Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En fibrinberiket og tPA-sensitiv fototrombotisk slagmodell

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/61740
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Anesthesiology, Taipei Veterans General Hospital, National Yang-Ming University School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

Summary

Tradisjonelle fototrombotiske slagmodeller (PTS) induserer hovedsakelig tette blodplateaggregater med høy motstand mot vevsplasminogenaktivator (tPA)-lytisk behandling. Her introduseres en modifisert murine PTS-modell ved samtidig injeksjon av trombin og lysfølsomt fargestoff for fotoaktivering. Den trombinforsterkede PTS-modellen produserer blandet blodplate: fibrinpropper og er svært følsom for tPA-trombolyse.

Abstract

En ideell tromboembolisk slagmodell krever visse egenskaper, inkludert relativt enkle kirurgiske prosedyrer med lav dødelighet, konsistent infarktstørrelse og lokalisasjon, utfelling av blodplater: fibrinblandede blodpropper som ligner på pasienter, og tilstrekkelig følsomhet for fibrinolytisk behandling. Rosebengal (RB) fargestoffbasert fototrombotisk slagmodell oppfyller de to første kravene, men er svært motstandsdyktig mot tPA-mediert lytisk behandling, antagelig på grunn av sin blodplaterike, men fibrinfattige koagulasjonssammensetning. Vi tenker at kombinasjon av RB-fargestoff (50 mg/kg) og subtrombotisk dose trombin (80 E/kg) til fotoaktivering rettet mot proksimale gren av arteria cerebri media (MCA) kan gi fibrinberikede og tPA-sensitive propper. Faktisk utløste trombin og RB (T + RB) -kombinert fototrombosemodell blandet blodplate: fibrin blodpropper, som vist ved immunfarging og immunoblots, og opprettholdt konsistente infarktstørrelser og steder pluss lav dødelighet. Videre reduserte intravenøs injeksjon av tPA (Alteplase, 10 mg/kg) innen 2 timer etter fotoaktivering infarktstørrelsen signifikant ved T+RB-fototrombose. Dermed kan trombinforsterket fototrombotisk slagmodell være en nyttig eksperimentell modell for å teste nye trombolytiske terapier.

Introduction

Endovaskulær trombektomi og tPA-mediert trombolyse er de eneste to amerikanske Food and Drug Administration (FDA) -godkjente terapier av akutt iskemisk slag, som rammer ~ 700,000 pasienter årlig i USA1. Fordi anvendelsen av trombektomi er begrenset til okklusjon av store kar (LVO), mens tPA-trombolyse kan lindre okklusjoner av små kar, er begge verdifulle terapier for akutt iskemisk hjerneslag2. Videre bedrer kombinasjonen av begge behandlingene (f.eks. oppstart av tPA-trombolyse innen 4,5 timer etter hjerneslagdebut, etterfulgt av trombektomi) reperfusjonen og funksjonsutfallene3. Optimalisering av trombolyse er derfor fortsatt et viktig mål for hjerneslagforskning, selv i trombektomiens tid.

Tromboemboliske modeller er et viktig verktøy for preklinisk slagforskning som tar sikte på å forbedre trombolytiske terapier. Dette skyldes at mekaniske vaskulære okklusjonsmodeller (f.eks. Intraluminal sutur MCA okklusjon) ikke produserer blodpropper, og dens raske gjenoppretting av cerebral blodstrøm etter fjerning av mekanisk okklusjon er altfor idealisert 4,5. Hittil inkluderer viktige tromboemboliske modeller fototrombose 6,7,8, topisk jernklorid (FeCl3) applikasjon9, mikroinjeksjon av trombin i MCA-grenen 10,11, injeksjon av ex vivo (mikro)emboli i MCA eller arteria carotis communis (CCA)12,13,14 og forbigående hypoksi-iskemi (tHI)15,16, 17,18. Disse slagmodellene har forskjellig histologisk sammensetning av påfølgende blodpropper og sensitivitet for tPA-mediert lytisk behandling (tab 1). De varierer også i det kirurgiske behovet for kraniotomi (nødvendig for in situ trombininjeksjon og lokal påføring av FeCl3), konsistensen av infarktstørrelse og lokalisasjon (f.eks. CCA-infusjon av mikroemboluser gir svært variable utfall) og globale effekter på kardiovaskulærsystemet (f.eks. øker tHI hjertefrekvensen og hjertets minuttvolum for å kompensere for hypoksiindusert perifer vasodilatasjon).

