Summary
I modelli tradizionali di ictus fototrombotico (PTS) inducono principalmente aggregati piastrinici densi con un'elevata resistenza al trattamento litico con attivatore tissutale del plasminogeno (tPA). Qui viene introdotto un modello PTS murino modificato co-iniettando trombina e colorante fotosensibile per la fotoattivazione. Il modello PTS potenziato con trombina produce coaguli misti piastrina:fibrina ed è altamente sensibile alla trombolisi tPA.
Abstract
Un modello ideale di ictus tromboembolico richiede determinate proprietà, tra cui procedure chirurgiche relativamente semplici con bassa mortalità, dimensioni e posizione dell'infarto coerenti, precipitazione di coaguli di sangue misto piastrino-fibrina simili a quelli dei pazienti e un'adeguata sensibilità al trattamento fibrinolitico. Il modello di ictus fototrombotico a base di colorante rosa bengala (RB) soddisfa i primi due requisiti, ma è altamente refrattario al trattamento litico mediato da tPA, presumibilmente a causa della sua composizione del coagulo ricca di piastrine, ma povera di fibrina. Ragioniamo che la combinazione di colorante RB (50 mg/kg) e una dose sub-trombotica di trombina (80 U/kg) per la fotoattivazione mirata al ramo prossimale dell'arteria cerebrale media (MCA) può produrre coaguli arricchiti di fibrina e sensibili al tPA. Infatti, il modello di fototrombosi combinato con trombina e RB (T+RB) ha innescato coaguli di sangue misti piastrina:fibrina, come dimostrato dall'immunocolorazione e dagli immunoblots, e ha mantenuto dimensioni e posizioni dell'infarto coerenti, oltre a una bassa mortalità. Inoltre, l'iniezione endovenosa di tPA (Alteplase, 10 mg/kg) entro 2 ore dalla fotoattivazione ha ridotto significativamente le dimensioni dell'infarto nella fototrombosi T+RB. Pertanto, il modello di ictus fototrombotico potenziato dalla trombina può essere un utile modello sperimentale per testare nuove terapie trombolitiche.
Introduction
La trombectomia endovascolare e la trombolisi mediata da tPA sono le uniche due terapie approvate dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti per l'ictus ischemico acuto, che affligge ~700.000 pazienti all'annonegli Stati Uniti. Poiché l'applicazione della trombectomia è limitata all'occlusione dei grandi vasi (LVO), mentre la trombolisi tPA può alleviare le occlusioni dei piccoli vasi, entrambe sono terapie preziose per l'ictus ischemico acuto2. Inoltre, la combinazione di entrambe le terapie (ad esempio, l'inizio della trombolisi tPA entro 4,5 ore dall'insorgenza dell'ictus, seguita da trombectomia) migliora la riperfusione e gli esiti funzionali3. Pertanto, l'ottimizzazione della trombolisi rimane un obiettivo importante per la ricerca sull'ictus, anche nell'era della trombectomia.
I modelli tromboembolici sono uno strumento essenziale per la ricerca preclinica sull'ictus che mira a migliorare le terapie trombolitiche. Ciò è dovuto al fatto che i modelli di occlusione vascolare meccanica (ad esempio, l'occlusione MCA della sutura intraluminale) non producono coaguli di sangue e il suo rapido recupero del flusso sanguigno cerebrale dopo la rimozione dell'occlusione meccanica è eccessivamente idealizzato 4,5. Ad oggi, i principali modelli tromboembolici includono la fototrombosi 6,7,8, l'applicazione topica di cloruro ferrico (FeCl3)9, la microiniezione di trombina nel ramo MCA 10,11, l'iniezione di (micro)emboli ex vivo nell'MCA o nell'arteria carotide comune (CCA)12,13,14 e l'ipossia-ischemia transitoria (tHI)15,16, 17,18. Questi modelli di ictus differiscono nella composizione istologica dei coaguli che ne derivano e nella sensibilità alle terapie litiche mediate da tPA (Tabella 1). Variano anche nella necessità chirurgica di craniotomia (necessaria per l'iniezione di trombina in situ e l'applicazione topica di FeCl3), nella consistenza delle dimensioni e della posizione dell'infarto (ad esempio, l'infusione di microemboli da parte di CCA produce risultati molto variabili) e negli effetti globali sul sistema cardiovascolare (ad esempio, il tHI aumenta la frequenza cardiaca e la gittata cardiaca per compensare la vasodilatazione periferica indotta dall'ipossia).
