm (20,91 mm ± 0,53 mm)55. Die Verwendung einer Glaskapillare war die derzeit beste Möglichkeit, Organoide in Abstiegsgröße zu laden und abzugeben, ohne sie während des Implantationsprozesses zu beschädigen. Es zeigte sich, dass die Reduzierung des Infusionsdrucks von 20–30 mmHg während der Vitrektomie auf 10 mmHg während der Bläschenbildung optimal ist, um Netzhautablösungen zu erzeugen, die benötigt werden, um Platz für Netzhautorganoide zu schaffen. Darüber hinaus sind die Lebensfähigkeit von hPSC-3D-Netzhautgewebe (Organoiden) während des Langstreckentransports und die Wahl des optimierten Immunsuppressionsschemas für die Aufrechterhaltung xenogener menschlicher Transplantate von entscheidender Bedeutung, wie kürzlich berichtet wurde31,54.
Die Autoren fanden heraus, dass aufgrund des stark reflektierenden Katzentapetums keine Endobeleuchtung erforderlich war, um die Operation durchzuführen. Die Transplantation in eine atapetale Spezies (z. B. Schwein, nichtmenschlicher Primat) würde eine Vitrektomie mit 3 Anschlüssen erfordern, die eine Endobeleuchtung beinhaltet. Eine Tamponade (z. B. mit Perfluorkohlenwasserstoff gefolgt von Silikonöl), wie sie bei routinemäßigen Netzhautablösungen durchgeführt wird, wurde nicht durchgeführt, da der Druck auf die Blase die Gefahr birgt, dass die Organoide in den Glaskörper extrudiert werden. Zukünftige Entwicklungen könnten den Einsatz von Materialien beinhalten, die derzeit zur Abdichtung von Netzhautlöchern untersucht werden. Dies könnte genutzt werden, um den Verlust von Organoiden nach der Implantation in den Glaskörper zu verhindern. Darüber hinaus könnte Trieszenz, das Kenalog-40 ähnelt, aber konservierungsmittelfreies Triamcinolon enthält, als Alternative zur Visualisierung des Glaskörpers verwendet werden.
Die kleinere Kugelgröße bei jüngeren Tieren (z. B. 1–2 Monate) stellte im Vergleich zum großen Auge (erwachsene Tiere) eine größere chirurgische Herausforderung dar. Dennoch ist es mit der hier beschriebenen Methode möglich, die subretinalen Transplantate zu verabreichen. Im CrxRdy/+ LCA-Modell wurde festgestellt, dass größere Netzhautbläschen nicht immer wieder anhaften. Indem die Blase auf die Mindestgröße reduziert wurde, die für die Injektion der Netzhautorganoide erforderlich ist, wurde diese Komplikation reduziert. Eine frühere Transplantation in RD-Netzhaut (vor dem vollständigen Verlust von PRs, wenn die neuronale Netzhaut deutlich ausgedünnt wird) ist eine weitere Richtlinie, die mit früheren Arbeiten mit humanen fetalen Netzhauttransplantaten übereinstimmt20. Noch ein Hinweis: Die detaillierte Technik hängt nicht davon ab, die Netzhautfolie in die richtige Ausrichtung zu bringen, da die gesamten Netzhautorganoide transplantiert werden. Bei der Entwicklung von flachen hESC-Netzhautblättern wird dies von Bedeutung sein. Es steht jedoch nicht im Mittelpunkt dieses Protokolls, das darauf abzielt, intakte hESC-Netzhautgewebeblätter zu liefern und die subretinale Konservierung von PR-Faltblättern zu optimieren. Sobald die Technik entwickelt war, war sie sowohl in normaler als auch in RD-Netzhaut reproduzierbar.
Dieser chirurgische Eingriff birgt viele mögliche Komplikationen. Nur Fachkundige in der vitreoretinalen Chirurgie (z. B. ausgebildete Veterinäraugenärzte oder vitreoretinale Chirurgen, die mit den Artunterschieden zwischen dem Katzenauge und dem menschlichen Auge vertraut sind) sollten den Eingriff durchführen. Zu den möglichen Komplikationen gehören das Berühren der Linse während des Trokarlegens, Sklerablutungen während der Sklerotomievergrößerung und subretinale oder Netzhautblutungen. Andere Komplikationen, wie z. B. die Immunantwort des Wirts auf xenogene menschliche Organoidtransplantate, die im Laufe der Zeit zur Zerstörung des Transplantats führt, oder eine Endophthalmitis sind möglich. Die Einnahme von oralen Immunsuppressiva und Antibiotika hilft, diese zu verhindern. Es ist auch wichtig zu beachten, dass es einen Unterschied zwischen der Implantation bei Wildtyp- und CrxRdy/+- Katzen gibt. Bei einer fortgeschrittenen Netzhautdegeneration neigt die Netzhautblase dazu, sich weiter auszubreiten als beim Wildtyp, was in einigen Fällen eine vollständige Wiederanheftung der Netzhaut nach der Operation verhindern kann. Die hier vorgestellte Technik ist für die Implantation von Organoiden in Augen von Großtiermodellen von IRDs anwendbar. Weitere Verfeinerungen wären erforderlich, sobald die Transplantation für die Übertragung in die Klinik bereit ist.