RB-fargestoffbasert fototrombotisk hjerneslag (PTS) -modellen har mange attraktive funksjoner, inkludert enkle kraniotomifrie kirurgiske prosedyrer, lav dødelighet (vanligvis < 5%), og en forutsigbar størrelse og plassering av infarkt (i MCA-forsynende territorium), men den har to store begrensninger. 8 Det første forbeholdet er svak til null respons på tPA-mediert trombolytisk behandling, som også er en ulempe med FeCl3-modellen 7,19,20. Den andre advarselen til PTS- og FeCl3-taktmodeller er at den påfølgende tromben består av tettpakkede blodplateaggregater med en liten mengde fibrin, noe som ikke bare fører til motstandskraft mot tPA-lytisk terapi, men avviker også fra mønsteret av blandet blodplate: fibrintrombi hos pasienter med akutt iskemisk hjerneslag21,22. In situ trombin-mikroinjeksjonsmodellen består derimot hovedsakelig av polymerisert fibrin og et usikkert innhold av trombocytter10.

Gitt resonnementet ovenfor, antydet vi at blanding av RB og en subtrombotisk dose trombin for MCA-målrettet fotoaktivering gjennom tynnet skalle kan øke fibrinkomponenten i den resulterende trombi og øke følsomheten for tPA-mediert lytisk behandling. Vi har bekreftet denne hypotesen,23 og her beskriver vi detaljerte prosedyrer for den modifiserte (T+RB) fototrombotiske slagmodellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Virginia og følger National Institutes of Health Guideline for Care and Use of Laboratory Animals. Figur 1A skisserer sekvensen av kirurgiske prosedyrer i denne protokollen.

1. Oppsett av kirurgi

  1. Plasser en varmepute med temperaturinnstilling ved 37 °C på smådyradapteren minst 15 minutter før operasjonen. Forbered en neseklemmrulle for adapter som tillater dyrets hoderotasjon. Klargjør bedøvelsen Ketamin (60 mg / kg) / Xylazin (10 mg / kg).
  2. Steriliser operasjonsverktøyene, inkludert saks, tang, mikronåleholdere, hemostater, bomullspinner og suturer med autoklav (121 °C ved 15 psi i 60 minutter). Forbered vevlim og øyesalve. Forbered 532 nm laserbeskyttelsesbrille for kirurger.
    MERK: Denne protokollen beskriver en viktig overlevelsesoperasjon og bør utføres ved hjelp av aseptiske teknikker.
  3. Sett opp belysningssystemet med en laserkilde på 532 nm. Forbered en tannbor.
  4. Tilbered Rose Bengal oppløsningen i saltvann (10 mg/ml). Legg en aliquot bovin trombin (0,1 U / μL) på isbøtte.
  5. Injiser ketoprofen (4,0 mg/kg) subkutant i musen som analgesi 30 minutter før kirurgi, eller bruk smertestillende regime anbefalt av de lokale institusjonelle retningslinjene.

2. Ligering av den ipsilaterale arteria carotis communis

  1. Bedøv 10-14 uker gamle mannlige C57BL/6NCrl-mus som veier 22 til 30 g ved intramuskulær injeksjon av ketamin (60 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg).
    MERK: Hele den kirurgiske prosedyren, som omfatter ligering av den ipsilaterale arteria carotis communis gjennom overvåking av cerebral blodstrøm, forventes å ta ~ 120 min. Bedøvelsesregimet vil vanligvis være effektivt for hele denne varigheten, men bedøvelsesdybden bør revurderes minst hvert 15. minutt. Mens du lærer disse prosedyrene, kan det være nødvendig å re-dose anestesi.
  2. Utfør en tå-klype for å sikre at dyret er fullt bedøvet. Fjern håret på venstre hals for CCA-ligering og hodet for skalletynning med hårfjerningskremen.
  3. Plasser musen på adapteren til det lille dyret i den bakre posisjonen. Steriliser operasjonsområdet ved å tørke huden med tre vekslende sveip av povidon-jod og 70% etanol.
  4. Fest musehodet med ørestenger. Under et dissekerende mikroskop, gjør du et 0,5 cm venstre cervikal snitt ved hjelp av en mikrosaks og rett tang på ca. 0,2 cm lateralt til midtlinjen.
  5. Bruk et par fine taggete tang for å trekke fra hverandre bløtvev og fascia for å avsløre venstre arteria carotis communis (LCCA). Skill forsiktig venstre CCA fra vagalnerven ved hjelp av et par fine glatte tang.
  6. Plasser en permanent dobbelknutesutur rundt LCCA ved hjelp av 5-0 silkesutur kuttet i 20 mm segmenter, og lukk deretter såret ved hjelp av sterile sårklemmer.

