Summary
Un enfoque de ventana de vaso abierto utilizando trazadores fluorescentes proporciona una resolución suficiente para la medición del flujo sanguíneo coclear (CoBF). El método facilita el estudio de los cambios estructurales y funcionales en CoBF en ratón en condiciones normales y patológicas.
Abstract
La transducción del sonido es metabólicamente exigente, y la función normal de la microvasculatura en la pared lateral es crítica para mantener el potencial endococlear, el transporte de iones y el equilibrio de líquidos. Se informa que diferentes formas de trastornos auditivos implican microcirculación anormal en la cóclea. La investigación de cómo la patología del flujo sanguíneo coclear (CoBF) afecta la función auditiva es un desafío debido a la falta de métodos de interrogatorio factibles y la dificultad para acceder al oído interno. Una ventana de vaso abierta en la pared coclear lateral, combinada con microscopía intravital de fluorescencia, se ha utilizado para estudiar los cambios de CoBF in vivo, pero principalmente en conejillos de indias y solo recientemente en el ratón. Este documento y el video asociado describen el método de ventana de vaso abierto para visualizar el flujo sanguíneo en la cóclea del ratón. Los detalles incluyen 1) preparación de la suspensión de células sanguíneas marcadas con fluorescencia de ratones; 2) construcción de una ventana de vaso abierta para microscopía intravital en un ratón anestesiado, y 3) medición de la velocidad y el volumen del flujo sanguíneo utilizando una grabación fuera de línea de las imágenes. El método se presenta en formato de video para mostrar cómo usar el enfoque de ventana abierta en el ratón para investigar cambios estructurales y funcionales en la microcirculación coclear en condiciones normales y patológicas.
Introduction
La función normal de la microcirculación en la pared coclear lateral (que comprende la mayoría de los capilares en el ligamento espiral y la estría vascular) es de importancia crítica para mantener la función auditiva1. La CoBF anormal está implicada en la fisiopatología de muchos trastornos del oído interno, incluida la pérdida de audición inducida por ruido, la hidropesía del oído y la presbiacusia 2,3,4,5,6,7,8,9. La visualización del CoBF intravital permitirá una mejor comprensión de los vínculos entre la función auditiva y la patología vascular coclear.
Aunque la complejidad y localización de la cóclea dentro del hueso temporal impide la visualización directa y la medición del CoBF, se han desarrollado diversos métodos para la evaluación del CoBF, incluyendo la flujometría láser-doppler (LDF)10,11,12, la resonancia magnética (RM)13, la microscopía intravital de fluorescencia (FIVM)14, la microendoscopia fluorescente (FME)15, la imagen endoscópica de contraste con moteado láser (LSCI)16 , y enfoques basados en la inyección de marcadores marcados y microesferas marcadas radiactivamente en el torrente sanguíneo (microangiografía óptica, OMAG)17,18,19,20. Sin embargo, ninguno de estos métodos ha permitido el seguimiento absoluto en tiempo real de los cambios en CoBF in vivo, con la excepción de FIVM. La FIVM, en combinación con una ventana de vaso en la pared coclear lateral, es un abordaje que ha sido utilizado y validado en cuyes bajo diferentes condiciones experimentales por diversos laboratorios 14,21,22.
Se estableció con éxito un método FIVM para estudiar los cambios estructurales y funcionales en la microcirculación coclear en ratón utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano como medio de contraste y un colorante de fluorescencia, ya sea DiO (perclorato de 3, 3′-dioctadeciloxacarbocianina, verde) o Dil (perclorato de 1,1-dioctadecil-3,3,3,3-tetrametilindocarbocianina, rojo), para premarcar las células sanguíneas, visualizar los vasos y rastrear la velocidad del flujo sanguíneo. En el presente estudio, se ha descrito el protocolo de este método para obtener imágenes y cuantificar los cambios en CoBF en ratones en condiciones normales y patológicas (como después de la exposición al ruido). Esta técnica proporciona al investigador las herramientas necesarias para investigar los mecanismos subyacentes de CoBF relacionados con la disfunción auditiva y la patología en la estría vascular, especialmente cuando se aplica junto con modelos de ratones transgénicos fácilmente disponibles.
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Protocol
NOTA: Esta es una cirugía de no supervivencia. Todos los procedimientos que involucran el uso de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón (número de aprobación de IACUC: TR01_IP00000968).
1. Preparación de las células sanguíneas marcadas con fluorescencia
- Anestesiar a los ratones donantes (ratones machos C57BL/6J de edad ~6 semanas) con una inyección intraperitoneal (i.p.) de solución anestésica de ketamina/xilazina (5 mL/kg, ver la Tabla de materiales).