Il modello di ictus fototrombotico (PTS) basato su coloranti RB ha molte caratteristiche interessanti, tra cui semplici procedure chirurgiche senza craniotomia, bassa mortalità (in genere < 5%) e dimensioni e posizione prevedibili dell'infarto (nel territorio di fornitura di MCA), ma presenta due principali limitazioni. 8 Il primo avvertimento è la risposta debole a nulla al trattamento trombolitico mediato da tPA, che è anche uno svantaggio del modelloFeCl 3 7,19,20. Il secondo avvertimento dei modelli di ictus PTS e FeCl3 è che i trombi che ne derivano sono costituiti da aggregati piastrinici densamente impacchettati con una piccola quantità di fibrina, che non solo portano alla sua resilienza alla terapia tPA-litica, ma si discostano anche dal modello di trombi piastrinici:fibrina misti nei pazienti con ictus ischemico acuto21,22. Al contrario, il modello di microiniezione di trombina in situ comprende principalmente fibrina polimerizzata e un contenuto incerto di piastrine10.
Dato il ragionamento di cui sopra, abbiamo ipotizzato che la miscela di RB e una dose sub-trombotica di trombina per la fotoattivazione mirata a MCA attraverso il cranio assottigliato possa aumentare la componente di fibrina nei trombi risultanti e aumentare la sensibilità al trattamento litico mediato da tPA. Abbiamo confermato questa ipotesi,23 e qui descriviamo in dettaglio le procedure del modello di ictus fototrombotico modificato (T+RB).
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Protocol
Questo protocollo è approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Virginia e segue le linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. La Figura 1A delinea la sequenza delle procedure chirurgiche di questo protocollo.
1. Impostazione dell'intervento chirurgico
- Posizionare un tappetino riscaldante con temperatura impostata a 37 °C sull'adattatore per animali di piccola taglia almeno 15 minuti prima dell'intervento. Preparare un rotolo di clip per il naso per l'adattatore che consenta la rotazione della testa dell'animale. Preparare gli anestetici Ketamina (60 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg).
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici tra cui forbici, pinze, porta-aghi, emostatici, cotton fioc e suture con autoclave (121 °C a 15 psi per 60 min). Prepara la colla per tessuti e l'unguento per gli occhi. Prepara gli occhiali di protezione laser da 532 nm per i chirurghi.
NOTA: Questo protocollo descrive una procedura chirurgica di sopravvivenza maggiore e deve essere condotta utilizzando tecniche asettiche. - Configurare il sistema di illuminazione con una sorgente laser da 532 nm. Prepara un trapano dentale.
- Preparare la soluzione salina di Rose Bengal (10 mg/mL). Mettere un'aliquota di trombina bovina (0,1 U/μL) sul secchiello del ghiaccio.
- Iniettare Ketoprofene (4,0 mg/kg) per via sottocutanea nel topo come analgesia a 30 minuti prima dell'intervento chirurgico o utilizzare il regime analgesico raccomandato dalle linee guida istituzionali locali.
2. Legatura dell'arteria carotide comune omolaterale
- Anestetizzare topi maschi C57BL/6NCrl di 10-14 settimane di età compresa tra 22 e 30 g mediante iniezione intramuscolare di ketamina (60 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
NOTA: L'intera procedura chirurgica, che comprende la legatura dell'arteria carotide comune omolaterale attraverso il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale, dovrebbe richiedere ~ 120 minuti. Il regime anestetico sarà in genere efficace per l'intera durata, ma la profondità dell'anestetico deve essere rivalutata almeno ogni 15 minuti. Durante l'apprendimento di queste procedure, potrebbe essere necessario ridosare l'anestesia. - Eseguire un pizzicotto del piede per assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato. Rimuovere i peli sul collo sinistro per la legatura CCA e la testa per il diradamento del cranio con la crema depilatoria.
- Posizionare il mouse sull'adattatore per animali di piccola taglia in posizione supina. Sterilizzare l'area chirurgica strofinando la pelle con tre passaggi alternati di iodio povidone ed etanolo al 70%.
- Fissare la testa del mouse utilizzando le barre auricolari. Al microscopio da dissezione, praticare un'incisione cervicale sinistra di 0,5 cm utilizzando un paio di microforbici e una pinza diritta a circa 0,2 cm lateralmente alla linea mediana.
- Utilizzare un paio di pinze seghettate fini per separare i tessuti molli e la fascia per esporre l'arteria carotide comune sinistra (LCCA). Separare con cura il CCA sinistro dal nervo vagale utilizzando un paio di pinze fini e lisce.
- Posizionare una sutura permanente a doppio nodo attorno all'LCCA utilizzando una sutura di seta 5-0 tagliata in segmenti di 20 mm, quindi chiudere la ferita utilizzando clip sterili per ferite.
3. Assottigliamento del cranio sopra il ramo MCA e fotoattivazione
- Capovolgere il mouse in posizione prona sull'adattatore per piccoli animali. Ruotare il rotolo della clip nasale di 15°. Sterilizzare l'area chirurgica strofinando la pelle con tre passaggi alternati di betadine ed etanolo al 70%.