3. Hodeskalletynning over MCA-grenen og fotoaktivering

  1. Vend musen til mageleie på adapteren for små dyr. Roter neseklemmerullen i 15°. Steriliser operasjonsområdet ved å tørke huden med tre vekslende sveip av betadin og 70% etanol.
  2. Gjør et snitt på 0,8 cm i hodebunnen ved hjelp av en mikrosaks og rett tang langs venstre øye og øre for å eksponere temporalismuskelen, som ligger mellom øyet og øret (figur 1B).
  3. Under dissekeringsmikroskopet, gjør et 0,5 cm snitt langs kanten av temporalis muskel på venstre parietalben med et par fine taggete tang. Lag et nytt 0,3 cm vertikalt snitt på temporalis muskel med en mikro saks. Trekk inn den temporale muskelen for å eksponere kanten av parietalbenet og squamosalbenet. Sørg for å visualisere landemerket for koronal sutur mellom frontal- og parietalbenene (figur 1B,C).
  4. Fukt skallen ved å påføre sterilt saltvann for å avsløre venstre MCA. Merk den proksimale MCA-grenen på squamosalbenet med en markørpenn. Tegn forsiktig en sirkel for ca. 1 mm i diameter som omgir det markerte området med det pneumatiske tannboret (burrhastighetsinnstilling ved 50% av hastighetsregulatoren), og tynn deretter skallen ca. 0,2 mm i dybden uten å berøre undersiden av dura. Stopp boringen til et veldig tynt lag med bein er igjen.
  5. Bland trombinoppløsningen (T, 0,1 E/μL, 80 E/kg) og Rose bengal (RB, 10 mg/ml, 50 mg/kg) basert på musens kroppsvekt. For eksempel, for en mus med 25 g kroppsvekt, bland 20 μL trombin (0,1 E / μL) og 125 mikrol RB (10 mg / ml).
  6. Injiser T+RB-oppløsningen langsomt (145 μL per 25 g kroppsvekt) i sinus retro-orbitalt med en insulinsprøyte (#31G nål).
    MERK: I pilotforsøk ble dødeligheten av økende doser trombin blandet med standarddosen av RB-fargestoff (50 mg / kg) undersøkt for fotoaktivering. Mortaliteten var 0 % for 80 E/kg trombin (n=13), 43 % for 120 E/kg trombin (n=7) og 100 % for både 160 E/kg (n=5) og 200 E/kg trombin (n=5). En dose på 80 E/kg trombin ble derfor valgt for denne modellen. Laserspecklekontraktavbildning ble også brukt for å utelukke muligheten for voldsom blodpropp nær orbitalhulen etter retroorbital sinusinjeksjon av T+RB (tilleggsfigur 1), samt utbredt fibrinavleiring i den kontralaterale hemisfæren som ikke ble utsatt for laserbelysning (tilleggsfigur 2).
  7. Påfør øyesalve på begge øynene for å forhindre tørrhet.
  8. Påfør belysningen med et 532 nm laserlys (med 0,5 mW energi) på borestedet med 2-tommers avstand i 20 minutter. Visualiser belysningen på den proksimale grenen av MCA gjennom en laserbeskyttelsesbrille (figur 1C,D).
    MERK: MCA med 532 nm belysning viser rød fluorescens under goggle. Den distale MCA forsvinner etter 10 min belysning. Ekskluder dyret hvis den distale MCA-strømmen fortsatt er tilstede etter 20 min belysning.
  9. Stopp laserbelysningen etter 20 min. Lukk såret med sterile sårklemmer.

4. Intravital bildebehandling (valgfritt)

MERK: For å karakterisere trombusdannelsen in vivo, bruk intraviral avbildning av en spinndiskkonfokal med fotoaktiveringssystem23.

  1. Lag et kranialvindu ~ 3 mm i diameter på parietalbenet i skallen.
  2. Plasser et dekselglass på kranialvinduet og finn den distale MCA (~ 50 μm i diameter) under et 20x vann-nedsenkingsmål.
  3. Merk den sirkulerende blodplaten ved halemont injeksjon av DyLight488-konjugert anti-GPIbβ antistoff (0,1 mg/kg) 5 minutter før avbildning.
  4. Injiser blandingsoppløsningen av trombin (80 E/kg) og Rose bengal (50 mg/kg) i retrobane 5 minutter før avbildning.
  5. Fotoaktiver MCA ved hjelp av et 561 nm lasersystem med laserstråle 10 μm i diameter og ta bildet til trombedannelsen.

5. Administrasjon av tPA

  1. Plasser det bedøvede dyret på en varm pute på 37 °C. Ved det valgte tidspunktet etter fotoaktivering, fukt et gasbind med ~ 45 ° C varmt vann og pakk det på halen i 1 min.
  2. Injiser rekombinant human tPA (10 mg/kg) gjennom halevenen med en 50 % bolus og 50 % over 30 minutter med infusjonspumpe.
    MERK: Selv om den kliniske dosen av rekombinant human tPA for akutt iskemisk slagbehandling er 0,9 mg/kg, brukes en høyere dose (10 mg/kg) vanligvis hos gnagere for å kompensere for redusert tPA-reaktivitet på tvers av arter. Vi fulgte også standardprotokollen for tPA-administrering i prekliniske slagmodeller, med 50 % som bolus og 50 % infundert gjennom halevenen over 30 minutter.24

6. Overvåking av cerebral blodstrøm (CBF)

MERK: For å bekrefte CBF-bedring etter tPA-behandling, bruk et todimensjonalt laserflekkkontrastbildesystem15 og registrer umiddelbart etter fototrombose (trinn 3.9) eller 24 timer etter tPA-behandling.

