Summary
Traditionelle photothrombotische Schlaganfallmodelle (PTS) induzieren hauptsächlich dichte Thrombozytenaggregate mit einer hohen Resistenz gegen eine lytische Behandlung mit Gewebeplasminogenaktivator (tPA). Hier wird ein modifiziertes murines PTS-Modell durch Co-Injektion von Thrombin und lichtempfindlichem Farbstoff zur Photoaktivierung eingeführt. Das Thrombin-verstärkte PTS-Modell erzeugt gemischte Thrombozyten-Fibrin-Gerinnsel und ist hochempfindlich gegenüber tPA-Thrombolyse.
Abstract
Ein ideales thromboembolisches Schlaganfallmodell erfordert bestimmte Eigenschaften, darunter relativ einfache chirurgische Eingriffe mit geringer Mortalität, eine konsistente Infarktgröße und -lokalisation, Ausfällung von Blutplättchen-Fibrin-gemischten Blutgerinnseln, die denen bei Patienten ähneln, und eine ausreichende Empfindlichkeit gegenüber fibrinolytischer Behandlung. Das photothrombotische Schlaganfallmodell auf Basis von Rosen-Bengalen (RB) erfüllt die ersten beiden Anforderungen, ist aber sehr refraktär gegenüber tPA-vermittelter lytischer Behandlung, vermutlich aufgrund seiner plättchenreichen, aber fibrinarmen Gerinnselzusammensetzung. Wir gehen davon aus, dass die Kombination von RB-Farbstoff (50 mg/kg) und einer subthrombotischen Dosis Thrombin (80 U/kg) zur Photoaktivierung auf den proximalen Ast der mittleren Hirnarterie (MCA) fibrinangereicherte und tPA-empfindliche Gerinnsel erzeugen kann. In der Tat löste das kombinierte Photothrombosemodell von Thrombin und RB (T+RB) gemischte Blutgerinnsel aus Thrombozyten und Fibrin aus, wie durch Immunfärbung und Immunablots gezeigt wurde, und behielt konsistente Infarktgrößen und -lokalisationen sowie eine niedrige Mortalität bei. Darüber hinaus verringerte die intravenöse Injektion von tPA (Alteplase, 10 mg/kg) innerhalb von 2 h nach der Photoaktivierung die Infarktgröße bei T+RB-Photothrombose signifikant. Daher könnte das Thrombin-verstärkte photothrombotische Schlaganfallmodell ein nützliches experimentelles Modell sein, um neuartige thrombolytische Therapien zu testen.
Introduction
Die endovaskuläre Thrombektomie und die tPA-vermittelte Thrombolyse sind die einzigen beiden von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Therapien des akuten ischämischen Schlaganfalls, von dem in den Vereinigten Staaten jährlich ~700.000 Patienten betroffen sind1. Da die Anwendung der Thrombektomie auf den Verschluss großer Gefäße (LVO) beschränkt ist, während die tPA-Thrombolyse Verschlüsse kleiner Gefäße lindern kann, sind beide wertvolle Therapien des akuten ischämischen Schlaganfalls2. Darüber hinaus verbessert die Kombination beider Therapien (z.B. Einleitung einer tPA-Thrombolyse innerhalb von 4,5 Stunden nach Beginn des Schlaganfalls, gefolgt von einer Thrombektomie) die Reperfusion und die funktionellen Ergebnisse3. So bleibt die Optimierung der Thrombolyse auch im Zeitalter der Thrombektomie ein wichtiges Ziel für die Schlaganfallforschung.
Thromboembolische Modelle sind ein wesentliches Werkzeug für die präklinische Schlaganfallforschung mit dem Ziel, thrombolytische Therapien zu verbessern. Dies liegt daran, dass mechanische Gefäßverschlussmodelle (z. B. intraluminaler Naht-MCA-Verschluss) keine Blutgerinnsel erzeugen und die schnelle Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses nach der Entfernung des mechanischen Verschlusses übermäßig idealisiert ist 4,5. Zu den wichtigsten thromboembolischen Modellen gehören bisher die Photothrombose 6,7,8, die topische Anwendung von Eisenchlorid (FeCl3)9, die Mikroinjektion von Thrombin in den MCA-Zweig 10,11, die Injektion von ex vivo (Mikro-)Embolien in das MCA oder die Arteria carotis communis (CCA)12,13,14 und die transiente Hypoxie-Ischämie (tHI)15,16, 17,18. Diese Schlaganfallmodelle unterscheiden sich in der histologischen Zusammensetzung der nachfolgenden Gerinnsel und der Sensitivität gegenüber tPA-vermittelten lytischen Therapien (Tabelle 1). Sie unterscheiden sich auch in den chirurgischen Anforderungen der Kraniotomie (erforderlich für die In-situ-Thrombininjektion und die topische Anwendung von FeCl3), der Konsistenz der Infarktgröße und -lokalisation (z. B. führt die CCA-Infusion von Mikroembolien zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen) und den globalen Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System (z. B. erhöht tHI die Herzfrequenz und das Herzzeitvolumen, um die Hypoxie-induzierte periphere Vasodilatation zu kompensieren).