- Praticare un'incisione di 0,8 cm nel cuoio capelluto utilizzando un paio di microforbici e una pinza diritta lungo l'occhio sinistro e l'orecchio per esporre il muscolo temporale, che si trova tra l'occhio e l'orecchio (Figura 1B).
- Al microscopio da dissezione, praticare un'incisione di 0,5 cm lungo il bordo del muscolo temporale sull'osso parietale sinistro con un paio di pinze seghettate sottili. Eseguire una seconda incisione verticale di 0,3 cm sul muscolo temporale con una microforbice. Ritrarre il muscolo temporale per esporre il bordo dell'osso parietale e dell'osso squamoso. Assicurati di visualizzare il punto di riferimento della sutura coronale tra le ossa frontali e parietali (Figura 1B,C).
- Idratare il cranio applicando soluzione fisiologica sterile per rivelare l'MCA sinistro. Segna il ramo prossimale MCA sull'osso squamoso con un pennarello. Disegnare delicatamente un cerchio di circa 1 mm di diametro che circonda l'area contrassegnata con il trapano dentale pneumatico (impostazione della velocità della fresa al 50% del regolatore di velocità), quindi assottigliare il cranio di circa 0,2 mm di profondità senza toccare la dura sottostante. Interrompere la perforazione fino a quando non rimane uno strato molto sottile di osso.
- Mescolare la soluzione di trombina (T, 0,1 U/μL, 80 U/kg) e Rose bengala (RB, 10 mg/mL, 50 mg/kg) in base al peso corporeo del topo. Ad esempio, per un topo di 25 g di peso corporeo, mescolare 20 μL di trombina (0,1 U/μL) e 125 μL di RB (10 mg/mL).
- Iniettare lentamente la soluzione T+RB (145 μL per 25 g di peso corporeo) nel seno retroorbitale con una siringa da insulina (ago #31G).
NOTA: Negli esperimenti pilota, il tasso di mortalità di dosi crescenti di trombina mescolate con la dose standard di colorante RB (50 mg/kg) è stato esaminato per la fotoattivazione. La mortalità è stata dello 0% per trombina da 80 U/kg (n=13), del 43% per trombina da 120 U/kg (n=7) e del 100% sia per la trombina da 160 U/kg (n=5) che per quella da 200 U/kg (n=5). Per questo modello è stata quindi scelta una dose di trombina da 80 U/kg. L'imaging a contratto con speckle laser è stato utilizzato anche per escludere la possibilità di coagulazione del sangue dilagante vicino alla cavità orbitale dopo l'iniezione del seno retro-orbitale di T+RB (Figura supplementare 1), nonché la deposizione diffusa di fibrina nell'emisfero controlaterale che non è stata sottoposta a illuminazione laser (Figura supplementare 2). - Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
- Applicare l'illuminatore con una luce laser da 532 nm (con energia di 0,5 mW) sul sito perforato a una distanza di 2 pollici per 20 minuti. Visualizzare l'illuminazione sul ramo prossimale dell'MCA attraverso un occhiale di protezione laser (Figura 1C,D).
NOTA: L'MCA con illuminazione a 532 nm mostra una fluorescenza rossa sotto la maschera. L'MCA distale scomparirà dopo 10 minuti di illuminazione. Escludere l'animale se il flusso distale di MCA è ancora presente dopo 20 minuti di illuminazione. - Interrompere l'illuminazione laser dopo 20 min. Chiudere la ferita con clip sterili.
4. Imaging intravitale (opzionale)
NOTA: Per caratterizzare la formazione di trombi in vivo, utilizzare l'imaging intravirale mediante un confocale spin-disk con sistema di fotoattivazione23.
- Crea una finestra cranica di ~ 3 mm di diametro sull'osso parietale del cranio.
- Posizionare un vetro di copertura sulla finestra cranica e posizionare l'MCA distale (~50 μm di diametro) sotto un obiettivo a immersione in acqua 20x.
- Etichettare la piastrina circolante mediante iniezione nella vena caudale dell'anticorpo anti-GPIbβ coniugato DyLight488 (0,1 mg/kg) 5 minuti prima dell'imaging.
- Iniettare la miscela di trombina (80 U/kg) e rosa bengala (50 mg/kg) per via retroorbitale a 5 minuti prima dell'imaging.
- Fotoattivare l'MCA utilizzando un sistema laser a 561 nm con raggio laser di 10 μm di diametro e registrare l'immagine fino alla formazione del trombo.
5. Somministrazione di tPA
- Posizionare l'animale anestetizzato su un tampone caldo a 37 °C. Al punto di tempo di post-fotoattivazione selezionato, bagnare una garza con acqua tiepida a ~45 °C e avvolgerla sulla coda per 1 minuto.