  1. Plasser bedøvet dyr i utsatt stilling og gjør et midtlinjesnitt i hodebunnen med skallen utsatt.
  2. Fukt skallen med steril saltvann og påfør forsiktig ultralydgelen på skallen. Unngå hår og bobler i gelen, som vil forstyrre CBF-signalet.
  3. Overvåk CBF i begge cerebrale hemisfærer under laserflekkkontrast i 10 minutter.
  4. Etter å ha tatt opp CBF-bildet, lukk hodebunnen med vevlim og returner dyret til buret.
  5. Analyser CBF i de utvalgte regionene og beregne CBF-utvinningsprosenten sammenlignet med kontralateral region.
  6. Deretter plasserer du dyret tilbake til et varmt bur for utvinning. Overvåk musene i 5-10 minutter til de gjenoppretter fra anestesi. Plasser fuktet mat i buret og returner den til dyrepleieanlegget.
    MERK: Gi analgesi etter operasjonen som anbefalt av de lokale institusjonelle retningslinjene.

7. Måling av infarktvolum ved farging av trifenyltetrazoliumklorid (TTC)

  1. Tjuefire timer etter fototrombose, dypt anestesere dyret i henhold til de lokale institusjonelle retningslinjene for ikke-overlevelseskirurgi.
    MERK: Vi administrerer tribromoetanol (avertin) 250 mg/kg via intraperitoneal (IP) injeksjon.
  2. Utfør transkardial perfusjon med PBS, samle frisk hjerne og legg inn i 3% agar gel.
  3. Snitt hjerneskiven med 1 mm tykkelse med vibratom, og rug i 2% TTC-løsning i 10 min.
  4. Kvantifiser det totale infarktvolumet fra 6 hjerneskiver som det absolutte volumet av ImageJ-programvare.
    MERK: Hjerneødem ble ikke brukt som utfallsmåling av to grunner. For det første måler TTC-flekken vevets levedyktighet (via mitokondriereduksjonsaktiviteten) som er en mer alvorlig konsekvens enn ødem. For det andre, når infarkt fortsetter, forekommer både vasogent og cytotoksisk ødem og kan ikke lett skilles ved standard hjerneødemmålingsmetoder. Vi har imidlertid brukt antiimmunglobin (IgG)-merking for å vurdere integriteten til blod-hjernebarriere (BBB), og funnet sammenlignbar IgG-ekstravasasjon ved 6 timer etter fotoaktivering i både RB- og T+RB-slagmodeller (tilleggsfigur 3).

8. Måling av trombusdannelse

MERK: For å måle trombusdannelsen, samle hjernen ved 1 time og 2 timer etter fototrombose for trombusmåling i MCA ved henholdsvis immunokjemi (IHC) og for fibrinmåling i hjernehalvkule ved immunoblot.

  1. Utfør IHC for karakterisering av koagulasjonssammensetning. Fest hjernen med 4% paraformaldehyd over natten og dehydrer deretter hjernen med 30% sukrose for OCT-innebyggingen.
  2. Seksjon hjernen med sagittal orientering i 20 μm tykkelse, og utføre IHC med spesifikke antistoffer mot fibrinogen, blodplater (glykoprotein IIb), røde blodlegemer (TER119) og blodkar (isolektin GS-IB4).
  3. Utfør måling av fibrin i hjernehalvdelen ved immunoblot med et antistoff mot fibrinogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Først sammenlignet vi fibrininnholdet i RB versus T+RB fototromboseinduserte blodpropper. Mus ble ofret ved transkardial perfusjon av fikseringsmidler ved 2 timer etter fotoaktivering, og hjerner ble fjernet for immunfluorescensfarging av MCA-grenen i langsgående og tverrgående plan. Ved RB-fototrombose var MCA-grenen tettpakket med CD41+-trombocytter og lite fibrin (figur 2A,C). I motsetning til dette ble MCA-grenen i T + RB-fototrombose okkludert av tilfeldig blandet blodplate: fibrinpropper (figur 2B, D, n>3 for hver). Vi brukte også immunblotter for å sammenligne fibrin(ogen)nivået i hjernebarken mellom de to modellene, etter transkardial perfusjon med saltvann 2 timer etter fotoaktivering. Denne analysen viste > dobbelt økning av fibrinavleiring i ipsilaterale hemisfærer i T+RB enn RB-fototrombose (figur 2E, p=0,027 ved uparet t-test; n=3 for hver gruppe). I vår opprinnelige rapport brukte vi også konfokalmikroskopbasert enkeltfartøyfotoaktivering og intravital bildebehandling for å sammenligne oppførselen til FITC-konjugerte anti-GP1bβ-merkede blodplater. 23 Disse forsøkene viste at intravenøs injeksjon av trombin på 80 E/kg ikke induserte trombocyttaggregater selv under laserbelysning (figur 3A), og at trombocytter danner homogene propper i RB-fototrombosemodellen (figur 3B), men ujevne aggregater med flere svake regioner i T+RB-fototrombose (figur 3C). Disse resultatene tyder på at T + RB fototrombose øker fibrininnholdet i den påfølgende tromben.

