Summary
使用荧光示踪剂的开放式血管窗口方法为耳蜗血流（CoBF）测量提供了足够的分辨率。该方法有助于研究正常和病理条件下小鼠CoBF的结构和功能变化。
Abstract
声音的转导对代谢要求很高，侧壁微脉管系统的正常功能对于维持耳蜗电位、离子转运和体液平衡至关重要。据报道，不同形式的听力障碍涉及耳蜗中的异常微循环。由于缺乏可行的询问方法和难以进入内耳，研究人工耳血流（CoBF）病理如何影响听力功能具有挑战性。侧耳蜗壁上的打开血管窗口与荧光活体显微镜相结合，已被用于研究体内CoBF变化， 但主要用于豚鼠，最近才在小鼠中。本文和相关视频描述了用于可视化小鼠耳蜗血流的开放血管窗口方法。细节包括1）从小鼠制备荧光标记的血细胞悬液;2）在麻醉小鼠中构建用于活体显微镜检查的开放血管窗口，以及3）使用成像的离线记录测量血流速度和体积。该方法以视频格式呈现，以展示如何使用鼠标中的开窗方法研究正常和病理条件下耳蜗微循环的结构和功能变化。
Introduction
耳蜗外侧壁微循环（包括螺旋韧带和血管纹中的大部分毛细血管）的正常功能对于维持听力功能至关重要1。CoBF异常与许多内耳疾病的病理生理学有关，包括噪音引起的听力损失，耳水肿和老年性聋2，3，4，5，6，7，8，9。活体CoBF的可视化将有助于更好地了解听力功能与耳蜗血管病理之间的联系。
尽管耳蜗在颞骨内的复杂性和位置无法直接可视化和测量CoBF，但已经开发了各种方法来评估CoBF，包括激光多普勒血流法（LDF）10，11，12，磁共振成像（MRI）13，荧光活体显微镜（FIVM）14，荧光显微内窥镜（FME）15，内窥镜激光斑点对比成像（LSCI）16。，以及基于将标记标记物和放射性标记微球注射到血液中的方法（光学微血管造影，OMAG）17，18，19，20。然而，除了FIVM之外，这些方法都没有能够绝对实时跟踪体内CoBF的变化。FIVM与侧耳蜗壁中的容器窗口相结合，是一种已被各种实验室在不同实验条件下在豚鼠中使用和验证的方法14，21，22。
以异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖为造影剂，以DiO（3，3′-二十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐，绿色）或Dil（1，1-二十八烷基-3，3，3，3-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐，红色）为预标记血细胞、可视化血管和跟踪血流速度，成功建立了研究小鼠耳蜗微循环结构和功能变化的FIVM方法。在本研究中，已经描述了该方法的方案，用于在正常和病理条件下（例如噪声暴露后）对小鼠CoBF的变化进行成像和量化。该技术为研究人员提供了研究与血管纹中听力功能障碍和病理学相关的CoBF潜在机制所需的工具，特别是当与现成的转基因小鼠模型结合使用时。
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Protocol
注意：这是一项非生存性手术。所有涉及使用动物的程序均由俄勒冈健康与科学大学的机构动物护理和使用委员会审查和批准（IACUC批准号：TR01_IP00000968）。
1.荧光标记血细胞的制备
- 用腹膜内（ip）注射氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉液（5mL / kg，参见 材料表）麻醉供体小鼠（年龄~6周的雄性C57BL / 6J小鼠）。
注意：此麻醉方案非常可靠，可维持全身血压。 - 将鼠标放在背上，打开皮肤并使用镊子和解剖剪刀露出胸腔。切开横膈膜，用夹式剪刀抓住胸骨底部，切开胸腔并提起以露出心脏。通过心脏穿刺收集1mL肝素（15IU / mL血液）中的血液，并在4°C下以3，000× g 离心3分钟。 采血后通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
- 取出血浆，用1mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤血细胞沉淀，并在4°C下以3000× g 离心3x3分钟。
- 在PBS中用1mL的20mM DiO或Dil标记血细胞，并在室温23，24下在黑暗中孵育30分钟。
- 用1mL PBS离心并洗涤标记的血细胞，在4°C下以3000× g 离心3x3分钟，并在注射前用~0.9mL PBS（最终体积~1.3mL）将细胞沉淀重悬于30%血细胞比容中。
2. 手术创造打开的窗户 25
- 准备无菌手术器械和成像平台，并在窗帘下方放置加热垫（图1A）。如步骤1.1所述麻醉小鼠（年龄~6周的雄性C57BL / 6J小鼠），并通过监测爪反射和一般肌肉张力来检查麻醉深度。将动物放在温暖的加热垫上，并将直肠温度保持在37°C。
- 将动物尾巴放入CODATM监测系统中，以监测血压和心跳（见 材料表）。记录动物在麻醉状态下的收缩压、舒张压和平均血压 （MBP）。
注意：在麻醉和非麻醉状态下，动物MBP没有差异（107 ± 11 mmHg与97 ± 7 mmHg）。动物心率在麻醉下稳定，但低于（仍在正常范围内）低于非麻醉条件下（357 ± 12 bmp vs. 709 ± 3 bmp）。在被束缚的动物中，预计心跳应略有增加26. - 在体视显微镜下通过侧向和腹侧入路打开左鼓膜大疱（见 材料表），保持鼓膜和听小骨完整21.