- Iniettare tPA umano ricombinante (10 mg/kg) attraverso la vena caudale con un bolo al 50% e al 50% nell'arco di 30 minuti con pompa per infusione.
NOTA: Sebbene la dose clinica di tPA umano ricombinante per il trattamento dell'ictus ischemico acuto sia di 0,9 mg/kg, una dose più elevata (10 mg/kg) è comunemente usata nei roditori per compensare la ridotta reattività del tPA interspecie. Abbiamo anche seguito il protocollo standard di somministrazione di tPA in modelli preclinici di ictus, utilizzando il 50% come bolo e il 50% infuso attraverso la vena caudale per 30 minuti.24
6. Monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale (CBF)
NOTA: Per confermare il recupero del CBF dopo il trattamento con tPA, utilizzare un sistema di imaging bidimensionale con contrasto a speckle laser15 e registrare immediatamente dopo la fototrombosi (passaggio 3.9) o a 24 ore dopo il trattamento con tPA.
- Posizionare l'animale anestetizzato in posizione prona e praticare un'incisione sulla linea mediana del cuoio capelluto con il cranio esposto.
- Idratare il cranio con soluzione fisiologica sterile e applicare delicatamente il gel per ultrasuoni sul cranio. Evitare capelli e bolle nel gel, che interferiranno con il segnale CBF.
- Monitorare il CBF in entrambi gli emisferi cerebrali con l'imager a contrasto a speckle laser per 10 minuti.
- Dopo aver registrato l'immagine CBF, chiudere il cuoio capelluto con colla per tessuti e riportare l'animale nella gabbia.
- Analizza il CBF nelle regioni selezionate e calcola la percentuale di recupero del CBF rispetto alla regione controlaterale.
- Quindi, rimetti l'animale in una gabbia calda per il recupero. Monitorare i topi per 5-10 minuti fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Mettere il cibo bagnato nella gabbia e riportarlo alla struttura di cura degli animali.
NOTA: Fornire l'analgesia post-operatoria come raccomandato dalle linee guida istituzionali locali.
7. Misurazione del volume dell'infarto mediante colorazione con cloruro di trifenile tetrazolio (TTC)
- Ventiquattro ore dopo la fototrombosi, anestetizzare profondamente l'animale secondo le linee guida istituzionali locali per la chirurgia di non sopravvivenza.
NOTA: Somministriamo tribromoetanolo (avertina) 250 mg/kg tramite iniezione intraperitoneale (IP). - Eseguire la perfusione transcardica con PBS, raccogliere il cervello fresco e incorporare in gel di agar al 3%.
- Sezionare la fetta di cervello con uno spessore di 1 mm mediante vibratomo e incubare in una soluzione di TTC al 2% per 10 minuti.
- Quantificare il volume totale dell'infarto da 6 fette cerebrali come volume assoluto con il software ImageJ.
NOTA: L'edema cerebrale non è stato utilizzato come misurazione dell'esito per due motivi. In primo luogo, la colorazione TTC misura la vitalità tissutale (attraverso l'attività di riduzione mitocondriale) che è una conseguenza più grave dell'edema. In secondo luogo, man mano che l'infarto procede, si verificano sia edema vasogenico che citotossico e non possono essere facilmente distinti dai metodi standard di misurazione dell'edema cerebrale. Tuttavia, abbiamo utilizzato la marcatura anti-immunoglobina (IgG) per valutare l'integrità della barriera emato-encefalica (BBB) e abbiamo trovato uno stravaso di IgG comparabile a 6 ore dopo la fotoattivazione in entrambi i modelli di ictus RB e T+RB (Figura 3 supplementare).
8. Misurazione della formazione del trombo
NOTA: Per misurare la formazione di trombi, prelevare il cervello a 1 ora e 2 ore dopo la fototrombosi per la misurazione del trombo nell'MCA mediante immunochimica (IHC) e per la misurazione della fibrina nell'emisfero cerebrale mediante immunoblot, rispettivamente.
- Eseguire l'IHC per la caratterizzazione della composizione del coagulo. Fissare il cervello con il 4% di paraformaldeide durante la notte e poi disidratare il cervello con il 30% di saccarosio per l'inclusione dell'OCT.
- Sezionare il cervello con orientamento sagittale in 20 μm di spessore, ed eseguire l'IHC con anticorpi specifici contro fibrinogeno, piastrine (glicoproteina IIb), globuli rossi (TER119) e vasi sanguigni (isolectina GS-IB4).
- Eseguire la misurazione della fibrina nell'emisfero cerebrale mediante immunoblot con un anticorpo contro il fibrinogeno.