Das RB-Farbstoff-basierte photothrombotische Schlaganfallmodell (PTS) hat viele attraktive Merkmale, darunter einfache kraniotomiefreie chirurgische Eingriffe, eine niedrige Mortalität (typischerweise < 5 %) und eine vorhersagbare Größe und Lokalisation des Infarkts (im MCA-liefernden Bereich), aber es hat zwei wesentliche Einschränkungen. 8 Der erste Vorbehalt ist das schwache bis Null-Ansprechen auf eine tPA-vermittelte thrombolytische Behandlung, was auch ein Nachteil des FeCl-3-Modells ist 7,19,20. Der zweite Vorbehalt von PTS- und FeCl-3-Schlaganfallmodellen besteht darin, dass die nachfolgenden Thromben aus dicht gepackten Thrombozytenaggregaten mit einer geringen Menge Fibrin bestehen, was nicht nur zu ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber der tPA-lytischen Therapie führt, sondern auch vom Muster der gemischten Thrombozyten:Fibrin-Thromben bei akuten ischämischen Schlaganfallpatienten abweicht 21,22. Im Gegensatz dazu besteht das in situ Thrombin-Mikroinjektionsmodell hauptsächlich aus polymerisiertem Fibrin und einem unsicheren Gehalt an Thrombozyten10.
Vor diesem Hintergrund stellten wir die Hypothese auf, dass die Beimischung von RB und einer subthrombotischen Dosis Thrombin zur MCA-gezielten Photoaktivierung durch einen ausgedünnten Schädel die Fibrinkomponente in der resultierenden Thrombe erhöhen und die Empfindlichkeit gegenüber tPA-vermittelter lytischer Behandlung erhöhen kann. Wir haben diese Hypothese bestätigt,23 und hier beschreiben wir detaillierte Prozeduren des modifizierten (T+RB) photothrombotischen Schlaganfallmodells.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Virginia genehmigt und folgt der Richtlinie der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Abbildung 1A zeigt die Abfolge der chirurgischen Eingriffe dieses Protokolls.
1. Aufbau der Chirurgie
- Legen Sie mindestens 15 Minuten vor der Operation ein Wärmekissen mit einer Temperatureinstellung von 37 °C auf den Kleintieradapter. Bereiten Sie eine Nasenklammerrolle für den Adapter vor, die die Drehung des Tierkopfes ermöglicht. Bereiten Sie die Anästhetika Ketamin (60 mg/kg)/ Xylazin (10 mg/kg) vor.
- Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente, einschließlich Scheren, Pinzetten, Mikronadelhalter, Hämostaten, Wattestäbchen und Nähte, mit einem Autoklaven (121 °C bei 15 psi für 60 Minuten). Bereiten Sie Gewebekleber und Augensalbe vor. Bereiten Sie die 532-nm-Laserschutzbrille für Chirurgen vor.
HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt ein wichtiges Verfahren zur Überlebenschirurgie und sollte mit aseptischen Techniken durchgeführt werden. - Richten Sie das Beleuchtungssystem mit einer 532-nm-Laserquelle ein. Bereite einen Zahnarztbohrer vor.
- Bereiten Sie die Rosenbengalenlösung in Kochsalzlösung (10 mg/ml) zu. Ein aliquotes Rinderthrombin (0,1 U/μl) auf einen Eiskübel geben.
- Injizieren Sie der Maus Ketoprofen (4,0 mg/kg) 30 Minuten vor der Operation subkutan als Analgesie oder verwenden Sie das von den lokalen institutionellen Richtlinien empfohlene Analgetikum-Schema.
2. Ligatur der ipsilateralen Arteria carotis communis
- 10-14 Wochen alte männliche C57BL/6NCrl-Mäuse mit einem Gewicht von 22 bis 30 g durch intramuskuläre Injektion von Ketamin (60 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anästhesieren.
HINWEIS: Der gesamte chirurgische Eingriff, der die Ligatur der ipsilateralen Arteria carotis communis durch die Überwachung des zerebralen Blutflusses umfasst, wird voraussichtlich ~120 Minuten dauern. Das Anästhesieschema ist in der Regel für die gesamte Dauer wirksam, aber die Anästhesietiefe sollte mindestens alle 15 Minuten neu beurteilt werden. Beim Erlernen dieser Verfahren kann es notwendig sein, die Anästhesie neu zu dosieren. - Führen Sie eine Zehenkneifung durch, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig betäubt ist. Entfernen Sie die Haare am linken Hals für die CCA-Ligatur und den Kopf für die Schädelausdünnung mit der Haarentfernungscreme.
- Legen Sie die Maus in Rückenlage auf den Kleintieradapter. Sterilisieren Sie den Operationsbereich, indem Sie die Haut mit drei abwechselnden Streichen von Povidon-Jod und 70%igem Ethanol abwischen.
- Befestigen Sie den Mauskopf mit Ohrbügeln. Machen Sie unter einem Präpariermikroskop einen 0,5 cm langen Schnitt der linken Halswirbelsäule mit einer Mikroschere und einer geraden Pinzette etwa 0,2 cm seitlich der Mittellinie.
- Verwenden Sie eine feine gezackte Pinzette, um das Weichgewebe und die Faszie auseinander zu ziehen, um die linke Halsschlagader (LCCA) freizulegen. Trennen Sie vorsichtig den linken CCA vom Vagusnerv mit einer feinen, glatten Pinzette.
- Legen Sie eine permanente Doppelknotennaht um die LCCA mit 5-0-Seidennaht, die in 20-mm-Segmente geschnitten wird, und verschließen Sie die Wunde dann mit sterilen Wundclips.