Basierend auf den Erfahrungen der Autoren mit der Durchführung komplexer vitreoretinaler chirurgischer Eingriffe in großen Augenmodellen sollte die in diesem Manuskript vorgestellte Technik auf andere Großtiermodelle (unter Einbeziehung der Endobeleuchtung bei atapetalen Spezies) anwendbar sein, die für die Übertragung vitreoretinaler Operationstechniken in die Klinik verwendet werden43,44,45.
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Disclosures
Ratnesh K. Singh, Ph.D., François Binette, Ph.D., und Igor O. Nasonkin Ph.D. sind Mitarbeiter von Lineage Cell Therapeutics, Inc. Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde finanziert durch NEI Fast-Track SBIR Grant R44-EY027654-01A1 und SBIR Grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones ist Co-PI). Die Autoren danken Frau Janice Querubin (MSU RATTS) für ihre Hilfe bei der Anästhesie und der allgemeinen Pflege der in dieser Studie eingeschlossenen Tiere sowie bei der chirurgischen Einstellung und der Vorbereitung/Sterilisation von Instrumenten. Die Autoren bedanken sich bei Dr. Paige Winkler für die Hilfe bei der Entgegennahme der Organoide und deren Platzierung in Medien am Tag vor der Implantation und für die Hilfe am Tag der Implantation. Die Autoren danken auch Herrn Randy Garchar (LCTX) für den gewissenhaften Versand von Netzhaut-Organoiden, die Zusammenstellung des Spediteurs und das Herunterladen von Temperatur- und G-Stress-Aufzeichnungen nach jeder Sendung. Diese Arbeit wurde durchgeführt, als der Autor Igor Nasonkin bei Biotime (jetzt Lineage) angestellt war.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore syringe filter with PES membrane | Cameo | NA | can be found through various suppliers |
| 23G subretinal injector with extendable 41 G cannula | DORC | 1270.EXT | |
| 250 µL hamilton gas tight luer lock syringe | Hamilton | NA | can be found through various suppliers |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | 707G | |
| 6-0/7-0 polyglactin suture | Ethicon | J570G | |
| Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) | Henry Schein Animal Health | NA | can be found through various suppliers |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NA | can be found through various suppliers |
| cSLO + SD-OCT | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+ OCT | |
| Cyclosporine | Novartis | NA | can be found through various suppliers |
| Dexamethasone 2mg/mL (Azium) | Vetone | NA | can be found through various suppliers |
| Doxycyline 25mg/5mL | Cipla | NA | can be found through various suppliers |
| Fatal Plus solution (pentobarbital solution) | Vortech | NA | can be found through various suppliers |
| Gentamicin 20mg/2mL | Hospira | NA | can be found through various suppliers |
| Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing | World Precision Instruments | TW150-4 | |
| Methylprednisolone actetate 40 mg/mL | Pfizer | NA | can be found through various suppliers |
| Microscope | Zeiss | NA | |
| OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) | Sakura | 4583 | |
| Olympic Vac-Pac Size 23 | Natus | NA | can be found through various suppliers |
| Paraformaldehyde 16% solution | EMS | 15719 | |
| Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution | Akorn | NA | can be found through various suppliers |
| Prednisolone 15mg/5mL | Akorn | NA | can be found through various suppliers |
| Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) | Zoetis | NA | can be found through various suppliers |
| RetCam II video fundus camera | Clarity Medical Systems | NA | can be found through various suppliers |
| Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) | Bristol -Myers Squibb Company | NA | can be found through various suppliers |
| Tropicamide 1% ophthalmic solution | Akorn | NA | can be found through various suppliers |
| Vitrectomy 23G port | Alcon | Accurus systems | |
| Vitrectomy machine | Alcon | Accurus systems | |
| Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle | Frimen | FT170206T |
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