- 沿着动物颈部的中线做一个切口，头部固定并定位以尽量减少运动（图1B）。切除左下颌下腺和二腹肌后腹部并烧灼。
注意：皮下注射丁丙诺啡0.05mg / kg，以减轻手术过程中的疼痛。 - 通过识别胸锁乳突肌和向前延伸至大疱的面神经来定位并暴露骨大疱。
- 用30G针打开骨大疱，并用手术镊子小心地去除周围的骨头，以提供耳蜗和镫骨动脉的清晰视野，其内侧边缘位于圆窗壁龛的边缘，并向椭圆形窗口前上流（图1C，D）。
注意：进行气管切开术是为了保持气道畅通无阻，并且只有在动物在手术过程中出现呼吸问题时才应进行。一般来说，大多数麻醉下的动物呼吸顺畅。但是，如果动物在手术过程中接受了气管切开术，则记录的血流量不应用于任何比较。
- 沿着动物颈部的中线做一个切口，头部固定并定位以尽量减少运动（图1B）。切除左下颌下腺和二腹肌后腹部并烧灼。
- 使用小刀片（定制铣削的#16手术刀）刮擦小鼠耳蜗顶端-中转处的侧壁骨，距顶端约1.25毫米，直到薄点破裂。用小线钩取出骨屑（图1E）。
- 用切好的盖玻片盖住容器窗口，以保持正常的生理条件，并为记录容器图像提供光学视图。
注意：所有程序均应谨慎执行。除了监测体温外，还应在整个手术过程中监测动物的生命体征，包括血压和心跳。
3. FIVM 下 CoBF 的成像
- 沿右隐静脉做一个~1厘米的切口以暴露血管（图1F）。
- 通过大隐静脉将 100 μL FITC-葡聚糖溶液（2000 kDa，40 mg/mL PBS 溶液）和 100 μL 血细胞悬液（30% 血细胞比容）相继注入动物体内（图 1G），以实现血管可视化和血流速度跟踪。
- 注射后5分钟直接在视频监视器上实时观察血流。使用配备长工作距离（W.D.）物镜（W.D.30.5 mm，10x，0.26数值孔径）和包含多波段激发滤光片和兼容发射滤光片的灯罩（材料表）的荧光显微镜对血管进行成像。使用高分辨率数字黑白电荷耦合器件相机（材料表）以 2 帧/秒的速度录制视频）。每个视频采集 350 多张图像，以确保成功分析流速。
注意：螺旋韧带和血管纹的血管都可以通过调整光学焦点来成像（补充视频1）。
4. 视频分析
- 使用适当的软件（材料表）测量容器直径，并确定采集图像中容器上两个固定点之间的距离。
- 通过跟踪标记血细胞在图像位置27之间的空间距离中的运动，从捕获的视频帧计算血流速度。
- 在软件中打开血流视频（本协议中使用了斐济[ImageJ]），并设置图像的比例。
- 使用跟踪功能跟踪选定的DiO染色血细胞。使用单元格移动的距离和视频中图像帧之间的时间间隔来自动计算流速。
- 根据以下公式计算体积流量 （F）：F = V × A.（V：速度;A：容器的横截面积）。
5. 噪声暴露
- 将动物放在金属丝网笼中。将它们暴露在声音暴露室中120 dB声压级的宽带噪声中3小时，第二天再暴露3小时。
注意：本实验室常规使用的这种噪声暴露制度会导致人工耳蜗敏感性的永久性丧失28。
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Representative Results
在侧壁的耳蜗毛细血管手术暴露后（图1），通过打开的血管窗口对FITC右旋糖酐标记的血管中的Dil标记血细胞进行活体高分辨率荧光显微镜观察是可行的。图2A是在FIVM下拍摄的代表性图像，显示了小鼠耳蜗顶端-中转侧壁的毛细血管。这些血管的管腔通过与血浆混合的FITC-葡聚糖的荧光可见。分布在血管网络中的单独标记的血细胞在此图像中也清晰可见。两个不同的网络 - 螺旋韧带的毛细血管和血管纹的毛细血管 - 通过位置进行区分（在正置显微镜下，血管纹在螺旋韧带下方光学运行，并且它包含更多的毛细血管环和更小的血管25）。两者都可以通过调整光学焦点来评估血流量。如图2B，C所示，螺旋韧带的血管密度比血管纹的血管密度稀疏。