3. Ausdünnung des Schädels über dem MCA-Ast und Photoaktivierung
- Drehen Sie die Maus in die Bauchlage des Kleintieradapters. Drehen Sie die Nasenbügelrolle um 15°. Sterilisieren Sie den Operationsbereich, indem Sie die Haut mit drei abwechselnden Streichen von Betadin und 70%igem Ethanol abwischen.
- Machen Sie einen 0,8 cm langen Schnitt in der Kopfhaut mit einer Mikroschere und einer geraden Pinzette entlang des linken Auges und Ohrs, um den Schläfenmuskel freizulegen, der sich zwischen Auge und Ohr befindet (Abbildung 1B).
- Unter dem Präpariermikroskop wird mit einer feinen gezackten Zange ein 0,5 cm langer Schnitt entlang des Randes des Schläfenmuskels am linken Scheitelbein gemacht. Machen Sie einen zweiten 0,3 cm langen vertikalen Schnitt am Schläfenmuskel mit einer Mikroschere. Ziehen Sie den Schläfenmuskel zurück, um den Rand des Scheitelknochens und des Plattenepithelknochens freizulegen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Markierung der koronalen Naht zwischen dem Stirn- und dem Scheitelbein visualisieren (Abbildung 1B,C).
- Befeuchten Sie den Schädel, indem Sie sterile Kochsalzlösung auftragen, um das linke MCA freizulegen. Markieren Sie den proximalen MCA-Ast auf dem Plattenepithelknochen mit einem Markerstift. Zeichnen Sie mit dem pneumatischen Dentalbohrer vorsichtig einen Kreis mit einem Durchmesser von etwa 1 mm, der den markierten Bereich umgibt (Gratgeschwindigkeitseinstellung auf 50 % des Drehzahlreglers), und verdünnen Sie dann den Schädel etwa 0,2 mm tief, ohne die darunter liegende Dura zu berühren. Stoppen Sie das Bohren, bis eine sehr dünne Knochenschicht übrig bleibt.
- Mischen Sie die Thrombin- (T, 0,1 U/μl, 80 U/kg) und Rosenbengalenlösung (RB, 10 mg/ml, 50 mg/kg) basierend auf dem Körpergewicht der Maus. Bei einer Maus mit einem Körpergewicht von 25 g mischen Sie beispielsweise 20 μl Thrombin (0,1 U/μl) und 125 μl RB (10 mg/ml).
- T+RB-Lösung (145 μl pro 25 g Körpergewicht) langsam mit einer Insulinspritze (#31G Nadel) in den Retroorbitalsinus injizieren.
ANMERKUNG: In Pilotexperimenten wurde die Mortalitätsrate bei steigenden Dosen von Thrombin gemischt mit der Standarddosis des RB-Farbstoffs (50 mg/kg) auf Photoaktivierung untersucht. Die Mortalität betrug 0 % für 80 U/kg Thrombin (n=13), 43 % für 120 U/kg Thrombin (n=7) und 100 % für 160 U/kg (n=5) und 200 U/kg Thrombin (n=5). Für dieses Modell wurde daher eine Dosis von 80 U/kg Thrombin gewählt. Die Laser-Speckle-Kontrakt-Bildgebung wurde auch verwendet, um die Möglichkeit einer zügellosen Blutgerinnung in der Nähe der Orbitalhöhle nach retroorbitaler Sinusinjektion von T+RB auszuschließen (Ergänzende Abbildung 1) sowie eine ausgedehnte Fibrinablagerung in der kontralateralen Hemisphäre, die keiner Laserbeleuchtung ausgesetzt war (Ergänzende Abbildung 2). - Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden.
- Bringen Sie den Strahler mit einem 532 nm Laserlicht (mit 0,5 mW Energie) 20 Minuten lang auf die gebohrte Stelle mit einem Abstand von 2 Zoll auf. Visualisieren Sie die Beleuchtung auf dem proximalen Ast des MCA durch eine Laserschutzbrille (Abbildung 1C,D).
HINWEIS: Der MCA mit 532 nm Beleuchtung zeigt rote Fluoreszenz unter der Brille. Das distale MCA verschwindet nach 10 Minuten Beleuchtung. Schließen Sie das Tier aus, wenn der distale MCA-Fluss nach 20-minütiger Beleuchtung immer noch vorhanden ist. - Stoppen Sie die Laserbeleuchtung nach 20 Minuten. Verschließen Sie die Wunde mit sterilen Wundklammern.
4. Intravitale Bildgebung (optional)
ANMERKUNG: Um die Thrombusbildung in-vivo zu charakterisieren, ist die intravirale Bildgebung durch ein konfokales Spin-Scheiben-Photoaktivierungssystem23 zu verwenden.
- Machen Sie ein Schädelfenster mit einem Durchmesser von ~3 mm auf dem Scheitelbein des Schädels.
- Platzieren Sie ein Deckglas auf dem Schädelfenster und lokalisieren Sie den distalen MCA (~50 μm Durchmesser) unter einem 20-fachen Wasserimmersionsobjektiv.
- Markierung der zirkulierenden Blutplättchen durch Injektion der Schwanzvene mit DyLight488-konjugiertem Anti-GPIbβ-Antikörper (0,1 mg/kg) 5 Minuten vor der Bildgebung.
- Die Mischungslösung aus Thrombin (80 U/kg) und Rosenbengalen (50 mg/kg) wird 5 Minuten vor der Bildgebung retroorbital injiziert.