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Representative Results
In primo luogo, abbiamo confrontato il contenuto di fibrina in RB rispetto ai coaguli di sangue indotti dalla fototrombosi T+RB. I topi sono stati sacrificati mediante perfusione transcardica di fissativi a 2 ore dopo la fotoattivazione e i cervelli sono stati rimossi per la colorazione a immunofluorescenza del ramo MCA nei piani longitudinali e trasversali. Nella fototrombosi RB, il ramo MCA era densamente impacchettato con piastrine CD41+ e poca fibrina (Figura 2A,C). Al contrario, il ramo MCA nella fototrombosi T+RB è stato occluso da coaguli piastrina:fibrina mescolati in modo casuale (Figura 2B,D, n>3 per ciascuno). Abbiamo anche utilizzato immunoblot per confrontare il livello di fibrina (ogeno) nella corteccia cerebrale tra i due modelli, dopo perfusione transcardica con soluzione fisiologica a 2 ore dopo la fotoattivazione. Questa analisi ha mostrato > aumento di due volte della deposizione di fibrina nell'emisfero omolaterale in T+RB rispetto alla fototrombosi RB (Figura 2E, p=0,027 con t-test spaiato; n=3 per ciascun gruppo). Nel nostro rapporto originale, abbiamo anche utilizzato la fotoattivazione a vaso singolo basata su microscopio confocale e l'imaging intravitale per confrontare i comportamenti delle piastrine marcate con anti-GP1bβ coniugate con FITC. 23 Tali esperimenti hanno dimostrato che l'iniezione endovenosa di trombina da 80 U/kg non è riuscita a indurre aggregati piastrinici anche sotto illuminazione laser (Figura 3A) e che le piastrine formano coaguli omogenei nel modello di fototrombosi RB (Figura 3B), ma aggregati irregolari con più regioni deboli nella fototrombosi T+RB (Figura 3C). Questi risultati suggeriscono che la fototrombosi T+RB aumenta il contenuto di fibrina nei trombi successivi.
Successivamente, abbiamo confrontato gli effetti del trattamento con tPA per via endovenosa acuta (10 mg/kg di Alteplase, 30 minuti dopo la fotoattivazione) sul recupero del flusso sanguigno cerebrale (CBF) tra i due modelli. Il CBF dello stesso topo al trattamento pre- e 24 ore post-tPA-versus-vehicle è stato misurato mediante imaging con contrasto laser speckle e normalizzato all'emisfero controlaterale (Figura 4A,B). Nella fototrombosi RB, il trattamento con tPA ha portato a una tendenza al recupero del CBF, in particolare nell'area di confine ischemica, rispetto ai topi trattati con veicolo (Figura 4C, veicolo 51 ± 9% vs tPA 65 ± 7%, p=0,3 con t-test spaiato, n=4 per ciascuno). Nella fototrombosi T+RB, il recupero del CBF nei topi trattati con tPA è stato più prominente e i rami prossimali dell'MCA sono spesso diventati visibili a 24 ore (Figura 4D, veicolo 55 ± 3% vs tPA 81 ± 7%, p=0,02 con t-test spaiato, n=6 per ciascun gruppo). Questi risultati suggeriscono una maggiore sensibilità alla terapia tPA-litica da parte di T+RB rispetto alla fototrombosi RB.
Infine, abbiamo utilizzato la colorazione TTC per quantificare gli effetti del trattamento con tPA sulle dimensioni dell'infarto nei modelli di ictus fototrombotico RB e T+RB. Nella fototrombosi RB, una dimensione dell'infarto simile è stata rilevata nei topi trattati con veicolo (18 ± 2,80 mm 3, n=6) e trattati con tPA (18 ± 1,95 mm3, n=10; 10 mg/kg di tPA sono stati iniettati a 30 minuti dopo la fotoattivazione) (Figura 5A). Al contrario, il trattamento tPA-litico ha ridotto significativamente l'infarto quando il tPA è stato iniettato a 0,5 h (7 ± 2,1 mm 3, n = 9), 1 h (4,6 ± 1 mm 3, n = 10) o 2 h (6,4 ± 1,5 mm 3, n = 8 ), ma non a 6 h dopo la fotoattivazione (15,2 ± 3,1 mm 3, n = 7), rispetto ai topi trattati con veicolo (14,8 ± 2 mm 3, n=19) (Figura 5B, il valore p determinato dal test t spaiato). Questi risultati indicano che il modello di ictus fototrombotico T+RB ha sensibilità al trattamento tPA-litico nel.