Deretter sammenlignet vi effekten av akutt intravenøs tPA-behandling (10 mg/kg Alteplase, 30 min etter fotoaktivering) på cerebral blodstrømsrestitusjon (CBF) mellom de to modellene. CBF for samme mus ved pre- og 24 timer etter tPA-versus-kjøretøy-behandling ble målt med laserspeckle-kontrastavbildning og normalisert til den kontralaterale hemisfæren (figur 4A,B). Ved RB-fototrombose førte tPA-behandlingen til en trend med CBF-restitusjon, spesielt i det iskemiske grenseområdet, sammenlignet med kjøretøybehandlede mus (figur 4C, kjøretøy 51 ± 9 % vs tPA 65 ± 7 %, p=0,3 ved uparet t-test, n=4 for hver). I T + RB fototrombose var utvinningen av CBF i tPA-behandlede mus mer fremtredende, og de proksimale MCA-grenene ble ofte synlige ved 24 timer (figur 4D, kjøretøy 55 ± 3% vs tPA 81 ± 7%, p = 0,02 ved uparet t-test, n = 6 for hver gruppe). Disse resultatene tyder på større sensitivitet for tPA-lytisk behandling av T+RB enn RB-fototrombose.

Til slutt brukte vi TTC-flekk for å kvantifisere effekten av tPA-behandling på infarktstørrelse i RB- og T+RB-fototrombotiske slagmodeller. Ved RB-fototrombose ble tilsvarende infarktstørrelse påvist hos kjøretøybehandlede (18 ± 2,80 mm 3, n=6) og tPA-behandlede mus (18 ± 1,95 mm3, n=10; 10 mg/kg tPA ble injisert 30 minutter etter fotoaktivering) (figur 5A). I motsetning til dette reduserte tPA-lytisk behandling signifikant infarkt når tPA ble injisert ved 0,5 timer (7 ± 2,1 mm 3, n = 9), 1 time (4,6 ± 1 mm 3, n = 10) eller 2 timer (6,4 ± 1,5 mm 3, n = 8), men ikke ved 6 timer etter fotoaktivering (15,2 ± 3,1 mm 3, n = 7), sammenlignet med kjøretøybehandlede mus (14,8 ± 2 mm 3, n=19) (figur 5B, p-verdien bestemt ved uparet t-test). Disse resultatene indikerer at T+RB fototrombotisk slagmodell har sensitivitet for tPA-lytisk behandling i.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over prosedyrer. (A) Flytdiagrammet over de viktigste kirurgiske prosedyrene i T+RB fototrombotisk slagmodell. Ligering av arteria carotis communis ipsilateralt (CCA) er valgfritt, men vi fant at det gjør infarktstørrelsen mer konsistent, antagelig på grunn av redusert sikkerhetssirkulasjon. (B) Topp og lateralt bilde av musehjernen i forhold til skallen. Også indikert er øynene, øret, temporalis muskelen, den midterste hjernearterien (MCA) og grener, koronal sutur og laserbelysningsstedet. (C) Visualisering av den målrettede MCA-grenen under den tynnede skallen (C1) og under laserbelysning (C2), og opphør av blodstrømmen etter fotoaktivering (C3). Legg merke til forholdet mellom MCA-grenen og koronal sutur. (D) Oppsettet av en mus under laserbelysning på venstre MCA-gren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Ulikt fibrininnhold i blodproppene. (AD) Immunfluorescensmerking av RB og T+RB fototromboseindusert tromber i distale MCA-gren i enten lengde- (A, B) eller tverrplan (C, D) ved bruk av antifibrin (grønn), anti-CD41/plate (rød) og isolektin B4/endotelcelle (blå) markører. Legg merke til den markerte økningen av antifibrin immunsignaler i T + RB fototrombose-induserte blodpropper (B, D, n = 3 for hver gruppe). (E) Immunblotting indikerte større fibrinavleiring i ipsilateral cerebral cortex i T+RB enn RB-fototrombose 2 timer etter fotoaktivering (n=3 for hver). FN: uskadde mus; Cont: kontralateral cortex; Ipsi: ipsilateral cortex. Skala bar: 50 μm. Denne figuren er endret med tillatelse fra [23]. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Intravital avbildning av trombocyttresponsene. Konfokalmikroskopbasert intravital avbildning av FITC-konjugert anti-GP1bβ-merkede blodplater under enkeltfartøylaserbelysning (på stedet indikert med hvite piler). De eksperimentelle gruppene er: (A) trombin alene, (B) Rose Bengal alene, og (C) trombin pluss Rose Bengal. Tidene etter laserbelysning er merket. Se videoen på JoVEs nettsted for dette manuskriptet. Skala bar: 50 μm. Denne figuren er endret med tillatelse fra [23]. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Effekter av tPA-behandling på CBF-gjenoppretting. Rekombinant human tPA (Alteplase, 10 mg/kg) eller vehikkel ble administrert via halevene til RB og T+RB fototrombose-utfordret mus ved 30 minutter etter laserbelysning, og cerebral blodstrøm (CBF) ved pre- og 24 timer etter behandling i samme mus ble sammenlignet med laserflekkkontrastavbildning. CBF i et område på 3 x 4,8 mm på begge halvkuler ble målt. De eksperimentelle gruppene er: (A, C) RB fototrombose; (B, D) T+RB fototrombose. Legg merke til signifikant gjenoppretting av CBF ved tPA-behandling i T+RB-fototrombosegruppen (p=0,02 ved uparet t-test, n=4 for vehikkel og n=6 for tPA-behandling) og hyppig visualisering av den proksimale MCA-grenen. Ved RB-fototrombose førte tPA-behandlingen til en trend med bedre CBF, hovedsakelig ved det perifere iskemiske området (p=0,3 ved uparret t-test, n=4 for vehikkel og n=5 for tPA-behandling). Hvite piler indikerer stedet for MCA-fotoaktivering. Denne figuren er endret med tillatelse fra [23]. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Effekter av tPA-behandling på infarktstørrelse. (A) Intravenøs tPA-behandling (Alteplase, 10 mg/kg) 30 minutter etter RB-fototrombose klarte ikke å redusere infarktstørrelsen (n=6 hos vehikkelbehandlede og n=10 hos tPA-behandlede mus). (B) I T+RB-fototrombose førte derimot intravenøs 10 mg/kg alteplasebehandling ved enten 0,5, 1 eller 2 timer, men ikke 6 timer etter fotoaktivering, til signifikant reduksjon av infarktstørrelsen. P-verdien ble bestemt av enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligningstest. Denne figuren er endret med tillatelse fra [23]. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Modell Kirurgisk prosedyre Blodpropp Blodplater Fibrin tPA-reaktivitet Hovedfunksjoner/verktøy Viktige referanser
Intraluminal sutur MCAO Endovaskulær MCA okklusjon Nei N/A N/A Nei Rask reperfusjon; Neuroprection studie; tPA-indusert BBB-skade Longa et al. 1989 (Ref #5)
Fototrombose Kranietynning og fotoaktivering Ja Svak Høy reproduserbarhet; lav dødelighet Watson et al. 1985 (Ref #6)
Trombin-fototrombose UCCAO, hodeskalletynning og fotoaktivering Ja Ja Høy reproduserbarhet; lav dødelighet Sun et al. 2020 (Ref #23)
FeCl3 (på MCA) Kranietynning og kjemisk aktivering Ja Nei Høy reproduserbarhet; lav dødelighet Karatas et al. 2011 (Ref #69)
in situ trombininjeksjon Kraniotomi og MCA mikroinjeksjon Ja Ja Høy reproduserbarhet; lav dødelighet; tPA-lytisk behandling Orset et al. 2007 (Ref #10)
Emboli-MCAO Endovaskulær MCA okklusjon Ja Ja tPA-lytisk behandling; Variabel blodpropphardhet Busch et al. 1997 (Ref #13)
Forbigående hypoksi-iskemi (tHI) UCCAO pluss hypoksi Ja Ja Infarkt > MCA-området; Systemiske CV-effekter Sun et al. 2014 (Ref #15)