- Photoaktivieren Sie das MCA mit einem 561 nm Lasersystem mit einem Laserstrahl von 10 μm Durchmesser und zeichnen Sie das Bild bis zur Thrombusbildung auf.
5. tPA-Verabreichung
- Legen Sie das betäubte Tier auf eine 37 °C warme Unterlage. Befeuchten Sie zum gewählten Zeitpunkt nach der Photoaktivierung eine Gaze mit ~45 °C warmem Wasser und wickeln Sie sie 1 Minute lang um den Schwanz.
- Rekombinantes humanes tPA (10 mg/kg) durch die Schwanzvene mit einem 50%igen Bolus und 50% über 30 min mittels Infusionspumpe injizieren.
HINWEIS: Obwohl die klinische Dosis von rekombinantem humanem tPA für die Behandlung eines akuten ischämischen Schlaganfalls 0,9 mg/kg beträgt, wird bei Nagetieren üblicherweise eine höhere Dosis (10 mg/kg) verwendet, um die reduzierte tPA-Reaktivität zwischen verschiedenen Spezies auszugleichen. Wir folgten auch dem Standardprotokoll der tPA-Verabreichung in präklinischen Schlaganfallmodellen, wobei 50 % als Bolus und 50 % über die Schwanzvene über 30 Minuten infundiert wurden.24
6. Überwachung des zerebralen Blutflusses (CBF)
HINWEIS: Um die CBF-Erholung nach einer tPA-Behandlung zu bestätigen, verwenden Sie ein zweidimensionales Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebungssystem15 und zeichnen Sie unmittelbar nach der Photothrombose (Schritt 3.9) oder 24 Stunden nach der tPA-Behandlung auf.
- Legen Sie das betäubte Tier in die Bauchlage und machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut, wobei der Schädel freiliegt.
- Befeuchten Sie den Schädel mit steriler Kochsalzlösung und tragen Sie das Ultraschallgel sanft auf den Schädel auf. Vermeiden Sie Haare und Blasen im Gel, die das CBF-Signal stören.
- Überwachen Sie die CBF in beiden Gehirnhälften unter einem Laser-Speckle-Kontrast-Imager für 10 Minuten.
- Verschließen Sie nach der Aufnahme des CBF-Bildes die Kopfhaut mit Gewebekleber und setzen Sie das Tier wieder in den Käfig ein.
- Analysieren Sie CBF in den ausgewählten Regionen und berechnen Sie den Prozentsatz der CBF-Rückgewinnung im Vergleich zur kontralateralen Region.
- Setzen Sie das Tier dann wieder in einen warmen Käfig, um sich zu erholen. Beobachten Sie die Mäuse 5-10 Minuten lang, bis sie sich von der Narkose erholt haben. Legen Sie das angefeuchtete Futter in den Käfig und geben Sie es an die Tierpflegeeinrichtung zurück.
HINWEIS: Bieten Sie eine postoperative Analgesie an, wie von den lokalen institutionellen Richtlinien empfohlen.
7. Infarktvolumenmessung durch Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung
- Vierundzwanzig Stunden nach der Photothrombose ist das Tier gemäß den lokalen institutionellen Richtlinien für Nicht-Überlebensoperationen tief zu betäuben.
HINWEIS: Wir verabreichen Tribromethanol (Avertin) 250 mg/kg als intraperitoneale (IP) Injektion. - Führen Sie eine transkardiale Perfusion mit PBS durch, sammeln Sie frisches Gehirn und betten Sie es in 3% Agar-Gel ein.
- Den 1 mm dicken Hirnschnitt mit einem Vibratom durchtrennen und 10 min in 2%iger TTC-Lösung inkubieren.
- Quantifizieren Sie das gesamte Infarktvolumen aus 6 Gehirnschnitten als absolutes Volumen mit der ImageJ-Software.
HINWEIS: Das Hirnödem wurde aus zwei Gründen nicht als Ergebnismessung verwendet. Erstens misst die TTC-Färbung die Lebensfähigkeit des Gewebes (über die mitochondriale Reduktionsaktivität), was eine schwerwiegendere Folge als ein Ödem ist. Zweitens treten im Verlauf des Infarkts sowohl vasogene als auch zytotoxische Ödeme auf, die mit den Standard-Hirnödem-Messmethoden nicht leicht unterschieden werden können. Wir haben jedoch die Anti-Immunglobin-Markierung (IgG) verwendet, um die Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu beurteilen, und haben eine vergleichbare IgG-Extravasation 6 h nach der Photoaktivierung sowohl in RB- als auch in T+RB-Schlaganfallmodellen gefunden (ergänzende Abbildung 3).
8. Messung der Thrombusbildung
HINWEIS: Um die Thrombusbildung zu messen, entnehmen Sie das Gehirn 1 h und 2 h nach der Photothrombose zur Thrombusmessung bei MCA mittels Immunchemie (IHC) bzw. zur Fibrinmessung in der Gehirnhälfte mittels Immunoblot.
- Führen Sie die IHC zur Charakterisierung der Gerinnselzusammensetzung durch. Fixieren Sie das Gehirn über Nacht mit 4 % Paraformaldehyd und dehydrieren Sie das Gehirn dann mit 30 % Saccharose für die OCT-Einbettung.
- Schneiden Sie das Gehirn mit sagittaler Ausrichtung in 20 μm Dicke und führen Sie die IHC mit spezifischen Antikörpern gegen Fibrinogen, Blutplättchen (Glykoprotein IIb), rote Blutkörperchen (TER119) und Blutgefäße (Isolektin GS-IB4) durch.