将噪声暴露小鼠模型中的血管功能与对照组的血管功能进行比较。CoBF测量是在噪声暴露后2周进行的。图3A，B是代表性图像，显示了对照组和噪声暴露组中的流动模式。在暴露于噪音的组中观察到血流紊乱的模式（图3B）。异常包括血管直径减小（图3C）和血管直径变化增加（图3D）。如图4A，B所示，通过跟踪DiO标记的血细胞的路径来计算对照组和噪声暴露组的血流速度（补充视频2）。结果表明，噪声暴露组的血流速度和血容量明显低于对照组（图4C，D）。这些数据表明，响亮的声音会显着影响血液循环，并导致血流减少和紊乱。
图1：用于小鼠IVM成像的开放血管窗口的制备 。 （A）准备手术器械和工具。（B）左大疱通过侧向和腹侧入路暴露。（C）耳蜗在去除大疱后暴露。（D）耳蜗的放大图像，来自（C）中的圆圈。（E）在耳蜗侧壁（箱）的顶端-中转处创建一个开放的血管窗口。（F 和 G）通过隐静脉静脉输注FITC-葡聚糖和标记的血细胞。缩写：OW = 椭圆形窗口;RW = 圆窗;IVM = 活体显微镜检查;FITC = 异硫氰酸荧光素。 请点击此处查看此图的大图。
图2：侧壁耳蜗毛细血管的代表性图像。 （A）用FITC-葡聚糖（绿色）标记的心房血管中的Dil标记血细胞（红色，箭头）。（B）用FITC-葡聚糖标记的螺旋韧带血管中的DiO标记血细胞（绿色）（箭头，绿色）。请注意，船只稀疏。（C）用FITC-葡聚糖（绿色）标记的心房血管中的DiO标记血细胞（绿色）。请注意，容器更密集。比例尺：50 μm 和 100 μm。 缩写：Dil = 1，1-二十八烷基-3，3，3，3-四甲基吲哚羚花青高氯酸盐;DiO = 3，3′-二十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐;FITC = 异硫氰酸荧光素。 请点击此处查看此图的大图。
图3：噪声暴露两周后条纹血管直径的变化。 （A和B）对照组和噪声暴露（NE）组用FITC-葡聚糖（绿色）标记血管和用DiO（绿色）标记血细胞后血液循环的代表性图像，以及使用高分辨率IVM标记噪声暴露（NE）组。（C）为对照组和NE组计算的平均血管直径。与对照组相比，噪声暴露组的血管直径减小。（n = 18， t （34） = 2.880， **p = 0.007， 学生 t 检验， 平均值 ± 标准差 [SD]）。（D）对照组和NE组中容器直径的差异。NE组的血管直径变化比对照组大得多。（n = 6， t （10） = 6.630， ****p < 0.0001， 学生 t 检验， 平均值 ± 标准偏差）。比例尺：100 μm。 缩写：DiO = 3，3′-二十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐;FITC = 异硫氰酸荧光素;IVM = 活体显微镜检查。请点击此处查看此图的大图。
图 4：噪声暴露两周后条纹中的血流变化。 （A和B）代表性图像显示了DiO标记血细胞（绿色）的跟踪路径（红色，绿色和蓝色线），用于对照组和噪声暴露组的血流速度测量。（C 和 D）分别计算对照组和噪声暴露组的血流速度（μm/s）和体积流速（μm3/s）。噪声暴露组血流速和体积流速均低于对照组（n=54，t速度（106）=19.705，****p速度<0.0001;t 体积 （106） = 15.342，****p体积< 0.0001，学生 t 检验，平均值±标准差）。比例尺：100 μm。 缩写：DiO = 3，3′-二十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐1;FITC = 异硫氰酸荧光素;NE 2W = 两周噪声暴露。请点击此处查看此图的大图。
补充视频1：螺旋韧带和血管纹的血管。 请点击此处下载此视频。