NOTA: Este protocolo de anestesia es muy confiable y mantiene la presión arterial sistémica. - Coloque el ratón sobre su espalda, abra la piel y exponga la cavidad torácica con pinzas y tijeras de disección. Corte el diafragma, agarre la base del esternón con tijeras de abrazadera, corte a través de la caja torácica y levante para exponer el corazón. Recoger 1 ml de sangre en heparina (15 UI/ml de sangre) mediante punción cardíaca y centrifugar a 3.000 × g durante 3 min a 4 °C. Eutanasia del ratón por dislocación cervical después de la recolección de sangre.
- Extraer el plasma, lavar el pellet de células sanguíneas con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y centrifugar 3x a 3000 × g durante 3 min a 4 °C.
- Etiquetar las células sanguíneas con 1 ml de 20 mM de DiO o Dil en PBS, e incubar en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente23,24.
- Centrifugar y lavar las células sanguíneas marcadas con 1 ml de PBS, centrifugar 3x a 3000 × g durante 3 min a 4 °C, y resuspender el pellet celular en hematocrito al 30% con ~0,9 ml de PBS (volumen final ~1,3 ml) antes de la inyección.
2. Cirugía para crear una ventana abierta 25
- Prepare los instrumentos quirúrgicos estériles y la plataforma de imágenes, y coloque una almohadilla térmica debajo de la cortina (Figura 1A). Anestesiar a los ratones (ratones machos C57BL / 6J de edad ~ 6 semanas) como se describe en el paso 1.1, y verificar la profundidad de la anestesia monitoreando el reflejo de la pata y el tono muscular general. Coloque al animal en la almohadilla térmica caliente y mantenga la temperatura rectal a 37 ° C.
- Coloque la cola del animal en el sistema de monitoreo CODATM para monitorear la presión arterial y los latidos cardíacos (consulte la Tabla de materiales). Registre la presión arterial sistólica del animal, la presión arterial diastólica y la presión arterial media (MBP) en la condición anestesiada.
NOTA: No se observan diferencias en la MBP animal en el estado anestesiado y no anestesiado (107 ± 11 mmHg vs. 97 ± 7 mmHg). La frecuencia cardíaca animal es estable bajo anestesia, aunque menor (todavía dentro del rango normal) que en la condición no anestesiada (357 ± 12 bmp vs. 709 ± 3 bmp). Se debe esperar un ligero aumento del latido cardíaco en animales colocados en restricción26. - Abrir la bulla timpánica izquierda mediante un abordaje lateral y ventral bajo un microscopio estereoscópico (ver Tabla de Materiales), dejando intactas la membrana timpánica y los osículos21.
- Haga una incisión a lo largo de la línea media del cuello del animal con la cabeza inmovilizada y colocada para minimizar el movimiento (Figura 1B). Extirpar la glándula submandibular izquierda y el vientre posterior del músculo digástrico y cauterizar.
NOTA: Inyecte buprenorfina por vía subcutánea a 0,05 mg/kg para reducir el dolor durante la cirugía. - Localice y exponga la bulla ósea identificando el músculo esternocleidomastoideo y el nervio facial que se extiende anteriormente hacia la bulla.
- Abra la bulla ósea con una aguja de 30 G y retire cuidadosamente el hueso circundante con pinzas quirúrgicas para proporcionar una visión clara de la cóclea y la arteria estapedial, con su margen medial sobre el borde del nicho de la ventana redonda y cursando anterior-superior hacia la ventana oval (Figura 1C, D).
NOTA: La traqueotomía se realiza para mantener las vías respiratorias sin obstrucciones y solo debe realizarse cuando el animal tiene un problema respiratorio durante la cirugía. En general, la mayoría de los animales bajo anestesia tienen una respiración suave. Sin embargo, si los animales recibieron una traqueotomía durante la cirugía, el flujo sanguíneo registrado no debe usarse para ninguna comparación.
- Haga una incisión a lo largo de la línea media del cuello del animal con la cabeza inmovilizada y colocada para minimizar el movimiento (Figura 1B). Extirpar la glándula submandibular izquierda y el vientre posterior del músculo digástrico y cauterizar.
- Use una hoja de cuchillo pequeña (bisturí # 16 molido a medida) para raspar el hueso de la pared lateral en el ápice de la cóclea media del ápice, aproximadamente a 1,25 mm del ápice hasta que se agriete un punto delgado. Retire las astillas de hueso con pequeños ganchos de alambre (Figura 1E).
- Cubra la ventana del recipiente con un cubreobjetos cortado para preservar las condiciones fisiológicas normales y proporcione una vista óptica para grabar imágenes del recipiente.
NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse con precaución. Además de controlar la temperatura corporal, los signos vitales del animal, incluida la presión arterial y los latidos del corazón, también deben controlarse durante toda la cirugía.
3. Imágenes de CoBF bajo FIVM
- Haga una incisión de ~1 cm a lo largo de la vena safena derecha para exponer el vaso (Figura 1F).
- Infundir 100 μL de la solución de FITC-dextrano (2000 kDa, 40 mg/ml en PBS) y 100 μL de una suspensión de células sanguíneas (hematocrito al 30%) sucesivamente en el animal a través de la vena safena (Figura 1G) para permitir la visualización de los vasos sanguíneos y el seguimiento de la velocidad del flujo sanguíneo.
- Observe el flujo sanguíneo en tiempo real directamente en un monitor de video 5 minutos después de la inyección. Imagen de los vasos sanguíneos utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de larga distancia de trabajo (W.D.) (W.D. 30.5 mm, 10x, 0.26 apertura numérica) y una carcasa de lámpara que contiene un filtro de excitación de banda múltiple y un filtro de emisión compatible (Tabla de materiales). Grabe el vídeo con una cámara digital de alta resolución en blanco y negro con dispositivo de carga acoplada (Tabla de materiales) a 2 fotogramas/s). Adquiera más de 350 imágenes por video para garantizar un análisis exitoso de la velocidad del flujo.
NOTA: Se pueden obtener imágenes de los vasos sanguíneos tanto del ligamento espiral como de la estría vascular ajustando el enfoque óptico (Video suplementario 1).
4. Análisis de vídeo
- Mida el diámetro del recipiente utilizando el software apropiado (Tabla de materiales) y determine la distancia entre dos puntos fijos a través del recipiente en las imágenes adquiridas.
- Calcule la velocidad del flujo sanguíneo a partir de fotogramas de vídeo capturados rastreando el movimiento de las células sanguíneas marcadas en la distancia espacial entre las ubicaciones de las imágenes27.
- Abra el video del flujo sanguíneo en el software (Fiji [ImageJ] se usó en este protocolo) y establezca la escala de las imágenes.
- Rastree las células sanguíneas teñidas con DiO seleccionadas utilizando la función de seguimiento. Utilice la distancia a la que se han movido las celdas y el intervalo de tiempo entre fotogramas de imagen en el vídeo para el cálculo automático de la velocidad de flujo.
- Calcule el flujo volumétrico (F) según la siguiente ecuación: F = V × A. (V: velocidad; A: área de sección transversal del buque).
5. Exposición al ruido
- Coloque a los animales en jaulas de malla de alambre. Exponerlos a ruido de banda ancha a un nivel de presión acústica de 120 dB en una cabina de exposición al sonido durante 3 h y durante 3 h adicionales al día siguiente.
NOTA: Este régimen de exposición al ruido, utilizado habitualmente en este laboratorio, produce pérdida permanente de sensibilidad coclear28.
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Representative Results
Después de la exposición quirúrgica de los capilares cocleares en la pared lateral (Figura 1), la observación microscópica de fluorescencia intravital de alta resolución de células sanguíneas marcadas con Dil en vasos marcados con FITC-dextrano fue factible a través de una ventana de vaso abierta. La Figura 2A es una imagen representativa tomada bajo FIVM que muestra los capilares de la pared lateral del ápice coclear del ápice del ratón que gira en el medio. La lumina de estos recipientes se hace visible por la fluorescencia de FITC-dextrano mezclado con plasma. Las células sanguíneas marcadas individualmente distribuidas en la red vascular también son claramente visibles en esta imagen. Dos redes distintas, capilares del ligamento espiral y capilares de la estría vascular, se distinguen por su ubicación (bajo un microscopio vertical, la estría vascular corre ópticamente debajo del ligamento espiral, y contiene más bucles capilares y vasos más pequeños25). Ambos pueden ser evaluados para el flujo sanguíneo con el ajuste del enfoque óptico. Como se muestra en la Figura 2B, C, la densidad de los vasos del ligamento espiral es más escasa que la de la estría vascular.