- Führen Sie die Messung von Fibrin in der Gehirnhälfte durch Immunoblot mit einem Antikörper gegen Fibrinogen durch.
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Representative Results
Zunächst verglichen wir den Fibringehalt in RB mit T+RB-Photothrombose-induzierten Blutgerinnseln. Die Mäuse wurden 2 Stunden nach der Photoaktivierung durch transkardiale Perfusion von Fixiermitteln getötet, und die Gehirne wurden für die Immunfluoreszenzfärbung des MCA-Zweiges in der Längs- und Transversalebene entfernt. Bei der RB-Photothrombose war der MCA-Zweig dicht gepackt mit CD41+-Thrombozyten und wenig Fibrin (Abbildung 2A,C). Im Gegensatz dazu war der MCA-Zweig bei der T+RB-Photothrombose durch zufällig gemischte Thrombozyten-Fibrin-Gerinnsel verschlossen (Abbildung 2B,D, n>3 für jeden). Wir verwendeten auch Immunoblots, um den Fibrin(ogen)-Spiegel in der Großhirnrinde zwischen den beiden Modellen nach transkardialer Perfusion mit Kochsalzlösung 2 Stunden nach der Photoaktivierung zu vergleichen. Diese Analyse zeigte > zweifache Zunahme der Fibrinablagerung in der ipsilateralen Hemisphäre bei T+RB im Vergleich zur RB-Photothrombose (Abbildung 2E, p=0,027 durch ungepaarten t-Test; n=3 für jede Gruppe). In unserem ursprünglichen Bericht haben wir auch konfokalmikroskopische Einzelgefäß-Photoaktivierung und intravitale Bildgebung verwendet, um das Verhalten von FITC-konjugierten Anti-GP1bβ-markierten Blutplättchen zu vergleichen. 23 Diese Experimente zeigten, dass die intravenöse Injektion von 80 U/kg Thrombin auch unter Laserbeleuchtung keine Thrombozytenaggregate induzierte (Abbildung 3A) und dass die Thrombozyten im RB-Photothrombosemodell homogene Gerinnsel bildeten (Abbildung 3B), während die Thrombozyten bei der T+RB-Photothrombose ungleichmäßige Aggregate mit mehreren schwachen Regionen bildeten (Abbildung 3C). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die T+RB-Photothrombose den Fibringehalt in den nachfolgenden Thromben erhöht.
Als nächstes verglichen wir die Auswirkungen einer akuten intravenösen tPA-Behandlung (10 mg/kg Alteplase, 30 min nach Photoaktivierung) auf die Erholung des zerebralen Blutflusses (CBF) zwischen den beiden Modellen. Der CBF derselben Maus vor und 24 Stunden nach der Behandlung mit tPA wurde mittels Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung gemessen und auf die kontralaterale Hemisphäre normiert (Abbildung 4A,B). Bei RB-Photothrombose führte die tPA-Behandlung zu einem Trend der CBF-Erholung, insbesondere im ischämischen Grenzbereich, im Vergleich zu mit Vehikeln behandelten Mäusen (Abbildung 4C, Vehikel 51 ± 9 % vs. tPA 65 ± 7 %, p=0,3 durch ungepaarten t-Test, jeweils n=4). Bei der T+RB-Photothrombose war die Erholung des CBF bei tPA-behandelten Mäusen ausgeprägter, und die proximalen MCA-Äste wurden oft nach 24 Stunden sichtbar (Abbildung 4D, Vehikel 55 ± 3 % vs. tPA 81 ± 7 %, p=0,02 durch ungepaarten t-Test, n=6 für jede Gruppe). Diese Ergebnisse deuten auf eine höhere Sensitivität gegenüber der tPA-lytischen Therapie durch T+RB als gegenüber der RB-Photothrombose hin.
Schließlich verwendeten wir die TTC-Färbung, um die Auswirkungen der tPA-Behandlung auf die Infarktgröße in den photothrombotischen Schlaganfallmodellen RB und T+RB zu quantifizieren. Bei RB-Photothrombose wurde eine ähnliche Infarktgröße bei Vehikel-behandelten (18 ± 2,80 mm 3, n=6) und tPA-behandelten Mäusen (18 ± 1,95 mm3, n=10; 10 mg/kg tPA wurde 30 Minuten nach der Photoaktivierung injiziert) nachgewiesen (Abbildung 5A). Im Gegensatz dazu reduzierte die tPA-lytische Behandlung signifikant den Infarkt, wenn tPA nach 0,5 h (7 ± 2,1 mm 3, n=9), 1 h (4,6 ± 1 mm 3, n=10) oder 2 h (6,4 ± 1,5 mm 3, n=8 ), aber nicht 6 h nach der Photoaktivierung injiziert wurde (15,2 ± 3,1 mm 3, n=7), im Vergleich zu vehikelbehandelten Mäusen (14,8 ± 2 mm 3, n=19) (Abbildung 5B, der durch ungepaarten t-Test ermittelte p-Wert). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das T+RB photothrombotische Schlaganfallmodell eine Sensitivität gegenüber tPA-lytischer Behandlung aufweist.