补充视频2：跟踪DiO标记的血细胞的路径，以计算对照动物的血流速度。缩写：DiO = 3，3′-二十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐。请点击此处下载此视频。
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Discussion
本文展示了如何在FIVM系统下的开放式血管窗口制备中通过荧光团标记可视化小鼠模型耳蜗侧壁（和血管纹）中的毛细血管。小鼠模型被广泛使用并优选作为哺乳动物模型来研究人类健康和疾病。这里描述的协议是一种可行的方法，用于在FIVM系统下使用开放的血管窗口对小鼠侧壁（特别是在血管纹中）中的CoBF进行成像和研究该方法提供了足够的分辨率，用于使用荧光标记的血细胞作为示踪剂来确定血流速度和体积（如图 3 和 图4所示）。).该方法可用于几种不同的应用，例如评估血管通透性和检查周细胞收缩力，以及跟踪循环骨髓细胞迁移25。CoBF对创伤，感染，噪音，异物，耳毒性药物或其他影响侧壁的物质的急性变化也可以实时监测25，29。
在过去的几十年中，建立了几种相对非侵入性的方法来评估CoBF而不去除耳蜗骨壁，包括LDF，MRI，OMAG，内窥镜LSCI，内窥镜FME和将微球注射到血浆中。然而，这些方法都不能用于评估单个容器中的绝对流速。例如，非侵入性内窥镜FME只能用于对圆窗附近的有限区域进行成像，而不能用于血管纹中的血流成像。 然而，血管纹中的血液循环在维持 EP、离子转运和内淋巴液平衡方面起着至关重要的作用，所有这些都对听力敏感性至关重要（Zhang 等人，2021 年）。OMAG也可用于完整耳蜗中血流的可视化，但是，分辨率太差，无法对小鼠模型19的血管纹中的单个毛细血管进行成像。
打开的血管窗口与FIVM相结合，可以实时可视化耳蜗侧壁中的血流，并测量记录区域的血管直径和血流速度。与其他方法相比，IVM 系统具有多个优点。例如，可以根据需要方便地定位和操纵动物。可以灵活地调整荧光标记的血浆和血细胞的对比度，以优化血管结构的可视化并突出显示相关结构。还可以选择FITC偶联示踪剂的不同分子量，以优化血管通透性的评估。e 与用于标记血浆的FITC-葡聚糖相比，是否使用Dil（lex = 550 nm;lem = 564 nm）或Dio（lex = 484 nm;lem = 501 nm）来标记血细胞的选择取决于实验目标。通常，Dil为血管腔和单个血细胞的可视化提供了更好的对比度，而当同时成像用于同一采集通道中的血细胞和腔的可视化时，Dio是首选。更重要的是，跟踪最好使用少量标记的细胞来完成，因为如果血管中的所有血细胞都被标记21，血细胞荧光将掩盖血管腔荧光。此外，应注意限制施用于血液的溶液量，以尽量减少耳蜗30中的稀释和粘度相关血流变化。
总体而言，该方法是稳健的，可用于研究CoBF在正常和病理条件下（如炎症，噪声和衰老）的结构和功能变化。重要的是，在手术过程中可以保持恒定和正常的EP，表明当足够仔细地进行时，该过程对耳蜗功能无害25。然而，成功建立开放的血管窗口确实需要高度的手术技巧。例如，必须小心去除耳蜗侧壁的骨，以防止外淋巴液流失和耳蜗螺旋韧带外层的微损伤。这些可能会对耳蜗稳态产生不利影响并损害成像。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了NIH / NIDCD R21 DC016157（X.Shi），NIH / NIDCD R01 DC015781（X.Shi），NIH / NIDCD R01-DC010844（X.Shi）和俄勒冈健康与科学大学（OHSU）（X.Shi）的医学研究基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
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