Figura 1: Schema delle procedure. (A) Il diagramma di flusso delle principali procedure chirurgiche nel modello di ictus fototrombotico T+RB. La legatura dell'arteria carotide comune omolaterale (CCA) è facoltativa, ma abbiamo scoperto che rende le dimensioni dell'infarto più coerenti, presumibilmente a causa della diminuzione della circolazione collaterale. (B) Vista dall'alto e laterale del cervello del topo in relazione al cranio. Sono indicati anche gli occhi, l'orecchio, il muscolo temporale, l'arteria cerebrale media (MCA) e i rami, la sutura coronale e il sito di illuminazione laser. (C) Visualizzazione del ramo MCA mirato sotto il cranio assottigliato (C1) e durante l'illuminazione laser (C2) e cessazione del flusso sanguigno dopo fotoattivazione (C3). Si noti la relazione tra il ramo MCA e la sutura coronale. (D) L'installazione di un mouse durante l'illuminazione laser sul ramo MCA sinistro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diversi contenuti di fibrina nei coaguli di sangue. (A-D) Marcatura in immunofluorescenza dei trombi indotti dalla fototrombosi RB e T+RB nel ramo distale dell'MCA in un piano longitudinale (A, B) o trasversale (C, D) utilizzando marcatori anti-fibrina (verde), anti-CD41/piastrine (rosso) e isolectina B4/cellule endoteliali (blu). Si noti il marcato aumento degli immunosegnali anti-fibrina nei coaguli di sangue indotti dalla fototrombosi T+RB (B, D, n=3 per ciascun gruppo). (E) L'immunoblotting ha indicato una maggiore deposizione di fibrina nella corteccia cerebrale omolaterale in T+RB rispetto alla fototrombosi RB a 2 ore dalla fotoattivazione (n=3 per ciascuna). ONU: topi illesi; Cont: corteccia controlaterale; Ipsi: corteccia omolaterale. Barra graduata: 50 μm. Questa figura è stata modificata con il permesso di [23]. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging intravitale delle risposte piastriniche. Imaging intravitale basato su microscopio confocale di piastrine marcate con anti-GP1bβ coniugate FITC sotto illuminazione laser a vaso singolo (nel sito indicato da frecce bianche). I gruppi sperimentali sono: (A) trombina da sola, (B) Rosa Bengala da sola e (C) trombina più Rosa Bengala. I tempi dopo l'illuminazione laser sono etichettati. Guarda il video nel sito web di JoVE per questo manoscritto. Barra graduata: 50 μm. Questa figura è stata modificata con il permesso di [23]. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetti del trattamento con tPA sul recupero del CBF. Il tPA umano ricombinante (Alteplase, 10 mg/kg) o il veicolo sono stati somministrati attraverso la vena caudale a un topo sottoposto a fototrombosi RB e T+RB a 30 minuti dopo l'illuminazione laser e il flusso sanguigno cerebrale (CBF) prima e 24 ore dopo il trattamento nello stesso topo sono stati confrontati con l'imaging con contrasto a speckle laser. È stato misurato il CBF in un'area di 3 x 4,8 mm su entrambi gli emisferi. I gruppi sperimentali sono: (A, C) fototrombosi RB; (B, D) Fototrombosi T+RB. Si noti il significativo recupero del CBF mediante trattamento con tPA nel gruppo di fototrombosi T+RB (p=0,02 con t-test spaiato, n= 4 per il veicolo e n=6 per il trattamento con tPA) e la frequente visualizzazione del ramo prossimale dell'MCA. Nella fototrombosi RB, il trattamento con tPA ha portato a un trend di miglioramento del CBF, prevalentemente nell'area ischemica periferica (p=0,3 per il t-test spaiato, n= 4 per il veicolo e n=5 per il trattamento con tPA). Le frecce bianche indicano il sito di fotoattivazione dell'MCA. Questa figura è stata modificata con il permesso di [23]. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Effetti del trattamento con tPA sulle dimensioni dell'infarto. (A) Il trattamento con tPA per via endovenosa (Alteplase, 10 mg/kg) a 30 minuti dopo che la fototrombosi RB non è riuscita a ridurre le dimensioni dell'infarto (n=6 nei topi trattati con veicolo e n=10 nei topi trattati con tPA). (B) Al contrario, nella fototrombosi T+RB, il trattamento endovenoso con 10 mg/kg di Alteplase a 0,5, 1 o 2 ore, ma non a 6 ore dopo la fotoattivazione, ha portato a una significativa riduzione delle dimensioni dell'infarto. Il valore p è stato determinato mediante ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Tukey. Questa figura è stata modificata con il permesso di [23]. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Modello | Procedura chirurgica | Coaguli di sangue | Piastrine | Fibrina | reattività tPA | Caratteristiche principali/utilità | Riferimenti chiave |
| Sutura intraluminale MCAO | Occlusione endovascolare MCA | No | N/A | N/A | No | Riperfusione rapida; Studio di neuroprecazione; Lesione della BBB indotta da tPA | Longa et al. 1989 (Ref #5) |
| Fototrombosi | Diradamento del cranio e fotoattivazione | Sì | Debole | Elevata riproducibilità; bassa mortalità | Watson et al. 1985 (Ref #6) | ||
| Trombina-Fototrombosi | UCCAO, assottigliamento del cranio e fotoattivazione | Sì | Sì | Elevata riproducibilità; bassa mortalità | Sole et al. 2020 (Ref #23) | ||
| FeCl3 (sull'MCA) | Assottigliamento del cranio e attivazione chimica | Sì | No | Elevata riproducibilità; bassa mortalità | Karatas et al. 2011 (Ref #69) | ||
| Iniezione di trombina in situ | Craniotomia e microiniezione di MCA | Sì | Sì | Elevata riproducibilità; bassa mortalità; Trattamento tPA-litico | Orset et al. 2007 (Ref #10) | ||
| Emboli-MCAO | Occlusione endovascolare MCA | Sì | Sì | trattamento tPA-litico; Durezza variabile del coagulo | Busch et al. 1997 (Ref #13) | ||
| Ipossia-ischemia transitoria (tHI) | UCCAO più ipossia | Sì | Sì | Infarto >'area MCA; Effetti sistemici del CV | Sun et al. 2014 (Ref #15) |
Tabella 1: Confronto di modelli preclinici selezionati per l'ictus. Le scatole piene indicano positività (presenza di coaguli di sangue, piastrine e fibrina) o significativa reattività al tPA.
Figura 1 supplementare: Monitor CBF dopo l'iniezione retroorbitale di trombina. (A) Le foto rappresentative del seno retro-orbitale (pannello superiore) e del flusso sanguigno mediante imaging a contrasto con speckle laser (pannello inferiore). I tre siti vascolari (1~3 come etichettato) sono stati monitorati dopo l'iniezione di trombina (80 U/kg) nel seno retro-orbitale. (B) Il grafico rappresentativo del flusso sanguigno per 15 minuti dopo l'iniezione di trombina (freccia). (C) La quantificazione basata su macchioline laser non ha mostrato alcuna riduzione del flusso sanguigno vicino al seno retro-orbitale entro 15 minuti dall'iniezione di trombina (n=4, valore p determinato dal test t spaiato). Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura 2 supplementare: Mancanza di deposizione di fibrina nell'emisfero controlaterale a 6 ore dalla fotoattivazione. L'immunocolorazione dell'anti-fibrinogeno (verde) ha mostrato la deposizione di fibrina nella corteccia omolaterale a 6 ore dopo la fototrombosi RB e T+RB. Al contrario, non c'è stata alcuna deposizione di fibrina discerabile nella corteccia controlaterale dopo la fototrombosi potenziata da trombina. N=4 per ogni gruppo. Barra graduata: 50 μm. Fluorescenza blu come colorazione del nucleo DAPI. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 3: Mancanza di stravaso di immunoglobuline (IgG) dopo fototrombosi. A 6 ore dalla fotoattivazione unilaterale mirata all'MCA, l'immunocolorazione ha mostrato uno stravaso di IgG nell'emisfero omolaterale, ma non nell'emisfero controlaterale, suggerendo un danno limitato della BBB dopo la fototrombosi potenziata da trombina. N=4 per ciascuno. Barra graduata: 50 μm. Clicca qui per scaricare questa figura.
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Discussion
L'ictus fototrombotico RB tradizionale, introdotto nel 1985, è un modello interessante di ischemia cerebrale focale per semplici procedure chirurgiche, bassa mortalità e alta riproducibilità dell'infarto cerebrale. 5 In questo modello, il colorante fotodinamico RB attiva rapidamente le piastrine all'eccitazione della luce, portando a densi aggregati che occludono il vaso sanguigno 5,8,23. Tuttavia, la piccola quantità di fibrina nei coaguli di sangue indotti da RB (Figura 2) si discosta dal modello misto piastrino:fibrina dominante di trombi recuperati in modo acuto nei pazienti con ictus ischemico21,22. Il basso contenuto di fibrina nei trombi indotti da RB probabilmente contribuisce anche alla sua resilienza al trattamento tPA-litico 7,8,19. Sebbene l'irradiazione laser ultravioletta induca la ricanalizzazione vascolare nella fototrombosi RB, è improbabile che questa terapia sperimentale venga utilizzata clinicamente7. Pertanto, l'ictus fototrombotico RB tradizionale è stato utilizzato principalmente come modello di occlusione permanente, meno adatto per la ricerca sulla trombolisi e sulla neuroprotezione (quest'ultima utilizza spesso il modello MCAO di sutura intraluminale che presenta una rapida riperfusione vascolare dopo la rimozione dell'occlusione meccanica).