Abbildung 1: Überblick über die Verfahren. (A) Das Flussdiagramm der wichtigsten chirurgischen Eingriffe im T+RB-Modell des photothrombotischen Schlaganfalls. Die Ligatur der ipsilateralen Arteria carotis communis (CCA) ist optional, aber wir fanden heraus, dass sie die Infarktgröße konsistenter macht, vermutlich aufgrund einer verminderten Kollateralzirkulation. (B) Draufsicht und Seitenansicht des Mäusegehirns in Bezug auf den Schädel. Ebenfalls angezeigt sind die Augen, das Ohr, der Schläfenmuskel, die mittlere Hirnarterie (MCA) und die Äste, die koronale Naht und die Laserbeleuchtungsstelle. (C) Visualisierung des anvisierten MCA-Astes unter dem ausgedünnten Schädel (C1) und während der Laserbeleuchtung (C2) und Beendigung des Blutflusses nach Photoaktivierung (C3). Man beachte die Beziehung des MCA-Astes zur koronalen Naht. (D) Das Einrichten einer Maus während der Laserbeleuchtung auf dem linken MCA-Zweig. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Unterschiedliche Fibringehalte in den Blutgerinnseln. (A-D) Immunfluoreszenzmarkierung der RB- und T+RB-Photothrombose-induzierten Thromben im distalen MCA-Ast in einer longitudinalen (A, B) oder transversalen Ebene (C, D) unter Verwendung von Antifibrinmarkern (grün), Anti-CD41/Thrombozyten (rot) und Isolekin B4/Endothelzellen (blau). Man beachte den deutlichen Anstieg der Anti-Fibrin-Immunsignale in den T+RB-Photothrombose-induzierten Blutgerinnseln (B, D, n=3 für jede Gruppe). (E) Die Immunoblottierung zeigte 2 h nach der Photoaktivierung eine größere Fibrinablagerung in der ipsilateralen Großhirnrinde bei T+RB als eine RB-Photothrombose (jeweils n=3). UN: unverletzte Mäuse; Fortsetzung: kontralateraler Kortex; Ipsi: ipsilateraler Kortex. Maßstab: 50 μm. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von [23] geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Intravitale Bildgebung der Thrombozytenreaktionen. Konfokalmikroskop-basierte intravitale Bildgebung von FITC-konjugierten Anti-GP1bβ-markierten Thrombozyten unter Einzelgefäß-Laserbeleuchtung (an der durch weiße Pfeile gekennzeichneten Stelle). Die Versuchsgruppen sind: (A) Thrombin allein, (B) Rose Bengal allein und (C) Thrombin plus Rose Bengal. Die Zeiten nach der Laserbeleuchtung sind beschriftet. Sehen Sie sich das Video auf der JoVE-Website für dieses Manuskript an. Maßstab: 50 μm. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von [23] geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Auswirkungen der tPA-Behandlung auf die CBF-Erholung. Rekombinantes humanes tPA (Alteplase, 10 mg/kg) oder Vehikel wurde 30 Minuten nach der Laserbestrahlung über die Schwanzvene an RB- und T+RB-Photothrombose-geschädigte Mäuse verabreicht, und der zerebrale Blutfluss (CBF) vor und 24 Stunden nach der Behandlung in derselben Maus wurde mit Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung verglichen. Der CBF wurde in einem Bereich von 3 x 4,8 mm auf beiden Hemisphären gemessen. Die experimentellen Gruppen sind: (A, C) RB-Photothrombose; (B, D) T+RB Photothrombose. Man beachte die signifikante Erholung des CBF durch tPA-Behandlung in der T+RB-Photothrombose-Gruppe (p=0,02 durch ungepaarten t-Test, n= 4 für Vehikel und n=6 für tPA-Behandlung) und häufige Visualisierung des proximalen MCA-Zweigs. Bei der RB-Photothrombose führte die tPA-Behandlung zu einem Trend zu besserem CBF, vorwiegend im peripheren ischämischen Bereich (p=0,3 durch ungepaarten t-Test, n= 4 für Vehikel und n=5 für tPA-Behandlung). Weiße Pfeile zeigen den Ort der MCA-Photoaktivierung an. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von [23] geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Auswirkungen der tPA-Behandlung auf die Infarktgröße. (A) Intravenöse tPA-Behandlung (Alteplase, 10 mg/kg) 30 Minuten nach RB-Photothrombose konnte die Infarktgröße nicht reduzieren (n=6 bei Vehikel-behandelten Mäusen und n=10 bei tPA-behandelten Mäusen). (B) Im Gegensatz dazu führte bei der T+RB-Photothrombose eine intravenöse Behandlung mit 10 mg/kg Alteplase entweder 0,5, 1 oder 2 h, aber nicht 6 h nach der Photoaktivierung zu einer signifikanten Verringerung der Infarktgröße. Der p-Wert wurde mittels Einweg-ANOVA mit dem Tukey-Mehrfachvergleichstest bestimmt. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von [23] geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Modell | Chirurgischer Eingriff | Blutgerinnsel | Blutplättchen | Fibrin | tPA-Reaktivität | Hauptmerkmale/Dienstprogramm | Wichtige Referenzen |
| Intraluminales Nahtmaterial MCAO | Endovaskulärer MCA-Verschluss | Nein | N/A | N/A | Nein | Schnelle Reperfusion; Neuroprection-Studie; tPA-induzierte BHS-Verletzung | Longa et al. 1989 (Ref #5) |
| Photothrombose | Ausdünnung des Schädels und Photoaktivierung | Ja | Schwach | Hohe Reproduzierbarkeit; geringe Sterblichkeit | Watson et al. 1985 (Ref #6) | ||
| Thrombin-Photothrombose | UCCAO, Ausdünnung des Schädels und Photoaktivierung | Ja | Ja | Hohe Reproduzierbarkeit; geringe Sterblichkeit | Sun et al. 2020 (Ref #23) | ||
| FeCl3 (auf dem MCA) | Ausdünnung des Schädels und chemische Aktivierung | Ja | Nein | Hohe Reproduzierbarkeit; geringe Sterblichkeit | Karatas et al. 2011 (Ref #69) | ||
| In-situ-Thrombin-Injektion | Kraniotomie und MCA-Mikroinjektion | Ja | Ja | Hohe Reproduzierbarkeit; niedrige Sterblichkeit; tPA-lytische Behandlung | Orset et al. 2007 (Ref #10) | ||
| Emboli-MCAO | Endovaskulärer MCA-Verschluss | Ja | Ja | tPA-lytische Behandlung; Variable Gerinnselhärte | Busch et al. 1997 (Ref #13) | ||
| Transiente Hypoxie-Ischämie (tHI) | UCCAO plus Hypoxie | Ja | Ja | Infarkt > MCA-Bereich; Systemische kardiovaskuläre Effekte | Sun et al. 2014 (Ref #15) |
Tabelle 1: Vergleich ausgewählter präklinischer Schlaganfallmodelle. Gefüllte Kästchen weisen auf Positivität (das Vorhandensein von Blutgerinnseln, Blutplättchen und Fibrin) oder eine signifikante tPA-Reaktivität hin.