La función vascular en el modelo de ratón expuesto al ruido se comparó con la función vascular en el grupo control. La medición de CoBF se tomó 2 semanas después de la exposición al ruido. Las figuras 3A, B son imágenes representativas que muestran los patrones de flujo en los grupos de control y expuestos al ruido. Se observó un patrón alterado del flujo sanguíneo en el grupo expuesto al ruido (Figura 3B). Las anomalías incluyeron reducción del diámetro del vaso (Figura 3C) y aumento de la variación en el diámetro del vaso (Figura 3D). Como se ilustra en la Figura 4A, B, las velocidades de flujo sanguíneo en los grupos de control y expuestos al ruido se calcularon mediante el seguimiento de las rutas de las células sanguíneas marcadas con DiO (video complementario 2). Los resultados muestran que la velocidad y el volumen sanguíneo en el grupo expuesto al ruido fueron significativamente menores que en el grupo control (Figura 4C, D). Estos datos indican que el sonido fuerte afecta notablemente la circulación sanguínea y causa un flujo sanguíneo reducido y alterado.
Figura 1: Preparación de una ventana de vaso abierta para imágenes de MIV en ratón. (A) Preparación de instrumentos y herramientas para la cirugía. (B) La bulla izquierda fue expuesta a través de un enfoque lateral y ventral. (C) La cóclea quedó expuesta después de retirar la bulla. (D) Imagen ampliada de la cóclea, del círculo en (C). (E) Se creó una ventana de vaso abierta en el vértice medio de la pared lateral coclear (caja). (F y G) Infusión intravenosa de FITC-dextrano y células sanguíneas marcadas a través de la vena safena. Abreviaturas: OW = ventana oval; RW = ventana redonda; MIV = microscopía intravital; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de capilares cocleares en la pared lateral. (A) Células sanguíneas marcadas con dil (rojo, flecha) en vasos estriales marcados con FITC-dextrano (verde). (B) Células sanguíneas marcadas con DiO (verde) en vasos de ligamentos espirales marcados con FITC-dextrano (flechas, verde). Tenga en cuenta que los vasos son escasos. (C) Células sanguíneas marcadas con DiO (verde) en vasos estriales marcados con FITC-dextrano (verde). Tenga en cuenta que los vasos son más densos. Barras de escala: 50 μm y 100 μm. Abreviaturas: Dil = 1,1-dioctadecil-3,3,3,3-perclorato de tetrametilindocarbocianina; DiO = 3, perclorato de 3′-dioctadeciloxacarbocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cambio en el diámetro de los vasos en la estría dos semanas después de la exposición al ruido. (A y B) Imágenes representativas de la circulación sanguínea después de marcar vasos con FITC-dextrano (verde) y células sanguíneas con DiO (verde) en grupos control y expuestos al ruido (NE) con MIV de alta resolución. (C) Diámetro medio del vaso calculado para los grupos control y NE. En comparación con el grupo de control, el diámetro del vaso se redujo en el grupo expuesto al ruido. (n = 18, t (34) = 2,880, **p = 0,007, prueba t de Student, media ± desviación estándar [DE]). (D) Varianza del diámetro del vaso en los grupos control y NE. El diámetro del vaso varió mucho más en el grupo NE que en el grupo control. (n = 6, t (10) = 6,630, ****p < 0,0001, prueba t de Student, media ± DE). Barras de escala: 100 μm. Abreviaturas: DiO = 3, perclorato de 3′-dioctadeciloxacarbocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína; MIV = microscopía intravital. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cambios en el flujo sanguíneo en la estría dos semanas después de la exposición al ruido. (A y B) Las imágenes representativas muestran las rutas de seguimiento (líneas rojas, verdes y azules) de las células sanguíneas marcadas con DiO (verde) para la medición de la velocidad del flujo sanguíneo en grupos de control y expuestos al ruido. (C y D) La velocidad del flujo sanguíneo (μm/s) y la tasa de flujo volumétrico (μm3/s) se calcularon respectivamente para los grupos control y expuestos al ruido. La tasa de flujo sanguíneo y la tasa de flujo volumétrico en el grupo expuesto al ruido fueron menores que en el grupo control (n = 54, velocidad t (106) = 19.705, velocidad ****p < 0.0001; volumen t (106) = 15,342, ****pvolumen < 0,0001, prueba t de Student, media ± desviación estándar). Barras de escala: 100 μm. Abreviaturas: DiO = 3, perclorato de 3′-dioctadeciloxacarbocianina1; FITC = isotiocianato de fluoresceína; NE 2W = exposición al ruido durante dos semanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video complementario 1: Vasos sanguíneos tanto del ligamento espiral como de la estría vascular. Haga clic aquí para descargar este video.
Video complementario 2: Seguimiento de las rutas de las células sanguíneas marcadas con DiOpara el cálculo de las velocidades del flujo sanguíneo en un animal de control. Abreviaturas: DiO = 3, perclorato de 3′-dioctadeciloxacarbocianina. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Este documento demuestra cómo los capilares en la pared lateral coclear (y en la estría vascular) de un modelo de ratón se pueden visualizar con etiquetado fluoróforo en una preparación de ventana de vaso abierto bajo un sistema FIVM. El modelo de ratón es ampliamente utilizado y preferido como modelo de mamífero para investigar la salud humana y la enfermedad. El protocolo descrito aquí es un enfoque factible para obtener imágenes e investigar CoBF en la pared lateral del ratón (particularmente en la estría vascular) utilizando una ventana de vaso abierta bajo el sistema FIVM. El método proporciona una resolución suficiente para determinar la velocidad y el volumen del flujo sanguíneo utilizando células sanguíneas marcadas con fluorescencia como marcador (como se muestra en la Figura 3 y la Figura 4). ). Este enfoque puede ser utilizado para varias aplicaciones diferentes, como la evaluación de la permeabilidad vascular y el examen de la contractilidad de los pericitos, y el seguimiento de la migración de células circulantes de la médula ósea25. Los cambios agudos en el CoBF en respuesta a traumatismos, infecciones, ruidos, cuerpos extraños, fármacos ototóxicos u otros agentes que afectan la pared lateral también pueden ser monitoreados en tiempo real25,29.
En las últimas décadas se establecieron varios métodos relativamente no invasivos para evaluar la CoBF sin eliminar la pared ósea coclear, incluyendo LDF, MRI, OMAG, LSCI endoscópica, FME endoscópica y la inyección de microesferas en el plasma sanguíneo. Sin embargo, ninguno de estos enfoques se puede utilizar para evaluar el caudal absoluto en vasos individuales. Por ejemplo, la FME endoscópica no invasiva solo se puede usar para obtener imágenes de regiones limitadas cerca de la ventana redonda, pero no del flujo sanguíneo en la estría vascular. Sin embargo, la circulación sanguínea en la estría vascular tiene un papel crucial en el mantenimiento de la EP, el transporte de iones y el equilibrio de líquidos endolinfáticos, todos esenciales para la sensibilidad auditiva (Zhang et al., 2021). OMAG también es útil para la visualización del flujo sanguíneo en la cóclea intacta, sin embargo, la resolución es demasiado pobre para obtener imágenes de capilares individuales en la estría vascular de un modelo de ratón19.
Una ventana de vaso abierta, junto con un FIVM, permite la visualización en tiempo real del flujo sanguíneo en la pared lateral coclear y la medición del diámetro vascular y la velocidad del flujo sanguíneo en las regiones registradas. El sistema IVM tiene varias ventajas sobre otros métodos. Por ejemplo, el animal puede ser convenientemente posicionado y manipulado según sea necesario. Hay flexibilidad para ajustar el contraste del plasma marcado con fluorescencia y las células sanguíneas para optimizar la visualización de la arquitectura vascular y resaltar las estructuras relevantes. Los diferentes pesos moleculares de los trazadores conjugados con FITC también se pueden seleccionar para optimizar la evaluación de la permeabilidad vascular. e La elección de utilizar Dil (lex = 550 nm; lem = 564 nm) o Dio (lex = 484 nm; lem = 501 nm) para etiquetar las células sanguíneas, en contraste con el FITC-dextrano utilizado para etiquetar el plasma, está determinada por los objetivos del experimento. En general, Dil proporciona un mejor contraste para la visualización de la luz del vaso y las células sanguíneas individuales, mientras que Dio se prefiere cuando se utilizan imágenes simultáneas para la visualización de células sanguíneas y lumen en el mismo canal de adquisición. Además, el seguimiento se logra mejor con un pequeño número de células marcadas, ya que la fluorescencia de las células sanguíneas enmascarará la fluorescencia de la luz del vaso si todas las células sanguíneas del vaso están etiquetadas21. Además, se debe tener cuidado para limitar la cantidad de solución administrada a la sangre, para minimizar la dilución y los cambios en el flujo sanguíneo relacionados con la viscosidad en la cóclea30.
En general, este método es robusto y se puede utilizar para investigar cambios estructurales y funcionales en CoBF en condiciones normales y patológicas como inflamación, ruido y envejecimiento. Es importante destacar que se puede mantener una EP constante y normal durante la cirugía, lo que indica que el procedimiento es inofensivo para la función coclear cuando se realiza con suficiente cuidado25. Sin embargo, el establecimiento exitoso de la ventana de vaso abierto requiere un alto grado de habilidad quirúrgica. Por ejemplo, se debe tener cuidado al extirpar el hueso de la pared lateral coclear para evitar la pérdida de líquido perilinfático y microlesiones en la capa externa del ligamento espiral coclear. Estos podrían afectar negativamente la homeostasis coclear y comprometer las imágenes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) y Medical Research Foundation de Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
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