Tabell 1 Sammenligning av utvalgte prekliniske slagmodeller. Fylte bokser indikerer positivitet (tilstedeværelse av blodpropp, blodplater og fibrin) eller signifikant tPA-reaktivitet.

Tilleggsfigur 1: CBF-monitor etter retroorbital injeksjon av trombin. (A) De representative bildene av retro-orbital sinus (øvre panel) og blodstrøm ved laserflekkkontrastavbildning (nedre panel). De tre vaskulære stedene (1~3 som merket) ble overvåket etter trombininjeksjon (80 U/kg) i sinus retroorbital. (B) Den representative sporingsgrafen over blodstrømmen i 15 minutter etter trombininjeksjon (pil). (C) Den laserflekkbaserte kvantifiseringen viste ingen reduksjon av blodstrømmen nær sinus retro-orbital innen 15 minutter etter trombininjeksjon (n = 4, p-verdi bestemt ved uparet t-test). Klikk her for å laste ned dette tallet.

Tilleggsfigur 2: Manglende fibrinavleiring i kontralateral hemisfære 6 timer etter fotoaktivering. Immunfarging av antifibrinogenet (grønt) viste fibrinavleiring i ipsilateral cortex ved 6 timer etter RB og T+RB fototrombose. Derimot var det ingen merkbar fibrinavleiring i kontralateral cortex etter trombinforsterket fototrombose. N=4 for hver gruppe. Skala bar: 50 μm. Blå fluorescens som DAPI-kjernefarging. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Tilleggsfigur 3: Mangel på immunglobulin (IgG) ekstravasasjon etter fototrombose. Ved 6 timer etter ensidig MCA-målrettet fotoaktivering viste immunfarging ekstravasasjon av IgG i den ipsilaterale hemisfæren, men ikke i kontralateral hemisfære, noe som tyder på begrenset BBB-skade etter trombinforsterket fototrombose. N=4 for hver. Skala bar: 50 μm. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det tradisjonelle RB-fototrombotiske hjerneslag, introdusert i 1985, er en attraktiv modell for fokal cerebral iskemi for enkle kirurgiske prosedyrer, lav dødelighet og høy reproduserbarhet av hjerneinfarkt. 5 I denne modellen aktiverer det fotodynamiske fargestoffet RB raskt blodplater ved lyseksitasjon, noe som fører til tette aggregater som okkluderer blodkaret 5,8,23. Den lille mengden fibrin i RB-indusert blodpropp (figur 2) avviker imidlertid fra den dominante trombocytten:fibrin blandet mønster av tromber hentet akutt hos iskemiske slagpasienter21,22. Det lave fibrininnholdet i RB-indusert tromber bidrar sannsynligvis også til motstandsdyktigheten mot tPA-lytisk behandling 7,8,19. Selv om ultrafiolett laserbestråling induserer vaskulær rekanalisering i RB-fototrombose, er det lite sannsynlig at denne eksperimentelle terapien vil bli brukt klinisk7. Dermed har det tradisjonelle RB-fototrombotiske hjerneslaget hovedsakelig blitt brukt som en permanent okklusjonsmodell, mindre egnet for trombolyse og nevroproteksjonsforskning (sistnevnte bruker ofte intraluminal sutur MCAO-modell som har rask vaskulær reperfusjon ved fjerning av mekanisk okklusjon).

Vi antydet at bruk av blanding av RB og en subtrombotisk dose trombin for fotoaktivering kan øke fibrininnholdet i påfølgende trombi og forbedre responsene på tPA trombolyse, den virkelige hjerneslagbehandlingen. Denne hypotesen støttes av resultatene som presenteres her og i vår opprinnelige rapport. 23 Den trombinforsterkede fototrombotiske slagmodellen opprettholder også fordelene med lav dødelighet, enkle kirurgiske prosedyrer og høy konsistens i infarktstørrelse og lokalisasjon, som i tradisjonell RB-fototrombosemodell. Vi mener derfor at trombinforsterket fototrombose er et verdifullt tillegg til repertoaret til tromboemboliske slagmodeller (tab 1). To prosessuelle detaljer i trombinforsterket fototrombosemodell berettiger diskusjon. For det første kan overdosering av intravenøs trombin provosere akutt lungetromboembolisme og dyredødelighet25. Vi undersøkte en rekke trombindoser for kombinasjon med RB-fototrombose, og den valgte dosen på 80 E/kg har ikke indusert dødelighet hos >100 eksperimenterte voksne mannlige C57Bl/6-mus så langt. Det er sannsynlig at trombindosen må justeres for mus med hyperkoagulasjonstilstand26. For det andre ligerte vi rutinemessig ipsilateral CCA i tillegg til MCA-målrettet fototrombose i våre prosedyrer. Vi fant at ligering av ipsilateral CCA ytterligere øker konsistensen i infarktstørrelse, noe som kan skyldes redusert sikkerhetssirkulasjon mellom MCA og fremre pluss bakre cerebrale arterier.

Med sine unike egenskaper kan trombinforsterket fototrombotisk slagmodell være spesielt nyttig for minst tre forskningsemner. For det første er denne nye modellen ideell for head-to-head sammenligning av tPA og andre fibrinolytiske midler som Tenecteplase (TNKase)27. TNKase er en konstruert tPA-mutert variant med økt fibrinspesifisitet og lavere risiko for iatrogen blødning i ex vivo eksperimenter. Likevel har dens overlegenhet til tPA bare blitt testet i en mikroembolisk slagmodell og ved hjelp av en binær nevrologisk utfallsanalyse14. Gitt sin høye reproduserbarhet og kvantitative infarktstørrelsesanalyse, kan trombinforsterket fototrombotisk slagmodell brukes til å sammenligne fordeler og bivirkninger av tPA-versus-TNKase i flere aspekter (f.eks. doserespons, terapeutisk vindu, komorbiditetspåvirkninger og potensielle bivirkninger ved forsinket behandling). For det andre kan trombinforsterket fototrombosemodell være nyttig for å undersøke effekten av kombinert tPA og platehemmende behandling ved akutt hjerneinfarkt28. Nylige fremskritt av endovaskulære prosedyrer i iskemisk hjerneslag har gjort det mulig for forskere å analysere den histologiske sammensetningen av akutt trombi og identifisert en dominerende, blandet blodplate: fibrinmønster21,22. Følgelig kan kombinasjonen av et fibrinolytisk middel (tPA) og anti-platelet midler øke den totale effekten av trombolyse, men en slagmodell som simulerer den kliniske blodplate-fibrinsammensetningen av trombe er avgjørende for slik forskning. Sammen med tHI og emboli-MCAO-modellene oppfyller trombinfototrombose dette kravet og skiller seg ut for lav mortalitet, enkle kirurgiske prosedyrer og mangel på systemiske kardiovaskulære effekter (tabell 1).