Ergänzende Abbildung 1: CBF-Monitor nach retroorbitaler Injektion von Thrombin. (A) Die repräsentativen Fotos des retroorbitalen Sinus (oberes Bild) und des Blutflusses mittels Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung (unteres Bild). Die drei vaskulären Stellen (1~3 wie markiert) wurden nach Thrombininjektion (80 U/kg) in den retroorbitalen Sinus überwacht. (B) Das repräsentative Diagramm des Blutflusses für 15 Minuten nach der Thrombininjektion (Pfeil). (C) Die Laser-Speckle-basierte Quantifizierung zeigte innerhalb von 15 min nach Thrombininjektion keine Reduktion des Blutflusses in der Nähe des retroorbitalen Sinus (n=4, p-Wert bestimmt durch ungepaarten t-Test). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Fehlende Fibrinablagerung in der kontralateralen Hemisphäre 6 Stunden nach der Photoaktivierung. Die Immunfärbung des Antifibrinogens (grün) zeigte eine Fibrinablagerung im ipsilateralen Kortex 6 h nach RB- und T+RB-Photothrombose. Im Gegensatz dazu gab es keine disperierbare Fibrinablagerung im kontralateralen Kortex nach Thrombin-verstärkter Photothrombose. N=4 für jede Gruppe. Maßstab: 50 μm. Blaue Fluoreszenz als DAPI-Kernfärbung. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Fehlende Immunglobulin (IgG)-Extravasation nach Photothrombose. 6 Stunden nach unilateraler MCA-gezielter Photoaktivierung zeigte die Immunfärbung eine Extravasation von IgG in der ipsilateralen Hemisphäre, jedoch nicht in der kontralateralen Hemisphäre, was auf eine eingeschränkte BHS-Schädigung nach Thrombin-verstärkter Photothrombose hindeutet. N=4 für jeden. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Der traditionelle photothrombotische RB-Schlaganfall, der 1985 eingeführt wurde, ist ein attraktives Modell der fokalen zerebralen Ischämie für einfache chirurgische Eingriffe, niedrige Mortalität und hohe Reproduzierbarkeit des Hirninfarkts. 5 In diesem Modell aktiviert der photodynamische Farbstoff RB die Blutplättchen bei Lichtanregung schnell, was zu dichten Aggregaten führt, die das Blutgefäß verschließen 5,8,23. Die geringe Menge an Fibrin in RB-induzierten Blutgerinnseln (Abbildung 2) weicht jedoch von dem dominanten Thrombozyten-Fibrin-gemischten Muster der Thromben ab, die bei ischämischen Schlaganfallpatienten akut gewonnen werden21,22. Der niedrige Fibringehalt in RB-induzierten Thromben trägt wahrscheinlich auch zu ihrer Resilienz gegenüber tPA-lytischer Behandlung bei 7,8,19. Obwohl die ultraviolette Laserbestrahlung eine vaskuläre Rekanalisation bei RB-Photothrombose induziert, ist es unwahrscheinlich, dass diese experimentelle Therapie klinisch eingesetzt wird7. Daher wurde der traditionelle photothrombotische RB-Schlaganfall hauptsächlich als permanentes Okklusionsmodell verwendet, das weniger für die Thrombolyse- und Neuroprotektionsforschung geeignet ist (letztere verwendet häufig das intraluminale Naht-MCAO-Modell, das eine schnelle vaskuläre Reperfusion nach Entfernung des mechanischen Verschlusses aufweist).
Wir stellten die Hypothese auf, dass die Beimischung von RB und einer subthrombotischen Dosis Thrombin zur Photoaktivierung den Fibringehalt in nachfolgenden Thromben erhöhen und das Ansprechen auf die tPA-Thrombolyse, die reale Schlaganfalltherapie, verstärken kann. Diese Hypothese wird durch die hier vorgestellten Ergebnisse und in unserem Originalbericht gestützt. 23 Das thrombinverstärkte photothrombotische Schlaganfallmodell behält auch die Vorteile einer niedrigen Mortalität, einfacher chirurgischer Eingriffe und einer hohen Konsistenz in Infarktgröße und -lokalisation bei, wie im traditionellen RB-Photothrombosemodell. Daher glauben wir, dass die thrombinverstärkte Photothrombose eine wertvolle Ergänzung des Repertoires thromboembolischer Schlaganfallmodelle darstellt (Tabelle 1). Zwei verfahrenstechnische Details des Thrombin-verstärkten Photothrombosemodells verdienen Diskussion. Erstens kann eine Überdosierung von intravenösem Thrombin eine akute pulmonale Thromboembolie und Tiersterblichkeit hervorrufen25. Wir untersuchten eine Reihe von Thrombindosen für die Kombination mit RB-Photothrombose, und die gewählte Dosis von 80 U/kg hat bisher keine Mortalität in >100 experimentierten erwachsenen männlichen C57Bl/6-Mäusen induziert. Es ist wahrscheinlich, dass die Thrombindosis bei Mäusen mit Hyperkoagulationszuständen angepasst werden muss26. Zweitens ligierten wir routinemäßig die ipsilaterale CCA neben der MCA-gerichteten Photothrombose in unseren Verfahren. Wir fanden heraus, dass die Ligatur der ipsilateralen CCA die Konsistenz der Infarktgröße weiter erhöht, was auf eine verminderte Kollateralzirkulation zwischen MCA und den vorderen und hinteren Hirnarterien zurückzuführen sein könnte.
Mit seinen einzigartigen Eigenschaften könnte das Thrombin-verstärkte photothrombotische Schlaganfallmodell für mindestens drei Forschungsthemen besonders nützlich sein. Erstens eignet sich dieses neue Modell ideal für den direkten Vergleich von tPA und anderen fibrinolytischen Wirkstoffen wie Tenecteplase (TNKase)27. TNKase ist eine modifizierte tPA-mutierte Variante mit erhöhter Fibrinspezifität und einem geringeren Risiko für iatrogene Blutungen in ex vivo Experimenten. Die Überlegenheit gegenüber tPA wurde jedoch nur in einem mikroembolischen Schlaganfallmodell und mit einer binären neurologischen Ergebnisanalyse getestet14. Aufgrund seiner hohen Reproduzierbarkeit und quantitativen Infarktgrößenanalyse kann das Thrombin-verstärkte photothrombotische Schlaganfallmodell verwendet werden, um den Nutzen und die Nebenwirkungen von tPA-versus TNKase in mehreren Aspekten zu vergleichen (z. B. Dosis-Wirkungs-, therapeutisches Fenster, Auswirkungen auf Komorbidität und mögliche Nebenwirkungen bei verzögerter Behandlung). Zweitens könnte das Thrombin-verstärkte Photothrombosemodell nützlich sein, um die Auswirkungen einer kombinierten tPA- und Thrombozytenaggregationshemmer-Behandlung bei akutem ischämischem Schlaganfall zu untersuchen28. Jüngste Fortschritte bei endovaskulären Verfahren beim ischämischen Schlaganfall haben es den Forschern ermöglicht, die histologische Zusammensetzung akuter Thromben zu analysieren und ein dominantes, gemischtes Thrombozyten-Fibrin-Muster zu identifizieren21,22. Dementsprechend kann die Kombination eines fibrinolytischen Wirkstoffs (tPA) und Thrombozytenaggregationshemmern die Gesamtwirksamkeit der Thrombolyse erhöhen, aber ein Schlaganfallmodell, das die klinische Thrombozyten-Fibrin-Zusammensetzung des Thrombus simuliert, ist für eine solche Forschung von entscheidender Bedeutung. Zusammen mit den tHI- und Emboli-MCAO-Modellen erfüllt die Thrombin-Photothrombose diese Anforderung und zeichnet sich durch eine niedrige Mortalität, einfache chirurgische Eingriffe und das Fehlen systemischer kardiovaskulärer Effekte aus (Tabelle 1).
Zu guter Letzt kann die Thrombin-verstärkte Photothrombose besonders nützlich sein, um die Schlaganfall-induzierte Kollateralzirkulation zu untersuchen, da sie im MCA-liefernden Gebiet vor dem Infarkt liegt. Durch die Aufrechterhaltung der Penumbra, um das Infarktwachstum auszugleichen, wird die Kollateralzirkulation zunehmend als wichtiger Prädiktor für ischämische Schlaganfallergebnisse anerkannt, da eine akute vaskuläre Obstruktion den Blutfluss durch das Kollateralnetzwerk fördert, gefolgt von Umbau und Angiogenese zur Bildung von Neokollateralgefäßen29,30. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass tPA nicht nur die Rekanalisation des proximalen MCA fördert, sondern auch die Kollateralzirkulation in der Peripherie des MCA-versorgenden Bereichs erhöht (Abbildung 4). Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die die Plastizität der Kollateralzirkulation regulieren, könnte neue Therapien nahelegen. Da das thrombin-verstärkte photothrombotische Schlaganfallmodell den Vorteil einer vorhersagbaren Periinfarktregion und der Sensitivität gegenüber lytischer Behandlung bietet, wird es die Erforschung der Kollateralzirkulation nach einem Schlaganfall unterstützen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse unterstützt (NS108763, NS100419, NS095064 und HD080429 an C.Y. K. und NS106592 an Y.Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
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