Abbiamo ipotizzato che l'uso di una miscela di RB e una dose sub-trombotica di trombina per la fotoattivazione possa aumentare il contenuto di fibrina nei trombi successivi e migliorare le risposte alla trombolisi tPA, la terapia dell'ictus nel mondo reale. Questa ipotesi è supportata dai risultati presentati qui e nel nostro rapporto originale. 23 Il modello di ictus fototrombotico potenziato con trombina mantiene anche i vantaggi di una bassa mortalità, di procedure chirurgiche semplici e di un'elevata coerenza nelle dimensioni e nella posizione dell'infarto, come nel modello tradizionale di fototrombosi RB. Pertanto, riteniamo che la fototrombosi potenziata da trombina sia una preziosa aggiunta al repertorio dei modelli di ictus tromboembolico (Tabella 1). Due dettagli procedurali del modello di fototrombosi potenziata da trombina meritano di essere discussi. In primo luogo, una dose eccessiva di trombina per via endovenosa può provocare tromboembolia polmonare acuta e mortalità animale25. Abbiamo esaminato una gamma di dosi di trombina per la combinazione con la fototrombosi RB e la dose scelta di 80 U/kg non ha indotto mortalità in >100 topi maschi adulti C57Bl/6 sperimentati finora. È probabile che la dose di trombina debba essere aggiustata per i topi con stati di ipercoagulazione26. In secondo luogo, abbiamo regolarmente legato il CCA omolaterale oltre alla fototrombosi mirata all'MCA nelle nostre procedure. Abbiamo scoperto che la legatura del CCA omolaterale aumenta ulteriormente la consistenza delle dimensioni dell'infarto, il che può essere dovuto alla diminuzione della circolazione collaterale tra MCA e le arterie cerebrali anteriori e posteriori.
Con le sue proprietà uniche, il modello di ictus fototrombotico potenziato dalla trombina può essere particolarmente utile per almeno tre argomenti di ricerca. Innanzitutto, questo nuovo modello è ideale per il confronto testa a testa di tPA e altri agenti fibrinolitici come Tenecteplase (TNKase)27. TNKase è una variante ingegnerizzata di tPA-mutante con una maggiore specificità della fibrina e un minor rischio di emorragia iatrogena negli esperimenti ex vivo. Tuttavia, la sua superiorità rispetto al tPA è stata testata solo in un modello di ictus micro-embolico e utilizzando un'analisi binaria degli esiti neurologici14. Data la sua elevata riproducibilità e l'analisi quantitativa delle dimensioni dell'infarto, il modello di ictus fototrombotico potenziato da trombina può essere utilizzato per confrontare i benefici e gli effetti avversi della tPA-rispetto alla TNKasi in molteplici aspetti (ad esempio, risposte alla dose, finestra terapeutica, impatti sulla comorbidità e potenziali effetti avversi nel trattamento ritardato). In secondo luogo, il modello di fototrombosi potenziato con trombina può essere utile per studiare gli effetti del trattamento combinato con tPA e antipiastriniche nell'ictus ischemico acuto28. I recenti progressi delle procedure endovascolari nell'ictus ischemico hanno permesso ai ricercatori di analizzare la composizione istologica dei trombi acuti e hanno identificato un pattern piastrinico:fibrina dominante, misto21,22. Di conseguenza, la combinazione di un agente fibrinolitico (tPA) e agenti antipiastrinici può aumentare l'efficacia complessiva della trombolisi, ma un modello di ictus che simuli la composizione clinica piastrina:fibrina del trombo è fondamentale per tale ricerca. Insieme ai modelli tHI ed emboli-MCAO, la trombina-fototrombosi soddisfa questo requisito e si distingue per la bassa mortalità, la semplicità delle procedure chirurgiche e l'assenza di effetti cardiovascolari sistemici (Tabella 1).
Ultimo ma non meno importante, la fototrombosi potenziata da trombina può essere particolarmente utile per studiare la circolazione collaterale indotta dall'ictus, data la sua prevedibile posizione peri-infartuale nel territorio di fornitura di MCA. Sostenendo la penombra per compensare la crescita dell'infarto, la circolazione collaterale è sempre più riconosciuta come un importante predittore degli esiti dell'ictus ischemico, perché l'ostruzione vascolare acuta promuove il flusso sanguigno attraverso la rete collaterale, seguita dal rimodellamento e dall'angiogenesi per formare vasi neo-collaterali29,30. I risultati suggeriscono che il tPA non solo promuove la ricanalizzazione dell'MCA prossimale, ma aumenta anche la circolazione collaterale nella zona periferica dell'MCA (Figura 4). Una migliore comprensione dei meccanismi che regolano la plasticità della circolazione collaterale può suggerire nuove terapie. Poiché il modello di ictus fototrombotico potenziato dalla trombina offre il vantaggio di una regione peri-infartuale prevedibile e di una sensibilità al trattamento litico, aiuterà la ricerca sulla circolazione collaterale post-ictus.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del NIH (NS108763, NS100419, NS095064 e HD080429 a C.Y.K.; e NS106592 a Y.Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , Springer. (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