Sist, men ikke minst, kan trombinforsterket fototrombose være spesielt nyttig for å undersøke slagindusert sikkerhetssirkulasjon, gitt sin forutsigbare peri-infarktplassering i MCA-forsyningsområdet. Ved å opprettholde penumbraen for å kompensere for infarktvekst, blir sikkerhetssirkulasjon i økende grad anerkjent som en viktig prediktor for iskemiske slagutfall, fordi akutt vaskulær obstruksjon fremmer blodstrømmen over sikkerhetsnettverket, etterfulgt av remodellering og angiogenese for å danne neo-sikkerhetsfartøy29,30. Resultatene tyder på at tPA ikke bare fremmer rekanalisering av proksimale MCA, men også øker sikkerhetssirkulasjonen i perifert MCA-forsyningsområde (figur 4). Bedre forståelse av mekanismene som regulerer plastisiteten i sikkerhetssirkulasjonen kan foreslå nye terapier. Siden den trombinforsterkede fototrombotiske slagmodellen gir fordelen av forutsigbar peri-infarktregion og følsomhet for lytisk behandling, vil den hjelpe forskningen av sikkerhetssirkulasjon etter slag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskuddene (NS108763, NS100419, NS095064 og HD080429 til C.Y. K.; og NS106592 til Y.Y.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma T8877 infarct
4-0 Nylon monofilament suture LOOK 766B surgical supplies
5-0 silk suture Harvard Apparatus 624143 surgical supplies
543nm laser beam Melles Griot 25-LGP-193-249 photothrombosis
adult male mice Charles River C57BL/6 10~14 weeks old (22~30 g)
Anesthesia bar for mouse adaptor machine shop, UVA surgical setup
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) Sigma T48402 euthanasia
Dental drill Dentamerica Rotex 782 surgical setup
Digital microscope Dino-Lite AM2111 brain imaging
Dissecting microscope Olympus SZ40 surgical setup
Fine curved forceps (serrated) FST 11370-31 surgical instrument
Fine curved forceps (smooth) FST 11373-12 surgical instrument
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 Invitrogen A11008 Immunohistochemistry
Halsted-Mosquito hemostats FST 13008-12 surgical instrument
Heat pump with warming pad Gaymar TP700 surgical setup
infusion pump KD Scientific 200 thrombolytic treatment
Insulin syringe with 31G needle BD 328291 photothrombosis
Ketamine CCM, UVA anesthesia
Laser protective google 532nm Thorlabs LG3 photothrombosis
Ketoprofen CCM, UVA NSAID analgesia
micro needle holders FST 12060-01 surgical instrument
micro scissors FST 15000-03 surgical instrument
MoorFLPI-2 blood flow imager Moor 780-nm laser source Laser Speckle Contrast Imaging
Mouse adaptor RWD 68014 surgical setup
Puralube Vet ointment Fisher NC0138063 eye dryness prevention
Retractor tips Kent Scientific Surgi-5014-2 surgical setup
Rose Bengal Sigma 198250 photothrombosis
Thrombin Sigma T7513 photothrombosis
Tissue glue Abbott Laboratories NC9855218 surgical supplies
tPA Genetech Cathflo activase 2mg thrombolytic treatment
Vibratome Stoelting 51425 TTC infacrt
Xylazine CCM, UVA anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lyden, P. D. Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , Springer. (2015).
  2. Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
  3. Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
  4. Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
  5. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  6. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
  7. Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
  8. Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
  9. Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
  10. Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
  11. Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
  12. Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
  13. Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
  14. Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
  15. Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
  16. Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
  17. Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
  18. Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
  19. Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
  20. Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
  21. Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
  22. Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
  23. Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
  24. Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
  25. Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
  26. Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
  27. Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
  28. McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
  29. Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
  30. Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).

Tags

Fibrinberiket slagmodell TPA-sensitiv slagmodell tromboembolisk slagmodell kirurgiske prosedyrer infarktstørrelse og plassering blodplate: fibrinblandede blodpropper fibrinolytisk behandling RB fargestoffbasert fototrombotisk slagmodell lytisk behandling koagulasjonssammensetning trombin og RB kombinert fototrombosemodell blandet blodplate: fibrin blodpropper infarktstørrelser og steder dødelighet alteplase nye trombolytiske terapier
En fibrinberiket og tPA-sensitiv fototrombotisk slagmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuo, Y. M., Sun, Y. Y., Kuan, C. Y.… More

Kuo, Y. M., Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model. J. Vis. Exp. (172), e61740, doi:10.3791/61740 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter